Ứng dụng chỉ thị SCoT đánh giá đa dạng di truyền một số giống vú sữa (Chrysophyllum cainito) ở Việt Nam

NTTU-NCKH- CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KÉT ĐÈ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2020 Tên đề tài: ứng dụng thị SCoT đánh giá đa dạng di truyền số giống vú sữa (Chrysophyllum cainito) Việt Nam Số hợp đồng: 2020.01.100/HĐ-KHCN Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Nhà Đơn vị công tác: Khoa Công nghệ Sinh học Thời gian thực hiện: 3/2020 - 9/2020 TP Hồ Chí Minh, ngày thảng năm 2020 MỤC LỤC MỤC LỤC MỞ ĐÀU TÓNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu ve vú sữa Chùng loại vú sữa Đặc điểm sinh thái Nơi phân bố Các giá trị cùa vú sữa 10 Kỳ thuật sử dụng nghiên cứu 10 Kỳ thuật chì thị phân từ .10 Chỉ thị phân tù ScoT 11 Tỉnh hình nghiên cứu chì thị phân từ SCoT ứng dụng thị phân tử vú sữa 12 Các nghiên cứu ứng dụng chi thị ScoT 12 Các nghiên cứu ứng dụng chi thị phân từ vú sữa 15 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cúu 17 Nơi thực .17 Phương pháp nghiên cứu 17 Tách chiết DNA 17 Sàng lọc đánh giá moi ScoT đa hình 19 Phân tích đa dạng di truyền mẫu giong xoài 20 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 Thu thập mẫu 23 Tách chiết DNA 24 Tính đa hình cùa 22 thị SCoT 25 Mối quan hệ di truyền 30 giong xoài 26 Đa hình giúp nhận diện cá the 28 KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 PHỤ LỤC 34 Đa hình giúp nhận diện cá thể Error! Bookmark not defined DANH MỤC CÁC BẢNG BIẾU Bảng 2.1 Trình tự chi thị ScoT sứ dụng nghiên cứu 19 Bảng 2.2 Thành phần phàn ứng PCR 19 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt sừ dụng phản ứng PCR 19 Bảng 3.1 Danh sách giống xoài sữ dụng nghiên cứu 23 Bảng 3.2 Nong độ giá trị OD cùa 30 mẫu DNA xoài 24 Bảng 3.3 Danh sách chì thị Scot đa hình chọn 26 Bảng 3.4 Danh sách thị SCoT sử dụng đe chi định 29 Bảng 3.4 Danh sách chi thị SCoT sữ dụng đế chi định Error! Bookmark not defined DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Chuẩn bị nhập dử liệu Microsoft Excel 21 Hình 2.2 Ví dụ ma trận tương đong 21 Hình 2.3 Ví dụ vẻ ma trận tương đong (Cây phát sinh loài) 22 Hình 3.1 DNA tổng số cùa vú sữa 24 Hình 3.2 Sản phẩm PCR mồi SCoT04, SCoT02, SC0TO6, SC0TO8 14 mẫu vú sữa 25 TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN cứu Sản phẩm đăng kí thuyết minh Sản phẩm thực đạt Báo cáo phân tích di truyền 14 mẫu giống vú Báo cáo phân tích di truyền 14 mầu giống vú sữa Việt Nam sữa Việt Nam 01 báo (chưa đãng): Le Thi Thanh Nga, 01 báo Nguyen Thi Nha, Ho Thị Cam Nguyen, Ton Đào tạo: 01 sinh viên (Chuyên ngành Nu Thuy An, Nguyen Huu Thuan Anh, Tran CNSH) Hoang Dung, Vu Thi Huyen Trang, ứng dụng thị SCoT đánh giá đa dạng di truyền số giống vú sữa (Chrysophyllum cainito) Việt Nam Đào tạo: 01 sinh viên (hồn thành Khóa luận tốt nghiệp chuyên ngành CNSH, tháng 7/2020) Nguyền Thị Tuyền, úng dụng chi thị SCoT đánh giá đa dạng di truyền số giống vú sữa (Chrysophyllum cainito) Việt Nam Thòi gian đăng ký : Từ ngày đến ngày Thòi gian nộp báo cáo: Ngày MỞ ĐẦU Vú sữa (Chrysophyllum cainito) có nguồn gốc vùng nhiệt đới châu Mỹ đảo Antilles, đuợc trồng chủ yếu nuớc Àn Độ, Campuchia, Thái Lan, Việt Nam , nhung hau het chi đuợc tiêu thụ khu vực nội địa Việt Nam nuớc the giới chọn trái vú sữa làm hàng hóa xuất giá trị dinh dưỡng giá trị kinh tể mà mang lại Việt Nam có số giống điển hình như: vú sữa Lị Rèn, vú sữa Vĩnh Kim, vú sữa bách thảo nâu, vú sữa trắng Bên cạnh việc lựa chọn bào tồn cá thể mang tính trạng tốt việc phân loại để có hướng khai thác phát triển nguồn tài nguyên cần thiết Tuy nhiên, chưa có hệ thống phân loại giong vú sữa hồn chình nhằm phục vụ cho việc khai thác gen quý, xác định truy nguyên nguồn gốc giống vú sữa bày bán thị trường Ngoài ra, việc nhận diện giong vú sữa dựa vào đặc điểm hình thái, chất lượng, màu sắc, hình dạng cịn nhiều khó khán chúng có tương đong cao phụ thuộc chù yếu vào kinh nghiệm, lịch sữ lai tạo, cắt ghép, khu vực điạ lí Đồng thời nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tữ vú sữa thực chưa phổ biến Kỳ thuật chi thị phân tữ đặc biệt thị DNA lúc ứng dụng rộng rãi nghiên cứu di truyền Trong số chi thị DNA, thị phân tử ScoT (Start Codon Target) kỳ thuật có lợi thể bật việc ứng dụng trực tiếp vào chọn giống Chỉ thị SCoT kỳ thuật đơn giàn dựa phương pháp PCR nhân vùng trình tự chứa ba mở đầu ATG Chì thị SCoT biểt đến khả nãng cho đa hình cao, thực phản ứng PCR khơng biết rõ thơng tin trình tự đoạn gen mục tiêu, có the sứ dụng việc đánh dấu gen phục vụ nghiên cứu chuyên sâu ve gen chức có liên quan trực tiếp đen gen mã hóa tính trạng Chính đề tài “úng dụng thị SCoT đánh giá đa dạng di truyền số giống vú sữa (Chrysophyllum cainitò) Việt Nam” thực góp phần cho cơng tác phân loại giống vú sữa biên khu vực bàng chì thị phân tứ, đong thời làm sở cho việc lựa chọn chi thị để nhiên diện đầu dòng số giống phục vụ tiêu dùng nước xuất Mục tiêu đề tài Phân loại so mầu giống xoài thu từ tinh thành Việt Nam dựa thị SCoT Xác định mối quan hệ di truyền cặp mầu giống TỐNG QUAN TÀI LIỆU Giói thiệu vú sữa Tên khoa học vị trí vú sữa hệ thống phân loại: Giới (Kingdom): Pantae Ngành (Phylum): Spermatophyta Phân ngành (Subphylum): Angiospermae Lớp (Class): Dicotyledonae Bộ (Order): Ebenales Họ (Family): Sapotaceae Chi (Genus): Chrysophyllum Loài (Species): chrysophyllum cainito Họ vú sữa (danh pháp khoa học Sapotaceae) họ thực vật hạt kín thuộc Ericales Hệ thong phân loại Cronquist Dhalgren xếp họ Ericalesf ] Nhiều loài họ có ãn có giá trị kinh te cao, ví dụ hồng xiêm (Manilkara zapota), vú sữa (Chrysophyllum cainito), lê ki ma (Pouteria lucuma), than kỳ (Synsepalum dulciíĩcum) Họ Sapotaceae lồi thân gỗ bụi có nhựa mú, ưa ẩm vừa phái, đơn thường xanh, mọc so le, bóng da, có cuống Phiên nguyên, hoa lưỡng tính, mọc đơn độc hay thành cụm hoa, cụm hoa mọc nách (đôi cành già) Bao hoa với đài hoa tràng hoa riêng biệt Quà dày cùi thịt, dạng q mọng Hạt có nội nhũ khơng, nội nhũ chứa dầu Phôi phân biệt rõ không chứa diệp lục[2] Họ có phân bố rộng khẳp vùng nhiệt đới Họ có lẽ có bắt nguồn khống 100 triệu năm trước khu vực Đơng Nam Á Có khoảng 1.100 lồi phân bố 50 chi Tại Việt Nam ghi nhận có khoảng 16 chi với 40 lồi khác Trong đáng ý cà vú sữa (Chrysophyllum caimto)\Ị>, 4] Chủng loại vú sữa Vú sữa Việt Nam có nhiều giong, nhiên người ta chi phân biệt giống với qua màu sắc trái vú sữa trắng, tím, vàng hay nâu Chi có số giống vú sữa đặt tên thơm ngon đặc trưng cùa nó: Vú sữa Lò Rèn: Vú sữa lò rèn đặc sàn cùa vùng đồng sơng Cứu Long, đặc tính ưa nóng thích họp với đất phù sa nên vú sữa nhiều tình Tien Giang, Ben Tre, Vĩnh Long, Đồng Tháp, cần Thơ Cây vú sữa đậu trái đen thu hoạch khoáng thời gian từ 180 - 200 ngày Mùa thu hoạch vú sữa từ tháng 2-3 dương lịch hàng năm Cây tuổi cho quanh năm Quả cùa vú sữa trịn, có lớp vị màu tía nâu ánh lục chín, thường có màu xanh lục xung quanh đài hoa, với kiểu hình cùi thịt Có vài giong cho quà màu trang ánh xanh lục Các hạt dẹt có màu nâu nhạt cứng Lớp cùi thịt cùa ăn ngon, dùng làm tráng miệng Vú sữa có vị ngọt, hay phục vụ dạng tươi làm lạnh (khoảng 10-15 °C) Cây giong tốt cho suất đạt từ 1000 1500quà/cây từ năm tuổi trở lên Trọng lượng lớn đạt trung bình 200- 300gam/quả Vú sữa Bơ Hồng: Thích nghi với nhiều vùng sinh thí hậu nhiệt đới, sinh trưởng phát triển tốt nhiệt độ 18- 35°c, cao độ thích hợp 800m, lượng mưa 1500mm trở lên phân bố Chịu úng hạn Trong sau 2,5 năm có the cho hoa trái Dạng trái dài, nhở trung bình, Trọng lượng bình quân 200- 250 gam/trái vỏ trái chín mỏng, màu tím hong, hạt, thịt ngon, thanh, mem có vị béo giống bơ Giá vú sữa Bơ Hong có giá cao loại vú sữa khác, nguyên nhân giống vú sữa cho trái ket vào đầu vụ Vú sữa Bơ cho doanh thu cao 300-420 triệu/ha Có the xen ổi, qt, cam, ca cao đe tãng thu nhập đơn vị canh tác Vú sữa Bắc Thảo: Cây vú sữa có tốc độ sinh trưởng Nhanh Phù họp với: điều kiện nhiệt đới nhiệt độ 22-34 °C, chi hoa tốt điều kiện có hai mùa mưa nắng phân biệt khơng chịu gió to có tán dày rề