khảo sát tiềm năng kháng khuẩn từ cao chiết lá cây ổi psidium guajava l

chứa nhiều hợp chất phenolic ức chế phản ứng peroxid hóa trong cơ thể, do đó nó có thể ngăn chặn các bệnh mãn tính khác nhau như bệnh tiểu đường, bệnh tim mạch và ung thư.Hơn nữa, ổi làm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

KHẢO SÁT TIỀM NĂNG KHÁNG KHUẨN TỪ

CAO CHIẾT LÁ CÂY ỔI (Psidium guajava L.)

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC – Y DƯỢC

GVHD : ThS Dương Nhật Linh

TS Nguyễn Tấn Phát SVTH:Nguyễn Đoàn Thanh Liêm MSSV: 1553010088

Khóa : 2015 – 2019

Tp Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2019

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

đạt kiến thức cơ bản để giúp em làm cơ sở cho đề tài nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến cô ThS Dương Nhật Linh đã tận tình

hướng dẫn, động viên, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu, tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt trong suốt thời gian thực hiện đề tài này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy TS Nguyễn Tấn Phát đang

công tác tại Viện Công nghệ Hóa học là người đã giúp đỡ em rất nhiều về mặt trang thiết bị và phương pháp thực hiện có trong đề tài của em

Em xin cảm ơn chị Trần Thị Á Ni đã hết lòng giúp đỡ em giải quyết các vấn đề

gặp phải trong quá trình thực hiện đề tài

Và nhân dịp này em xin gửi lời cảm ơn đến ba mẹ người đã sinh thành dưỡng dục

và nuôi dạy em nên người để em có được ngày hôm nay

Tôi cũng xin cảm ơn tất cả các bạn cùng làm khóa luận tốt nghiệp chung với tôi ở phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh – Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã bên cạnh giúp đỡ tôi hoàn thành tốt đề tài

Sinh viên thực hiện Nguyễn Đoàn Thanh Liêm

Tháng 6/2019

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC SƠ ĐỒ vii

DANH MỤC BIỂU ĐỒ viii

PHẦN IĐẶT VẤN ĐỀ 9

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Tổng quan về nguyên liệu 6

1.1.1 Sơ lược về cây ổi (Psidium guajava L.) 6

1.1.2 Nguồn gốc và sự phân bố 7

1.1.3 Đặc điểm hình thái 7

1.1.4 Thành phần hóa học của cây ổi 9

1.1.5 Giá trị dược liệu của cây ổi 12

1.2 Tổng quan về một số vi khuẩn gây bệnh ở người 13

1.2.1 Staphylococcus aureus kháng methicilin (MRSA) 13

1.2.2 Escherichia coli 15

1.2.3 Salmonella typhi 16

1.2.4 Pseudomonas aeruginosa 17

1.3 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước 17

1.4 Khái quát về phương pháp chiết cao dược liệu 19

1.4.1 Phân loại cao dược liệu: 20

1.4.2 Các kĩ thuật chiết dược liệu: 20

1.4.2.1 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt (Percolation) 20

1.4.2.2 Kỹ thuật chiết ngâm dầm (Maceration) 21

2.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 29

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 29

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường 29

2.2 Phương pháp nghiên cứu 30

2.2.1 Bố trí thí nghiệm 30

2.2.2 Quy trình thu nhận và xử lý mẫu 31

2.2.3 Xác định tên khoa học của cây thuốc 31

2.2.4 Quy trình chiết xuất cao dược liệu từ lá cây ổi 31

2.2.5 Khảo sát giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết 32

2.2.6 Định tính khả năng kháng khuẩn gây bệnh 33

2.2.7 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với vi khuẩn gây bệnh 35

2.2.8 Xác định cấu trúc hợp chất tự nhiên trong lá cây ổi 35

PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Kết quả giám định tên khoa học của cây 29

3.2 Kết quả chiết cao dược liệu 37

3.2.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết đến khối lượng cao chiết thu

được từ lá cây ổi 37

3.2.2 Xác định độ nhiễm khuẩn của cao chiết 38

3.3 Kết quả định tính khả năng kháng khuẩn 38

3.4 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết 41

3.5 Điều chế các phân đoạn từ cao ethyl axetat 42

3.6 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các cao phân đoạn cao ethyl axetat 433.7 Xác định cấu trúc hợp chất tự nhiên trong lá cây ổi 44

