Phân tích đột biến phân tử trên exon 8 gen LDLR ở bệnh nhân tăng cholesterol máu gia đình người Việt Nam

Bệnh lý Familial Hypercholesterolemia

Familial Hypercholesterolemia (FH) là bệnh lý rối loạn di truyền, xảy ra trên nhiễm sắc thể thường, thường do các dạng đột biến tập trung trên các gen mã hóa protein chuyển hóa lipid, cholesterol trong máu. Nghiên cứu đoạt giải Nobel năm 1985 của Brown và Goldstein – nhóm tác giả đầu tiên chứng minh được nồng độ LDL tăng bất thường trong huyết tương có liên quan đến đột biến trên gen LDLR (Pears et al., 2015). Một số báo cáo khoa học ghi nhận nguy cơ mắc bệnh động mạch vành sớm (Coronary Artery Disease – CAD) ở những bệnh nhân FH thể dị hợp không được chữa trị cao gấp 13 lần so với những người không mắc FH (Harada-Shiba et al., 2018), nguy cơ dẫn đến bệnh tim mạch vành.

- Nghiên cứu của Di Taranto và cộng sự (2015) xác định FH được chia làm 2 loại dựa vào kiểu hình là dạng bệnh lý tăng cholesterol máu tính trạng trội trên nhiễm sắc thể thường (Autosomal Dominant Hypercholesterolemia – ADH), và dạng bệnh lý tăng cholesterol máu tính trạng lặn trên nhiễm sắc thể thường (Autosomal Recessive Hypercholesterolemia – ARH). (1) Đột biến xuất hiện trên gen thụ thể LDL (Low Density Lipoprotein Receptor – LDLR) dẫn đến LDLR không tương tác với LDL – C, dẫn đến cholesterol không chuyển vào gan, làm tăng nồng độ cholesterol trong huyết tương. Bên cạnh đó, còn có tính chất đột biến xảy ra trên một số gen ở trạng thái allele lặn dẫn đến bệnh lý FH, gồm có: Low – density lipoprotein receptor adaptor protein 1 (LDLRAP1), APOE, SREBP2, STAP1 và LIPA (Alonso et al., 2018).

- Hiện nay, trên thế giới thường áp dụng một số tiêu chí chẩn đoán FH theo hệ thống của “Make Early Diagnosis to Prevent Early Deaths – MEDPED” của Hoa Kì, “Simon Broome” của Anh và “Dutch Lipid Clinic Network – DLCN” của Hà Lan (Ahmad et al., 2016). Thế hệ thứ nhất xuất hiện xanthoma ở gân và giác mạc 2 Trẻ em dưới 18 tuổi có nồng độ cholesterol 2 Tiền sử lâm sàng Bệnh nhân mắc bệnh tim mạch vàng sớm 2 Bệnh nhân mắc bệnh mạch máu não và ngoại vi sớm 1 Kiểm tra thể trạng.

Gen Low Density Lipoprotein Receptor (LDLR)

Tiền sử gia đình mắc bệnh tim mạch vành sớm ở thế hệ thứ nhất là. Bệnh nhân được chẩn đoán mắc bệnh FH khi nồng độ cholesterol đo được vượt mức các chỉ số nêu trên. - Loại 2: đột biến dẫn đến sự sai hỏng cấu trúc protein LDLR trong quá trình vận chuyển LDLR từ mạng lưới nội chất đến bề mặt tế bào.

- Loại 3: đột biến dẫn đến cản trở sự tương tác đặc hiệu của thụ thể LDL với APOB. - Loại 4: đột biến dẫn đến cản trở sự tương tác giữa protein LDLR và LDL. - Loại 5: đột biến dẫn đến rối loạn quá trình tái thiết lập LDLR trên bề mặt tế bào.

Phương pháp phân tích đặc điểm phân tử và một số bệnh lý di truyền.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Phương pháp

Phương pháp phân tích tổng hợp (Meta – analysis) được tiến hành dựa vào các thuật toán thống kê trên nguồn dữ liệu gồm hai hoặc nhiều công bố khoa học có cùng đối tượng nghiên cứu, được ứng dụng trong lĩnh vực khoa học trong y học, tâm lý học…(Ling., 2002). Phương pháp phân tích tổng hợp được tiến hành nhằm xác định sự tương quan giữa tính chất đột biến trên gen LDLR và nguy cơ mắc bệnh tăng cholesterol có tính chất gia đình thông qua một số tham số định lượng như tần số đột biến trên gen LDLR trên tổng mẫu nghiên cứu và nguy cơ mắc bệnh tăng cholesterol có tính chất gia đình, chỉ số “Proportion”, viết tắt là PR% với khoảng tin cậy 95% (Confidence intervals – CIs), phản ánh mức độ xuất hiện đột biến trên gen LDLR trên bộ mẫu bệnh phẩm có chỉ số cholesterol cao trong máu thông qua công cụ thống kê Medcalc. - Xây dựng tiêu chí trích xuất dữ liệu theo thang chuẩn “PICO – Participant – Intervention – Comparator – Outcomes”, Participant được hiểu theo nghĩa đối tượng nghiên cứu, Intervention là sự tác động đến đối tượng nghiên cứu, Comparator là so sánh các đối tượng dưới những tác động khác nhau và cuối cùng là Outcomes: giải quyết, đưa ra kết quả.

Dựa vào giá trị của I2, từ đó xác định mô hình phân tích theo dạng mô hình ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects meta – analysis, R) và mô hình ảnh hưởng cố định (Fixed effects meta-analysis, F), theo tiêu chí nhị phân (a dichotomous outcome) với khoảng tin cậy 95% (Confidence intervals – CIs) nhằm đánh giá tính tương quan giữa yếu tố nguy cơ (tính chất đột biến trên gen LDLR) và nguy cơ mắc bệnh tăng cholesterol có tính chất gia đình (Hunter và Schmidt., 2000). Khảo sát trên máy tính (In silico) với mục đích xác định bộ mồi phù hợp với phương pháp PCR kết hợp giải trình tự nhằm xác định đột biến nổi trội trên các exon thuộc gen LDLR. - Khảo sát thông số vật lý và độ đặc hiệu của bộ mồi bằng một số công cụ tin sinh học: OligoAnalyzer 3.1 (IDT) và phần mềm Annhyb 4.946, BLASTN (NCBI) dựa vào các chỉ số: chiều dài mồi, nhiệt độ nóng chảy, % GC, năng lượng hình thành các cấu trúc thứ cấp (cấu trúc kẹp tóc, Self – dimer, Hetero – dimer), vị trí khuếch đại sản phẩm trên trình tự mạch khuôn… Trong quá trình phân tích, chúng tôi tham.

(2) Xác định chất lượng DNA bộ gen bằng phương pháp đo quang phổ: Hàm lượng DNA có thể xác định được nhờ sự hấp thụ mạnh ánh sáng ở bước sóng 260nm và độ tinh sạch của DNA được đánh giá qua tỷ lệ A260/A280. Chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự exon 8 gen LDLR bằng cặp mồi LDLR_F2 và LDLR_R2 được tham khảo bởi nghiên cứu của Cheng và cộng sự (2018).