phân lập thực khuẩn thể có khả năng kiểm soát sinh học vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ahpnd ở tôm thẻ chân trắng litopenaeus vannamei

TÓM TẮT NỘI DUNG Nội dung được thực hiện nhằm đánh giá khả năng kiểm soát sinh học Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính AHPND của thực khuẩn thể.. Do đó việc nghiên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH -∞0∞ -

TRẦN THỊ KIỀU HƯƠNG

PHÂN LẬP THỰC KHUẨN THỂ CÓ KHẢ NĂNG

KIỂM SOÁT SINH HỌC Vibrio parahaemolyticus

GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TÍNH (AHPND) Ở TÔM THẺ CHÂN TRẮNG

(Litopenaeus vannamei)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH -∞0∞ -

TRẦN THỊ KIỀU HƯƠNG

PHÂN LẬP THỰC KHUẨN THỂ CÓ KHẢ NĂNG

KIỂM SOÁT SINH HỌC Vibrio parahaemolyticus

GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TÍNH (AHPND) Ở TÔM THẺ CHÂN TRẮNG

ThS DƯƠNG NHẬT LINH

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Độc lập – Tự do – Hạnh Phúc

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là: Trần Thị Kiều Hương

Ngày sinh: 22/10/1999 Nơi sinh: Vĩnh Long Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Nông nghiệp – Môi trường Mã sinh viên: 17530095

Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin đồ án/khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin đồ án/khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

Ký tên

(Ghi rõ họ và tên)

Trần Thị Kiều Hương

Ý KIẾN CHO PHÉP BẢO VỆ ĐỒ ÁN/KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

Giảng viên hướng dẫn: Th.S Nguyễn Văn Minh

Th.S Dương Nhật Linh

Sinh viên thực tập: Trần Thị Kiều Hương Lớp: DH17NN01 Ngày sinh: 03/03/1999 Nơi sinh: Vĩnh Long

Tên đề tài: Phân lập thực khuẩn thể có khả năng kiểm soát sinh học Vibrio

parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) ở tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei)

Ý kiến của giảng viên hướng dẫn về việc cho phép sinh viên: Trần Thị Kiều Hương được bảo vệ đồ án/khóa luận trước Hội đồng:

LỜI CẢM ƠN

Trên thực tế không có sự thành công nào mà không gắn liền với những sự hỗ trợ, giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người khác Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập tại phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh – Trường Đại học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh Từ lúc mới vào phòng còn bở ngỡ cho đến thiếu kinh nghiệm, em đã gặp phải rất nhiều khó khăn nhưng với sự giúp đỡ tận tình của thầy cô và sự nhiệt tình của các anh chị, bạn bè đã giúp em có được những kinh nghiệm quý báu Khoảng thời gian này là khoảng thời gian có ý nghĩa và vui vẻ nhất đối với em Để hoàn thành khóa luận này, em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy cô, anh chị, bạn bè và gia đình

Đầu tiên, Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến thầy Nguyễn Văn Minh và cô Dương Nhật Linh Thầy, Cô đã truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho em trong

suốt thời gian học tập vừa qua Nhờ có những lời hướng dẫn, dạy bảo của thầy cô mà em biết thêm nhiều kiến thức, kinh nghiệm không những trong học tập mà còn trong cuộc sống Thầy, Cô đã cho em biết thêm nhiều điều bổ ích có thể áp dụng vào thực tế

Em xin cảm ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh Quý thầy cô đã hết lòng giảng dạy và truyền đạt những kiến thức quý báu làm nền tảng vững chắc để em có thể hoàn thành tốt công việc của mình

Em xin cảm ơn chị Trần Thị Á Ni và chị Nguyễn Thị Thảo Nguyên đã hết lòng

giúp đỡ em giải quyết các vấn đề gặp phải trong quá trình thực hiện đề tài

Bên cạnh đó tôi xin cảm ơn tất cả các bạn cùng làm thực tập tốt nghiệp chung với tôi ở phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh – Trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh đã bên cạnh giúp đỡ tạo điều kiện để mình hoàn thành tốt đề tài

Cuối cùng, con xin cảm ơn Ba Mẹ người đã sinh thành và nuôi dưỡng con nên người tạo mọi điều kiện cho con học tập và phát triển Ba Mẹ cũng là người luôn ủng hộ,

động viên con trên con đường mà con đã chọn giúp con hoàn thành được việc học của mình.Một lần nữa, em xin gửi đến tất cả các thầy cô, anh chị, bạn bè lời biết ơn và kính chúc sức khỏe, may mắn, gặt hái nhiều thành công trong tương lai

Bình Dương, ngày tháng năm 2020

Trần Thị Kiều Hương

TÓM TẮT NỘI DUNG

Nội dung được thực hiện nhằm đánh giá khả năng kiểm soát sinh học Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) của thực khuẩn thể

Hội chứng gan tụy cấp tính (tên tiếng Anh là Acute Hepatopancreatic Necrosis

Syndrome - AHPNS) do Vibrio parahaemolyticus gây ra đang được quan tâm vì bệnh

có tỷ lệ chết và nhiều thiệt hại kinh tế đến ngành nuôi tôm của thế giới Tình trạng lạm dụng kháng sinh và hóa chất diệt khuẩn đã ảnh hưởng chất lượng tôm xuất khẩu ra các thị trường, ảnh hưởng sức khỏe con người, gia tăng vi khuẩn kháng thuốc tồn tại trong chuỗi thức ăn ảnh hưởng đến con người Do đó việc nghiên cứu để tìm ra những phương pháp hiệu quả trong phòng trừ các bệnh nhiễm khuẩn luôn được nghiên cứu và phát triển, trong đó có liệu pháp thực khuẩn thể (một phương pháp sử dụng thực khuẩn thể để tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh) Đề tài đóng góp giúp phát hiện ra bacteriophage có khả

năng kiểm soát sinh học Vibrio parahaemolyticus, từ đó làm tiền đề cho các nghiên

cứu sau này nhằm tạo ra chế phẩm vi sinh vừa có hoạt tính sinh học vừa mang lại hiệu quả kinh tế cao và bảo vệ môi trường.

