Sàng lọc các cây thuốc việt nam có tác dụng ức chế xathin oxidase in vitro

Sàng lọc được tác dụng hạ acid uric thông qua ức chế xanthin oxidase in vitro của các dược liệu khoảng 100 loài được thu hái ở Việt Nam.. Các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt động của xanthin o

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Để hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ rất nhiều của thầy

cô, bạn bè và người thân

Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thuỳ Dương

và TS Nguyễn Quỳnh Chi, TS Nguyễn Hoàng Anh những người thầy đã luôn

quan tâm, giúp đỡ, hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình hoàn thành đề tài này

in chân thành cám ơn T hương Thi n Thương và các cán bộ i n ược

li u đã h trợ tôi trong quá trình thu thập mẫu nghiên c u

in chân thành cảm ơn T guy n Th oài – hoa ược, Trường Đại h c ược uế đã h trợ tôi trong quá trình chiết xuất phân đoạn và phân lập chất nghiên c u

in chân thành cảm ơn các thầy, cô, các anh ch kỹ thuật viên, các bạn sinh viên Bộ môn ược lực đã giúp đỡ và tạo điều ki n cho tôi trong suốt quá trình nghiên c u và thực hi n đề tài

in chân thành cảm ơn các cán bộ phòng đào tạo sau đại h c, các bộ môn, phòng ban khác của Trường Đại h c ược à ội

Lời cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè, đồng nghi p những người đã luôn luôn động viên, giúp đỡ và đóng góp ý kiến cho tôi hoàn thành luận văn này

à ội, tháng 10, năm 2013

H c viên

Hoàng Thị Thanh Thảo

N 1

Chương 1 ỔN QU N L U 3

1.1 Acid u i tăng acid uric 3

1.1.1 Acid uric 3

1.1.2 Tăng acid uric m u 5

1.2 Enzym xanthin oxidase 8

1.2.1 Cấu trúc, cơ chế hoạt động v động h c c x nthin oxid se 8

1.2.2 C c yếu tố ảnh hưởng tới hoạt động c xanthin oxidase 10

1.3 C hương h nh gi t ng ứ h nthin i in vitro 14

1.3.1 Phương ph p đo qu ng 14

1.3.2 Phương ph p đo p 15

1.3.3 Phương ph p sắc ký lỏng hiệu năng c o với detector huỳnh qu ng 16

1.4 C nghi n ứ t i ư i t ng h i i th ng ứ h nthin i 16

Chương N U N L U N UN P N N P N P P N N CỨU 18

2.1 Ng y n ật i 18

2.1.1 ư c liệu nghi n c u 18

2.1.2 Chuẩn bị mẫu nghi n c u 19

2.1.3 Thuốc h chất 25

2.1.4 y m c, thiết bị d ng c 26

2.2 N i ng nghi n ứ 27

2.3 Phương h nghi n ứ 28

2.3.1 Tri n kh i phương ph p đ nh gi t c d ng c chế x nthin oxid se in vitro tr n đ UV giếng Costar 3635 28

2.3.3 Phương ph p x c định cơ chế c chế x nthin oxid se in vitro c chất c t c

d ng 34

2.3.4 Phương ph p x lý số liệu 35

Chương 3 K QU 36

1 K t t i n h i hương h nh gi t ng ứ h xanthin oxidase in vitro t n UV gi ng Costar 3635 36

3.1.1 Kết quả khảo s t động h c enzym 36

3.1.2 ết quả x y d ng đ thị inewe rver – urk c x nthin oxid se 36

3.1.3 ết quả thẩm định phương ph p th ng qu đ nh gi t c d ng c chế XO in vitro c llopurinol 37

3.2 K t ng ư t ng h acid uric th ng ứ h nthin oxidase in vitro 40

3.2.1 ết quả đ nh gi t c d ng c chế xanthin oxidase in vitro c c c c o dư c liệu 40

3.2.2 ết quả x c định C50 c c c dư c liệu tiềm năng 47

K t nh gi t ng ơ h ứ h nthin i in vitro ủ M n (Archidendron clyearia) 48

3.3.1 ết quả x c định C50 c c c ph n đoạn n đ 48

3.3.2 ết q x c định C50 c c c chất tinh khiết t ch từ ph n đoạn ACE 49

3.3.3 ết quả x c định cơ chế c ACE 50

Chương 4 N LU N 52

K LU N 60

U 61

L U M K O

P Ụ LỤC

ATP Adenosin triphosphat

BCRP Breast cancer resistance protein

CCTT Chư c th ng tin

DMSO Dimethyl sulfoxid

EULAR The European League Against Rheumatism

XO Xanthine oxidase

3.3 ng độ c chế 0 hoạt độ xanthin oxidase (IC50) c c c

1.3 C c nguy n nh n g y tăng acid uric m u 5

2.1 Quy tr nh thí nghiệm khảo s t động h c enzym 29 2.2 Quy tr nh thí nghiệm x y d ng đ thị Linewearver-Burk 30

2.3 Quy tr nh thí nghiệm đ nh gi t c d ng c chế x nthin oxid se

2.4 Đ thị bi u di n t c d ng c chế x nthin oxid se c

3.1

Đ thị bi u di n s ph thuộc theo th i gi n c lư ng cid uric

tạo th nh (bi u di n th ng qu O ) với c c dung dịch enzym c

ĐẶT VẤN ĐỀ

Acid uric là sản phẩm của quá trình chuyển hóa protein có nhân purin trong cơ thể Acid uric có vai trò quan trọng với cơ thể con người liên quan tới duy trì huyết áp, chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch [39], [44], [53], [74] Tuy nhiên, tăng acid uric máu, đặc biệt tăng acid uric máu mạn tính, lại là nguyên nhân dẫn tới nhiều vấn đề về sức khỏe như gút, tăng huyết áp, bệnh tim mạch, bệnh thận, bệnh đái tháo đường typ II [44], [74], [84] Trong đó gút là bệnh viêm khớp phổ biến nhất, ảnh hưởng đến 2,13% dân số Mỹ trong năm 2009 [23] Theo các nghiên cứu gần đây, gút và các bệnh liên quan tới tăng acid uric máu ngày càng trở nên phổ biến không chỉ ở các nước phát triển mà cả các nước đang phát triển [24], [34], [86], [109] Theo một nghiên cứu năm 2000, tỷ lệ mắc bệnh gút

