Sàng lọc các chủng thực khuẩn thể có khả năng ly giải tế bào vi khuẩn vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy (ahpnd) trên tôm sú (penaeus monodon)

GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh Ths.Dương Nhật Linh Báo cáo thực tập tốt nghiệp BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP Tên đề tài: SÀNG LỌC CÁC CHỦNG THỰC KHUẨN THỂ CÓ KHẢ NĂNG LY GIẢI TẾ BÀO VI KHUẨN VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY (AHPND) TRÊN TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: MÔI TRƯỜNG CBHD: THS.NGUYỄN VĂN MINH THS.DƯƠNG NHẬT LINH BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP Tên đề tài: SÀNG LỌC CÁC CHỦNG THỰC KHUẨN THỂ CÓ KHẢ NĂNG LY GIẢI TẾ BÀO VI KHUẨN VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY (AHPND) TRÊN TÔM MONODON) KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: MÔI TRƯỜNG SÚ (PENAEUS LỜI CẢM ƠN Đơi lời đầu dịng muốn gữi lời cảm ơn đến đấng sinh thành mình, nhờ có Bố Mẹ mà có hội đến trường học tập bạn trang lứa, nhờ giọt mồ hôi ngày hè nóng mà có ngày ngồi phòng điều hòa trao dồi kiến thức giảng đường hôm nay, hai chữ cảm ơn bù đắp công lao com muốn thơng qua hai từ để nói lên lịng biết ơn đến hai người “Con cảm ơn Bố Mẹ nhờ có cơng lao hai người mà có ngày hơm nay” Thứ hai em muốn cảm ơn thầy Nguyễn Văn Minh cô Dương Nhật Linh người hướng dẫn em đường đại học, tiếp thêm đam mê cho em để em bước tiếp đường mà người xung quanh bảo khơng có tương lai, làm em sáng tỏ muốn làm mai sau, thầy cô người truyền lửa giúp lửa đam mê em luôn sáng không bị dập tắt đời Cuối muốn cảm ơn bạn lớp ln giúp đỡ hỗ trợ lúc khó khăn, thiếu dụng cụ thí nghiệm phải mượn ngũ hồ tứ hải, hay lúc đùa với làm nảy ý tưởng kỳ lạ mà hiệu quả, cảm ơn bạn hỗ trợ lúc làm thực tập Báo cáo thực tập tốt nghiệp GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh Ths.Dương Nhật Linh DANH MỤC ẢNH Hình 1.1 Ảnh minh họa cho Tơm Sú 13 Hình 2.1 Ảnh mơ tả khác tơm bình thường tơm bị bệnh AHPND 15 Hình 3.1 Cấu trúc protein Pir A Pir B 16 Hình 4.1 Ảnh thực khuẩn thể kính hiển vi điện tử 17 Hình 4.2 Sơ đồ chu trình sống ký sinh thực khuẩn thể 18 Hình 3.1 Sơ đồ quy trình thí nghiệm 22 Hình 1.1 Hình ảnh vi khuẩn Vibrio môi trường TCBS 26 Báo cáo thực tập tốt nghiệp GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh Ths.Dương Nhật Linh DANH MỤC BẢNG Bảng Bảng kết phân lập thực khuẩn thể 26 Bảng Bảng mơ tả kết thí nghiệm đường cong sinh trường bước 26 Báo cáo thực tập tốt nghiệp GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh Ths.Dương Nhật Linh DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ Biểu đồ đường cong sinh trưởng vi khuẩn 28 Biểu đồ Biểu đồ đường cong sinh trưởng kiểm soát thực khuẩn thể 28 Biểu đồ Biểu đồ so sánh hai đường cong sinh trưởng 29 Báo cáo thực tập tốt nghiệp GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh Ths.Dương Nhật Linh DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Sucrose): môi trường đặc hiệu cho hai củng Vibrio parahaemolyticus Vibrio cholerae ABS: đơn vị đo số quang hấp thụ EMS (Early Mortality Syndrome): bệnh tôm chết sớm AHPND (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease): Bệnh hoại tử gan tụy tôm Cs: cộng Báo cáo thực tập tốt nghiệp GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh Ths.Dương Nhật Linh MỤC LỤC Lời cảm ơn Danh mục ảnh Danh mục bảng Danh mục biểu đồ Danh mục từ viết tắt Mục lục Đặt vấn đề 10 Phần 1: tổng quan tài liệu 12 Giới thiệu chung Tôm Sú 13 1.1 Phân loại khoa học 13 1.2 Đặc điểm 13 1.3 Tiềm lực kinh tế 13 Bệnh hoại tử gan tụy (AHPND) 14 2.1 Khái quát bệnh AHPND 14 2.2 Cơ chế gây bệnh 15 Vibrio parahaemolyticus 15 3.1 Phân loại học 15 3.2 Khái quát vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 16 3.3 Độc lực Pir AB 16 thực khuẩn thể 17 4.1 Khái niệm 17 4.2 Vòng đời 17 4.3 Cơ chế gây độc 18 4.4 Endolysin 19 Phần 2: Vật liệu Phương pháp nghiên cứu 20 Thời gian địa điểm 21 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Sờ đồ thí nghiệm 21 2.2.2 Thí nghiệm 1:Tái phân lập chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 22 Báo cáo thực tập tốt nghiệp GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh Ths.Dương Nhật Linh 2.2.3 Thí nghiệm 2: Phân lập chủng thực khuẩn thể có khả ly giải tế bào vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 22 2.2.4 Thí nghiệm 3: khảo sát độc lực thực khuẩn thể vi khuẩn Vibrio parahaemolitycus 23 Phần 3: Kết nghiên cứu thảo luận 25 Kết 26 1.1 Thí nghiệm 1: Tái phân lập chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus phòng thí nghiệm Cơng nghệ vi sinh trường Đại học Mở TP.HCM 26 1.2 Thí nghiệm 2: Phân lập chủng thực khuẩn thể có khả ly giải tế bào vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 26 1.3 Thí nghiệm 3: khảo sát độc lực thực khuẩn thể vi khuẩn Vibrio parahaemolitycus 26 Phần 4: Kết luận kiến nghị 30 Kết luận 31 Kiến nghị 31 Tài liệu tham khảo 32 Phụ lục 35 Phụ lục 1: xử lý thống kê 35 Báo cáo thực tập tốt nghiệp GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh Ths.Dương Nhật Linh ĐẶT VẤN ĐỀ Theo Bộ Nông Nghiệp Và Phát Triển Nơng Thơn, tổng diện tích đất ni Tơm Sú vào năm 2005 551.470ha đạt 590,315ha vào năm 2014 dự đoán tiếp tục tăng vào năm 2020, Tổng Cục Thủy Sản báo cáo vào năm 2014 tổng sản lượng tôm đạt 657.000 có giá trị xuất 3.95 tỷ USD Tuy nhiên, ngành nuôi tôm đối mặt với nhiều trở ngại phải nhắc đến bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND), bệnh lần phát vào năm 2009 Trung Quốc với 100% độ tử vong vịng 35 ngày Tơm Sú (Eshik cs., 2017) có nguồn gốc lây nhiễm từ vi khuẩn gram âm ưa mặn phổ biến vùng nước biển Vibrio parahaemolyticus (Chung-Te Lee cs., 2015, Loc Tran cs., 2013) chúng tiết độc tố Pir ABvp đóng vai trị quan trọng chế phát bệnh AHPND (Chung-Te Lee cs., 2015) Tơm bị nhiễm bệnh có biểu bên bao gồm bị ngất, phát triển chậm, dày ruột trống không, gan tụy bị teo nhỏ đến khơng cịn cuối dẫn đến tử vong (Xupeng Hong cs., 2016) Ngành công nghiệp xuất tôm chiểm 17,83% tổng kim ngạch GDP xuất thủy sản năm 2020 theo Tổ chức phát triển cơng nghiệp Liên Hợp Quốc (UNIDO) bốn thị trường lớn EU, Hoa Kỳ, Nhật Bản Úc Việt Nam ba nước đứng đầu bị từ chối nhập thủy sản vào giai đoạn 2006 – 2010 dư lượng chất kháng sinh Hiện thực khuẩn thể biện pháp sinh