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 TÌNH HÌNH NUÔI TÔM TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 5

1.1.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới 5

1.1.2 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam 5

1.1.3 Thiệt hại do bệnh hoại tử gan tụy cấp tính gây ra cho ngành nuôi tôm trên thế giới và ở Việt Nam 6

1.2 BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY EMS/AHPNS TRÊN TÔM 7

1.4.1 Giới thiệu bacteriophage 10

1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ TRONG NƯỚC 20

Phụ lục 1 - THAO TÁC PHÂN LẬP MẪU 53

Phụ Lục 2 – ĐỊA ĐIỂM VÀ SỐ LƯỢNG THU MẪU 56

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả phân lập 30

Bảng 3 2 Kết quả thu thập và phân lập mẫu ở Tiền Giang 31

Bảng 3 3 Kết quả phân lập và thu mẫu ở tỉnh Kiên Giang 33

Bảng 3 4 Kết quả thu thập và phân lập mẫu ở tỉnh Bình Thuận 34

Bảng 3 5 Kết quả thu thập và phân lập mẫu ở tỉnh Trà Vinh 36

Bảng 3.6: Khả năng kiểm soát sinh học Vibrio parahaemolyticus của thực khuẩn thể38

vi

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 25

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 1 Tôm thẻ chân trắng có dấu hiệu nhiễm bệnh Hoại tử gan tụy (A, B) Hình (C, D) là tôm khỏe cho thấy HP có kích thước bình thường Hình (B) và (D) là mẫu lấy từ hai con tôm ở hình (A) và (C) tương ứng (Loc Tran và cs.,

2013) 8

Hình 1 2 Cấu trúc của Bacteriophage (Wikipedia and Morgridge Institute for Reseach) 12

Hình 1.3: Chu trình sinh tan và tiềm tan của thực khuẩn thể 15

Hình 1 4 Các vòng vô khuẩn phage được hình thành với Vibrio parahaemolyticus (N1A) bị nhiễm một phage VPP1 làm giàu bằng thạch hai lớp (A: TCBS; B: thạch dinh dưỡng) (Stalin, N., & Srinivasan, P (2016) 18

Hình 1 5 Ứng dụng của thực khuẩn thể trong nuôi trồng thủy sản và những ưu điểm 19

Hình 3.1 Hình ảnh đại thể (A) và vi thể (B) của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (100X) 30

Hình 3 2 Kết quả phân lập một số mẫu ở Tiền Giang 32

Hình 3 3 Hình ảnh phân lập một số mẫu ở Kiên Giang 34

Hình 3 4 Hình ảnh phân lập một số mẫu ở Bình Thuận 35

Hình 3.5 Hình ảnh phân lập một số mẫu ở Trà Vinh 37

Hình 3 6 Các bước phân lập thực khuẩn thể 55

(+) Phát hiện

LIH LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo tổng cục thống kê, năm 2020 nước ta có tổng sản lượng thuỷ sản ước tính đạt 7,7 triệu tấn, trong đó: sản lượng khai thác 3,5 triệu tấn, sản lượng nuôi trồng thủy sản 4,2 triệu tấn Diện tích tôm thả nuôi ước đạt 725.900 ha Trong đó tôm sú là 616.807 ha; tôm thẻ chân trắng là 109.093 ha Sản lượng ước đạt 790.564 tấn Trong đó tôm sú đạt 254.382 tấn; tôm thẻ chân trắng đạt 536.182 tấn Mặc dù sản lượng nông sản tăng nhưng giá xuất khẩu lại sụt giảm mạnh một phần bởi quy trình và kĩ thuật canh tác Tình trạng lạm dụng kháng sinh và hóa chất diệt khuẩn để giảm rủi ro trong nuôi tôm ngày càng nhiều, hậu quả dư lượng kháng sinh ảnh hưởng chất lượng tôm xuất khẩu ra các thị trường, ảnh hưởng sức khỏe con người, gia tăng vi khuẩn kháng thuốc tồn tại trong chuỗi thức ăn ảnh hưởng đến con người Nguyên nhân do người nuôi tôm thường vẫn dùng biện pháp hóa học chủ yếu để có hiệu quả nhanh để phòng trừ bệnh hại hiện nay Biện pháp hóa học sẽ gây nhiều hậu quả nghiêm trọng như gây hại đến các quần thể sinh vật trên đồng ruộng, tiêu diệt sâu bọ có ích, tiêu diệt tôm cá, phá vỡ cân bằng sinh thái (Tổng cục thủy sản, 2020)

Việc nuôi tôm thâm canh và bán thâm canh trong nuôi trồng thủy sản đã làm tăng đáng kể tỷ lệ mắc các bệnh do vi sinh vật gây ra, gây thiệt hại đáng kể về kinh tế cho ngành thủy sản (Fraser, 2005) Một trong các bệnh đáng quan tâm hiện nay là

bệnh hoại tử gan tụy thuộc nhóm Vibrio, trong đó đáng chú ý là vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus Chúng có thể gây bệnh qua tất cả các giai đoạn của tôm nuôi và

được xem là nguồn gốc gây thiệt hại nghiêm trọng trên tôm giống ở các trại sản xuất Nhiều trường hợp nhiễm bệnh đã được phát hiện ở Australia, Ecuador, Ấn Độ, Indonesia, Philippines, Đài Loan và Thái Lan trên nhiều giống tôm khác nhau (Oakey

and Owens, 2000; (Shivu, 2007); Pasharawipas và cs., 2008)

Ở Việt Nam năm 2010, bệnh AHPND được ghi nhận ở các tỉnh như Ninh Thuận (16 ha), Sóc Trăng (1,719 ha), Bạc Liêu (346 ha) và Cà Mau (3,493 ha) (Hien NT và cs., 2016) Sau đó, bệnh này tiếp tục xảy ra và lan rộng đến 19 tỉnh thành năm 2012, 22 tỉnh thành năm 2015, 25 tỉnh thành năm 2017 với diện tích nuôi tôm bị

LIH LUẬN TỐT NGHIỆP

Do đó việc nghiên cứu để tìm ra những phương pháp hiệu quả trong phòng trừ các bệnh nhiễm khuẩn luôn được nghiên cứu và phát triển Thời gian gần đây, liệu pháp thực khuẩn thể (một phương pháp sử dụng thực khuẩn thể để tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh) có từ những năm đầu của thế kỷ 20 được sử dụng trở lại và đã phát huy rất nhiều ưu điểm trong việc chống lại các bệnh nhiễm khuẩn đặc biệt là trong giai đoạn hiện nay khi mà thực trạng người dân lạm dụng, tùy tiện sử dụng kháng sinh nuôi trồng thủy sản một cách tràn lan không theo chỉ dẫn của cơ quan chức năng, dẫn đến lượng kháng sinh tồn dư trong sản phẩm cao, ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng, ảnh hưởng đến hoạt động xuất khẩu Điều trị nhiễm vi khuẩn bằng thực khuẩn thể (phage), thường được gọi là liệu pháp phage, có tiềm năng sử dụng để kiểm soát bệnh trong các hệ thống nuôi trồng thủy sản (Nakai và Park 2002; Park và Nakai 2003; Skurnik và cs 2007)

Theo Pirisi (2000), thực khuẩn thể (TKT) là hiện tượng virus có thể nhân lên trong tế bào vi khuẩn và phá vỡ tế bào vi khuẩn trong thời gian ngắn Theo Balogh (2002), từ những năm 1990, thực khuẩn thể được chứng minh là có hiệu quả kiểm

soát một số vi khuẩn gây bệnh bao gồm Bacillus anthracis, Staphylococcus, Salmonellaspp., Shigella và Vibrio cholerae Bên cạnh đó, Huff cs., (2002) cũng đã thành công trong việc sử dụng thực khuẩn thể điều trị viêm đường hô hấp do E coli

gây ra trên gà thịt tại Mỹ Ở Việt Nam, thực khuẩn thể cũng đã được nghiên cứu trong

nông nghiệp như phòng trừ vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên hoa cúc (Huỳnh Ngọc Tâm và cs., 2017) và vi khuẩn E coli gây bệnh đường ruột trên

gà ( (Mai Huỳnh Dư An, 2016)