Danh mục viết tắt

Cộng sự : cs

Staphylococcus aureus kháng methycillin : MRSA Escherichia coli : E.coli Salmonella typhi : S.typhi

Pseudomonas aeruginosa : P.aeruginosa

Muller Hinton Agar : MHA Dimethyl sulfoxid : DMSO Nutrient Agar : NA

Psidium guajava : P.guajava

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Hiệu suất thu cao từ dung môi chiết 37

Bảng 3.2 Hiệu suất thu cao từ các loại dung môi chiết 37

Bảng 3.3 Kết quả số lượng nấm và vi khuẩn sống có trong cao chiết 38

Bảng 3.4 Đường kính vòng vô khuẩn (mm) của các loại cao chiết 39

Bảng 3.5 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các loại cao chiết (mg/mL) 41

Bảng 3.6 Khối lượng của các phân đoạn thu được (g) 42

Bảng 3.7 Đường kính vòng vô khuẩn (mm) của các phân đoạn 43

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây ổi (Psidium guajava L.) 6

Hình 1.2 Lá , hoa và quả ổi 9

Hình 1.3 Cấu trúc của 2 triterpenoids trong lá cây ổi 10

Hình 1.4 Cấu trúc của 16 loại carotenoids có trong lá cây ổi 11

Hình 1.5 Cấu trúc của 3 loại benzen trong lá cây ổi 11

Hình 2.1 Kết quả kháng vi khuẩn bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch 34

Hình 3.1 Đường kính vòng kháng khuẩn của các loại cao chiết 40

Hình 3.2 Nồng độ ức chế tổi thiểu (MIC) của cao ethyl axetat từ lá cây ổi 42

Hình 3.3 khả năng kháng khuẩn của 5 phân đoạn 44

Hình 3.4 Cấu trúc hoá học 45

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 30

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Đường kính vòng vô khuẩn (mm) của các loại cao chiết 39Biểu đồ 3.2 Đường kính vòng vô khuẩn (mm) của các phân đoạn 43

PHẦN I

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới nóng ẩm, người dân tiếp xúc nhiều với bùn đất ẩm ướt kéo dài chính là điều kiện thuận lợi cho các loài vi khuẩn, vi nấm phát triển mạnh, các bệnh về da và niêm mạc do nấm, nhiễm trùng do vi khuẩn gây ra ngày càng phổ biến và nghiêm trọng (Al-Alawi và cs., 2005) Bên cạnh đó, việc sử dụng thuốc để trị bệnh ngày càng gia tăng, phương pháp chữa trị hiện nay chủ yếu là dùng kháng sinh nên dẫn đến tình trạng kháng thuốc của vi sinh vật (Trần Xuân Thuyết, 2011)

Vào năm 2013, theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), Việt Nam được xếp vào danh sách các nước có tỉ lệ kháng thuốc kháng sinh cao nhất thế giới (Theo WHO, 2013) Ở Châu Âu mỗi năm, số ca nhiễm và tử vong do vi khuẩn đa kháng thường gặp nhất thường

là Escherichia coli, Enterococcus faecium, Streptococcus pneumoniae, Klebsiella

pneumonia, Pseudomonas aeruginosa (Francesca và cs., 2015) Nhiễm trùng thông

thường trong chăm sóc sơ sinh đang ngày càng trở nên cực kỳ khó khăn, và đôi khi không thể điều trị (Francesca và cs., 2015) Vì vậy, việc tìm ra nguồn thuốc mới thay thế cho các thuốc đang sử dụng trở nên cấp thiết trong đó thực vật là những nguồn đầy tiềm năng đang được quan tâm

Ổi (Psidium guajava L.) chứa nhiều hợp chất phenolic ức chế phản ứng peroxid hóa

trong cơ thể, do đó nó có thể ngăn chặn các bệnh mãn tính khác nhau như bệnh tiểu đường, bệnh tim mạch và ung thư.Hơn nữa, ổi làm giảm lượng phóng xạ tự do trong cơ

thể, có nghĩa là các polyphenol trong lá ổi có thể ngăn ngừa xơ vữa động mạch, đục thủy

tinh thể và cũng ức chế lão hóa sinh học của cơ thể và da.Lá ổi chứa triterpenes, cineol và tannin Ngoài ra, ba lavonoid (avicularin, guaijaverin và quercetin) đã được phân lập từ lá.Trong lá trưởng thành, nồng độ flavonoid lớn nhất được tìm thấy trong: Quercetin