nông, đất phù sa ven sơng, đất thịt nhẹ, nước tốt, chua, pH 5,5-6,5, cao độ không 400m Cây vú sữa trồng bang cách chiết nhánh tháp Khi châm bón cẩn thận khoảng sau nãm sau thu hoạch Cây vú sữa đậu trái đen thu hoạch khoáng thời gian từ 180 đen 200 ngày Mùa thu hoạch vú sữa từ tháng 2-3 dương lịch hàng năm Vú sửa trang: Vú sữa trang có trái nhỏ, chín có màu xanh lục q có nhíu mũ Vì the vú sữa trắng không ưu chuộng thị trường nên khơng có giá trị cao loại vú sữa khác Vú sữa trắng trồng số lượng để làm kiếng Vú sữa Hoàng Kim (vú sữa Abiu): Vú Sữa Hoàng Kim (vú sữa vàng Đài Loan) hay cịn gọi vú sữa Abiu, q ln có hạt nằm quả, vỏ quà mỏng, thịt dày thơm ngon Vú sữa hồng kim có the cao từ 0,9 - l,2m sau tháng với việc tưới nước thường xuyên bón phân cách Sau năm, cao tới 3-4,5m Vú sữa Mica: Cây trái sau năm trong từ ghép, chiết Cây trưởng thành từ 220m, tàn 2-6m Trái to: 700-800g/trái (tùy điêu kiện chăm sóc), chín trái có màu tím đẹp mắt, khơng có mũ., vị giịn ngọt, vỏ mịng ãn chì can gọt bỏ vỏ bên ngồi Đặc điểm sinh thái Cây vú sữa trồng hầu het vùng đất Việt Nam, nhiên vú sữa nhiều miền Nam phù họp với khí hậu đây, tinh Tiền Giang, Đồng Tháp, Ben Tre, Cần Thơ, Cà Mau Cây vú sữa phù họp với điêu kiện nhiệt đới nhiệt độ 22 - 34 °C, hoa tốt điều kiện có hai mùa mưa nắng phân biệt khơng chịu gió to có tán dày rề nơng, phát triền tốt đất phù sa ven sông, đất thịt nhẹ, nước tốt, chua, pH 5,5 - 6,5, cao độ không 400 m Cây vú sữa cách chiết nhánh ghép cành Khi chăm bón cẩn thận khoảng sau năm sau thu hoạch Cây vú sữa đậu trái đen thu hoạch khoáng thời gian từ 180 - 200 ngày[5] Noi phân bố Vú sữa lần ghi nhận nhà thám hiểm người Tây Ban Nha Pedro Cieza de Leon Peru sách mang tên Chronicle of Peru cùa ông vào năm 1500 Hạt giống cùa du nhập vào Hawaii vào nám 1901 vào Florida vào khoáng năm 1887 Sau the kỳ 20, vú sữa bắt đầu du nhập đen vùng cùa Châu Á Châu Phi Cũng có ghi chép cho rang vú sữa có nguồn gốc từ Trung Mỳ Tây Àn Độ Ngày vú sữa phân bố nhiều nơi khu vực xung quanh vùng biển Caribbean, Trung Mỳ, khu vực phía bắc Nam Mỳ, úc số quốc gia Đông Nam Á Châu Phi [1, 2]cụ thể số nước Zanzibar, Cuba, Việt Nam, Philippines, Bêlarut, Nigeria, Peru Argentina Với phong phú vùng phân bố minh chứng cho đa dạng địa lý vú sữa Rất quốc gia chọn vú sữa làm loại trái thương mại, Việt Nam nước chọn vú sữa làm loại trái xuất khẩu[6] Tại Việt Nam, vú sữa nhiều mien Nam, tinh Tiền Giang, Đồng Tháp, Ben Tre, Can Thơ, Cà Mau, Sóc Trăng nhiều tinh thành mien Trung, miền Bắc 3/ Đánh giá tính hiệu quà cùa chị thị SCoT việc phân biệt cá thê cùa giơng vú sữa Tím mầu thu ngẫu nhiên Viện Cây Ăn Quà Miền Nam kết hợp với số nhà vườn Chti nhiệm đề tài 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Morton, J.F and C.F Dowling, Fruits of warm climates Vol 20534 1987: JF Morton Miami, FL Watson, L and M.J Dallwitz, The families of angiosperms: automated descriptions, with interactive identification and information retrieval Australian Systematic Botany, 1991 4(4): p 681-695 Bremer, K , e Friis, and B Bremer, Molecular phylogenetic dating of asteridflowering plants shows early Cretaceous diversification Systematic Biology, 2004 53(3): p 496505 Smedmark, J.E., u Swenson, and A.A Anderberg, Accounting for variation of substitution rates through time in Bayesian phylogeny reconstruction of Sapotoideae (Sapotaceae) Molecular Phylogenetics and Evolution, 2006 39(3): p 706-721 Morton, J.F., Crops Fruits Of Warm Climates 2004 Minh, T Việt Nam-nước xuất khấu quà vú sữa vào thị trường Mỹ 2017 Thành, N.