học thay cho kháng sinh để kiểm soát sinh học, chúng virus ký sinh tế bào phụ thuộc vào tế bào vi khuẩn vật chủ để tổng hợp protein vỏ hạt (E Fidelma Boyd cs., 2001) phân lập lần vào đầu kỷ 20 Frederick Twort and Félix d’Hérelle (Frits van Charante cs., 2019) trước phát sử dụng phổ biến kháng sinh có ý kiến cho sử dụng bacteriophages để điều trị ca nhiễm khuẩn (Alexander Sulakvelidze cs., 2001) Năm 2016, pVp-1 phage thuộc họ Siphoviridae báo cáo có khả ức chế hoạt động chung V parahaemolyticus phân lập Châu Á 15/17 chủng Mexico (Jin Woo Jun cs., 2016), chủng VPMS1 xem chủng phage báo cáo có khả ly giải tế bào vi khuẩn V 10 Báo cáo thực tập tốt nghiệp GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh Ths.Dương Nhật Linh THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM Thời gian thực hiện: Từ tháng 6/2021 đến tháng 2/2022 Địa điểm: Phịng thí nghiệm Cơng Nghệ Vi Sinh trường Đại học Mở TP.HCM Đối tượng nghiên cứu: Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Nguồn gốc mẫu: Mẫu nước bùn ao nuôi tôm huyện Nhà Bè Mơi trường ni cấy vi sinh vật hóa chất: Môi trường TCBS tổng hợp, peptone, dung dịch NaOH 1M, dung dịch HCl 1M, dung dịch Ringer, ZnSO4.7H2O, cồn Thiết bị dụng cụ thí nghiệm sử dụng: Tủ cấy vi sinh vật, nồi hấp, ống nghiệm, đĩa petri, que cấy trang, que cấy ria, đầu típ, micro pipet, cuvet 2.2 Bố trí thí nghiệm 2.2.1 Sờ đồ thí nghiệm 21 SVTH: Nguyễn Hồng Phúc Báo cáo thực tập tốt nghiệp GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh Ths.Dương Nhật Linh Hình 2.1 Sơ đồ quy trình thí nghiệm 2.2.2 Thí nghiệm 1:Tái phân lập chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus Cấy chuyền trực tiếp vi khuẩn từ ống chủng phòng lên đĩa thạch mơi trường TCBS 2.2.3 Thí nghiệm 2: Phân lập chủng thực khuẩn thể có khả ly giải tế bào vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus Các bước xử lý mẫu: Mẫu bùn pha loãng với nước máy theo tỉ lệ 1/5 mẫu nước sử dụng thẳng khơng qua pha lỗng Quay ly tâm 10ml mẫu với tốc độ 4000 vòng 20 phút sau lấy phần dịch bỏ phần lắng Thêm vào dung dịch nước cất đến dung dịch quay lại thể tích ban đầu 10ml 22 SVTH: Nguyễn Hồng Phúc GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh Ths.Dương Nhật Linh Báo cáo thực tập tốt nghiệp Thêm vào dung dịch mẫu ZnSO4.7H2O với nồng độ mol/L để tủa nhiệt độ phòng phút Đem dung dịch tủa quay ly tâm với tốc độ 4000 20 phút sau bỏ phần dịch Thêm vào eppendof 1ml dung dịch Ringer lắc Các bước phân lập thực khuẩn thể: Tăng sinh vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus qua đêm Cấy trang 1ml dịch khuẩn tăng sinh lên môi trường peptone kiềm sau ủ qua đêm Nhỏ 0,2 ml dung dịch thực khuẩn thể xủ lý trước lên bề mặt đĩa thạch đợi 15 phút sau đọc kết Múc phần thạch bị trống đĩa thạch có kết lặp lại trình xử lý mẫu phân lập để làm thực khuẩn thể 2.2.4 Thí nghiệm 3: khảo sát độc lực thực khuẩn thể vi khuẩn Vibrio parahaemolitycus Độc lực thực khuẩn thể tính theo công thức (Storms cs., 2020) 𝑉𝑖 = − 𝐴𝑖 𝐴0 Trong Vi độc lực vi khuẩn, Ai số hấp thụ quang phổ (ABS) lớn đại diện cho tổng sinh khối vi khuẩn đạt có xuất thực khuẩn thể, A0 số hấp thụ (ABS) lớn đại