Sàng lọc các cây thuốc việt nam có tác dụng ức chế xathin oxidase in vitro

      XANTHIN OXIDASE IN VITRO         XANTHIN OXIDASE IN VITRO   : 60720405 c:   H3 LỜI CẢM ƠN  lun  c s  rt nhiu ca thy   c ti TS. Nguyễn Thuỳ Dương TS. Nguyễn Quỳnh Chi, TS. Nguyễn Hoàng Anh nhi th  ng d         k thun sinh  B  c l    u ki     c hi   o  a Ti hi. Li cui li c ng nghip nh  lun    Hc  Hoàng Thị Thanh Thảo      1    3 1.1. Acid u acid uric 3 1.1.1. Acid uric 3 acid uric 5 1.2. Enzym xanthin oxidase 8 1.2.1. ,  8 1.2.2. xanthin oxidase 10 1.3.  in vitro 14  14   15   16 1.4.   16    18 2.1.  18 2.1.1.  18  19 2.1.3.  25 2.1.4. , 26 2.2.  27 2.3.  28 2.3.1. Te in vitro UV  Costar 3635 28 2.3.2.          UV 96 Costar 3635  32 2.3.3. in vitro   34 2.3.4.  35  3.  36  xanthin oxidase in vitro UV  Costar 3635 36 3.1.1. K 36 3.1.2.  36 3.1.3.  in vitro  37 3.2.         acid uric      oxidase in vitro 40 3.2.1.  xanthin oxidase in vitro   40 3.2.2.  50  47 in vitro  Archidendron clyearia) 48  50  48  50  49  50   52  60  61    ABCG2 ATP-binding cassette sub-family G member 2 ABT -azino-di (3ethylbenzthiazoline-6-sulphonate AHP 2-amino-4-hydroxypteridin ATP Adenosin triphosphat BCRP Breast cancer resistance protein CCTT  DMSO Dimethyl sulfoxid EULAR The European League Against Rheumatism HGPRT Hypoxanthin-guanin phosphoribosyltransferase IC 50  IXP Isoxanthopterin OXH  PRPP Phosphoribosyl pyrophosphate   SLC2A9 Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 9 protein URAT1 Urate transporter 1 XO Xanthine oxidase    Trang 1.1   max   m  13 2.1  19 2.2 ng 32 3.1              38 3.2   41 3.3      xanthin oxidase (IC 50    47 3.4          50       48 3.5          50        49 3.6              ACE8 51    Trang 1.1 acid uric 3 1.2 acid uric 4 1.3 acid uric 5 1.4  9 1.5  10 1.6  13 2.1  29 2.2  Linewearver-Burk 30 2.3   31 2.4             34 3.1    36 3.2 UV   Costar 3635 37 3.3             39 3.4       Burk     50 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Acid uric là sản phẩm của quá trình chuyển hóa protein có nhân purin trong cơ thể. Acid uric có vai trò quan trọng với cơ thể con người liên quan tới duy trì huyết áp, chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch [39], [44], [53], [74]. Tuy nhiên, tăng acid uric máu, đặc biệt tăng acid uric máu mạn tính, lại là nguyên nhân dẫn tới nhiều vấn đề về sức khỏe như gút, tăng huyết áp, bệnh tim mạch, bệnh thận, bệnh đái tháo đường typ II [44], [74], [84]. Trong đó gút là bệnh viêm khớp phổ biến nhất, ảnh hưởng đến 2,13% dân số Mỹ trong năm 2009 [23]. Theo các nghiên cứu gần đây, gút và các bệnh liên quan tới tăng acid uric máu ngày càng trở nên phổ biến không chỉ ở các nước phát triển mà cả các nước đang phát triển [24], [34], [86], [109]. Theo một nghiên cứu năm 2000, tỷ lệ mắc bệnh gút ở Việt Nam ước tính là 0,14% dân số và tỷ lệ này ngày một tăng cao [10], [73]. Hạ acid uric là mục tiêu hàng đầu trong phòng, điều trị gút và các bệnh liên quan đến tăng acid uric máu [39]. Hiện nay, hai nhóm thuốc hạ acid uric máu gồm các thuốc làm tăng thải acid uric qua thận và nhóm thuốc làm giảm tổng hợp acid uric. Các thuốc gây tăng thải acid uric như probenecid, sulfinpyrazon có hiệu quả tốt trong việc làm hạ acid uric máu, đặc biệt làm giảm kích thước cũng như số lượng các hạt tophi. Tuy nhiên, thuốc tỏ ra kém hiệu