LIH LUẬN TỐT NGHIỆP

Vì thế thực khuẩn thể đang là “Chiếc phao cứu sinh” cho những ca bệnh nhiễm vi khuẩn kháng tất cả các loại kháng sinh Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi tiến

hành thực hiện đề tài: “Phân lập thực khuẩn thể có khả năng kiểm soát sinh học

Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) ở tôm thẻ

chân trắng (Litopenaeus vannamei)

Mục tiêu:

Phân lập thực khuẩn thể (Bacteriophage) có khả năng kiểm soát sinh học Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) ở tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei)

Nội dung:

- Phân lập các thực khuẩn thể phân giải vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

- Đánh giá khả năng kiểm soát sinh học Vibrio parahaemolyticus của thực khuẩn thể

- Tinh sạch thực khuẩn thể

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TÌNH HÌNH NUÔI TÔM TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 1.1.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới

Hiện nay, trên thế giới có khoảng 50 nước nuôi tôm (VASEP, 2016) và các vùng nuôi trọng điểm như Đông Nam Á (ĐNA), Trung Quốc, Ấn Độ, Mỹ và Trung Đông (Global Aquaculture Alliance, 2016) Sản lượng tôm thế giới được dự báo tăng trưởng hơn 90 % cho giai đoạn 2010 - 2030, riêng ĐNA sẽ tăng hơn 100% (FAO,

2015) Loài tôm được nuôi phổ biến nhất là tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và kế đến là tôm sú (Penaeus monodon), trong đó tôm thẻ chân trắng đóng

góp sản lượng lớn nhất, chiếm 72 % sản lượng Sản lượng tôm nuôi thế giới có thể đạt 4,44 triệu tấn vào năm 2018 (Global Aquaculture Alliance, 2016) và khoảng 4,49 triệu tấn vào năm 2020 (FAO, 2016) Châu Á sẽ đóng góp 3,65 triệu tấn vào năm 2018, trong đó tăng trưởng chủ yếu là từ Thái Lan, Việt Nam, Indonesia và Ấn Độ (Global Aquaculture Alliance, 2016)

1.1.2 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam

Ở Việt Nam hiện nay có gần 694.645 ha nuôi tôm, trong đó có khoảng 560000 ha nuôi tôm quảng canh cải tiến với năng suất trung bình chỉ 200-350 kg/ha Hình thức nuôi này có thể tăng năng suất cao gấp 3-4 lần nếu áp dụng những giải pháp khoa học công nghệ (KHCN) phù hợp Đối với nuôi tôm thâm canh, năng suất bình quân vẫn còn thấp, khoảng 4 tấn/ha, có thể nâng cao năng suất từ 1,5 đến 2 lần so với hiện tại Thêm vào đó, ngành tôm Việt Nam vẫn còn tiềm năng có thể chuyển diện tích đất sản xuất nông nghiệp kém hiệu quả khoảng 300000 ha sang nuôi tôm để đạt con số 1 triệu ha Ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có tổng diện tích nuôi tôm nước lợ đến năm 2020 là 650000 ha, trong đó: nuôi tôm sú khoảng 560000 ha; tôm thẻ chân trắng là 90000 ha Tổng sản lượng tôm nuôi nước lợ toàn vùng đạt 700000 - 825000 tấn, trong đó: tôm sú đạt 350000 - 375000 tấn, tôm thẻ chân trắng đạt 350000 - 450000 tấn (Viện kinh tế và quy hoạch thủy sản, 2015) Riêng ở Cà Mau, sản lượng tôm nuôi sẽ đạt trên 280000 tấn vào năm 2020

Trong các tháng đầu năm 2020, việc triển khai sản xuất tôm nước lợ gặp nhiều khó khăn do dịch Covid-19 kèm theo tình hình xâm nhập mặn tại các vùng nuôi chủ lực, dẫn đến sản lượng tôm nước lợ, đặc biệt là đối tượng tôm sú bị sụt giảm Đến các

6

tháng cuối năm 2020, tình hình sản xuất tôm nước lợ đã có sự phục hồi khi tình hình dịch bệnh được khống chế, việc xuất khẩu mặt hàng tôm nước lợ được khôi phục đã giúp cho sản lượng tôm nước lợ tăng trưởng khá, tổng sản lượng vượt kế hoạch năm 2020 đã đề ra Năm 2020, Tổng sản lượng tôm nuôi đạt 950000 tấn Trong đó tôm sú đạt 267,7 nghìn tấn, tăng 1 %; tôm thẻ chân trắng 632,3 nghìn tấn, tăng 8,5 % so với cùng kỳ, tôm khác đạt 50000 tấn (Tổng cục Thủy Sản, 2020)

1.1.3 Thiệt hại do bệnh hoại tử gan tụy cấp tính gây ra cho ngành nuôi tôm trên thế giới và ở Việt Nam

Trên thế giới

Theo ước tính của các nhà nghiên cứu thuộc Viện Nuôi trồng Thủy sản Nước lợ Trung ương của Ấn Độ (CIBA), ngành tôm nước này sẽ phải đối mặt với khoản lỗ 1,5 tỉ USD trong giai đoạn 2020-2021 do dịch Covid-19 gây ra (H Mĩ, Ngành tôm Ấn Độ đã vượt qua ảnh hưởng của COVID-19 như thế nào? vietnambiz)

Ở Malaysia bệnh hoại tử gan tụy gây ra tỷ lệ chết trong ao khác nhau, từ 40- 100% trong quần thể nuôi tôm thẻ chân trắng trong giai đoạn từ năm 2011 đến năm 2013 Các đợt bùng phát đã dẫn đến sản lượng tôm thẻ chân trắng giảm 43%, từ 69.853 tấn năm 2010 còn 39,916 tấn vào năm 2011 Ở Mexico, bệnh được báo cáo lần đầu tiên vào năm 2013 Ba bang nơi nuôi tôm được thực hành là Sinaloa, Sonora và Nayarit Ở Sinaloa, vào năm 2015, 16.401 ha trong tổng số 50.310 ha của các vùng nuôi và 74% số trang trại bị ảnh hưởng bởi AHPND Sản lượng ở Sinaloa năm 2012 là 75.841 tấn, giảm hơn 50% xuống 35.652 tấn vào năm 2013 sau đó sự xuất hiện của AHPND (Tang và cs., 2019)

Việt Nam

Theo số liệu báo cáo của Cục Thú y, năm 2020 cả nước có 43.000 ha tôm nuôi bị thiệt hại Trong đó, thiệt hại ở tôm nước lợ là 42.738,81 ha, chiếm 93,83% trong tổng số diện tích tôm nuôi bị thiệt hại