diện cho tổng sinh khối vi khuẩn đạt khơng có xuất thực khuẩn thể giá trị Vi di chuyển từ đến giá trị cao độc lực mạnh Sử dụng phương pháp đường cong sinh trường bước để đo khả đường cong sinh trưởng vi sinh vật, bước thực sau: Các bước đo đường cong sinh trưởng vi khuẩn: Tăng sinh vi khuẩn bình serum, ủ nhiệt độ phòng để qua đêm Pha loãng mật độ đến số OD600 đạt 0,1 Bắt đầu tính ghi lại kết phút lần Các bước đo đường cong sinh trưởng vi khuẩn bị kiểm soát thực khuẩn thể: 23 SVTH: Nguyễn Hồng Phúc Báo cáo thực tập tốt nghiệp GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh Ths.Dương Nhật Linh Tăng sinh vi khuẩn bình serum, ủ nhiệt độ phòng để qua đêm Thêm 0,1ml dung dịch thực khuẩn thể làm vào 0,9ml dung dịch khuẩn tăng sinh để 3,5 Pha loãng mật độ đến số OD600 đạt 0,1 Theo dõi số OD phút với MOI = 0,1 24 SVTH: Nguyễn Hồng Phúc GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh Ths.Dương Nhật Linh Báo cáo thực tập tốt nghiệp PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25 SVTH: Nguyễn Hồng Phúc Báo cáo thực tập tốt nghiệp GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh Ths.Dương Nhật Linh KẾT QUẢ 1.1 Thí nghiệm 1: Tái phân lập chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus phịng thí nghiệm Cơng nghệ vi sinh trường Đại học Mở TP.HCM Hình 1.1 Hình ảnh vi khuẩn Vibrio mơi trường TCBS 1.2 Thí nghiệm 2: Phân lập chủng thực khuẩn thể có khả ly giải tế bào vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus Từ mẫu nước ao tơm mẫu bùn rìa ao nuôi tôm phân lập chủng thực khuẩn thể có khả ly giải màng tế bào vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus Bảng Bảng kết phân lập thực khuẩn thể Địa điểm thu mẫu Nhà Bè Số lượng mẫu Kết Mã + NBN1 1.3 Thí nghiệm 3: khảo sát độc lực thực khuẩn thể vi khuẩn Vibrio parahaemolitycus Sau lập đường cong sinh trưởng vi khuẩn Vibrio ta thấy số OD cao mà vi khuẩn đạt hai khảo sát 0,17 với khoảng thời gian cho pha lag 10 phút pha log 40 phút Bảng Bảng mơ tả kết thí nghiệm đường cong sinh trường bước Thời gian A0a Aib (Phút) (ABS) (ABS) 26 SVTH: Nguyễn Hồng Phúc Báo cáo thực tập tốt nghiệp GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh Ths.Dương Nhật Linh 0,109 ± 0,016 0,121 ± 0,01 10 0,124 ± 0,016 0,119 ± 0,01 15 0,127 ± 0,016 0,123 ± 0,01 20 0,133 ± 0,016 0,124 ± 0,01 25 0,136 ± 0,016 0,124 ± 0,01 30 0,141 ± 0,016 0,128 ± 0,01 35 0,145 ± 0,016 0,126 ± 0,01 40 0,151 ± 0,016 0,129 ± 0,01 45 0,154 ± 0,016 0,132 ± 0,01 50 0,16 ± 0,016 0,132 ± 0,01 55 0,158 ± 0,016 0,136 ± 0,01 60 0,157 ± 0,016 0,147 ± 0,01 65 0,161 ± 0,016 0,15 ± 0,01 70 0,161 ± 0,016 0,141 ± 0,01 75 0,161 ± 0,016 0,142 ± 0,01 80 0,161 ± 0,016 0,144 ± 0,01 85 0,163 ± 0,016 0,149 ± 0,01 90 0,161 ± 0,016 0,146 ± 0,01 95 0,166 ± 0,016 0,146 ± 0,01 100 0,17 ± 0,016 0,147 ± 0,01 105 0,168 ± 0,016 0,145 ± 0,01 110 0,169 ± 0,016 0,145 ± 0,01 115 0,167 ± 0,016 0,146 ± 0,01 120 0,168 ± 0,016 0,147 ± 0,01 27 SVTH: Nguyễn Hồng Phúc Báo cáo thực tập tốt nghiệp GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh Ths.Dương Nhật Linh Biểu đồ Biểu đồ đường cong sinh trưởng vi khuẩn Biểu đồ biểu diện ba pha hoàn chỉnh