ở Việt Nam ước tính là 0,14% dân số và tỷ lệ này ngày một tăng cao [10], [73]

Hạ acid uric là mục tiêu hàng đầu trong phòng, điều trị gút và các bệnh liên quan đến tăng acid uric máu [39] Hiện nay, hai nhóm thuốc hạ acid uric máu gồm các thuốc làm tăng thải acid uric qua thận và nhóm thuốc làm giảm tổng hợp acid uric Các thuốc gây tăng thải acid uric như probenecid, sulfinpyrazon có hiệu quả tốt trong việc làm hạ acid uric máu, đặc biệt làm giảm kích thước cũng như số lượng các hạt tophi Tuy nhiên, thuốc tỏ ra kém hiệu quả trên bệnh nhân suy giảm chức năng thận và có thể gây ra sỏi thận urat cũng như nhiều tác dụng phụ khác [2], [72], [83], [107] Các thuốc làm giảm tổng hợp acid uric như allopurinol, febuxostat được sử dụng khá phổ biến trên lâm sàng và thể hiện tác dụng hạ acid uric tốt Tuy nhiên, các thuốc này cũng có không ít tác dụng không mong muốn Allopurinol gây độc với gan, tổn thương thận, ban da, kích ứng đường tiêu hóa, các phản ứng quá mẫn tuy hiếm gặp nhưng nặng nề và

có thể gây tử vong [38], [72], [92] Febuxostat gây rối loạn chức năng gan, đau đầu, buồn nôn, chóng mặt [48] Vì vậy, việc tìm kiếm các dược liệu, bổ sung vào các bài thuốc điều trị gút và các bệnh liên quan tới tăng acid uric máu nhằm khắc

Tiềm năng về dược liệu của Việt Nam rất lớn [4], [11] Các nhà khoa học Việt Nam đã tiến hành các nghiên cứu về tác dụng hạ acid uric của dược liệu và bước đầu có thành công nhất định Tuy nhiên, các nghiên cứu này chủ yếu tập trung đánh giá tác dụng phòng và điều trị gút của một dược liệu hoặc một bài thuốc cụ thể, chỉ có 1 nghiên cứu sang lọc dược liệu có tiềm năng hạ acid uric của Nguyễn Thị Thanh Mai [6], [7], [75] Việc nghiên cứu sàng lọc trên quy mô lớn để tìm kiếm, phát hiện các dược liệu có hiệu quả hạ acid uric tốt là rất cần thiết Vì vậy, đề tài “Sàng lọc các cây thuốc Việt Nam có tác dụng ức chế

xanthin oxidase in vitro” được thực hiện với các mục tiêu cụ thể sau:

1 Triển khai được phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin

oxidase in vitro trên đĩa UV 96 giếng Costar 3635

2 Sàng lọc được tác dụng hạ acid uric thông qua ức chế xanthin oxidase

in vitro của các dược liệu (khoảng 100 loài) được thu hái ở Việt Nam

3 Đánh giá được tác dụng và cơ chế ức chế xanthin oxidase in vitro của

dược liệu tiềm năng nhất

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ACID URIC VÀ SỰ TĂNG ACID URIC MÁU

1.1.1 Acid uric

Acid uric có công thức phân tử là 2,6,8 - trioxypurin (C5H4N4O3), là chất chuyển hóa của purin [78]

1.1.1.1 Quá trình hình thành acid uric trong cơ thể

Acid uric là sản phẩm của quá trình thoái giáng các nucleo-protein có chứa nhân purin (adenin, guanin) trong cơ thể với sự tham gia của các enzym: phosphoribosyl pyrophosphatase (PRPP), nucleoside phosphorylase, xanthin oxidase (XO) [37], [78] (hình1.1)

Hình 1.1: Quá trình hình thành acid uric trong cơ thể [37]

Acid uric được thải trừ ra ngoài cơ thể theo hai con đường Khoảng 2/3 lượng acid uric tạo ra mỗi ngày được thải trừ qua thận, 1/3 được thải trừ qua đường tiêu hóa [50], [53]

Tại thận, 100% acid uric được lọc qua cầu thận, sau đó được tái hấp thu tới 90% tại ống thận Có nhiều kênh vận chuyển tham gia quá trình tái hấp thu acid uric tại thận (hình 1.2) Trong đó, có hai kênh quan trọng là kênh URAT1 (urat transporter) và SLC2A9 URAT1 là kênh vận chuyển urat đầu tiên được tìm thấy Đây là kênh trao đổi anion – urat nằm trên diềm bản chải của ống lượn gần Kênh SLC2A9 là kênh vận chuyển aqcid uric quan trọng nhất, công suất vận chuyển acid uric của SLC2A9 cao hơn URAT1 nhiều lần

Hình 1.2: Các kênh vận chuyển acid uric ở ống thận [50]

Con đường thải trừ acid uric qua ruột được quyết định bởi kênh ABCG2 ABCG2 còn có tên khác là BCRP, kênh vận chuyển acid uric sử dụng năng lượng ATP để vận chuyển urat vào lòng ruột [50], [53], [85]

1.1.2 Tăng acid uric máu

Tăng acid uric máu được xác định khi nồng độ acid uric máu vượt quá 7,0 mg/dl (420 µmol/l) đối với nam và 6,0 mg/dl (360 µmol/l) đối với nữ [10], [78]