Thiệt hại do dịch bệnh là 6.684,27 ha, chiếm 15,64%, tăng 6,7% so với năm 2019 Thiệt hại do không xác định được nguyên nhân là 32.731,8 ha, chiếm 76,59% trong tổng số tôm bị thiệt hại Thiệt hại do biến đổi môi trường, thời tiết là 3.322,75 ha, chiếm 7,77% trong tổng số tôm nuôi bị thiệt hại Diện tích nuôi tôm thâm canh, bán

thâm canh bị thiệt hại là 9.335,25 ha; quảng canh, quảng canh cải tiến là 32.896,24 ha; còn lại là tôm lúa và các hình thức nuôi khác chiếm 534,32 ha

Các loại mầm bệnh nguy hiểm như bệnh Hoại tử gan tụy cấp (EMS), Đốm trắng (WSSD)… vẫn lưu hành rộng ở nhiều vùng nuôi Cụ thể, với bệnh EMS, Cục Thú y thống kê được 151 xã của 53 huyện, thị xã, thuộc 18 tỉnh thành mắc phải Diện tích tôm mắc bệnh là 2.754,06 ha, chiếm 3,12% diện tích thả nuôi Sóc Trăng là tỉnh chịu thiệt hại nặng nề nhất do EMS gây ra với 1.179,51 ha mắc bệnh (chiếm 42,83% tổng diện tích bị bệnh) Với bệnh WSSD, năm 2020 bệnh xảy ra tại 202 xã của 68 huyện thuộc 22 tỉnh thành Tổng diện tích nuôi bị bệnh là 2.629,39 ha, chiếm 2,18% diện tích thả nuôi tôm của các khu vực có bệnh Trọng điểm nuôi tôm của cả nước, tỉnh Sóc Trăng là nơi có diện tích bị bệnh lớn nhất, chiếm 686,72 ha (26,12% tổng diện

tích bị bệnh) (Phạm Huệ, Tổng quan ngành tôm 2020: Tăng trưởng trong khó khăn,

Người nuôi tôm)

1.2.1 Tình hình dịch bệnh

Hội chứng gan tụy cấp tính (tên tiếng Anh là Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome - AHPNS) hay còn gọi là Hội chứng chết sớm (Early Mortality Syndrome - EMS) xuất hiện lần đầu tiên tại Trung Quốc (2009), Việt Nam (2010), Malaysia (2010) và Thái Lan (2012) đã gây ra những thiệt hại nặng nề cho nghề nuôi tôm Bệnh ảnh hưởng nghiêm trọng đến trang trại nuôi tôm ở Đông Nam Á, ảnh

hưởng lên cả tôm sú (Penaeus monodon) và tôm chân trắng (Penaeus vannamei),

được đặc trưng bởi việc chết hàng loạt (có thể lên đến 100 % trong một số trường hợp) trong 20-30 ngày đầu tiên thả nuôi (sau thả giống trong ao nuôi thương phẩm) Dấu hiệu lâm sàng có thể quan sát được bao gồm: tăng trưởng chậm, bơi xoắn ốc, vỏ mềm, cũng như màu sắc nhợt nhạt Tôm bị ảnh hưởng cũng đều cho thấy dấu hiệu bất thường ở gan tụy (teo tóp lại, nhỏ, sưng hoặc đổi màu) Các tác nhân gây bệnh chính (xem xét bệnh có thể lây bệnh) chưa được xác định, trong khi sự hiện diện của

một số vi khuẩn bao gồm cả vi khuẩn Vibrio, Microsporidians và giun tròn đã được

quan sát thấy trong một số mẫu (Lightner và cs., 2012)

8

Tại Trung Quốc, hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính xuất hiện lần đầu năm 2009 nhưng không được chú ý Đến năm 2011, dịch đã lan rộng ở 4 tỉnh gồm Quảng Đông, Quảng Tây, Phúc Kiến và Hải Nam (Leaño và Mohan, 2012) Tại Malaysia AHPNS/EMS xuất hiện lần đầu vào giữa năm 2010 tại 2 bang Pahang and Joho, sau đó lan ra các bang Sabah và Sarawak (Othman, 2012) Tại Thái Lan các mẫu tôm chân trắng thu tại 2 tỉnh Chantaburi và Rayong vào cuối năm 2011 đầu năm 2012 cho thấy tôm có các dấu hiệu giống Hội chứng AHPNS/EMS (Prachumwat và cs 2012) Ở Việt Nam năm 2010, bệnh AHPND được ghi nhận ở các tỉnh như Ninh Thuận (16 ha), Sóc Trăng (1,719 ha), Bạc Liêu (346 ha) và Cà Mau (3,493 ha) (Hien NT và cs., 2016) Sau đó, bệnh này tiếp tục xảy ra và lan rộng đến 19 tỉnh thành năm 2012, 22 tỉnh thành năm 2015, 25 tỉnh thành năm 2017 với diện tích nuôi tôm bị nhiễm bệnh lần lượt tương ứng là 28005 ha, 9284 ha và 6793 ha làm giảm đáng kể sản lượng tôm nuôi của Việt Nam ( (Dang, 2018)

Hình 1 1 Tôm thẻ chân trắng có dấu hiệu nhiễm bệnh hoại tử gan tụy (A, B) Hình (C, D) là tôm khỏe cho thấy HP có kích thước bình thường Hình (B) và (D) là mẫu lấy từ hai con tôm ở hình (A) và (C) tương ứng (Loc Tran và cs.,

2013) 1.2.2 Tác nhân gây bệnh

Nhiều nghiên cứu gần đây đã tìm thấy nhiều loại vi khuẩn ở tôm bị hội

chứng hoại tử gan tụy cấp ở tất cả các vùng nuôi tôm trong đó vi khuẩn Vibrio chiếm thành phần chủ yếu và phổ biến nhất là các loài V parahaemolyticus, V vulnificus, V harveyi Cụ thể là, một nghiên cứu của giáo sư Lightner và cs., (2012) đã chỉ ra một chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là tác nhân gây ra hội chứng này Theo

Lighner và cs., (2012), tôm bệnh thường có một số đặc điểm mô bệnh học đặc trưng

như: thoái hoá cấp tính của các ống gan tụy với sự rối loạn về chức năng của tế bào E, R và F; nhân tế bào trương to, tế bào bị hoại tử rơi vào trong lòng ống gan tụy Ở giai đoạn cuối, phát hiện có hiện tượng tập trung của các tế bào máu và sự phát triển

của tác nhân vi khuẩn thứ cấp chủ yếu là nhóm vi khuẩn Vibrio trong vùng gan tụy,

đặc biệt là ở những ống gan tụy bị hoại tử và thoái hoá (Khemayan và cs, 2012)

