TÓM TẮT NỘI DUNG Nội dung được thực hiện nhằm đánh giá khả năng kiểm soát sinh học Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính AHPND của thực khuẩn thể.. Do đó việc nghiên
Thu thập mẫu
Mẫu nước tôm được lấy ở các tỉnh Tiền Giang, Kiên Giang, Bình Thuận, Trà Vinh.
Chủng vi khuẩn
Chủng Vibrio parahaemolyticus được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công Nghệ Vi Sinh Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh.
Môi trường – hóa chất
− Tryptone Soya Broth (TSB), Tryptone Casein Soy Agar (TSA)
− Các muối khoáng: NaCl, nước cất, nước muối sinh lý 0.85 %.
Thiết bị - dụng cụ
− Cỏc loại micropipette và đầu tớp tương ứng (100 - 1000 àL, 20 - 200 àL)
− Một số dụng cụ khác bao gồm: đèn cồn, que cấy vòng, que cấy trang, que cấy mốc
Sơ đồ 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm Đánh giá khả năng kiểm soát sinh học
Vibrio parahaemolyticus của thực khuẩn thể
Hoạt hóa chủng trên TSB + 3
Phân lập các thực khuẩn thể phân giải vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
Tinh sạch thực khuẩn thể
Phân lập thực khuẩn thể có khả năng phân giải vi khuẩn Vibrio
2.4.1.1 Địa điểm lấy mẫu và cách lấy mẫu Địa điểm lấy mẫu
Mẫu được lấy nước từ ao nuôi tôm ở các tỉnh Tiền Giang, Bình Thuận, Kiên Giang, Trà Vinh
Cách lấy mẫu: lấy nước ở tần đáy ao, độ sâu tối thiểu xuống khoảng 1,2m và dựa vào TCVN 6663-1:2011 (ISO 5667-1:2006)
Bảo quản mẫu : Mẫu sau khi thu về bảo quản ở nhiệt độ 25 0 C
• Hút 2 mL dung dịch mẫu cho vào 10mL môi trường TSB + 3 % NaCl ủ 37 o C / 24 giờ, sau khi ủ hút 4 mL dung dịch cho vào ống Facol 15mL đem đi vortex
• Ly tâm 6000 vòng/ 10 phút thu dịch nổi Sau đó, lọc qua màng lọc 0,2 μm
Để đếm khuẩn lạc Vibrio parahaemolyticus, có thể dùng 0,1 ml dịch huyền phù vi khuẩn (108 CFU/ml) cho vào đĩa petri, sau đó thêm khoảng 10 - 12 ml môi trường TSB chứa 0,6% agar, lắc đều đĩa petri để hỗn hợp đồng đều Hoặc, có thể hút 200 μL dịch khuẩn trải đều trên đĩa thạch TSA chứa 3% NaCl (Võ Văn Nha và cộng sự, 2014).
Đánh giá khả năng kiểm soát sinh học Vibrio parahaemolyticus của thực khuẩn thể
2.4.2 Đánh giá khả năng kiểm soát sinh học Vibrio parahaemolyticus của thực khuẩn thể
Tiến hành khảo sát khả năng kiểm soát sinh học Vibrio parahaemolyticus của Bacteriophage bằng phương pháp thạch hai lớp (Kropinski và cs., 2009)
Chuẩn bị dịch thử nghiệm:
Chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus được hoạt hóa trên môi trường TSB + 3 % NaCl ở 37 o C/ 16 giờ
• Môi trường TSB (hấp nước cất vô trùng) và môi trường TSA thử nghiệm
• được hấp vô trùng ở 121 o C trong 20 phút
• Môi trường được đỗ đĩa Petri (đường kính 90 mm) với thể tích 15 mL
• Chuẩn bị đĩa môi trường TSB bổ sung 3 % NaCl và 1,7 % agar đã được chấm và đánh số từng thực khuẩn thể
• Cho vào đĩa hỗn hợp gồm 10 ml TSB bổ sung 3 % NaCl và 0,5 % agar và 1 ml huyền phù Vibrio parahaemolyticus để yên đĩa 10 phút
• Hỳt 2 àl từng thực khuẩn thể nhỏ vào ụ chấm tương ứng và ủ ở 37 o C trong 24 giờ Quan sát sự xuất hiện vết tan và đo đường kính vô khuẩn
Đường kính vòng vô khuẩn của các thực khuẩn thể được đo bằng thước đo ở thời điểm 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ sau khi nuôi cấy Mỗi đĩa petri dùng để đo đường kính của 3 vòng vô khuẩn ngẫu nhiên Kết quả được ghi nhận và so sánh để đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của thực khuẩn thể.
Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2013 và được phân tích thống kê bằng phần mềm Stagraphic Plus 3.0.
Tinh sạch thực khuẩn thể
Để tinh sạch các thực khuẩn thể, các khuẩn lạc được phân lập riêng rẽ phải được lấy bằng một vòng vô trùng và cấy vào môi trường nuôi cấy ký chủ thích hợp Sau đó, chúng được nuôi cấy trong một giờ trước khi được ủ trong 6 giờ trong tủ ấm lắc ở 120 vòng/phút Quy trình này sẽ giúp loại bỏ các tạp chất và tinh sạch các thực khuẩn thể.
28 o C và được lọc qua màng lọc 0,45 μm và 0,22 μm Dịch lọc thu được được pha loãng theo dõi và kiểm tra sự hiện diện của các khuẩn lạc Tất cả các bước trên được lặp lại hai lần để thu được các dịch ly giải đồng nhất được tinh chế tốt Sau khi tinh sạch thực khuẩn thể được dán nhãn và bảo quản dưới dạng dự trữ 50% glycerol ở 4°C (Surekhamol và cs.,2014).
Kính hiển vi điện tử
Phương pháp hiển vi điện tử truyền qua (TEM) được sử dụng để xác định đặc điểm của các phage về mặt hình thái Thực khuẩn thể tinh khiết ly giải được cố định bằng
28 chất cố định khác nhau, bao gồm cả 0,5% glutaraldehyde trong 4% paraformaldehyde và chất cố định Kernovsky, được nhuộm bằng 2% uranyl axetat và quan sát dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) (Surekhamol et al., 2014)
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
Chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus được hoạt hóa trên môi trường TSB + 3 % NaCl ở 37 o C/ 16 giờ Tiến hành cấy trên môi trường TCBS khuẩn lạc có màu xanh, hình tròn Sau khi hoạt hóa chủng Vibrio parahaemolyticus tiến hành nhuộm gram cho thấy: gram âm, hình que thẳng hoặc hơi uốn cong, catalase dương tính, kết quả trùng khớp với nghiên cứu trước của Nguyễn Văn Minh, (2014) Kết quả được trình bày cụ thể ở bảng 3.1 hình ảnh khảo sát đại thể và vi thể được trình bày ở hình 3.1
Bảng 3.1 Kết quả phân lập
Mã chủng Đặc điểm đại thể Đặc điểm vi thể Khả năng sinh catalase
Khuẩn lạc màu xanh, hình tròn
Hình que ngắn, xếp riêng lẻ, Gram - +
Hình 3.1 Hình ảnh đại thể (A) và vi thể (B) của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (100X)
3.2 PHÂN LẬP CÁC THỰC KHUẨN THỂ PHÂN GIẢI VI KHUẨN
3.2.1 Kết quả phân lập thực khuẩn thể ở tỉnh Tiền Giang
Kết quả phân lập thực khuẩn thể có khả năng phân giải vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ở Tiền Giang được trình bày ở bảng 3.2 và hình 3.2:
Bảng 3 2 Kết quả thu thập và phân lập mẫu ở Tiền Giang Địa điểm thu mẫu Số lượng thu mẫu Kết quả phân lập
Ghi chú: (-) Không phát hiện, (+) Phát hiện
Hình 3 2 Kết quả phân lập một số mẫu ở Tiền Giang Đối chứng
Sau khi xét nghiệm 25 mẫu nước ao tôm thu thập từ các xã Gia Thuận, Kiểng Phước và thị xã Gò Công (Tiền Giang), các nhà nghiên cứu đã phân lập được 4 mẫu có hiện tượng ly giải của thực khuẩn thể.