1.1.2.1 Nguyên nhân gây tăng acid uric máu

Các nguyên nhân gây tăng acid uric máu được chia thành hai nhóm chính, một là do tăng sản xuất acid uric, hai là do thận giảm bài xuất acid uric Gần đây, cùng với việc thừa nhận vai trò quan trọng của con đường đào thải acid uric qua đường tiêu hóa, các nhà khoa học Nhật Bản đã đề xuất chia các nguyên nhân gây tăng acid uric máu thành 2 nhóm lớn như sau: nhóm A gồm các nguyên nhân ngoài thận (trong đó gồm 2 nhóm nhỏ, A1: tăng sản xuất acid uric, A2: giảm đào thải qua con đường ngoài thận), nhóm B gồm các nguyên nhân giảm đào thải acid uric qua thận [53] (Hình 1.3)

Hình 1.3: Các nguyên nhân gây tăng acid uric máu [53]

Các nguyên nhân gây tăng sản xuất acid uric gồm có: tăng các chất có nhân purin, rối loạn hoạt động các enzym

- Các chất có nhân purin là nguồn để tạo thành acid uric, được cung cấp

do ba nguồn: thức ăn giàu purin, tổng hợp nội sinh, tiêu hủy tế bào chết Những người thường xuyên ăn nhiều thức ăn giàu purin, sử dụng nhiểu rượu, bia có nguy cơ tăng acid uric máu và mắc bệnh gút cao hơn những người khác Tăng purin nội sinh có vai trò chủ yếu trong việc tăng acid uric máu và gút [37], [78]

- Rối loạn hoạt động các enzym là nguyên nhân quan trọng gây tăng acid uric máu PRPP và xanthin oxidase tăng hoạt động làm tăng nồng độ acid uric máu Sự thiếu hụt một phần hay toàn phần HGPRT (HGPRT xúc tác cho phản ứng nghịch chuyển acid guanylic thành guanin) làm tăng phản ứng chuyển hypoxanthin thành xanthin và sau đó là acid uric [10], [37], [78]

 Giảm đào thải acid uric qua ruột

Giảm hoạt động của kênh ABCG2 (BCRP) làm tăng đào thải acid uric qua thận nhưng lại làm giảm đào thải acid uric qua ruột và do đó làm tăng acid uric

máu [50], [53]

 Giảm đào thải acid uric qua thận

Có đến 80 – 90% bệnh nhân tăng acid uric máu bị giảm thải trừ acid uric qua thận Các đa hình ở các gen quy định URAT1 và SLC2A9 gây tăng hoạt động của các kênh vận chuyển này, do đó làm tăng tái hấp thu acid uric ở ống thận, giảm thải trừ acid uric ở thận [53], [78] Một số trường hợp giảm thải trừ acid uric qua thận do dùng thuốc (corticoid, aspirin liều thấp, thuốc lợi tiểu) hoặc suy thận dẫn đến rối loạn chức năng thận [37], [86]

1.1.2.2 Tăng acid uric máu và các bệnh liên quan

Acid uric máu ở người cao hơn so với các động vật khác nhằm giúp con người duy trì mức huyết áp cao hơn, và sự tăng acid uric máu trong thời gian ngắn có vai trò quan trọng đối với hệ thống miễn dịch và hệ thống bảo vệ chống oxy hóa Tuy nhiên, tăng acid uric máu mạn tính lại đem đến nguy cơ cao mắc các bệnh gút, bệnh tăng huyết áp, bệnh tim mạch, bệnh tiểu đường, bệnh thận [44], [74], [84]

 Tăng acid uric máu và gút

Tăng acid uric máu là điều kiện tiên quyết của bệnh gút và là đặc trưng cơ bản của bệnh gút [23], [86], [90] Bệnh nhân tăng acid uric máu 5 năm với mức acid uric máu trên 10 mg/dl có nguy cơ mắc bệnh gút là 30,5%, trong khi những người có mức acid máu dưới 7 mg/dl nguy cơ này chỉ là 0,6% [55] Một nghiên cứu cộng đồng tại Đài Loan trên 3.185 người ở độ tuổi trên 30, tỷ lệ mắc gút tăng theo nồng độ acid uric trong huyết thanh: 10,8% khi nồng độ acid uric trong huyết thanh trong khoảng 7,0-7,9 mg/dl; tăng lên 27,7% khi nồng độ acid uric trong huyết thanh trong khoảng 8,0-8,9 mg/dl; và tăng lên 61,1% khi nồng độ

acid uric trong huyết thanh trên 9,0 mg/dl [86]

 Tăng acid uric máu và tăng huyết áp, bệnh tim mạch

Tăng acid uric máu có mối liên hệ chặt chẽ với bệnh tăng huyết áp, bệnh tim mạch [69] Nồng độ acid uric máu cao làm thay đổi cấu trúc, chức năng của

vi mạch, từ đó làm rối loạn chức năng nội mô là nguyên nhân của bệnh động mạch vành và bệnh tăng huyết áp Mặt khác, tăng acid uric máu cũng làm tăng nguy cơ béo phì và suy giảm chức năng thận dẫn đến tăng nguy cơ về bệnh tim mạch [39], [84]

 Tăng acid uric máu và bệnh thận

Các nghiên cứu lâm sàng cho thấy, tăng acid uric máu làm tăng nguy cơ mắc bệnh thận Acid uric máu cao không những làm tổn hại tới động mạch vành

mà còn ảnh hưởng tới mạch máu ở thận Các nghiên cứu can thiệp gần đây cung cấp bằng chứng cho thấy, giảm urat khi sử dụng allopurinol có thể làm chậm sự tiến triển của bệnh suy thận mạn tính [39], [45], [84]

Tăng acid uric máu làm tăng nguy cơ kháng insulin, béo phì [83] Nguy cơ mắc đái tháo đường typ II của bệnh nhân gút tăng 35% đến 65% [84] so với người bình thường

Như vậy, tăng acid uric máu không chỉ là nguyên nhân gây bệnh gút mà còn đóng vai trò quan trọng trong các bệnh khác như huyết áp, tim mạch, thận và đái tháo đường typ II Hạ acid uric máu là mục tiêu điều trị quyết định trong bệnh gút và các bệnh khác liên quan tới tăng acid uric