Đ., DNA marker techniques in study and selection ofplant Tap Chi Sinh Hoc, 2015 36(3): p 265-294 Collard, B.c and D.J Mackill, Start codon targeted (SCoT) polymorphism: a simple, novel DNA marker technique for generating gene-targeted markers in plants Plant molecular biology reporter, 2009 27(1): p 86 Luo, c., et al., Analysis of diversity and relationships among mango cultivars using Start Codon Targeted (SCoT) markers 2010 38: p 1176-1184 Luo, c., et aL, Genetic diversity of mango cultivars estimated using SCoT and ISSR markers Biochemical Systematics and Ecology, 2011 39(4): p 676-684 Chai, X., et al., Optimizing Sample Size to Assess the Genetic Diversity in Common Vetch (Vicia sativa L.) Populations Using Start Codon Targeted (SCoT) Markers Molecules, 2017.22(4) Gajera, H.P., et al., Molecular characterization and genetic variability studies associated with fruit quality of indigenous mango (Mangifera indica L.) cultivars Plant Systematics and Evolution, 2013 300(5): p 1011-1020 Guo, D.L., J.Y Zhang, and C.H Liu, Genetic diversity in some grape varieties revealed by SCoTanalyses Mol Biol Rep, 2012 39(5): p 5307-13 Que, Y., et al., Genetic Analysis of Diversity within a Chinese Local Sugarcane Germplasm Based on Start Codon Targeted Polymorphism 2014 2014: p 468375 Zeng, B., et al., Genetic diversity of orchardgrass (Dactylìs glomerata L.) germplasms with resistance to rust diseases revealed by Start Codon Targeted (SCoT) markers 2014 54: p 96-102 Feng, s., et al., Start codon targeted (SCoT) and target region amplification polymorphism (TRAP) for evaluating the genetic relationship ofDendrobium species Gene, 2015 567(2): p 182-8 Al-Qurainy, F., et al., SCoT marker for the assessment ofgenetic diversity in Saudi Arabian date palm cultivars 2015 47: p 637-643 Talebi, R and F Fayaz, Geographical diversity pattern in Iranian landrace durum wheat (Triticum turgidum) accessions using start codon targeted polymorphism and conserved DNA-derivedpolymorphism markers 2016 14 Chai, X., et al., Optimizing Sample Size to Assess the Genetic Diversity in Common Vetch (Vicia sativa L.) Populations Using Start Codon Targeted (SCoT) Markers 2017 22 32 20 21 22 23 24 25 Guo, Y., et al., Genetic diversity ofBletilla striata assessed by SCoT and IRAP markers 2018 155 Collard, B and D Mackill, Start Codon Targeted (SCoT) Polymorphism: A Simple, Novel DNA Marker Technique for Generating Gene-Targeted Markers in Plants 2009 27: p 86-93 Agarwal, A., et al., Assessment ofgenetic diversity in 29 rose germplasms using SCoT marker Journal of King Saud University - Science, 2018 Petersen, J.J., I.M Parker, and D Potter, Origins and close relatives of a semi­ domesticated neotropical fruit tree: Chrysophyllum cainito (Sapotaceae) Am J Bot, 2012 99(3): p 585-604 Petersen, J.J., I.M Parker, and D Potter, Domestication of the neotropical tree chrysophyllum cainito from a geographically limited yet genetically diverse gene pool in Panama Ecol Evol, 2014 4(5) Que, Y., et al., Genetic analysis of diversity within a Chinese local sugarcane germplasm based on start codon targeted polymorphism Biomed Res Int, 2014 2014: p 468375 33 PHỤ LỤC Phụ lục L Nil M2 M3 M4 M5 M6 M8 M9 £0 M1ÌM12NÍÌ3.MĨ4 ứl5 Ảnh Sản phẩm PCR mồi SCoTOl L Mi M2 M3 M4 ì Ml M2 M3 M4 M5 M6 MS M9 ỉẳo Mil MĨ fỊĩ3.híl4 M15 Ánh Sản phẩm PCR mồi SCoT07 L Ml M2 M3 M4 M5 M6 Ms ÍÍ9 M10 ổll M12 M13 M14 M15 M6 M8 M9 MÌ0Nân412NÍỈ3Níỉ4MT5 SCoTIO SCOĨ09 Anh Sản phẩm PCR mồi SCoTlO Anh Sản phẩm PCR mồi SC0TO9 L' Mĩ NỂ NỔNÙ-' M? N® Nffi SCOĨ14 Anh Sản phẩm PCR mồi SCoT14 Anh Sán phẩm PCR môi SC0TO3 34 35 Phụ lục ÚNG DỤNG CHỈ THỊ SCOT ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SÓ GIÓNG vú SỮA (Chrysophyllum cainito) Ở VIỆT NAM Nguyen Thi Nha, Lê Thị Thanh Nga, Ho Thi Cam Nguyen, Tôn Nu Thuy An, Nguyen Huu Thuan Anh, Tran Hoang Dung, Vu Thi Huyen Trang TÓM TẲT Mười bốn mẫu vú sữa thu thập từ trung tâm giong Việt Nam hệ thống chi thị SCoT vật liệu nghiên cứu sữ dụng nhàm đánh giá tính đa dạng di truyền Ket ghi nhận mồi SCoT có khà khuếch đại band đa hình vú sữa với tổng số band khuếch đại 98 band với 96 band đa hình; SCoTlO moi cho so band band đa hình thấp ngược lại moi SC0TO6 ghi nhận so band/ band đa hình nhiều Đong thời tiến hành phân nhóm mầu giống vú sữa nghiên cửu thành hai nhóm; ngoại trừ mẫu vú sữa Hồng Kim xép vào nhóm riêng 13 mầu vú sữa lại xep chung vào nhóm với độ tương đong lớn 85% Ket cho phù hợp với đặc