quả trên bệnh nhân suy giảm chức năng thận và có thể gây ra sỏi thận urat cũng như nhiều tác dụng phụ khác [2], [72], [83], [107]. Các thuốc làm giảm tổng hợp acid uric như allopurinol, febuxostat được sử dụng khá phổ biến trên lâm sàng và thể hiện tác dụng hạ acid uric tốt. Tuy nhiên, các thuốc này cũng có không ít tác dụng không mong muốn. Allopurinol gây độc với gan, tổn thương thận, ban da, kích ứng đường tiêu hóa, các phản ứng quá mẫn tuy hiếm gặp nhưng nặng nề và có thể gây tử vong [38], [72], [92]. Febuxostat gây rối loạn chức năng gan, đau đầu, buồn nôn, chóng mặt [48]. Vì vậy, việc tìm kiếm các dược liệu, bổ sung vào các bài thuốc điều trị gút và các bệnh liên quan tới tăng acid uric máu nhằm khắc 2 phục những nhược điểm gặp phải với các thuốc tân dược đang trở thành mối quan tâm trong phát triển thuốc mới. Tiềm năng về dược liệu của Việt Nam rất lớn [4], [11]. Các nhà khoa học Việt Nam đã tiến hành các nghiên cứu về tác dụng hạ acid uric của dược liệu và bước đầu có thành công nhất định. Tuy nhiên, các nghiên cứu này chủ yếu tập trung đánh giá tác dụng phòng và điều trị gút của một dược liệu hoặc một bài thuốc cụ thể, chỉ có 1 nghiên cứu sang lọc dược liệu có tiềm năng hạ acid uric của Nguyễn Thị Thanh Mai [6], [7], [75]. Việc nghiên cứu sàng lọc trên quy mô lớn để tìm kiếm, phát hiện các dược liệu có hiệu quả hạ acid uric tốt là rất cần thiết. Vì vậy, đề tài “Sàng lọc các cây thuốc Việt Nam có tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro” được thực hiện với các mục tiêu cụ thể sau: 1. Triển khai được phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa UV 96 giếng Costar 3635. 2. Sàng lọc được tác dụng hạ acid uric thông qua ức chế xanthin oxidase in vitro của các dược liệu (khoảng 100 loài) được thu hái ở Việt Nam. 3. Đánh giá được tác dụng và cơ chế ức chế xanthin oxidase in vitro của dược liệu tiềm năng nhất. [...]... xanthin oxidase để lựa chọn ra dược liệu có tác dụng mạnh nhất - Thực hiện mục tiêu 3: Đánh giá được tác dụng và cơ chế ức chế xanthin oxidase in vitro của dược liệu tiềm năng nhất + Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của các phân đoạn chiết xuất được từ dược liệu có tác dụng ức chế XO mạnh nhất + Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của các chất phân lập được từ phân đoạn có tác. .. giá tác dụng ức chế XO in vitro của allopurinol - Thực hiện mục tiêu 2: Sàng lọc được tác dụng hạ acid uric thông qua ức chế xanthin oxidase in vitro của các dược liệu + Đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase in vitro của các cao toàn phần dược liệu ở 3 nồng độ 100 µg/ml, 50 µg/ml và 10 µg/ml để lựa chọn ra các dược liệu có tiềm năng + Xác định IC50 của các dược liệu có tiềm năng ức chế xanthin... (Asteraceae) [42] Dược liệu thuộc các họ này được sử dụng phổ biến với tác dụng chống viêm, giảm đau đồng thời có chứa flavonoid, nhóm hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học trong đó có tác dụng chống oxy hóa Các nhóm hợp chất có tiềm năng ức chế xanthin oxidase như flavonoid, polyphenol, coumarin hay tanin đã được sàng lọc tác dụng trên mô hình in vitro để tìm kiếm các chất có tác dụng ức chế mạnh nhất [27], [28],... OXIDASE IN VITRO Ức chế enzym XO là một trong các cơ chế chính mà các thuốc hạ acid uric hướng tới Trên thế giới đã có những nghiên cứu sàng lọc dược