1.2 ENZYM XANTHIN OXIDASE

Xanthin oxidase (XO) là enzym xúc tác cho phản ứng cuối cùng trong chuỗi phản ứng để tạo thành acid uric trong cơ thể Bất kỳ tác động nào ảnh hưởng đến hoạt động của xanthin oxidase cũng ảnh hưởng tới sự tạo thành acid uric trong cơ thể

Enzym XO được tìm thấy ở nhiều động vật có vú, chim, côn trùng, vi khuẩn [12] Ở động vật có vú, XO được phân bố rộng rãi ở gan, ruột, thận, phổi, tim, não, huyết tương, hồng cầu và các mô khác, trong đó tập trung chủ yếu ở gan, ruột [21] Ở người, XO được tìm thấy trong hầu hết các tế bào của cơ thể, tuy nhiên nó có nhiều nhất trong các tế bào gan và các tế bào ruột [18]

1.2.1 Cấu trúc, cơ chế hoạt động và các thông số động học của xanthin

oxidase

 Cấu trúc

Xanthin oxidase là một protein có khối lượng khoảng 300 kDa, gồm 2 tiểu đơn vị Mỗi tiểu đơn vị chứa bốn thế oxy hóa khử: một phần phụ molybden, một FAD, 2 Fe2S2 [12], [49] Phần phụ molybden bao gồm một dẫn xuất pterin hữu

cơ liên kết cộng hóa trị với 2 nguyên tử lưu huỳnh của molybdopterin, 2 nguyên

tử oxy và 1 nguyên tử lưu huỳnh khác [49] (Hình 1.4)

A B

Hình 1.4: Cấu trúc xanthin oxidase

(A: Cấu trúc không gian của xanthin oxidase, B: Phần phụ molybden)

 Cơ chế hoạt động

Hoạt động xúc tác cho phản ứng tạo thành acid uric từ xanthin xảy ra ở trung tâm molybden của xanthin oxidase Ở trạng thái oxy hóa, trung tâm molybden của enzym có thể được xây dựng như mô hình LMoVIOS(OH) với L là đại diện cho đồng yếu tố pyranopterin chung cho các enzym molybden và vonfram đơn nhân

Cơ chế hoạt động của enzym như sau: proton từ nhóm Mo-OH tấn công trung tâm ái nhân tại vị trí C-8 của cơ chất, đồng thời vận chuyển hydro giải phóng từ vị trí C-8 tới nhóm Mo-S tạo ra LMoIVO(SH)(OR) – giai đoạn 1 Sản phẩm trung gian này bị phá vỡ bởi sự vận chuyển electron giữa các trung tâm oxy hóa khử khác trong enzym, giải phóng H+, tạo ra LMoVOS(OR) – giai đoạn

2 Sau đó, hydro từ dung môi thay thế nhóm R, quay về trạng thái ban đầu LMoVIOS(OH) của enzym – giai đoạn 3 [32] (Hình 1.5)

Hình 1.5: Cơ chế hoạt động của xanthin oxidase

 Các thông số động học enzym

Thông số dược động học của enzym (Km và Vmax) được xác định bằng phương pháp đo quang và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Giá trị Km thu được nằm trong khoảng 5,32 – 13,8 µM [54]

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt động của xanthin oxidase

 Nồng độ cơ chất

Xanthin oxidase xúc tác cho phản ứng chuyển hypoxanthin và xanthin thành acid uric Khi nồng độ của xanthin trong cơ thể tăng thì tốc độ của phản ứng chuyển hóa sẽ tăng, acid uric tạo ra sẽ càng nhiều Tuy nhiên, đến một mức nào đó, enzym sẽ bão hòa cơ chất và tốc độ phản ứng không tăng lên nữa [1] Vì vậy, cần lựa chọn nồng độ xanthin thích hợp trong phản ứng để tốc độ phản ứng tối đa nhưng không lãng phí cơ chất

 Nồng độ enzym

Khi nồng độ enzym tăng lên, tốc độ phản ứng cũng tăng Tuy nhiên, khi nồng độ enzym tăng đến một mức nhất định, sản phẩm tạo ra quá nhiều sẽ tác động vào trung tâm dị lập thể của enzym, phản ứng bão hòa và tốc độ phản ứng

sẽ không tăng lên nữa [1] Nồng độ enzym cũng là một yếu tố quan trọng khi xác

 pH

Enzym rất nhạy cảm với pH của môi trường, vì vậy pH có tác dụng rất lớn đối với tốc độ phản ứng enzym Mỗi enzym có một giá trị pH phù hợp nhất cho hoạt động của enzym đó Một sự thay đổi nhỏ so với pH tối ưu cũng dẫn đến sự giảm hoạt độ enzym do nó làm thay đổi sự ion hóa của nhóm chức trong trung tâm hoạt động enzym [1] Với xanthin oxidase, pH thích hợp là 7,5 – 8 Cũng có nghiên cứu khác cho thấy pH thích hợp từ sữa bò là 7,5 và từ sữa dê là 7,2 – 7,4 [54]

 Ion kim loại

Các ion kim loại nặng có thể ức chế xanthin oxidase (Ví dụ: Hg2+,

Ag+…) Tác dụng của ion kim loại rất phức tạp vì nó còn ảnh hưởng tới cả trung tâm hoạt động và cơ chế xúc tác của enzym [1]

Xanthin oxidase bị ức chế bởi ure, nhiều loại purin, pyrimidin và các hợp chất dị vòng khác như 6 - aldehyd, 2-amino-4-hydroxypteridin-6-aldehyd, một

số thuốc và một số dịch chiết từ các loài thực vật [12]

Các cơ chế ức chế enzym bao gồm ức chế cạnh tranh (competitive inhibition), ức chế không cạnh tranh (uncompetitive inhibition) và ức chế hỗn hợp (mixed inhibition) Chất ức chế cạnh tranh là những chất có cấu trúc tương

tự cơ chất, kết hợp với enzym ở trung tâm hoạt động, ngăn chặn enzym kết hợp với cơ chất Trong cơ chế ức chế không cạnh tranh (uncompetitive inhibition), chất ức chế gắn với trung tâm điều hòa của enzym làm giảm hoặc mất khả năng hoạt động của enzym [62]