> Myricetin > Kaempferol > Luteolin (Anand và cs., 2016)

Ổi (Psidium guajava L.) rất giàu các chất chống oxy hóa, vitamin C, kali và chất

xơ Những thành phần dinh dưỡng này chính là những yếu tố làm nên lợi ích nhiều mặt

về sức khỏe của trái ổi Trong một số nghiên cứu, cây ổi (Psidium guajava L.) cho thấy

hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn gây bệnh đáng kể như Staphylococcus spp.,

Shigella spp., Salmonella spp., Bacillus spp., Escherichia coli, Clostridium spp,

Năm 2005, Mecks và cộng sự đã nghiên cứu ra được có hơn 20 hợp chất hoạt tính sinh học đã được chiết từ lá, thân, vỏ và rễ của cây ổi (Meckes và cs., 2005) Lá ổi được sử dụng để điều trị tiêu chảy và đau bụng Lá ổi đã được sử dụng ở Mỹ như là kháng sinh ở dạng thuốc bôi hoặc thuốc sắc cho vết thương, loét và đau răng (Meckes và cs., 2005) Theo kết quả nghiên cứu của Xavier và cộng sự (2016) đã cho thấy được hoạt tính của hợp chất Akaloids được chiết xuất từ cây ổi có thể điều trị bệnh viêm dạ dày

mạn tính do vi khuẩn Helicobacter pylori gây ra (Xavier và cs., 2016)

Mohammed và cộng sự (2016) đã cho thấy sự hiện diện của tanin, flavonoid, steroid, terpenoid, và phenol có trong dịch chiết lá cây ổi với các dung môi nước, ethanol, chloroform Sau đó Mohammed và cộng sự đã đưa ra khả năng kháng vi khuẩn

Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A và Salmonella paratyphi B của cao chiết nước

bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch là cao nhất với đường kính kháng khuẩn tương ứng lần lượt là: 8mm, 9,6 mm, 12 mm (Mohammed và cs., 2016).

Theo nghiên cứu của Alamin và cộng sự (2016), cao ethyl axetat có khả năng

kháng với MRSA là 13,50 ± 0,50 mm 600 mg/ mL và E.coli là 10,75 ± 0,48 tương ứng

Mục tiêu: nhằm nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của nhiều loại cao chiết từ lá

cây ổi, từ đó tạo tiền đề để nghiên cứu sản xuất các hợp chất kháng vi khuẩn gây bệnh trên người

Nội dung thực hiện bao gồm:

• Chiết xuất cao dược liệu từ lá cây ổi

• Thử nghiệm độ nhiễm khuẩn của cao chiết

• Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn gây bệnh của cao chiết

• Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết từ lá cây ổi với vi khuẩn

• Khảo sát khả năng kháng khuẩn của từng phân đoạn

• Phân lập hợp chất tự nhiên trong lá cây ổi có khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp sắc ký cột

PHẦN II

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về nguyên liệu

1.1.1 Sơ lược về cây ổi (Psidium guajava L.)

Cây ổi có tên khoa học là Psidium guajava L là loại cây ăn quả thường xanh lâu

năm, thuộc họ Đào Kim nương, có nguồn gốc từ Brasil được Linnaeus Mô tả khoa học đầu tiên vào năm 1753 (Linnaeus, 1753)

Tên gọi khác: Phan thạch lựu (vị thuốc), Kê thỉ quả (vị thuốc) Tên tiếng Anh: Apple guava, Common guava

Tên tiếng Pháp: Goyavier

Tên khoa học: Psidium guajava L

Phân loại khoa học của cây ổi: Giới: Plantae

Bộ: Myrtales Họ: Myrtaceae Chi: Psidium

Loài: P.guajava L (Linnaeus, 1753)

Hình 1.1 Cây ổi (Psidium guajava L.)