điểm hình thái sở cho việc xác định cá thể vú sữa nhờ tính đặc trưng cho cá the cùa chị thị SCoT Từ khóa: vú sữa, Start Codon Target, SCoT, đa dạng di truyền, quan hệ di di truyền, chì thị phân tử GIỚI THIỆU Vú sữa (Chrysophyllum cainito) có nguồn gốc vùng nhiệt đới cùa châu Mỳ đào Antilles, chủ yeu nước Án Độ, Campuchia, Thái Lan, Việt Nam [l, 2], hầu hết tiêu thụ khu vực nội địa Việt Nam nước the giới chọn trái vú sữa làm hàng hóa xuất khấu giá trị dinh dưỡng giá trị kinh tế mà mang lại[6] Ở Việt Nam có số giống dien hình như: vú sữa Lị Rèn, vú sửa Vĩnh Kim, vú sữa bách thào nâu, vú sữa trắng Bên cạnh việc lựa chọn bảo tồn cá thể mang tính trạng tốt việc phân loại để có hướng khai thác phát triển nguồn tài nguyên càn thiết Tuy nhiên, chưa có hệ thống phân loại giong vú sữa hồn chình nhằm phục vụ cho việc khai thác gen quý, xác định truy nguyên nguồn gốc giống vú sữa bày bán thị trường Ngoài ra, việc nhận diện giống vú sữa dựa vào đặc điểm hình thái, chất lượng, màu sắc, hình dạng cịn nhiều khó khăn chúng có tương đồng cao phụ thuộc 36 chù yếu vào kinh nghiệm, lịch sù lai tạo, cắt ghép, khu vục điạ lí Đồng thời nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử vú sữa thực chưa phổ biến Kỳ thuật chì thị phân tử đặc biệt thị DNA lúc ứng dụng rộng rãi nghiên cứu di truyền Trong so thị DNA, chi thị phân từ ScoT (Start Codon Target) kỳ thuật có lợi thể bật việc ứng dụng trực tiếp vào chọn giống Chỉ thị SCoT kỳ thuật đơn giản dựa phương pháp PCR nhân vùng trình tự chứa ba mở đầu ATG[8, 9] Chì thị SCoT biết đến khả cho đa hình cao, thực phàn ứng PCR cá rõ thông tin trình tự đoạn gen mục tiêu, sừ dụng việc đánh dấu gen phục vụ nghiên cứu chuyên sâu ve gen chức có liên quan trực tiếp đen gen mà hóa tính trạng Hơn het, thị SCoT ứng dụng thành công nhiều loại thực vật khác xoài [12], nho [13], lúa mì [18], đậu [19], phần chứng minh tính ứng dụng rộng rãi cùa chị thị Chính đề tài “úng dụng chi thị SCoT đánh giá đa dạng di truyền số giống vú sữa (Chrysophyllum cainito) Việt Nam” thực góp phần cho cơng tác phân loại giống vú sữa trồng phổ biến khu vực thị phân tứ, đồng thời làm sở cho việc lựa chọn thị đe nhiên diện đầu dòng so giống phục vụ tiêu dùng nước xuất khau VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Thu mẫu vú sữa Các mẫu thu thập tinh khác miền nam Việt Nam, cụ thể Trà Vinh (3 mầu), Vĩnh Long (1 mẫu), Ben Tre (6 mầu), Long An (1 mầu), Tien Giang (3 mầu) Các mẫu liệt kê cụ thể bàng 2.1 Bảng 3.1 Danh sách mầu vú sữa dùng nghiên cứu nr STT Tên mâu Ký hiệu Vú sừa Lò Rèn MI Vú sừa Tím Noi thu mẫu Trung Tâm Giồng Nông nghiệp Trà Vinh, tinh Trà Vinh Trung tâm giông Nông nghiệp Trà Vinh, tinh Trà Vinh Trung Tâm Giồng Cây Trổng Bển Tre Trung tâm giồng Nông nghiệp Trà Vinh, tinh Trà Vinh Trung Tâm Giồng Cây Trổng Bền Tre M2 Vú sữa Tím M3 Vú sữa MiCa M4 Vú sừa Bơ M5 37 Vú sừa Lị Rèn Vú sữa Hồng Kim M6 M7 Vú sừa Lò Rèn M8 Trung Tâm Khuyển Nông Long An Trung Tâm Giồng Cây Trống Bền Tre Trung Tâm Giống Nông nghiệp Trà Vinh, tinh Trà Vinh Viện ăn Miền Nam, tỉnh Tiền Giang Viện ăn Miền Nam, tỉnh Tiền Giang Viện ăn Miền Nam, tỉnh Tiền Giang Trung Tâm Giồng Cây Trồng Bển Tre Trung Tâm Giông Cây Trông Bên Tre Trung Tâm Giống Cây Trồng Bến Tre M9 Vú sữa Lò Rèn Vú sừa Nâu M10 Vú sừa Trằng Ml Vú sừa Tím Bẳc Tháo M12 Vú sữa Bơ Hông M13 M14 Vú sừa Lò Rèn Tách chiêt DNA vú sữa Khừ trùng mẫu dúi vòi nước máy cồn 70%, cắt 0,1 g mầu đựng tube 1.5 ml Bồ 10 11 12 13 14 sung thêm nitơ lỏng giúp phá vỡ thành te bào thực vật mẫu cách tốt Sau đó, mầu tách DNA kit Kit ISOLATE II Plant DNA Kit (50 Preps) cùa hãng BIOLINE, Cat No BIO-52069 Lot No IS506-B054260 có hiệu chinh để phù hợp với điệu kiện thí nghiệm thực te DNA gốc tiến hành định lượng định tính nhằm xác định chat lượng DNA Neu mầu DNA đạt chuẩn chưa sử dụng thi cần trữ mầu -4 °C Thực phản ứng PCR sàng lọc mồi đa hình Nghiên cứu sứ dụng 14 mầu vú sữa thu thập trung tâm giống Việt Nam 16 moi SCoT tham khảo từ nghiên cứu trước [9, 12, 20, 25] cung cấp công ty PHUSA