Vibrio parahaemolyticus xâm chiếm đường tiêu hóa của tôm và sinh ra độc tố gây

phá hủy mô, làm rối loạn chức năng của gan tụy, cơ quan tiêu hóa của tôm (Lightner và cs.,2012) Độc tố PirABvp, tương đồng với độc tố tiêu diệt côn trùng (Pir) của Photorhabdus, được chứng minh là yếu tố độc lực chính gây nên hội chứng gan tụy cấp ở tôm Các gen tương ứng của chúng (được đặt tên là pirAvp và pirBvp) nằm trên

một plasmid có kích thước lớn (69–70 kb) ở các chủng Vibrio parahaemolyticus gây

bệnh gan tụy cấp (Han, 2015); (Yang, 2014) Trên plasmid, gen pirAvp và pirBvp nằm trên vùng nucleotide với kích thước khoảng 3,5 kb với hai lần lặp đảo ngược của chuỗi mã hóa transposase (1 kb) Dựa trên phân tích proteomic, gen pirAvp (336 bp) và pirBvp (1.317 bp) mã hoá cho protein có kích thước khoảng 13 và 50 kDa ( (Han, 2015)

1.3 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA Vibrio parahaemolyticus

Đặc điểm chung các loài vi khuẩn thuộc chi Vibrio: Gram âm, hình que

thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0,3-0,5 x 1,4-2,6 μm Chúng không hình thành bào tử và chuyển động nhờ một tiên mao hoặc nhiều tiên mao mảnh (Baumann và cs., 1984) Loài vi khuẩn này là một trong những tác nhân gây rất nhiều bệnh cho ngành thủy sản (bệnh lở loét ở cá, bệnh hoại tử gan thận ở cá biển, hội chứng chết

10

sớm - EMS ở tôm sú và tôm thẻ…) Bên cạnh đó, nó được phát hiện là nguyên nhân gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm khi ăn những hải sản chưa được nấu chín Chúng lên men D-mannitol, maltose, L arabinose, không lên mem saccharose, oxydase dương tính và kỵ khí tùy nghi

Vibrio parahaemolyticus là vi khuẩn ưa mặn (halophile) nên chúng mọc tốt

ở môi trường kiềm và mặn, tồn tại trong nước biển và các động vật biển như cá, tôm,

sò, ốc , thường sống ở các cửa sông và ven biển hầu hết các vùng trên thế giới Vibrio parahaemolyticus bị chết ở 65 oC sau 10 phút, chúng không phát triển được ở nhiệt độ dưới 15 oC Nhiệt độ thích hợp cho sự nhân lên là 37 oC (Viện Pasteur, Cẩm nang phòng chóng bệnh truyền nhiễm)

Vi khuẩn này có khả năng hình thành màng bao sinh học, sự hình thành các màng bao sinh học bắt đầu khi vi khuẩn bám trên bề mặt vật chủ Sau đó, vi khuẩn tiết ra các chất hình thành nên một lớp keo giúp cho chúng gắn chặt vào bề mặt vật chủ Khi đã hình thành các màng bao sinh học chắc chắn trên dạ dày tôm, các vi khuẩn bắt đầu nhân lên, màng bao là hợp chất exopolysaccharides sẽ hình thành có tác dụng bảo vệ vi khuẩn với tác dụng của các loại kháng sinh, chất khử trùng, các chất chiết xuất từ thảo dược và các phương pháp điều trị khác, trong khi các hoạt động trao đổi chất ở tế bào của chúng vẫn diễn ra bình thường

1.4 THỰC KHUẨN THỂ (BACTERIOPHAGE) 1.4.1 Giới thiệu bacteriophage

Phát hiện ban đầu về thực khuẩn thể đã được báo cáo bởi ME Hankin vào năm 1896 sau khi quan sát các đặc tính kháng khuẩn của tác nhân giống virus này chống

lại Vibrio cholerae ở sông Hằng, Ấn Độ (Adhya và Merril, 2006) Bản chất của phage

đã được xác định rõ ràng sau khi Frederick Twort và Felix d'Herrelle quan sát khả năng phân ly môi trường nuôi cấy vi khuẩn của nó vào năm 1915 và 1917 (Adhya và Merril, 2006) Chính Felix d'Herrelle đã đặt tên cho các tác nhân giống virus này là thực khuẩn thể và được thực hiện trong việc điều trị các bệnh ở người gần như ngay lập tức sau khi phát hiện ra chúng Liệu pháp thực khuẩn thể đã xuất hiện như một phương pháp điều trị tiền đề chống lại bệnh truyền nhiễm trước khi phát hiện ra kháng

sinh phổ rộng và được sử dụng ở nhiều quốc gia cho đến Thế chiến thứ hai (Enderson và cs., 2014) Bacteriophages được coi là một công cụ thay thế không dùng kháng sinh để điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn đồng thời kiểm soát sự xuất hiện của tình trạng kháng kháng sinh (Meaden và Koskella, 2013 ; Payet và Suttle, 2014) Nghiên cứu về liệu pháp thể thực khuẩn đã được khuyến khích hơn nữa do các cơ quan quản lý phụ trách an toàn thực phẩm đã phê duyệt việc sử dụng một số thể thực khuẩn nhất định để sử dụng trong các sản phẩm thực phẩm như ListShield và Listex P100 (Bren, 2007 ; Coffey và cs., 2010) ListShield, (một thể thực khuẩn nhắm vào Listeria) từ Intralytix được USFDA phê duyệt để xử lý các sản phẩm thực phẩm, và các thể thực khuẩn được phân loại là được công nhận chung là an toàn (GRAS; FDA, 2013)

Bacteriophages tồn tại ở ba dạng cấu trúc cơ bản là đầu hình tứ diện (20 mặt) có đuôi; đầu hình tứ diện không có đuôi và dạng sợi Thực khuẩn thể thuộc bộ Caudovirales, được chia thành ba họ: Siphoviridae (capsid hình tam diện với đuôi không co lại dạng sợi), Myoviridae (đầu đối xứng hình tứ diện với đuôi co xoắn phân tách bằng cổ) và Podoviridae (đầu đối xứng hình tứ diện với đuôi rất ngắn không co lại Các thể thực khuẩn thuộc họ Myoviridae có dsDNA, đầu đối xứng hình tứ diện và một đuôi co xoắn được phân tách bằng cổ Các phage thuộc họ Siphoviridae có dsDNA, capsid hình tứ diện và đuôi dạng sợi không co Các phage Podoviridae có dsDNA, đầu đối xứng hình tứ diện, đuôi rất ngắn không co Các phage Inoviridae có ssDNA hình tròn + giác quan như bộ gen và có hình que hoặc hình sợi (Suttle, 2005; Rao và Lalitha, 2015)

Nhiều phage được gọi là phage ôn hòa lúc xâm nhiễm vi khuẩn thì axit nucleic của phage tích hợp vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn Trong quá trình phân bào axit nucleic của phage được sao chép đồng thời với nhiễm sắc thể của vi khuẩn Ở dạng tích hợp axit nucleic của phage được gọi là prophage Vi khuẩn chứa prophage ở nhiễm sắc thể gọi là vi khuẩn sinh tan Sau một số lần phân bào prophage có thể tách rời khỏi nhiễm sắc thể và trở thành phage độc lực Nó cho tổng hợp những phage con, làm tan vi khuẩn và phóng thích những phage độc lực