Theo Hệ thống APG II (Angiosperm Phylogeny Group II) (2003), ổi thuộc Bộ Sim hay Bộ Đào kim nương (Myrtales) chứa 11 họ với 380 chi và trên 11.000 loài

1.1.2 Nguồn gốc và sự phân bố

Ổi có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ, hiện được trồng ở nhiều nơi

Cây ổi thuộc Họ Sim (Myrtaceae) có khoảng 3.000 loài, phân bổ trong 130-150 chi Chúng phân bổ rộng khắp ở vùng nhiệt đới và ôn đới ấm áp trên thế giới

Chi Ổi (Psidium) có nguồn gốc ở Trung và Nam Mỹ với khoảng 100 loài cây bụi Trong đó có nhiều loài cây có quả ăn được và có giá trị kinh tế lớn

Cây ổi (Psidium guajava) còn gọi là cây Ổi thường (Common guava) hay cây Ổi táo (Apple guava) là loài cây có chất lượng quả ngon nhất trong Chi Ổi, có nguồn gốc ở

Trung Mỹ và vùng phụ cận (Mexico, vùng vịnh Caribbean, Trung và Nam Mỹ)

Cây ổi được trồng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới khắp thế giới kể từ khi Châu Âu chiếm đóng Châu Mỹ

Hiện nay cây ổi được trồng nhiều ở các nước thuộc Châu Phi, Nam Á, Đông Nam Á, vùng Caribbean, cận nhiệt đới của Bắc Mỹ, và Úc

Qua quá trình trồng trọt và chọn lọc giống, hiện nay các giống ổi cũng rất phong

phú, đa dạng Ngoài giống ổi thường (Psidium guajava L.) phổ biến khắp thế giới, còn

có những giống ổi đặc biệt của địa phương như: ổi trâu, ổi bo, ổi xá lị có quả to nhưng kém thơm ngọt; ổi mỡ, ổi găng, ổi đào, ổi nghệ tuy quả nhỏ nhưng ngọt và rất thơm

Ở Việt Nam cây ổi thường (Psidium guajava L.) được nhập vào trồng từ lúc nào

không rõ và nó được phát triển trên khắp cả nước từ đồng bằng ven biển cho đến vùng núi có độ cao khoảng 1500 m trở xuống

Ngày nay ngoài giống ổi ta bình thường, ở Việt Nam còn trồng các giống ổi mới như ổ Xá lị nhập từ Trung Quốc và ổi không hạt được phổ biến gần đây nhờ công nghệ chọn giống hiện đại (Hồ Đình Hải, 2012)

1.1.3 Đặc điểm hình thái

Cây ổi là loài cây tiểu mộc, sống lâu năm, có thể đến 60 - 70 năm

Rễ cây ổi: Rễ ổi là rễ cọc Các giống ổi khi trồng bằng hạt thường có bộ rễ chính ăn sâu xuống đất Bộ rễ của ổi thích nghi tốt với sự thay đổi đột ngột độ ẩm trong đất Nếu trời hạn, mực nước ngầm thấp, ổi có khả năng phát triển nhanh một số rễ thẳng

đứng ăn sâu xuống đất tận 3 - 4 m và hơn Nếu mưa nhiều, mực nước dâng cao ổi đâm nhiều rễ ăn trở lại mặt đất do đó không bị ngạt

Thân cây ổi: Thân phân cành nhiều, cao 4 - 6 m, cao nhất 10 m, đường kính thân tối đa 30 cm Những giống mới còn nhỏ và lùn hơn nữa Thân cây chắc, khỏe, ngắn vì phân cành sớm Thân nhẵn nhụi rất ít bị sâu đục, vỏ già có thể tróc ra từng mảng phía dưới lại có một lượt vỏ mới cũng nhẵn, màu xám, hơi xanh Cành non 4 cạnh, khi già mới tròn dần (Hồ Đình Hải, 2012)

Lá cây ổi: Lá đơn, mọc đối, không có lá kèm Phiến lá hình bầu dục, gốc thuôn tròn, đầu có lông gai hoặc lõm, dài 11 - 16 cm, rộng 5 - 7 m, mặt trên màu xanh đậm hơn mặt dưới Bìa phiến nguyên, ở lá non có đường viền màu hồng tía kéo dài đến tận cuống lá Gân lá hình lông chim, gân giữa nổi rõ ở mặt dưới Cuống lá màu xanh, hình trụ dài 1 - 1,3 cm, có rãnh cạn ở mặt trên

Hoa ổi: Hoa to, lưỡng tính, mọc từng chùm 2, 3 chiếc, ít khi ở đầu cành mà thường ở nách lá Cánh hoa màu trắng mỏng, dễ rụng khi hoa nở Hoa thụ phấn chéo dễ dàng nhưng cũng có thể tự thụ phấn