Biochem Co., Ltd Sau ba lần lặp lại với vật liệu nghiên cứu chu trình nhiệt, chi band DNA cho hình ảnh rõ ràng xác định kích thước ghi nhận Mỗi phàn ứng PCR bao gồm 12,5 pl 2X PCR Master Mix ( 50mM Tris-HCl (pH 9.0); 50mM NaCl; 5mM MgC12; 200pM dNTP bao gồm dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 2pl DNA đích, pl primer 9,5 pl nước cất Các phàn ứng PCR thực bang hệ thống Applied Biosystems™ PCR Chu trình nhiệt phản ứng gom: giai đoạn khới đầu phút 94 °C (1 chu kỳ); giai đoạn biến tính bao gồm biến tính ( 45 giây 94 °C), gan moi (60 giây 52 °C) kéo dài (60 giây 71 °C) lặp lại 40 chu kỳ; giai đoạn kẻo dài cuối phút 72 °C [9] Tất sản phẩm PCR nhuộm mày với 6X gelRed (DD-012) sau hiển thị gel agarose 2% với buffer TBE 0,5X ánh sáng cùa hệ thống đèn uv, Bảng 2.1 Danh sách mồi SCoT sứ dụng nghiên cứu Tên Primer Trình tự (5' to 3') Tham khảo Tên Primer Trình tự (5' to 3') SCoTl CAACAATGGCTACCACCA Luo SCoT9 CAACAATGGCTACCAGCA 38 Tham khảo Luo SCoT2 SCoT3 SCoT4 SCoT5 SC0T6 SCoT7 SC0T8 CAACAATGGCTACCACCC CAACAATGGCTACCACCG CAACAATGGCTACCACCT CAACAATGGCTACCACGA CAACAATGGCTACCACGC CAACAATGGCTACCACGG CAACAATGGCTACCACGT Gajera Luo Yan Gajera Gajera Yan Yong SCoTIO SCoTll SCoT12 SCoT13 SCoT14 SCoT15 SC0TI6 CAACAATGGCTACCAGCC AAGCAATGGCTACCACCA ACGACATGGCGACCAACG ACGACATGGCGACCATCG ACGACATGGCGACCACGC ACGACATGGCGACCGCGA ACCATGGCTACCACCGAC Yan Yong Yong Yan Gajera Yong Gajera Phân tích kết Chỉ band DNA cho hình ảnh rõ ràng có tính lặp lai cao sau ba lần lặp ghi nhận két cho phân tích Tại locus mà band DNA xuất ghi ngược lại không thấy xuất band Các kết thống kê sau phân tích bang phần mem NTSYSpc 2.02e để xây dựng ma trận tương đồng hệ số SM Từ ma trận này, tiến hành xây dựng moi quan hệ di truyền mầu giong vú sữa bàng cách sử dụng phương pháp UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical averages) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sàng lọc tính đa hình mồi SCoT Tiến hành phản ứng khuếch đại 14 mẫu DNA vú sữa với 16 moi SCoT sữ dụng nghiên cứu, sử dụng DNA Ladder hãng BIOLINE để làm thang chi thị Kết ghi nhận moi có tính đa hình cao khả lặp tốt sau ba lan lặp lại phản ứng, moi cho so band không rõ, không đũ điều kiện đe xác định tính đa hình hay đơn hình 39 t: sr St3^M4 Mi Mt M? MB MS Mjl Mil Mil Ml J Ml sn MW 1500: IWO 1500 1000 Mt- HI- SCoTH I Ml •*' J Mi M3 — — w — i w w MS M? wo Mil M12 MU MM — W C“ K •Ị" 1W — low — WD — WO — SÍ0ĨỒ6 Hình 3.2 Sản phẩm PCR mồi SCoT04, SCoT02, SC0TO6, SC0TO8 14 mẫu vú sữa Kết phân tích cho thấy tổng số mồi SCoT đa hình, ghi nhận tổng cộng 96 band với 94 band đa hình đạt tỷ lệ 97,92% Trong tồng số mồi SCoT khuếch đại, SC0TO6 moi cho so band đa hình nhiều (17 band), SCoTlO moi cho so band đa hình thấp (4 band) Các mồi cịn lại có so band cho dao động từ đen 16 band, so band trung bình ghi nhận cho moi 18,25 Bảng 3.3 Danh sách mồi đa hình ghi nhận Tên mồi Trình tự (5’ to 3’) SCoTOl SC0TO2 SC0TO4 SC0TO6 ScoT07 SC0TO8 SCoT09 SCoTlO SCoT14 CAACAATGGCTACCACCA CAACAATGGCTACCACCC CAACAATGGCTACCACCT CAACAATGGCTACCACGC CAACAATGGCTACCACGG CAACAATGGCTACCACGT CAACAATGGCTACCAGCA CAACAATGGCTACCAGCC ACGACATGGCGACCACGC 40 Tổng số Band 10 14 16 17 09 11 07 06 08 Band đa hình 10 14 16 17 09 11 07 04 08 Tỷ lệ đa hình 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 66,67% 100% Tông cộng Lớn Nhỏ Trung bình 98 17 06 18,25 - - - - 96 17 04 17.75 - - - - Mồi SCoT03 kết cùa Luo’s [9] cho 100% band đa hình khuếch đại DNA xồi, nhiên nghiên cứu này, moi SCoT03 khuếch đại mầu DNA vú sữa cho ket đơn hình 100% Moi SC0TO6 moi ghi nhận nhiều band đa hình (17 band đa hình/ 17 band, tỳ lệ đa hình 100%), kết q cùa Luo[9], mồi chì ghi nhận band với band đa hình (tỷ lệ đa hình 62,5%); với kết quà Que [25], moi ghi nhận band với tỷ lệ đa hình 100% Điều thêm khắng định thị SCoT có tính đặc trưng cấp độ cá the cho lồi Phân tích đa dạng di truyền mẫu giống vú sữa Phân tích ma trận tương đong cho thấy độ tương đong cặp mầu có khác biệt lớn với hệ so tương đong dao động từ 