3.2.2 Kết quả phân lập thực khuẩn thể ở tỉnh Kiên Giang
Kết quả phân lập thực khuẩn thể có khả năng phân giải vi khuẩn Vibrio parahaemolyticusở Kiên Giang được trình bày ở bảng 3.3 và hình 3.3:
Bảng 3 3 Kết quả phân lập và thu mẫu ở tỉnh Kiên Giang Địa điểm lấy mẫu Số lượng lấy mẫu Kết quả phân lập
Ghi chú: (-) Không phát hiện
Hình 3 3 Hình ảnh phân lập một số mẫu ở Kiên Giang
Từ bảng 3.3 và hình 3.3 cho ta thấy rằng, 10 mẫu nước ao tôm phân lập ở xã Hàm Thuận, huyện An Minh, tỉnh Kiên Giang không phát hiện được thực khuẩn thể
3.2.3 Kết quả phân lập thực khuẩn thể ở tỉnh Bình Thuận
Kết quả phân lập thực khuẩn thể có khả năng phân giải vi khuẩn Vibrio parahaemolyticusở Bình Thuận được trình bày ở bảng 3.4 và hình 3.4:
Bảng 3 4 Kết quả thu thập và phân lập mẫu ở tỉnh Bình Thuận Địa điểm lấy mẫu Số lượng lấy mẫu Kết quả phân lập
Ghi chú: (-) Không phát hiện
Hình 3 4 Hình ảnh phân lập một số mẫu ở Bình Thuận
Từ kết quả bảng 3.5 và hình ảnh 3.5 cho ta thấy rằng, 10 mẫu nước ao tôm phân lập ở thị xã LaGi, tỉnh Bình Thuận không phát hiện được thực khuẩn thể
3.2.4 Kết quả phân lập thực khuẩn thể ở tỉnh Trà Vinh
Kết quả phân lập thực khuẩn thể có khả năng phân giải vi khuẩn Vibrio parahaemolyticusở Trà Vinh được trình bày ở bảng 3.5 và hình 3.5: Đối chứng
Bảng 3 5 Kết quả thu thập và phân lập mẫu ở tỉnh Trà Vinh Địa điểm lấy mẫu Số lượng lấy mẫu Kết quả phân lập
Hình 3.5 Hình ảnh phân lập một số mẫu ở Trà Vinh
Từ kết quả phân lập ở bảng 3.5 và hình 3.5, cho thấy 20 mẫu nước tôm phân lập ở Duyên Hải, tỉnh Trà Vinh thì có 6 thực khuẩn thể được phân lập Nghiên cứu của Lomelí-Ortega và cs (2014) đã nghiên cứu kết quả cho thấy dùng hai loại thể thực khuẩn A3S và Vpms1 có hiệu quả cao trong việc giảm tỷ lệ tôm chết do nhiễm mầm bệnh Vibrio parahaemolyticustrong 6 giờ đầu sau lây nhiễm (Lomelí-Ortega và cs (2014) Từ kết quả của đề tài là tiền đề cho các nghiên cứu bacteriophage kiểm soát sinh học Vibrio parahaemolyticussau này Đối chứng
3.3 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT SINH HỌC Vibrio parahaemolyticus CỦA THỰC KHUẨN THỂ
Kết quả so sánh khả năng kiểm soát sinh học Vibrio parahaemolyticus của thực khuẩn thể được trình bày ở Bảng 3.6 cho thấy, ở 3 thời điểm so sánh, khả năng kiểm soát sinh học Vibrio parahaemolyticus của các dòng TKT có sự khác biệt và đường kính phân giải có chiều hướng gia tăng theo thời gian
Bảng 3.6: Khả năng kiểm soát sinh học Vibrio parahaemolyticus của thực khuẩn thể
Mã chủng Địa điểm phân lập Đường kính phân giải (mm) qua các thời điểm
Vinh 3,73 ± 0.09 a 3,9 ± 0.13 a 4,06 ± 0.06 a TV60 Duyên Hải – Trà
Trong cùng một cột các giá trị có cùng mẫu tự không khác biệt ở mức ý nghĩa 5% qua phép thử Ducan