Cơ chế ức chế được xác định thông qua đồ thị phương trình Lineweaver – Burk, là đồ thị hàm số ngược 1/V đối với nồng độ cơ chất (ký hiệu là [S]) với sự

có mặt và không có mặt chất ức chế ở các nồng độ khác nhau (được ký hiệu là [I]) (hình 1.6) Mối liên quan giữa các thông số động học biểu kiến của enzym khi có mặt chất ức chế với cơ chế ức chế được thể hiện ở bảng 1.1 [62]

A B

C

Hình 1.6: Đồ thị hàm số ngược 1/v đối với [S]

Trong đó, A: Cơ chế ức chế cạnh tranh ; B: Cơ chế ức chế không cạnh tranh

Ức chế cạnh tranh (competitive) Vmax αKm

Ức chế không cạnh tranh (uncompetitive) Vmax/α’ Km/α’

Ức chế hỗn hợp (mixed) Vmax/α’ αKm /α’

Nguyên tắc chung của phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase: so sánh hoạt độ enzym xanthin oxidase tinh khiết trong môi trường có

và không có mẫu thử Hoạt độ enzym được xác định theo nguyên tắc dựa vào sự giảm của các tác nhân oxy hóa thích hợp như oxy, xanh methylen, cytocrom, hoặc dựa vào sự giảm của cơ chất hay sự tạo thành của sản phẩm như acid uric bằng các phương pháp: đo quang, đo áp, đo huỳnh quang

1.3.1 Phương pháp đo quang

 Phương pháp đo quang dựa trên định lượng acid uric tạo ra

Nguyên tắc chung: hoạt độ xanthin oxidase được xác định thông qua lượng acid uric tạo thành theo phản ứng:

Lượng acid uric tạo thành được định lượng bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 290nm

Hỗn hợp phản ứng (gồm dung dịch đệm, dung dịch EDTA, dung dịch xanthin, enzym xanthin oxidase với mẫu trắng, các mẫu đối chiếu thêm dung dịch với các nồng độ khác nhau, các mẫu thử thêm cao dược liệu ở các nồng độ khác nhau) được ủ ấm ở nhiệt độ thích hợp, trong thời gian thích hợp Sau khi

phản ứng kết thúc, đem các hỗn hợp đo quang ở bước sóng 290nm [77]

Phương pháp này được nhiều nhà nghiên cứu áp dụng và điều chỉnh thiết

kế nghiên cứu nhằm phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Thí nghiệm thường được tiến hành trên ống nghiệm, sử dụng máy quang phổ UV thông thường [7] Tuy nhiên, cách này chỉ phù hợp với số lượng mẫu đo không quá nhiều Khi số lượng mẫu thử tăng lên, việc tiến hành thử từng mẫu trên ống

Xanthin oxidase

đo, đồng thời bị hạn chế do thời gian nghiên cứu kéo dài và chi phí cao Có thể tiến hành thí nghiệm trên đĩa UV 96 giếng, sử dụng hệ thống ELISA để giảm sai

số, rút ngắn thời gian nghiên cứu và giảm chi phí [59], [75]

 Phương pháp đo quang dựa trên chất ABT

(2,2’-azino-di (3ethylbenzthiazoline-6-sulphonate))

Nguyên tắc chung: hoạt độ xanthin oxidase được xác định thông qua lượng ABTS dạng oxy hóa tạo thành theo các phản ứng:

Hypoxanthin + 2 H2O + 2 O2 Acid uric + 2 H2O2

Acid uric + O2 Allantonin + H2O2 + CO2

H2O2 + ATBSred ATBSox + 2 H2O

Hoạt độ của xanthin oxidase được xác định thông qua việc đo độ hấp thụ của ATBSox tạo thành sau 10 phút ở bước sóng 410nm [70]

Phương pháp này có độ nhạy khá cao, có thể định lượng được hoạt độ lên tới 20 U/ml, và còn được áp dụng để định lượng hoạt độ enzym trong cả nghiên

cứu in vivo, tránh được sai số do enzym uricase so với phương pháp đo quang

dựa trên định lượng acid uric [70]

1.3.2 Phương pháp đo áp

Xanthin oxidase là một chất cho electron nên có thể xác định hoạt độ enzym thông qua việc đánh giá sự khử của các chất nhận electron phù hợp như oxy, xanh methylen và cytocrom C

Nguyên tắc của phương pháp dựa trên việc xác định tỷ lệ oxy tiêu thụ bằng phương pháp đo áp ở 37oC [36]

Xanthin oxidasse Uricase

Peroxidase

Nguyên tắc của phương pháp dựa trên phản ứng oxy hóa hydroxypteridin (AHP) thành isoxanthopterin (IXP) dưới sự xúc tác của xanthin oxidase Lượng IXP tạo ra tỷ lệ với hoạt độ xanthin oxidase được phân tách qua cột sắc ký và được phát hiện, định lượng bằng detector huỳnh quang với bước

2-amino-4-sóng kích thích và bước 2-amino-4-sóng phát hiện tương ứng là 343nm và 410nm [87]

1.4 CÁC NGHIÊN CỨU TÌM KIẾM DƯỢC LIỆU CÓ TÁC DỤNG HẠ

ACID URIC THÔNG QUA ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE IN VITRO

Ức chế enzym XO là một trong các cơ chế chính mà các thuốc hạ acid uric hướng tới Trên thế giới đã có những nghiên cứu sàng lọc dược liệu, các

nhóm hoạt chất hay các hoạt chất có tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase in

vitro

Dựa trên kinh nghiệm sử dụng dược liệu trong điều trị gút và các triệu chứng liên quan của thổ dân Bắc Mỹ, Owen và cộng sự đã tiến hành sàng lọc

khả năng ức chế xanthin oxidase in vitro của 26 loài thuộc 18 họ thực vật Kết

quả cho thấy, ở mức liều 100 µg/ml, có 20% số loài được thử có tác dụng ức chế

trên 50% hoạt tính của enzym, trong đó Larix laricina có tác dụng mạnh nhất

(86,33%) [79] Năm 2000, các nhà khoa học Trung Quốc đã sàng lọc 122 dược liệu dùng trong Y học Cổ truyền và phát hiện 69 dịch chiết methanol có tác dụng