Quả ổi: Quả hình tròn, hình trứng hay hình quả lê, dài 3 - 10 cm tùy theo giống Vỏ quả còn non màu xanh, khi chín chuyển sang màu vàng, thịt vỏ quả màu trắng, vàng hay ửng đỏ Ruột trắng, vàng hay đỏ Quả chín có vị chua ngọt hay ngọt và có mùi thơm đặc trưng, có thể ăn tươi, làm mứt hay làm nước giải khát

Hạt ổi: Hạt nhiều, màu vàng nâu hình đa giác, có vỏ cứng và nằm trong khối thịt quả màu trắng, hồng, đỏ vàng.Từ khi thụ phấn đến khi quả chín khoảng 100 ngày

Ổi là cây ăn quả phổ biến, được trồng hầu như khắp các địa phương, cả vùng đồng bằng lẫn ở miền núi, trừ vùng cao trên 1500 m Cây ưa sáng, sinh trưởng phát triển tốt trong vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới Giới hạn về nhiệt độ từ 15 - 45 oC, nhiệt độ tốt nhất cho cây sinh trưởng và cho nhiều quả là từ 23 - 28 oC; lượng mưa 1000 - 2000 mm/năm Ổi ra hoa quả nhiều năm Cụm hoa thường xuất hiện trên những cành non mới ra cùng năm Thụ phấn nhờ gió hoặc côn trùng Vòng đời có thể tồn tại 40 - 60 năm Mùa hoa: tháng 3 - 4; mùa quả: tháng 8 - 9

Hiện nay các nhà chọn tạo giống đã sản xuất ra giống ổi không hạt bằng phương pháp nuôi cấy mô (Hồ Đình Hải, 2012)

Hình 1.2 Lá , hoa và quả ổi

1.1.4 Thành phần hóa học của cây ổi

Quả và lá ổi đều chứa beta-sitosterol, quereetin, guaijaverin, leucocyanidin và avicularin; lá còn có tinh dầu dễ bay hơi, eugenol; quả chín chứa nhiều vitamin C và các polysaccarit như fructoza, xyloza, glucoza, rhamnoza, galactoza ; rễ có chứa acid arjunolic; vỏ rễ chứa tanin và các acid hữu cơ

Hàm lượng dinh dưỡng trung bình trong 100 gam quả ổi: 1 gam protein, 15 mg canxi, 1 mg sắt, 0,06 mg retinol (vitamin A), 0,05 mg thiamin (vitamin B1) và 200 mg acid ascorbic (vitamin C) Hàm lượng vitamin C cao trong quả ổi hơn đáng kể so với trong cam Quả ổi cũng giàu pectin

Theo một tài liệu khác, quả ổi chứa 77,9% nước, 0,9% protein, 0,3% lipit, 15% cacbohydrat, 0,3% acid hữu cơ, 0,5% tro, 0,03 mg% vitamin B1, 0,03 mg% vitamin B2, 0,2 mg% vitamin PP, 50 –60 mg% vitamin C Các loại đường trong quả ổi gồm 58,9% fructoza, 35,7% glucoza, 5,3% saccaroza Các acid hữu cơ chính là acid citric và acid malic (Hồ Đình Hải, 2012)

Năm 2010, Ghosh và cộng sự đã tìm thấy 2 triterpenoids trong lá ổi đó là triterpenoids betulinic acid và lupeol (Ghosh và cs., 2010)

Betulinic acid lupeol

Hình 1.3 Cấu trúc của 2 triterpenoids trong lá cây ổi

Năm 1999, Adriana và cộng sự đã tìm thấy 16 loại carotenoids có trong lá cây ổi (Adriana và cs., 1999)

Hình 1.4 Cấu trúc của 16 loại carotenoids có trong lá cây ổi

Năm 2012, Dwivedi và cộng sự đã tìm đã 3 loại benzen trong lá cây ổi (Dwivedi và cs., 2012)

1.1.5 Giá trị dược liệu của cây ổi

Các bộ phận của cây ổi như búp non, lá non, quả, vỏ rễ và vỏ thân đều được dùng để làm thuốc

Các bài thuốc dân gian từ cây ổi được sử dụng ở Việt Nam, Trung Quốc, Hawaii, Trung Mỹ, Nam Mỹ, Caribe, Tây Phi