đường cong sinh trưởng vi sinh vật bao gồm: pha lag, pha log pha cân cánh ổn định Nhưng thời gian khảo sát đường cong bị giới hạn kiểm tra pha suy tàn biểu đồ Biểu đồ Biểu đồ đường cong sinh trưởng kiểm soát thực khuẩn thể 28 SVTH: Nguyễn Hồng Phúc Báo cáo thực tập tốt nghiệp GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh Ths.Dương Nhật Linh Không giống với biểu đồ biểu đồ cho ta thấy mật độ vi khuẩn đường cong sinh trưởng bị dao động mạnh không ổn định, nhận pha đường cong sinh trưởng không rõ ràng biểu đồ Biểu đồ Biểu đồ so sánh hai đường cong sinh trưởng Như biểu đồ biểu thị đường cong sinh trưởng A0 có động ổn định mật độ thao số hấp thụ (ABS) cao đường Ai chứng tỏ việc thêm chủng thực khuẩn thể để kiểm sốt sinh học chủng khuẩn Vibrio parahaemolyticus có hiệu nhiên hiệu Sau khảo sát đường cong sinh trưởng vi khuẩn kiểm soát chủng thực khuẩn thể phân lập cho thấy giá trị OD lớn 0,15 ta tính tốn độc lực chủng thực khuẩn thể theo công thức sau: 𝑉𝑖 = − 0,15 = 0,1176 0,17 29 SVTH: Nguyễn Hồng Phúc Báo cáo thực tập tốt nghiệp GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh Ths.Dương Nhật Linh PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 30 SVTH: Nguyễn Hồng Phúc Báo cáo thực tập tốt nghiệp GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh Ths.Dương Nhật Linh KẾT LUẬN Trên chủng Vibrio parahaemolyticus tái phân lập chúng tơi tiếp tục thí nghiệm phân lập chủng thực khuẩn thể hai mẫu nước bùn thu thập từ huyện Nhà Bè phân lập chủng thực khuẩn thể có mã chủng NBN1 có hoạt tính 0,1176 KIẾN NGHỊ Theo kết thử nghiệm đường cong sinh trường bước độc lực chủng thực khuẩn thể phân lập tiếp tục gia tăng tiếp tục kéo dài thời gian khảo sát chúng tơi kiến nghị tiếp tục thực nghiêm cứu với thời gian khảo sát dài Do mật độ thực khuẩn thể môi trường nhiều nên kiến nghị tiếp tục thực nghiên cứu phân lập thêm củng thực khuẩn thể có hoạt tính cao để thực nghiên cứu góp phần làm đa dạng nguồn thực khuẩn thể dự trữ Do q trình thí nghiệm đường cong sinh trường bước có bước tương đồng với q trình thử hoạt tính ao tơm nên chúng tơi kiến nghị mở rộng phạm vi thí nghiệm đường cong sinh trường bước từ diện tích cuvet lên diện tích ao tơm với đơn vị đo CFU/ml thay độ hấp thụ (ABS) 31 SVTH: Nguyễn Hồng Phúc Báo cáo thực tập tốt nghiệp GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh Ths.Dương Nhật Linh TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Clark, W A (1962) Comparison of several methods for preserving bacteriophages Applied microbiology, 10(5), 466-471 [2] Clokie, M R., Millard, A D., Letarov, A V., & Heaphy, S (2011) Phages in nature Bacteriophage, 1(1), 31-45 [3] Daniels, N A., & Shafaie, A (2000) A review of pathogenic Vibrio infections for clinicians Infections in medicine, 17(10), 665-685 [4] Daniels, N A., MacKinnon, L., Bishop, R., Altekruse, S., Ray, B., Hammond, R M., & Slutsker, L (2000) Vibrio parahaemolyticus infections in the United States, 1973–1998 The Journal of infectious diseases, 181(5), 1661-1666 [5] Ellis, E L., & Delbruck, M (1939) The growth of bacteriophage Journal of General Physiology, 22(3), 365-384 [6] Eshik, M