Từ kết quả đáng giá khả năng kiểm soát sinh học của thực khuẩn thể ở bảng 3.2 cho thấy ở thời điểm 24 giờ, các nghiệm thức đều thể hiện hiệu quả với đường kính phân giải từ 1,26 ± 0.06 đến 3,73 ± 0.09 mm Trong đó, dòng thực khuẩn thể TV57 có đường kính phân giải cao hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê so với các dòng còn lại Ở thời điểm 48h có đường kính phân giải 3,9 ± 0.13 mm cao hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê so với các dòng còn lại và thời điểm 72h thì dòng thực khuẩn thể TV57 đạt 4,06 ± 0.06 mm có đường kính phân giải cao nhất và khác biệt ý nghĩa thống kê so với các dòng còn lại
Kết quả này cho thấy, khả năng kiểm soát sinh học Vibrio parahaemolyticus của từng thực khuẩn thể khác nhau theo từng dòng, dòng thực khuẩn TV57 có khả năng phân giải vi khuẩn mạnh sẽ có triển vọng tốt hơn trong việc ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh Kết quả này nghiên cứu thấp hơn so với nghiên cứu của Stalin
(2016), nghiên cứu đã đánh giá khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus thực khuẩn thể và ghi nhận đường kính phân giải vi khuẩn cao nhất ở 72h là 7,10 mm ± 0.4
3.4 Tinh sạch thực khuẩn thể
Thực khuẩn thể được làm sạch và nuôi cấy trong môi trường TSA + 3% NaCl trong 1 giờ Sau đó, chúng được đánh dấu và lưu trữ dưới dạng dự trữ 50% glycerol ở 4°C.
Nghiên cứu đã phân lập được 10 thực khuẩn thể từ 65 mẫu nước ao tôm thu thập tại các tỉnh Tiền Giang, Kiên Giang, Bình Thuận, Trà Vinh Kết quả sàng lọc cho thấy tiềm năng ứng dụng của thực khuẩn thể trong kiểm soát tác nhân gây bệnh hoại tử gan tụy ở tôm Việc sử dụng thực khuẩn thể có thể giúp giảm tình trạng lạm dụng kháng sinh trong nuôi tôm.
chiếm 2,9% tổng số mẫu Nghiên cứu này đặt nền tảng cho các nghiên cứu tiếp theo về ứng dụng thực khuẩn thể trong kiểm soát sinh học **Vibrio parahaemolyticus**.
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ
Từ 65 mẫu nước tôm đã thu thập được từ các tỉnh Tiền Giang, Kiên Giang, Bình Thuận và Trà Vinh Chúng tôi đã phân lập được 10 thực khuẩn thể gồm TG5, TG10, TG15, TG20, TV46, TV50, TV55, TV57, TV60, TV65 từ tỉnh Tiền Giang và Trà Vinh có hiện tượng ly giải thực khuẩn thể Đánh giá khả năng kiểm soát sinh học Vibrio parahaemolyticus của 10 thực khuẩn thể thì thực khuẩn thể TV57 có khả năng kiểm soát cao nhất ở thời điểm 72 giờ 4,06 ± 0.06 mm
Tinh sạch và bảo quản thực khuẩn thể trong glycerol 50% ở 4 o C
4.2 ĐỀ NGHỊ Để hoàn thiện hơn đề tài nghiên cứu của chúng tôi có những đề nghị để có thể có thêm kết quả tốt hơn:
Kiểm tra thực khuẩn thể bằng phương pháp xem kính hiển vi điện tử Định danh thực khuẩn thể
Tiếp tục phân lập và khảo sát thêm các thực khuẩn thể để tìm ra những thực khuẩn thể có hoạt tính mạnh Từ đó làm tiền đề cho các nghiên cứu sau này nhằm tạo ra chế phẩm vi sinh vừa có hoạt tính sinh học vừa mang lại hiệu quả kinh tế cao và bảo vệ môi trường