Nghiên cứu dược lý cho thấy dịch chiết các bộ phận của cây ổi đều có khả năng kháng khuẩn, làm săn se niêm mạc và cầm tiêu chảy

Theo Đông y: lá ổi có vị đắng, tính ấm, có tác dụng tiêu thũng giải độc, thu sáp chỉ huyết; quả ổi vị ngọt hơi chua sáp, tính ấm, có công dụng thu liễm, kiện vị cố tràng; các bộ phận của cây ổi thường được dùng để chữa các chứng bệnh như tả (đi lỏng), cửu lỵ (lỵ mạn tính), viêm dạ dày ruột cấp tính và mạn tính, thấp độc, thấp chẩn, sang thương xuất huyết, tiêu khát (tiểu đường), băng huyết

Ở Việt Nam kinh nghiệm dân gian nhiều nơi đã dùng lá ổi giã nát hoặc nước sắc lá ổi để làm thuốc sát trùng, chống nấm, chữa các trường hợp lở loét lâu lành, làm giảm sốt, chữa đau răng, chữa ho, viêm họng

Lá ổi chứa tinh dầu (0,31%) trong đó có dl-limonen, β-sitosterol, acid maslinic, acid guajavalic Trong lá ổi non và búp non còn có 7 - 10% tanin pyrogalic, khoảng 3% nhựa Cây, quả ổi có pectin, vitamin C Hạt có tinh dầu hàm lượng cao hơn trong lá Vỏ thân có chứa acid ellagic Thường được dùng trị viêm ruột cấp và mạn, kiết lỵ, trẻ em khó tiêu hóa Lá tươi còn được dùng khi bị chấn thương bầm dập, vết thương chảy máu và vết loét Lá ổi chữa tiêu chảy và đau bụng đi ngoài Lá, búp ổi non còn được dùng chữa bệnh zona

Theo Y học hiện đại, kể từ những năm 1950, các bộ phận của cây ổi, đặc biệt là lá và quả ổi đã là đề tài nghiên cứu đa dạng về thành phần cấu tạo, tính chất dược lý và lịch sử trong y học dân gian Các nghiên cứu được tiến hành chủ yếu trên loài ổi

thường (P guajava ), ngoài ra còn nghiên cứu trên một số loài ổi đặc biệt khác Từ

nghiên cứu y tế sơ bộ trong các mô hình phòng thí nghiệm, chiết xuất từ lá, vỏ cây và quả ổi liên quan đến cơ chế điều trị chống ung thư, nhiễm trùng do vi

khuẩn , viêm và đau Tinh dầu từ ổi được nghiên cứu tác động chống ung thư trong ống nghiệm

Nghiên cứu về thành phần dinh dưỡng của ổi cho biết quả ổi có hàm lượng các vitamin A, C, acid béo omega 3, omega 6 và nhiều chất xơ Ổi là một trong những loại rau quả có tỷ lệ vitamin C rất cao, mỗi 100 g có thể có đến 486 mg vitamin C Vitamin C tập trung cao nhất ở phần vỏ ngoài, càng gần lớp vỏ ngoài, lượng sinh tố càng cao Do đó, khi ăn ổi, nên rửa sạch và ăn cả vỏ

Quả ổi là một nguồn thực phẩm ít calori nhưng giàu chất dinh dưỡng và có nhiều chất chống oxy hoá thuộc 2 nhóm carotenoids và polyphenols Theo những nghiên cứu khoa học về những chất chống oxy hoá, vị chua và chát trong nhiều loại rau quả, bao gồm lá ổi, quả ổi là do độ đậm đặc của những loại tanin có tính chống oxy hoá gây ra Tương tự như quy luật màu càng sậm như vàng, tía, đỏ càng có nhiều chất chống oxy hoá, vị càng chát, càng đắng, càng chua độ tập trung của những chất nầy cũng càng nhiều

Ngoài vitamin A, C, quả ổi còn có quercetin, một chất có tính chống oxy hoá cực mạnh có tác dụng kháng viêm, chống dị ứng trong nhiều chứng viêm nhiễm mãn tính như suyển, dị ứng, tim mạch, thấp khớp, lỡ loét, ung thư