ức chế trong đó có 29 dịch chiết ức chế trên 50% ở nồng độ 100 µg/ml; 40 dịch chiết nước có tác dụng ức chế xanthin oxidase, trong đó có 13 dịch chiết ức chế trên 50% ở nồng độ 100 µg/ml Ở nồng độ 50 µg/ml, có 58 dịch chiết methanol,

24 dịch chiết nước thể hiện tác dụng ức chế, với 15 dịch chiết methanol và 2 dịch

chiết nước ức chế XO trên 50% Đặc biệt Polygonum cuspidatum có tác dụng

mạnh nhất (IC50 = 38 µg/ml) [59] Tác dụng hạ acid uric của Polygonum

cuspidatum sau đó đã tiếp tục được nghiên cứu sâu hơn [60] Cũng theo phương

pháp này, các nhà khoa học Australia đã sàng lọc 17 dược liệu và phát hiện được

dịch chiết loài Stemodia grossa có tác dụng mạnh nhất [94] Một số nghiên cứu

của Ấn Độ, Phillipine, Jordani cũng tiến hành theo hướng này [20], [52], [97]

Dược liệu thuộc các họ được sử dụng nhiều trong Y học Cổ truyền với tác dụng chống viêm, giảm đau cũng được các nhà khoa học trên thế giới đưa vào sàng lọc như các dược liệu họ Sim (Myrtaceae) [95], họ Dây gối (Celastraceae)

và họ Hoa môi (Lamiaceae) [46], chi Lychnophoras họ Cúc (Asteraceae) [42] Dược liệu thuộc các họ này được sử dụng phổ biến với tác dụng chống viêm, giảm đau đồng thời có chứa flavonoid, nhóm hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học trong đó có tác dụng chống oxy hóa

Các nhóm hợp chất có tiềm năng ức chế xanthin oxidase như flavonoid,

polyphenol, coumarin hay tanin đã được sàng lọc tác dụng trên mô hình in vitro

để tìm kiếm các chất có tác dụng ức chế mạnh nhất [27], [28], [35], [89] Kết hợp với nghiên cứu cấu trúc, đánh giá tương tác không gian giữa phân tử hợp chất với enzym, liên quan cấu trúc – tác dụng, đã tìm ra một số chất có tác dụng tốt như apigenin, myricetin và luteolin [65], [67]

Phối hợp với các nhà khoa học Nhật Bản, Nguyễn Thị Thanh Mai và cộng

sự đã thực hiện nghiên cứu sàng lọc 288 dịch chiết từ 96 dược liệu thu hái ở miền Nam Việt Nam để phân lập các hoạt chất có hoạt tính ức chế mạnh nhất Kết quả cho thấy 21 dịch chiết có tác dụng ức chế hoạt tính enzym trên 50% ở

nồng độ 50 µg/ml, trong đó dịch chiết methanol của 4 loài Artemisia vulgaris,

Caesalpinia sappan, Blumea balsamifera, Chrysanthemum sinense và dịch chiết

trong methanol – nước của Tetracera scandens [75]

Trong đề tài này, các dược liệu được biết đến với tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, công dụng trị bệnh xương khớp thu thập được từ dự án ‘Bảo tồn nguồn cây thuốc cổ truyền’ của Viện Dược liệu sẽ được đưa vào sàng lọc tìm kiếm các dược liệu có tiềm năng hạ acid uric thông qua ức chế xanthin oxidase

in vitro

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1 Dược liệu nghiên cứu

- Dược liệu được lựa chọn đưa vào nghiên cứu dựa trên kết quả rà soát thông tin trong các cơ sở dữ liệu về các mẫu thực vật, dược liệu được thu hái tại Việt Nam theo dự án “Bảo tồn nguồn cây thuốc cổ truyền” của Viện Dược liệu [3] (phụ lục 1) Việc định danh tên khoa học của mẫu dược liệu do cử nhân Ngô Văn Trại, Viện Dược liệu xác định Mẫu tiêu bản hoặc mẫu cây được lưu giữ tại Viện Dược liệu

- Tiêu chí lựa chọn dược liệu đưa vào danh sách sàng lọc: các dược liệu được ghi nhận có tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, ức chế XO, hạ acid uric, điều trị bệnh xương khớp.

- Các cơ sở dữ liệu được sử dụng để rà soát, lựa chọn:

+ Cơ sở dữ liệu thực vật của dự án “Bảo tồn nguồn cây thuốc cổ truyền” của Viện Dược liệu [3]

+ Các tài liệu chuyên ngành Thực vật – Dược liệu – Dược cổ

truyền: Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam của Đỗ Tất Lợi, Cây thuốc Việt

Nam của Võ Văn Chi và các báo cáo điều tra về tri thức sử dụng thuốc của nhân

dân các địa phương [4], [11], [14]

+ Các nghiên cứu về tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, ức chế

XO, hạ acid uric của các mẫu dược liệu thu được đã được công bố [8], [13], [9],

2.1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu

- Phương pháp chiết xuất dược liệu: Cân 100 g mẫu dược liệu đã sấy khô cho vào bình cầu 1 lít, thấm ẩm với MeOH rồi tiếp tục đổ MeOH ngập dược liệu khoảng 3 cm Chiết (2 lần) hồi lưu cách thuỷ trong 2 giờ, lọc qua giấy lọc lấy dịch chiết Cất thu hồi dung môi, sấy chân không để thu được cao toàn phần Việc chiết xuất cao toàn phần dược liệu được thực hiện tại Khoa Phân tích, Viện Dược liệu

- Mẫu thử: cao toàn phần của từng dược liệu được sấy tới khối lượng không đổi, hòa tan trong dung môi dimethyl sulfoxid (DMSO) để được dung dịch gốc ở nồng độ 10 mg/ml Dung dịch gốc pha trong DMSO sau đó được pha loãng bằng đệm phosphate pH 7,5 thành các nồng độ thích hợp để thực hiện các phản ứng enzym