Phage ôn hòa: sau khi xâm nhập vào tế bào vi khuẩn sẽ xảy ra một trong hai trường hợp:

Theo cách nhân lên của phage độc lực và giết chết tế bào vi khuẩn

Các DNA của phage sẽ kết hợp với DNA của vi khuẩn cho nên không có quá trình nhân lên Khi vi khuẩn nhân lên thì các DNA của phage nhân lên theo Sự nhân lên của phage độc lực trong vi khuẩn

Sự nhân lên của phage độc lực trong vi khuẩn thường diễn ra theo các giai đoạn sau:

Giai đoạn hấp phụ và xâm nhập: Muốn xâm nhập và nhân lên trong vi khuẩn, trước hết phage phải tìm thấy chỗ tiếp nhận đặc hiệu trên bề mặt tế bào vi khuẩn Nhiều nghiên cứu cho thấy khi vi khuẩn biến dị, thay đổi tính chất bề mặt thì phage không có khả năng xâm nhập vào vi khuẩn Khi đã bám vào bề mặt tế bào vi khuẩn, men ở đuôi của phage sẽ làm tan vách (thành) tế bào vi khuẩn, sau đó đuôi co bóp đẩy lõi của đuôi vào vi khuẩn, tiếp theo DNA của phage sẽ được bơm vào tế bào vi khuẩn Vỏ capsid sẽ ở lại ngoài vi khuẩn

Giai đoạn sinh tổng hợp các thành phần: Sau 2 - 3 phút, enzyme deoxyribonuclease của phage xuất hiện phá hủy DNA của tế bào vi khuẩn, mARN và kèm theo hàng loạt enzym cần thiết cho phage được tổng hợp DNA của phage được hình thành cùng với protein (tạo vỏ capsid) của phage được tổng hợp ở ribosome của tế bào chủ

Giai đoạn lắp ghép và giải phóng: Các thành phần DNA lắp ghép với protein tạo thành phage Các phage mới được hình thành sau thời gian khoảng 12 phút và sự giải phóng phage mới thường xảy ra ở phút thứ 25 Trung bình mỗi vi khuẩn có thể giải phóng từ 100 đến vài trăm phage (Dy, R L và cs., 2018)

Là virus tự nhiên của vi khuẩn, thể thực khuẩn xâm nhiễm vào vật chủ vi khuẩn của chúng bằng cách hấp phụ thuận nghịch vào tế bào chủ cụ thể thông qua các protein bề mặt tế bào cụ thể Sau đó, họ đẩy vật liệu di truyền của mình vào tế bào chất của vật chủ vi khuẩn (Burrowes và cs., 2011; Molineux và Panja, 2013) Bacteriophages có hai vòng đời rõ ràng; chu trình sinh tan và chu trình tiềm tan Chu

14

trình sinh tan là một dạng nhiễm trùng gây ra thiệt hại trực tiếp cho vật chủ vi khuẩn Nó liên quan đến một loạt các sự kiện xảy ra giữa việc gắn hạt phage vào tế bào vi khuẩn và giải phóng các hạt phage con Có bốn giai đoạn trong chu trình sinh tan; sự hấp phụ của phage vào tế bào chủ bằng cách liên kết với vật chủ cụ thể, sự xâm nhập của axit nucleic của phage, phát triển nội bào và cuối cùng là phá hủy thành tế bào, giải phóng phage mới tập hợp vào môi trường Cụ thể, sau khi gắn và tiêm bộ gen của phage vào tế bào chủ, các vi khuẩn độc sẽ điều khiển bộ máy protein của tế bào chủ thông qua sự biểu hiện của enzym cụ thể được mã hóa bởi bộ gen của phage Nó chuyển hướng bộ máy tổng hợp vi khuẩn để tái sản xuất các hạt phage mới

Việc sản xuất enzym của phage trong giai đoạn sau như lysin và holins gây ra sự phá hủy màng tế bào, cho phép các phage mới hình thành bùng phát từ tế bào chủ được ly giải vào môi trường (Young, 1992) Toàn bộ quá trình này mất khoảng 20 phút đến 2 giờ (Rao và Lalitha, 2015)

Ngược lại, chu trình tiềm tan bao gồm sự sao chép của axit nucleic của phage cùng với các gen vật chủ trong nhiều thế hệ mà không có sự phá hủy lớn đối với tế bào chủ Đây là một phương thức lây nhiễm tiềm ẩn xảy ra với tần suất rất thấp (Cochran và cs., 1998) Bộ gen của phage vẫn ở trạng thái bị kìm hãm trong bộ gen của vật chủ và được sao chép như một phần của nhiễm sắc thể vi khuẩn cho đến khi chu trình sinh tan được tạo ra Do đó, các phage ôn đới không thích hợp để sử dụng điều trị trực tiếp vì nó có thể làm trung gian cho quá trình tải nạp bằng cách chuyển vật chất di truyền của vi khuẩn này sang vi khuẩn khác Quá trình này có thể dẫn đến sự phát triển của tình trạng kháng thuốc kháng sinh hoặc thậm chí làm tăng độc lực của vật chủ bằng cách thu nhận các gen từ prophage Các vi khuẩn Sinh tan sao chép theo cấp số nhân và tiêu diệt vật chủ vi khuẩn bất kể khả năng kháng kháng sinh của chúng như thế nào, phù hợp hơn cho các mục đích trị liệu sinh học (Sillankorva và cs., 2012)

Hình 1.3: Chu trình sinh tan và tiềm tan của thực khuẩn thể

Ghi chú: 1 - Phage gắn tế bào chủ và tiêm DNA; 2 - Phage DNA đi vào chu trình sinh tan hoặc tiềm tan; 3a - DNA và protein của phage mới được tổng hợp và lắp ráp các virion; 4a –Cell lyses giải phóng virion; 3b và 4b - các bước của chu trình tiềm tan: tích hợp bộ gen của phage trong nhiễm sắc thể vi khuẩn (trở thành prophage) với sự sinh sản bình thường của vi khuẩn; 5- Trong những điều kiện nhất định, prophage đào thải khỏi nhiễm sắc thể vi khuẩn và bắt đầu chu trình sinh tan

Thành phần hóa học gồm:

DNA: có hầu hết ở các phage, thường có 2 chuỗi xoắn vào nhau, một số có DNA một chuỗi, những phage không chứa DNA thì chứa ARN và thường ARN một chuỗi

Protein: vỏ capsid được cấu tạo bằng những đơn phân gọi là capsome chính là những hạt protein

Enzyme: ở đuôi của phage có chứa một số loại enzyme

16

sự thối mềm do vi khuẩn cắt bỏ màng phổi Carotovorum sub sp gây ra, carotovorum

trong cà rốt (Coons và cs., 1925) và vi khuẩn Pectobacterium atrosepticum trong

khoai tây cắt lớp (Kotila vá cs., 1925) Gần đây hơn, đã có sự gia tăng trong các nghiên cứu điều tra tiềm năng của thể thực vật kiểm soát mầm bệnh (Frampton và cs., 2012) Hai trong số các mầm bệnh về thực vật có liên quan kinh tế nhất là