Nghiên cứu của Trần Thanh Lương và các cộng sự cho biết tác dụng chống nhiễm khuẩn và nhiễm nấm là do 2 hoạt chất Beta-caryophyllene và Alpha-caryophyllene (Hồ Đình Hải, 2012)

1.2 Tổng quan về một số vi khuẩn gây bệnh ở người

1.2.1 Staphylococcus aureus kháng methicilin (MRSA)

Phân loại như sau:

S aureus là vi khuẩn Gram dương, hình cầu đường kính 0,5 – 1,5 µm, có thể đứng

riêng lẻ, từng đôi, từng chuỗi ngắn, hoặc từng chùm không đều giống như chùm nho Đây là loại vi khuẩn không di động và không sinh bào tử, thường cư trú trên da và màng nhầy của người và động vật máu nóng Trên môi trường Baird Parker, khuẩn lạc có vòng sáng rộng 2 – 5 mm

S aureus gây ra hai loại hội chứng nhiễm độc và nhiễm trùng:

Nhiễm độc có thể do hoạt tính của một hoặc một vài sản phẩm của S aureus (độc

tố) mà không cần có sự hiện diện của vi khuẩn Như hội chứng sốc nhiễm độc, hội chứng phỏng ngoài da, hội chứng ngộ độc thức ăn

Nhiễm trùng là do S aureus xâm nhập vào cơ quan bảo vệ của vật chủ khi bị tổn

thương hay giảm chức năng Như nhiễm trùng da và mô mềm, nhiễm trùng hệ hô hấp, nhiễm trùng hệ thần kinh trung ương, nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng tiểu, nhiễm trùng nội mạch, nhiễm trùng xương…

S aureus gây ra nhiều bệnh nhiễm trùng, tạo mủ và gây độc ở người Thường xảy

ra ở những chỗ xây xước trên bề mặt da như nhọt, gây ra nhiều bệnh truyền nhiễm nghiêm trọng như viêm phổi, viêm tĩnh mạch, viêm màng não, nhiễm trùng tiểu và những bệnh nguy hiểm khác như viêm xương tủy, viêm màng trong tim (Nguyễn Thanh Bảo, 2008)

Trong những thập kỉ gần đây, vi khuẩn đa kháng thuốc (multidrug resistant – MDR) xuất hiện ngày càng tăng, gây ra những thách thức lớn trong điều trị nhiễm trùng Sự xuất hiện của vi khuẩn kháng đa thuốc là vấn đề đáng lo ngại của thế giới đối với sức khỏe con người, trong đó MRSA là một trong những tác nhân quan trọng Nguy cơ sức khỏe liên quan đến nhiễm trùng MRSA, bao gồm khả năng gây nhiễm trùng xâm lấn, đặc biệt ở những bệnh nhân có sức đề kháng yếu Vancomycin là kháng sinh được

lựa chọn để điều trị nhiễm trùng MRSA Tuy nhiên sự xuất hiện của S aureus kháng vancomycin (VRSA) và vancomycin – trung gian S.aureus (VISA) đã khiến việc điều

trị kháng khuẩn trở nên khó khăn Do đó, các hợp chất mới được điều chế để điều trị và kiểm soát nhiễm trùng bởi các vi sinh vật này đã được phát triển và nghiên cứu rộng rãi

Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) là một loại vi khuẩn gây bệnh

kháng nhiều loại thuốc và đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe con người trong một thời gian dài Để đối phó với tính kháng kháng sinh, nhiều nhà nghiên cứu đã nghiên cứu các sản phẩm tự nhiên có nguồn gốc từ thực vật cho các loại thuốc kháng sinh và phương pháp điều trị thay thế (Wang và cs., 2010) Tại Brazil, theo dữ liệu thu được từ 5 năm đầu của chương trình giám sát kháng khuẩn SENTRY, các chủng MRSA nằm trong số các mầm bệnh phổ biến nhất và chiếm 56% các bệnh nhiễm trùng bệnh viện và cộng đồng (Helio S Sader và cs., 2004) Gần đây, một số tác nhân kháng khuẩn tự nhiên như

Quercus dilatata, Hylomecon hylomeconoides, Eleutherine Americana, Chelidonium majus và các hợp chất của Tabebuia avellanedae, đã được thử nghiệm chống lại MRSA