- Dược liệu có tiềm năng ức chế xanthin oxidase mạnh nhất được chiết xuất phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần để được các phân đoạn n-hexan, cloroform, ethyl acetat, n-butanol và nước Phân đoạn có tác dụng tốt nhất được sử dụng để phân lập chất Quá trình chiết phân đoạn và phân lập chất được thực hiện bởi nhóm nghiên cứu của PGS TS Nguyễn Thị Hoài, Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược Huế

Bảng 2.1: Danh sách dược liệu đưa vào sàng lọc

Bộ phận dùng

Tác dụng liên quan

Các cây thuốc thu hái tại vườn quốc gia Bạch Mã, tỉnh Thừa Thiên Huế

[19]

Chữa đau xương khớp [3]

Chống oxh [33]

4 CT16 Lá men Mosla dianthera

Toàn cây

Chống viêm, chống oxh [100]

Cudrania tricuspidata Carr

Bur

Chống viêm, chống oxh [102]

Trị thấp khớp [3]

Trị thấp khớp [3]

halicacabum L Sapindaceae

Toàn cây

Chữa tê thấp, đau lưng [3]

Rễ, lá, thân

Chống viêm [15], [22]

Chống viêm khớp [56]

[71]

Trị đau nhức xương khớp [3]

Các cây thuốc thu hái tại Sapa, tỉnh Lào Cai

Trừ phong thấp [3]

Trị đau xương khớp [3]

STT Mã Tên phổ

Bộ phận dùng

Tác dụng liên quan

hoa tím

Cynoglossum zeylanicum Boraginaceae Cả cây

Chữa xương khớp [3]

Trị đau nhức xương khớp [3]

Các cây thuốc thu hái tại Ba Vì, thành phố Hà Nội

Cành lá mang quả

Chống viêm [96]

ghaesembilla Gaertn Euphorbiaceae

Cành non, lá

Trừ phong thấp [4]

Chữa đau nhức xương khớp [3]

cây

Rễ, lá trị phong tê thấp, sưng khớp [3]

Toàn cây

Chống viêm, chống oxh [51]

axillaris Burtt & Hill Anacardiaceae Vỏ thân

Chứa flavonoid [99]

Chống viêm khớp [3]

Trị viêm khớp [3]

Chống viêm khớp [91]

Chống viêm khớp [91]

pruniflorum Kurz Hypericaceae Cành, lá

Chống oxh [11]

Trị đau xương khớp [3]

hoắc

Epimedium macranthun Mooren

et Decne

Trừ phong thấp trị đau xương khớp [11]

Chữa phong thấp [11]

Chữa phong thấp [11]

Chứa flavonoid [30]

39 BV26

Cơm rượu(quả xanh)

Glycosmis pentaphylla Correa Rutaceae Cành, lá

Chống viêm [58]

Chống viêm, chống oxh [64]

[11]

Rễ có tác dụng chống oxh [108]

Chống oxh [57]

Lá, cành mang hoa

Chống oxh [104]

giảm đau [88]

STT Mã Tên phổ

Bộ phận dùng

Tác dụng liên quan

Pseuderanthemum palatiferum Nees

Cành mang lá, hoa

Quả chữa thấp khớp [11]

Lá: chống viêm, chống oxh [43]

Trị đau nhức xương khớp [3]

Chống viêm [9]

Trị viêm khớp [3]

Chống viêm[3], Chứa isoflavonoid [101]

Trị thấp khớp [3]

cành leo

Uncaria scandens Smith

Hutch

CCTT

Đoạn cành có móc

Trị đau nhức xương khớp [3]

59 BV33

Tầm kho mây (dây cốt khí)

Ventilago leiocarpa

Chống viêm [26]

Các cây thuốc thu hái tại Vườn quốc gia Phong Nha - Kẻ Bàng, tỉnh Quảng Bình

pedunculata Hypoxidaceae Thân rễ

Chống viêm [61]

Chống viêm [98]

63 BV11 Gai Anisomeles indica L

Chống viêm [93]

Thân, rễ

và lá

Trị phong thấp [3]

Chống viêm [76]

chinensis L DC Araceae Thân, lá

Trị đau lưng mỏi gối[3]

Thân, cành, lá

Chứa flavonoid [11]

Chống oxh [103]

Chữa đau nhức xương khớp [3]

Chống oxh [16]

Cành mang hoa

Chống viêm [31]

[11]

angustifolia Convallariaceae Thân rễ Trị tê thấp [3]

Chống viêm [66]

Chữa đau nhức lưng gối[3]

Chống oxh [13], chứa flavonoid [80]Chống viêm

STT Mã Tên phổ

Bộ phận dùng

Tác dụng liên quan

[106]

82 CT93 Cỏ sữa to lá

Pseuderanthemum palatiferum Nees

XO [75]

[81]

avicennae DC Lauraceae Cành, lá Trị tê thấp [3]

Các cây thuốc của đồng bào dân tộc Pako - Vân Kiều ở Quảng Trị

Archidendron clyearia (Jack.) I

Niels

mang lá

Chống viêm, chống oxh [8]

chữa đau xương khớp

Cành mang lá,

rễ

Trị thấp khớp [11]

reticulatus Poir Euphorbiaceae PTMĐ Tiêu viêm[3]

Chú thích:

CCTT: Chưa có thông tin, oxh: oxy hóa, PTMĐ: Phần trên mặt đất

Các mẫu BV55 và BV37 cùng loài nhưng khác nhau bộ phận thu mẫu

Các mẫu BV56 và BV57 cùng loài nhưng khác nhau bộ phận thu mẫu

2.1.3 Thuốc, hóa chất

- Thuốc đối chiếu: allopurinol (Sigma Aldrich)

- Xanthine oxidase từ sữa bò (9 U/mg protein, 8 mg protein/ml, Sigma Aldrich)