0,793 đen 0,935 Trong cặp mầu có hệ số tương đong cao đa số có nguồn gốc từ chung loài mầu từ lồi khác có hệ số tương đong thấp Cụ thế, cặp mầu có độ tương đong cao Tim-2 (vú sữa tím) Timmica (vú sữa mica) với hệ số tương đồng 0,935 Từ đặt giả thuyết mầu Tim-2 Tim-mica có nguồn gốc xuất phát từ đầu dòng cá hai mầu thu địa điểm Cặp mẫu có độ tương đồng thấp Trang (vú sữa trắng) Hoang-kim (vú sữa Hoàng Kim) với hệ số tương đong 0,793 vú sữa trắng vần thuộc chi Chrysophyllum Cainito vú sữa Hoàng Kim thuộc chi Pouteria [1], hai giong có khác nên két phân tích ma trận tương đong phù hợp với thực te Phương pháp phân nhóm UPGMA chia 14 mẫu vú sữa thành hai nhóm riêng biệt diem tương đong 0,82 Trong nhóm I bao gom 13 mầu (trừ mầu Hoang-kim), nhóm II chứa mẫu Hoang-kim (vú sữa Hồng Kim) Giải thích cho ket quà này, vú sữa hoàng kim dù họ Sapotaceae với vú sữa Việt Nam lại thuộc chi Pouteria [1] hầu hết vú sữa Việt Nam xuất phát từ chi Chrysophyllum, ket phân tích di truyền SCoT cung cấp khơng he mâu mà cố cho hệ thống phân loại vú sữa chung 41 MI M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 Mil M12 M13 M14 MI 1.000 0.808 0.839 0.843 0.866 0.908 0.801 0.935 0.897 0.889 0.824 0.854 0.881 0.920 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 1.000 0.916 0.904 0.820 0.862 0.824 0.828 0.828 0.805 0.831 0.893 0.858 0.828 1.000 0.935 0.835 0.893 0.824 0.851 0.843 0.858 0.862 0.893 0.897 0.843 1.000 0.839 0.889 0.828 0.870 0.877 0.862 0.820 0.889 0.900 0.877 1.000 0.851 0.820 0.862 0.877 0.893 0.889 0.835 0.877 0.916 1.000 0.808 0.920 0.881 0.866 0.854 0.854 0.912 0.912 1.000 0.820 0.835 0.805 0.793 0.847 0.828 0.820 1.000 0.908 0.862 0.828 0.820 0.885 0.931 1.000 0.893 0.889 0.858 0.893 0.900 M10 Mil M12 M13 M14 1.000 0.874 0.858 0.931 0.877 1.000 0.839 1.000 0.866 0.904 1.000 0.820 0.828 0.877 1.000 Hình 3.2 Ma trận tương đồng cùa 14 mẫu vú sữa với mồi SCoT đa hình dựa hệ số SM ( Thứ tự từ MI đến MI4 tương ứng với thứ tự mẫu sau: Lo-ren-ỉ, Tim-1, Tim-2, Tim-mỉca, Bo, Lo-ren-2, Hoang-kim, Lo-ren-3, Lo-ren-4, Nau, Trang, Tim-bac-thao, Bo-hong, Lo-ren-5} Trong nhóm I, 13 mẫu vú sữa phân thành hai nhóm phụ IA IB hệ so tương đồng 0,85 Trong nhóm IA, mầu vú sữa Lò Rèn phân nhánh nam gần với độ tương đong lớn 90%, cặp mẫu Lo-ren-1 Lo-ren-3 có độ tương đong di truyền lớn 93%, chúng điều giong vú sữa Lị rèn có giong đặc điếm lá, quà, nên có hệ số tương đồng cao phù hợp với đặc điềm tự nhiên Bốn mầu lại Nau (vú sữa nâu), Bo (vú sữa Bơ), Bo-hong (vú sữa Bơ Hong) Trang (vú sữa trang) nam hai nhánh riêng biệt, Nau Bo-Hong có độ tương đong gan với nhánh cũa mầu vú sữa Lị Rèn hơn, mẫu Bo Trang lại phân nhánh riêng biệt, chứng tỏ chúng có nguồn gốc khác ve vị trí địa lý, điều kiện khí hậu nên chúng khác ve mặt hình thái đặc diem Ket cho kết bị ảnh hưởng SCoT có tính khuếch đại ngẫu nhiên đoạn gen mà khơng phải tồn hệ gen số lượng moi khảo sát chưa lớn Nhóm IB gồm mẫu Tim-1, Tim-2, Tim-mica, Tim-bac-thao chia sẻ với 90% độ tương đong, mầu Tim-2 Tim-mica có độ tương đong cao 93% Từ kết quà có the thấy cà mầu vú sữa có khả nâng xuất phát từ chung đầu dòng từ đầu dịng có quan hệ di truyền chặt chẽ với nhóm IIA có mầu vú sữa Hoàng Kim với khoảng cách tương đong 82%, loại vú sữa nhập ngoại nên có khác biệt rõ rệt màu sac quà (quà có màu vàng khác biệt với mẫu vú sữa cịn lại), hình dạng dài khác so với mầu vú sữa Việt 42 Nam có lâu Nên kết quà sơ đồ quan hệ di truyền phù hợp với đặc điểm hình thái mầu vú sữa tự nhiên Hình 3.3 Sơ đồ quan hệ di truyền 14 mầu vú sữa với mồi SCoT đa hình Đa hình giúp nhận diện cá thể SCoT thị đa hình cao cấp độ riêng lẻ, điều thể rõ cách khuếch đại band khác cho cá the giống Ket phân tích cho thấy, SCoT có khà khuếch đại band đa hình đặc trung riêng biệt xuất cá thể mà khơng xuất cá khác, dù có mức độ đặc trung Cụ thể mồi SCoT02 xác định mẫu giống M2 vị trí 800bp; SC0TO4 moi xác định nhiều giống với M3 M4 ( cà hai mẫu giong hai vị trí 700 bp 850 bp) M7 ( hai vị trí 1500 bp 1700 bp); SCoT07 dùng