Xanthomonas spp và Pseudomonas syringae (Mansfield và cs., 2012), được thảo

luận dưới đây

Phage đã được thử nghiệm kiểm soát sinh học của X Campestris py Vesicatoria, tác nhân gây ra vi khuẩn tại cà chua, qua nhiều cuộc thử nghiệm trong

nhà kính và ngoài đồng vào năm 1997 và 1998 (Flaherty và cs., 2000)

Y dược

Các nghiên cứu in vivo về tương tác giữa thực khuẩn và hệ vi sinh vật đường ruột đã thay đổi tầm nhìn của chúng ta khi xem xét vòng đời, sự sao chép và tồn tại của thực khuẩn (Reyes và cs., 2013) Một số tác giả đã đề cập đến vai trò có thể có của thể thực khuẩn trong việc duy trì tình trạng viêm niêm mạc trong Bệnh viêm ruột (IBD) (Norman và cs., 2015), (Babickova và cs., 2015) Do đó, quần thể thể thực khuẩn ở bệnh nhân IBD khác với người khỏe mạnh Bệnh nhân mắc bệnh Crohn có số lượng thực khuẩn thấp hơn so với bệnh nhân khỏe mạnh (Pérez-Brocal và cs., 2013) và sự gia tăng số lượng thực khuẩn trong niêm mạc so với bệnh nhân khỏe mạnh (Lepage và cs., 2008) Mặc dù các nghiên cứu gần đây rất thú vị và đầy hứa hẹn, nhưng vẫn cần nhiều dữ liệu hơn để tổng quát hóa kết quả Ngoài ra, niêm mạc bị loét có số lượng phage thấp hơn so với niêm mạc không bị ảnh hưởng Các cơ chế giải thích cách phage điều chỉnh hệ vi khuẩn trong IBD hoặc ở những bệnh nhân khỏe mạnh vẫn chưa rõ ràng Một số tác giả cho rằng phage điều chỉnh hệ vi sinh vật theo cách thức vật chủ ăn thịt (Breitbart và cs., 2003) Điều này được hỗ trợ bởi thực tế là những bệnh nhân mắc bệnh Crohn có số lượng đại thực khuẩn cao hơn nhưng có liên quan đến sự đa dạng thấp hơn Ngoài ra, sự truyền gen của vi khuẩn bởi các phage là một cơ chế chính của quá trình chuyển gen bên ở vi khuẩn DNA prophage được tạo ra trong pha sinh tan có thể bao gồm các gen vi khuẩn nội sinh Điều này đặc biệt đúng đối với các gen kháng thuốc kháng sinh và các gen độc lực khác của vi

khuẩn Cơ chế như vậy có thể giúp làm giảm sự đa dạng của vi khuẩn và tạo thuận lợi cho tình trạng viêm mãn tính

Thực phẩm

Năm 2006, Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (FDA) đã phê duyệt một hỗn hợp lợi khuẩn, được gọi là “sinh tan cocktail”, ở dạng xịt được thiết kế để

giảm sự hiện diện của vi khuẩn Listeria monocytogenes trong thịt và các sản phẩm

đồ nguội (Zach, 2010) Ví dụ: ListShield TM (Intralytix, Inc.) là một sản phẩm thương mại được bán trên thị trường dưới dạng thực khuẩn thể nước đậm đặc được bảo quản ở 2– 6 °C Đối với các ứng dụng thực phẩm trực tiếp, dung dịch pha loãng thường được áp dụng trực tiếp trên bề mặt thực phẩm bằng cách phun với nồng độ khoảng 1-2 ml trên 250 cm vuông bề mặt sản phẩm thực phẩm Tỷ lệ áp dụng được khuyến nghị cho thực phẩm có bề mặt phức tạp thường là 1 – 4 ml dung dịch làm việc đã pha loãng cho mỗi pound thực phẩm

Thủy sản

Hiện tại, Biologix, một công ty công nghệ sinh học của Úc đang phát triển

liệu pháp phage đối với Vibrio sp liên quan đến tỷ lệ tử vong trong nuôi trồng thủy

sản Jafral, một tổ chức sản xuất theo hợp đồng độc lập (CMO) và tổ chức nghiên cứu hợp đồng (CRO) đặt tại Slovenia đã và đang sản xuất vi khuẩn Tại đây, vi khuẩn đã được sản xuất thành công bằng quy trình sản xuất có năng suất cao hơn tới 10 lần Sản phẩm cuối cùng có thể được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm hoặc điều trị cho động vật và người ở những nơi mong muốn hiệu giá phage cao và mức tạp chất thấp

Việc sử dụng kháng sinh trong ngành nuôi trồng thủy sản đã dẫn đến sự gia tăng của vi khuẩn kháng kháng sinh và sự phát triển của ARG trong môi trường gây nguy cơ sức khỏe cho con người và động vật (Kemper, 2008; Letchumanan và cs., 2015a) Vi khuẩn có khả năng làm giảm sự phụ thuộc của ngành nuôi trồng thủy sản vào việc sử dụng kháng sinh Các phage có thể được sử dụng thay vì kháng sinh để kiểm soát các bệnh nhiễm khuẩn xảy ra trong ngành nuôi trồng thủy sản Do đó, cấu hình ARG qua trung gian plasmid giữa các vi khuẩn sẽ giảm khi không có kháng sinh

18

trong môi trường Điều này cuối cùng sẽ bảo tồn hệ sinh thái và giảm ảnh hưởng đến con người và động vật

Hình 1 4 Các vòng vô khuẩn phage được hình thành với Vibrio

parahaemolyticus(N1A) bị nhiễm một phage VPP1 làm giàu bằng thạch hai lớp

(A: TCBS; B: thạch dinh dưỡng) (Stalin, N., & Srinivasan, P (2016)

Hình 1 5 Ứng dụng của thực khuẩn thể trong nuôi trồng thủy sản và những ưu điểm

Hình minh họa về ứng dụng của thực khuẩn thể trong nuôi trồng thủy sản và những ưu điểm (1) Vi khuẩn được phân lập từ các nguồn môi trường như trại giống, nước thải, ao hồ hoặc động vật thủy sinh (2) Thực khuẩn thể phân lập được tinh sạch và xác định Ba phage phổ biến được sử dụng làm tác nhân kiểm soát sinh học đối với Vibrio sp; Siphoviridae, Myoviridae và Podoviridae (3) Trong bể ấp, lợi khuẩn được thêm vào nước ấp Lượng phage cần bổ sung tùy thuộc vào kích thước ao và lượng tôm, sò hoặc cá trong ao (4) Sau khi được thêm vào, vi khuẩn trên tế bào vật chủ sẽ trải qua chu trình ly giải Bước hấp phụ sẽ diễn ra khi phage tiếp xúc với tế bào chủ bị nhiễm Sau đó, DNA của phage sẽ thâm nhập vào tế bào chủ và sao chép Tiếp theo là phiên mã và dịch mã của phage và DNA Sau đó, phage sẽ tập hợp, vật chủ sẽ ly giải và phage sẽ được giải phóng khỏi tế bào chủ (5) Vi khuẩn như Vibrio sp sẽ bị loại khỏi trại giống (6) Ưu điểm của ứng dụng vi khuẩn trong nhiễm trùng do vi khuẩn