M E., Abedin, M M., Punom, N J., Begum, M K., & Rahman, M S (2017) Molecular identification of AHPND positive Vibrio parahaemolyticus causing an outbreak in Elmahdi south-west shrimp farming regions of Bangladesh Journal of Bangladesh Academy of Sciences, 41(2), 127-135 [7] Elmahdi, S., DaSilva, L V., & Parveen, S (2016) Antibiotic resistance of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio vulnificus in various countries: a review Food microbiology, 57, 128-134 [8] Hong, X., Lu, L., & Xu, D (2016) Progress in research on acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) Aquaculture international, 24(2), 577593 [9] Jun, J W., Han, J E., Tang, K F., Lightner, D V., Kim, J., Seo, S W., & Park, S C (2016) Potential application of bacteriophage pVp-1: agent combating Vibrio parahaemolyticus strains associated with acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in shrimp Aquaculture, 457, 100-103 [10] Keyhani, N O., & Roseman, S (1999) Physiological aspects of chitin catabolism in marine bacteria Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects, 1473(1), 108-122 32 SVTH: Nguyễn Hồng Phúc Báo cáo thực tập tốt nghiệp GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh Ths.Dương Nhật Linh [11] Kumar, V., Nguyen, D V., Baruah, K., & Bossier, P (2019) Probing the mechanism of VPAHPND extracellular proteins toxicity purified from Vibrio parahaemolyticus AHPND strain in germ-free Artemia test system Aquaculture, 504, 414-419 [12] Lee, C T., Chen, I T., Yang, Y T., Ko, T P., Huang, Y T., Huang, J Y., & Lo, C F (2015) The opportunistic marine pathogen Vibrio parahaemolyticus becomes virulent by acquiring a plasmid that expresses a deadly toxin Proceedings of the National Academy of Sciences, 112(34), 10798-10803 [13] Loessner, M J (2005) Bacteriophage endolysins—current state of research and applications Current opinion in microbiology, 8(4), 480-487 [14] Letchumanan, V., Chan, K G., & Lee, L H (2014) Vibrio parahaemolyticus: a review on the pathogenesis, prevalence, and advance molecular identification techniques Frontiers in microbiology, 5, 705 [15] Lin, S J., Hsu, K C., & Wang, H C (2017) Structural insights into the cytotoxic mechanism of Vibrio parahaemolyticus PirAvp and PirBvp toxins Marine drugs, 15(12), 373 [16] Lai, H C., Ng, T H., Ando, M., Lee, C T., Chen, I T., Chuang, J C., & Wang, H C (2015) Pathogenesis of acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in shrimp Fish & Shellfish Immunology, 47(2), 1006-1014 [17] Martinez-Diaz, S F., & Hipólito-Morales, A (2013) Efficacy of phage therapy to prevent mortality during the vibriosis of brine shrimp Aquaculture, 400, 120-124 [18] Nachimuthu, R., Madurantakam Royam, M., Manohar, P., & Leptihn, S (2021) Application of bacteriophages and endolysins in aquaculture as a biocontrol measure Biological Control, 160, 104678 [19] Nelapati, S., Nelapati, K., & Chinnam, B K (2012) Vibrio parahaemolyticus-An emerging foodborne pathogen-A Review Vet World, 5(1), 4862 [20] Storms, Z J., Teel, M R., Mercurio, K., & Sauvageau, D (2020) The virulence index: a metric for quantitative