để xác định hai mẫu M7 M10 vị trí 1400 bp; SC0TO8 SC0TO9 xác định mầu M7 hai vị trí 1200 bp 900 bp Như vậy, dựa kết quà này, hai mầu vú sữa tím hồn tồn phân biệt rõ ràng nhờ mồi SC0TO2 SC0TO4 hệ thống chì thị SCoT Bảng 0.1 Danh sách thị SCoT sữ dụng đe chi định Tên mồi SC0TO2 SCoT04 Giống Kích thước M2 M3 M4 M7 800 bp 700 bp; 850 bp 700 bp; 850 bp 1500 bp; 1700 bp 43 SCoT07 SC0TO8 SCoT09 M7 M10 M7 M7 1400 bp 1400 bp 1200 bp 900 bp Những điểm sờ để đánh giá đa dạng di truyền cá thể xác định cá the giống Nghiên cứu đưa tiềm lớn đe truy tìm nguồn gốc sản phẩm vú sữa việc kinh doanh quàn lý chất lượng KẾT LUẬN Hệ thống thị SCoT chứng minh tính hiệu có khả khuếch đại đoạn trình tự vú sữa mà không cần cung cấp thông tin trình tự cùa lồi khả nhận diện cá thể cùa giống dựa vùng trình tự có tính bảo tồn cao xung quanh ba mở đầu ATG Trong nghiên cứu này, chúng tơi tìm moi SCoT có khà khuếch đại band đa hình từ giong khác Mã hóa xây dựng phát sinh giống vú sữa với mức độ tương đong di truyền lớn 79% Trong giong vú sữa có khoảng cách di truyền gần xep chung vào nhóm ngược lại; ngoại trừ mầu vú sữa hoàng kim xép vào nhánh riêng giong có nguồn gốc du nhập vào Việt Nam từ Đại Loan, 13 mầu lại xếp vào nhánh sau tiếp tục phân thành cách nhánh nhỏ the chi tiết mối quan hệ di truyền cá the mẫu riêng biệt Ket quà tính xác hiệu quà liệu phân tữ cung cấp hệ thong SCoT truy nguyên nguồn gốc chúng Ngoài hệ thong SCoT cịn cung cấp cho chúng tơi band đa hình mở sử dụng để phân biệt nhận biết cá thể khác Kết kết hợp với nghiên cứu kiểu hình nhàm phân biệt truy nguyên giống xồi có nguồn gốc khơng rõ ràng 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 11 Morton, J.F and C.F Dowling, Fruits of warm climates Vol 20534 1987: JF Morton Miami, FL Watson, L and M.J Dallwitz, The families of angiosperms: automated descriptions, with interactive identification and information retrieval Australian Systematic Botany, 1991 4(4): p 681-695 Minh, T Việt Nam-nước xuất khâu vú sữa vào thị trường Mỹ 2017 Collard, B.c and D.J Mackill, Start codon targeted (SCoT) polymorphism: a simple, novel DNA marker technique for generating gene-targeted markers in plants Plant molecular biology reporter, 2009 27(1): p 86 Luo, c., et al., Analysis of diversity and relationships among mango cultivars using Start Codon Targeted (SCoT) markers 2010 38: p 1176-1184 Gajera, H.P., et al., Molecular characterization and genetic variability studies associated with fruit quality of indigenous mango (Mangifera indica L.) cultivars Plant Systematics and Evolution, 2013 300(5): p 1011-1020 Guo, D.L., J.Y Zhang, and C.H Liu, Genetic diversity in some grape varieties revealed by SCoTanalyses Mol Biol Rep, 2012 39(5): p 5307-13 Talebi, R and F Fayaz, Geographical diversity pattern in Iranian landrace durum wheat (Triticum turgidum) accessions using start codon targeted polymorphism and conserved DNA-derivedpolymorphism markers 2016 14 Chai, X., et al., Optimizing Sample Size to Assess the Genetic Diversity in Common Vetch (Vicia sativa L.) Populations Using Start Codon Targeted (SCoT) Markers 2017 22 Que, Y., et al., Genetic analysis of diversity within a Chinese local sugarcane germplasm based on start codon targeted polymorphism Biomed Res Int, 2014 2014: p 468375 Guo, Y., et al., Genetic diversity of Bletilla striata assessed by SCoT and IRAP markers 2018 155 45 ... úng dụng chi thị SCoT đánh giá đa dạng di truyền số giống vú sữa (Chrysophyllum cainito) Việt Nam Thòi gian đăng ký : Từ ngày đến ngày Thòi gian nộp báo cáo: Ngày MỞ ĐẦU Vú sữa (Chrysophyllum cainito). .. [18], đậu [19], phần chứng minh tính ứng dụng rộng rãi cùa chị thị Chính đề tài “úng dụng chi thị SCoT đánh giá đa dạng di truyền số giống vú sữa (Chrysophyllum cainito) Việt Nam? ?? thực góp phần cho... Trang, ứng dụng thị SCoT đánh giá đa dạng di truyền số giống vú sữa (Chrysophyllum cainito) Việt Nam Đào tạo: 01 sinh viên (hồn thành Khóa luận tốt nghiệp chuyên ngành CNSH, tháng 7/2020) Nguyền Thị