20

1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ TRONG NƯỚC

Trên thế giới, một số nghiên cứu như nghiên cứu của Vinod, M G và cs.,

(2006) đã nghiên cứu với ấu trùng Penaeus monodon bị nhiễm V harveyi cho thấy tỷ

lệ sống của ấu trùng khi có thực khuẩn thể được tăng cường (80%) so với đối chứng (25%) Các thử nghiệm thực địa được tiến hành tại một trại giống thương mại nơi có sự bùng phát tự nhiên của bệnh vi khuẩn phát sáng Điều trị bằng thực khuẩn thể cải

thiện khả năng sống sót của ấu trùng và làm giảm số lượng V harveyi phát quang

trong các bể ương giống Do đó, có thể kết luận rằng thực khuẩn thể có tiềm năng

kiểm soát sinh học đối với V harveyi trong các cơ sở sản xuất giống

K M Alagappan và cs (2010) đã cho thấy trong nghiên cứu này tổng số phân

bố của Vibrio parahaemolyticus và các thể thực khuẩn của nó đã được kiểm tra trong các ao nuôi tôm, nước biển, cửa sông, bề mặt động vật và các mô Tổng số Vibrio

trong trầm tích của hai ao được tìm thấy là 2,6 x 103 và 5,6 x 103 CFU / g Tỷ lệ nhiễm

Vibrio parahaemolyticus trong các ao là gần nhau, trong khi tỷ lệ này cao hơn rõ rệt

ở bề mặt động vật và các mẫu mô Về mặt sinh hóa đã xác định được tám chủng

Vibrio parahaemolyticus (V1, V3 – V6, V9, V11, và V12) đã được thực hiện để

nghiên cứu thêm về sự lây nhiễm với thực khuẩn thể Tất cả các mẫu đều phân lập

được 5 loại thực khuẩn thể có khả năng lây nhiễm cho chủng Vibrio parahaemolyticus

MTCC-451 Một trong những thực khuẩn thể Vp1 phân lập được từ cửa sông đã có

thể phân lập tất cả các chủng Vibrio parahaemolyticus phân lập được mà chúng tôi

Stalin và cs (2016), nghiên cứu này cho thấy thực khuẩn thể sinh tan được

phân lập (VVP1) đặc hiệu hơn đối với N1A Vibrio parahaemolyticus và có thể lây nhiễm các chủng Vibrio alginolyticus N7A V parahaemolyticus, N3B và N13B Đánh giá các nghiên cứu vi mô với ấu trùng P monodon nhiễm Vibrio parahaemolyticus cho thấy khả năng sống sót của ấu trùng khi có xử lý phage ở mức

2,3 x 1010 PFU / mL1 được tăng cường khi so sánh với đối chứng Nghiên cứu này cung cấp việc áp dụng phage như một chiến lược hữu ích để ngăn ngừa và loại bỏ

hoặc làm giảm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh cho tôm trong hệ thống

nuôi trồng thủy sản (Stalin, 2016)

Kalatzis và cs (2016) đã nghiên cứu được in vitro ly giải tế bào được phát hiện

chống lại vi khuẩn chủ V Alginolyticus strain V1 nhưng cũng chống lại 12 chủng Vibrio có nguồn gốc từ nuôi cấy Artemia salina bắt mồi sống cho thấy hiệu quả sinh

tan mạnh mẽ của 2 thực khuẩn thể Việc sử dụng thực khuẩn thể, oSt2 và pGmi, tại

MOl= 100 trực tiếp trên môi trường nuôi cấy A salina, dẫn đến 93% mật độ Vibrio

bất hoạt sau 4 giờ Nghiên cứu hiện tại cho thấy việc sử dụng pSt2 và gGrn1 có thể

làm giảm có chọn lọc lượng Vibrio trong các trại sản xuất cá giống Các giải pháp

thân thiện với môi trường và sáng tạo chống lại các bệnh do vi khuẩn là cần thiết và liệu pháp phage là một trong số đó (Kalatzis và cs., 2016)

Prada-Peñaranda và cs (2018) đã cho thấy kết quả thu được khi vi khuẩn và chế phẩm thực khuẩn FBL1 được cấy đồng thời, dẫn đến 44,77% ngăn chặn màng

sinh học của Bacillus licheniformis, vi khuẩn gây ra tỷ lệ tử vong của tôm thẻ chân

trắng Litopenaeus vannamei ở Thái Bình Dương (Prada-Peñaranda, 2018)

Theo Jun và cs., (2016) đã tìm được phage pVp-1, pVp-2 thể thực khuẩn có thể kiểm soát bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm nuôi ( (Jun, 2016)

Kim và cs (2019) đã phân lập và xác định đặc tính của pVa-21, một thực

khuẩn thể khổng lồ có khả năng kháng màng sinh học chống lại Vibrio alginolyticus

(Kim, 2019)

Ding và cs (2020) đã phân lập một thực khuẩn thể mới vB_VpaS_PG07 (sau

đây được chỉ định là PG07) nhiễm vi khuẩn V parahaemolyticus, PG07 làm giảm đáng kể tỷ lệ chết của tôm bị nhiễm V parahaemolyticus Các phát hiện làm nổi bật

tiềm năng của PG07 như một chất kháng khuẩn hiệu quả để dự phòng thực khuẩn thể và liệu pháp thực khuẩn trong nuôi trồng thủy sản ( (Ding, 2020)

Tại Việt Nam, Năm 2014, Võ Văn Nha và cs đã nghiên cứu xác định được nồng độ vi khuẩn Vibrio trong nước có khả năng gây chết hơn 50% PL ở (1,47 - 5,51)

x 102 cfu/ml Tỷ lệ nhiễm Vibrio mang phage trong PL tôm sú, tôm thẻ chân trắng

22

tại các cơ sở sản xuất giống ở miền Trung chiếm 2,9% trong 69 mẫu phân tích và chỉ

tìm thấy trong Vibrio alginolyticus trên PL tôm thẻ chân trắng Vibrio parahaemolyticus mang phage khi cảm nhiễm trên tôm PL đã làm giảm số lượng vi

khuẩn nhiễm trên PL tôm Khi có sự tác động ở điều kiện môi trường khắc nghiệt về nhiệt độ, độ mặn hay có độc chất cypermethrin cho thấy ở nhiệt độ cao (370C), độ mặn cao (40‰) hay có độc chất cyperperin thì có ảnh hưởng đến tỷ lệ chết của PL tôm đem thí nghiệm (Võ Văn Nha và cs., 2014)