liệu, các nhóm hoạt chất hay các hoạt chất có tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase in vitro Dựa trên kinh nghiệm sử dụng dược liệu trong điều trị gút và các triệu chứng liên quan của thổ dân Bắc Mỹ, Owen và cộng sự đã tiến hành sàng lọc khả năng ức chế xanthin... xanthin oxidase in vitro của 26 loài thuộc 18 họ thực vật Kết quả cho thấy, ở mức liều 100 µg/ml, có 20% số loài được thử có tác dụng ức chế trên 50% hoạt tính của enzym, trong đó Larix laricina có tác dụng mạnh nhất (86,33%) [79] Năm 2000, các nhà khoa học Trung Quốc đã sàng lọc 122 dược liệu dùng trong Y học Cổ truyền và phát hiện 69 dịch chiết methanol có tác dụng ức chế trong đó có 29 dịch chiết ức. .. xanthin oxidase (Ví dụ: Hg2+, Ag+…) Tác dụng của ion kim loại rất phức tạp vì nó còn ảnh hưởng tới cả trung tâm hoạt động và cơ chế xúc tác của enzym [1] 11  Các chất ức chế Xanthin oxidase bị ức chế bởi ure, nhiều loại purin, pyrimidin và các hợp chất dị vòng khác như 6 - aldehyd, 2-amino-4-hydroxypteridin-6-aldehyd, một số thuốc và một số dịch chiết từ các loài thực vật [12] Các cơ chế ức chế enzym... đó, A: Cơ chế ức chế cạnh tranh ; B: Cơ chế ức chế không cạnh tranh C: Cơ chế ức chế hỗn hợp [62] Bảng 1.1: Mối liên quan giữa cơ chế ức chế và các thông số Vmax biểu kiến, Km biểu kiến [62] Kiểu ức chế Vmax biểu kiến Km biểu kiến Không ức chế Vmax Km Ức chế cạnh tranh (competitive) Vmax αKm Ức chế không cạnh tranh (uncompetitive) Vmax/α’ Km/α’ Ức chế hỗn hợp (mixed) Vmax/α’ 13 αKm /α’ 1.3 CÁC PHƯƠNG... chiết ức chế trên 50% ở nồng độ 100 µg/ml; 40 dịch chiết nước có tác dụng ức chế xanthin oxidase, trong đó có 13 dịch chiết ức chế trên 50% ở nồng độ 100 µg/ml Ở nồng độ 50 µg/ml, có 58 dịch chiết methanol, 24 dịch chiết nước thể hiện tác dụng ức chế, với 15 dịch chiết methanol và 2 dịch chiết nước ức chế XO trên 50% Đặc biệt Polygonum cuspidatum có tác dụng mạnh nhất (IC50 = 38 µg/ml) [59] Tác dụng hạ... hỗn hợp (mixed) Vmax/α’ 13 αKm /α’ 1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE IN VITRO Nguyên tắc chung của phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase: so sánh hoạt độ enzym xanthin oxidase tinh khiết trong môi trường có và không có mẫu thử Hoạt độ enzym được xác định theo nguyên tắc dựa vào sự giảm của các tác nhân oxy hóa thích hợp như oxy, xanh methylen, cytocrom, hoặc... - Các cơ sở dữ liệu được sử dụng để rà soát, lựa chọn: + Cơ sở dữ liệu thực vật của dự án “Bảo tồn nguồn cây thuốc cổ truyền” của Viện Dược liệu [3] + Các tài liệu chuyên ngành Thực vật – Dược liệu – Dược cổ truyền: Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam của Đỗ Tất Lợi, Cây thuốc Việt Nam của Võ Văn Chi và các báo cáo điều tra về tri thức sử dụng thuốc của nhân dân các địa phương [4], [11], [14] + Các . tác dụng hạ acid uric thông qua ức chế xanthin oxidase in vitro của các dược liệu (khoảng 100 loài) được thu hái ở Việt Nam. 3. Đánh giá được tác dụng và cơ chế ức chế xanthin oxidase in vitro. cứu sàng lọc trên quy mô lớn để tìm kiếm, phát hiện các dược liệu có hiệu quả hạ acid uric tốt là rất cần thiết. Vì vậy, đề tài Sàng lọc các cây thuốc Việt Nam có tác dụng ức chế xanthin oxidase. oxidase in vitro được thực hiện với các mục tiêu cụ thể sau: 1. Triển khai được phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa UV 96 giếng Costar 3635. 2. Sàng lọc được tác