- Hóa chất để pha mẫu dược liệu: dimethyl sulfoxid (Merck)

- Hóa chất pha đệm Na2HPO4.2H2O, KH2PO4, HCl, NaOH (Sigma Aldrich)

- Hóa chất cần cho chiết xuất: methanol đạt tiêu chuẩn công nghiệp

2.1.4 Máy móc, thiết bị, dụng cụ

- Máy đo pH (EUTECH)

- Máy ly tâm (HERMLE Z300)

- Máy siêu âm (Power sonic 405)

- Hệ thống ELISA gồm máy đọc khay vi tinh thể (Biotek, Hoa Kì) và máy

ủ lắc khay (Awareness, Hoa Kì)

- Máy cất nước 2 lần (Halminton, Hoa Kì)

- Thiết bị khuấy từ (Heidolph, Đức)

- Cân phân tích AY 220 (SHIMADZU)

- Đĩa UV 96 giếng đáy phẳng Costar 3635 (Corning)

- Micropipet một đầu kênh và đa kênh với các loại thể tích: 2-20 µl,

10-100 µl, 10-100-10-1000 µl, 10-1000-5000 µl (Eppendorf)

- Đầu côn, microtube các loại

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Để thực hiện các mục tiêu đề ra, đề tài được thiết kế với các nội dung sau:

- Thực hiện mục tiêu 1: Triển khai được phương pháp đánh giá tác dụng

ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa UV 96 giếng Costar 3635

+ Khảo sát động học enzym nhằm lựa chọn hoạt độ enzym và

thời gian dừng phản ứng thích hợp nhất

+ Xây dựng đồ thị Linewearver –Burk, xác định thông số Km của

XO trên đĩa UV 96 giếng Costar 3635

+ Thẩm định phương pháp thông qua đánh giá tác dụng ức chế XO

in vitro của allopurinol

- Thực hiện mục tiêu 2: Sàng lọc được tác dụng hạ acid uric thông qua

ức chế xanthin oxidase in vitro của các dược liệu

+ Đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase in vitro của các cao toàn phần dược liệu ở 3 nồng độ 100 µg/ml, 50 µg/ml và 10

µg/ml để lựa chọn ra các dược liệu có tiềm năng

+ Xác định IC50 của các dược liệu có tiềm năng ức chế xanthin oxidase để lựa chọn ra dược liệu có tác dụng mạnh nhất

- Thực hiện mục tiêu 3: Đánh giá được tác dụng và cơ chế ức chế

xanthin oxidase in vitro của dược liệu tiềm năng nhất

+ Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của các phân

đoạn chiết xuất được từ dược liệu có tác dụng ức chế XO mạnh nhất

+ Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của các chất

phân lập được từ phân đoạn có tác dụng ức chế XO mạnh nhất

+ Xác định cơ chế ức chế XO in vitro của chất có tác dụng mạnh

nhất

Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase trên đĩa UV 96 giếng Costar 3635 được triển khai theo phương pháp của Noro trong ống nghiệm

và của Nguyễn Thị Thanh Mai trên đĩa 96 giếng và được điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm [75], [77]

Nguyên tắc của phương pháp dựa trên sự tạo thành của acid uric từ xanthin nhờ sự xúc tác của xanthin oxidase Lượng acid uric tạo ra tỷ lệ thuận với hoạt độ enzym và được định lượng bằng phương pháp đo quang ở 290nm Mẫu có chất thử được so sánh với mẫu không có chất thử để đánh giá tác dụng

ức chế enzym của chất thử

2.3.1 Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in

vitro trên đĩa UV 96 giếng Costar 3635

 Chuẩn bị các hóa chất cần thiết:

- Đệm phosphat 70mM, pH = 7,5

- Enzym xanthin oxidase ở các nồng độ khác nhau trong đệm phosphat

- Cơ chất: dung dịch xanthin 150 µM trong đệm phosphat

- Hóa chất dừng phản ứng: dung dịch HCl 1N

2.3.1.1 Khảo sát động học enzym xanthin oxidase trên đĩa UV 96 giếng Costar

3635

 Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm được bố trí như hình 2.1

Hình 2.1: Quy trình thí nghiệm khảo sát động học enzym

+ Giếng thử và giếng trắng được bố trí theo từng cặp

+ Mỗi hoạt độ enzym được thử trong 6 giếng liền nhau

+ Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí như hình 2.2

Hình 2.2: Quy trình thí nghiệm xây dựng đồ thị Linewearver-Burk

2.3.1.3 Thẩm định phương pháp thông qua đánh giá tác dụng ức chế XO in vitro của allopurinol

 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí như hình 2.3

Hình 2.3: Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase của

allopurinol

+ Mẫu thử là allopurinol ở các nồng độ khác nhau

+ Song song với mẫu chứng có một mẫu trắng của chứng, song song với mỗi mẫu thử có một mẫu trắng của thử được tiến hành tương tự nhưng thay đổi trình tự cho enzym vào giếng (enzym được cho vào sau HCl 1N)

+ Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

 Đánh giá kết quả:

- Tính I (% ức chế) theo công thức :

∆ODchứng = ODchứng - ODtrắng chứng

∆ODthử = ODthử - ODtrắng thử

- Xác định nồng độ ức chế 50% hoạt độ xanthin oxidase (IC50)

2.3.2 Áp dụng đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa UV

96 giếng Costar 3635 của các dược liệu đưa vào sàng lọc

2.3.2.1 Đánh giá ảnh hưởng của cao dược liệu lên hoạt độ xanthin oxidase in vitro

 Bố trí thí nghiệm:

Trên mỗi đĩa UV 96 giếng Costar 3635 gồm có: giếng chứng, giếng đối chiếu (allopurinol) và các giếng thử Bố trí hỗn hợp thử trong các giếng được thể hiện ở bảng 2.2

+ Qui trình tiến hành như hình 2.3, cụ thể như sau:

 Trong các giếng chứng/đối chiếu/thử được cho tương ứng gồm: 50µl dung dịch đệm/dung dịch allopurinol/dung dịch thử,