analysis of phage virulence Phage, 1(1), 2736 33 SVTH: Nguyễn Hồng Phúc Báo cáo thực tập tốt nghiệp GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh Ths.Dương Nhật Linh [21] Sulakvelidze, A., Alavidze, Z., & Morris Jr, J G (2001) Bacteriophage therapy Antimicrobial agents and chemotherapy, 45(3), 649-659 Sharp, R (2001) Bacteriophages: biology and history Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 76(7), 667-672 [22] Soonthornchai, W., Chaiyapechara, S., Jarayabhand, P., Söderhäll, K., & Jiravanichpaisal, P (2015) Interaction of Vibrio spp with the inner surface of the digestive tract of Penaeus monodon PloS one, 10(8), e0135783 [23] S F., & Cardona‐Félix, C S (2018) Recombinant Lys VPMS as an endolysin with broad lytic activity against Vibrio parahaemolyticus strains associated to acute hepatopancreatic necrosis disease Aquaculture Research, 49(4), 1723-1726 [24] Sánchez, P C (2020) The B subunit of pirABvp toxin secreted from Vibrio parahaemolyticus causing AHPND is an amino sugar specific lectin [25] Taylor, M W (2014) The discovery of bacteriophage and the d’herelle controversy In Viruses and man: a history of interactions (pp 53-61) Springer, Cham [26] Tran, L., Nunan, L., Redman, R M., Mohney, L L., Pantoja, C R., Fitzsimmons, K., & Lightner, D V (2013) Determination of the infectious nature of the agent of acute hepatopancreatic necrosis syndrome affecting penaeid shrimp Diseases of aquatic organisms, 105(1), 45-55 [27] Van Charante, F., Holtappels, D., Blasdel, B G., & Burrowes, B H (2019) Isolation of Bacteriophages [28] Xiao, J., Liu, L., Ke, Y., Li, X., Liu, Y., Pan, Y., & Wang, Y (2017) Shrimp AHPND-causing plasmids encoding the PirAB toxins as mediated by pirABTn903 are prevalent in various Vibrio species Scientific reports, 7(1), 1-11 [29] Zermo‐Cervantes, L A., Makarov, R., Lomelí‐Ortega, C O., Martínez‐ Díaz, S F., & Cardona‐Félix, C S (2018) Recombinant Lys VPMS as an endolysin with broad lytic activity against Vibrio parahaemolyticus strains associated to acute hepatopancreatic necrosis disease Aquaculture Research, 49(4), 1723-1726 34 SVTH: Nguyễn Hồng Phúc Báo cáo thực tập tốt nghiệp GVHD:Ths.Nguyễn Văn Minh Ths.Dương Nhật Linh PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: XỬ LÝ THỐNG KÊ Kết xử lý thống kê ANOVA nhiều yếu tố kết xếp hạng thí nghiệm đánh giá hoạt lực chủng thực khuẩn thể kiểm soát sinh học vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 35 SVTH: Nguyễn Hồng Phúc ... THỰC KHUẨN THỂ CÓ KHẢ NĂNG LY GIẢI TẾ BÀO VI KHUẨN VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY (AHPND) TRÊN TÔM SÚ (PENAEUS MONODON). ” Mục tiêu nghiên cứu: Sàng lọc chủng thực khuẩn thể có khả. .. TP.HCM BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP Tên đề tài: SÀNG LỌC CÁC CHỦNG THỰC KHUẨN THỂ CÓ KHẢ NĂNG LY GIẢI TẾ BÀO VI KHUẨN VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY (AHPND) TRÊN TÔM MONODON) KHOA... sinh thực khuẩn thể 4.3 Cơ chế gây độc Các chủng thực khuẩn thể gây độc cho vi khuẩn chủng thực thực khuẩn thể có khả ly giải màng tế bào vi khuẩn, khả enzyme gọi endolysin tổng hợp gen thực khuẩn