(Cardozo và cs., 2013) Châu Á nằm trong số các khu vực có tỷ lệ nhiễm MRSA đa kháng thuốc cao nhất với tỷ lệ ước tính từ 28% (ở Hồng Kông và Indonesia) đến hơn

70% (ở Hàn Quốc) trong tất cả các chủng S aureus lâm sàng vào đầu những năm 2010

Loài: Escherichia coli (Buchanan và Gibbons, 1994)

E coli là trực khuẩn Gram âm Kích thước trung bình từ 2 – 3 µm x 0,5 µm; trong

những điều kiện không thích hợp (ví dụ như trong môi trường có kháng sinh) vi khuẩn

có thể rất dài như sợi chỉ Rất ít chủng E coli có vỏ, nhưng hầu hết có lông và có khả

năng di động

E coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, hiếu khí tùy

nghi, nhiệt độ từ 5 – 40oC Trong điều kiện thích hợp E coli phát triển rất nhanh, thời

E coli là vi khuẩn thường trú ở đường tiêu hóa của người, có thể được tìm thấy ở

đường hô hấp trên hay đường sinh dục E coli đứng đầu trong các vi khuẩn gây bệnh

tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật, căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết

E coli có khả năng gây bệnh khi xâm nhập vào những vị trí trong cơ thể mà bình thường

chúng không hiện diện

E coli hội sinh có trong phân người khỏe mạnh chỉ gây bệnh khi có dị vật hay hệ

thống miễn dịch của ký chủ bị suy yếu

E coli gây bệnh đường ruột Tác nhân gây bệnh qua đường tiêu hóa bất cứ khi nào

ký chủ nuốt vào đủ số lượng vi khuẩn Truyền bệnh chủ yếu qua thức ăn hay nước uống bị nhiễm vi khuẩn hay truyền từ người này qua người khác (Buchanan và Gibbons, 1994)

1.2.3 Salmonella typhi

Phân loại như sau:

Phân ngành: Proteobacteria

Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Chi: Salmonella

Loài: Salmonella typhi (Buchanan và Gibbons, 1994)

S typhi là trực khuẩn Gram âm, có lông xung quanh thân Vì vậy có khả năng di

động, không sinh nha bào Kích thước khoảng 0,4 - 0,6 x 2 - 3 μm S typhi là vi khuẩn

hiếu khí tùy nghi, phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường Trong môi trường thích hợp sau 24 giờ khuẩn lạc có kích thước trung bình 2 – 4 mm

Khả năng gây bệnh của S typhi:

S typhi chỉ gây bệnh cho người, chủ yếu gây bệnh thương hàn

Bệnh thương hàn có thể gây biến chứng chủ yếu là xuất huyết tiêu hóa và thủng ruột Một số biến chứng ít gặp hơn như viêm màng não, viêm tủy xương, viêm khớp, viêm thận (Nguyễn Thanh Bảo, 2008)

Loài: Pseudomonas aeruginosa (Buchanan và Gibbons, 1994)

P aeruginosa là trực khuẩn mủ xanh, thẳng hoặc hơi cong nhưng không xoắn, hai

đầu tròn, dài 1 - 5 µm, rộng 0,5 - 1 µm, ít khi có vỏ có một ít lông ở một đầu, di động, không sinh nha bào, bắt màu Gram âm Chúng mọc ở biên độ nhiệt rộng (10 – 44oC), nhưng tối ưu ở 35oC Trong môi trường đặc, có thể gặp hai loại khuẩn lạc: một loại to, nhẵn, bờ trải dẹt, giữa lồi lên; một loại khác thì xù xì (Nguyễn Thanh Bảo, 2008; Lê Văn Phủng, 2012)

Khả năng gây bệnh của P aeruginosa:

Trực khuẩn mủ xanh là loại vi khuẩn gây bệnh cơ hội: khi cơ thể bị suy giảm miễn dịch, bị bệnh ác tính hay mãn tính, khi dùng corticoid lâu dài, việc sử dụng kháng sinh tùy tiện… Chúng gây nhiễm trùng da, mắt như viêm nang lông, viêm da chảy nước ở

các vùng kẽ hoặc viêm tai ngoài, viêm loét giác mạc, Ngoài ra P aeruginosa là căn

nguyên gây nhiễm trùng vết bỏng, vết thương, xương khớp, huyết, dịch não tủy, tiết niệu và hô hấp (Nguyễn Thanh Bảo, 2008; Lê Văn Phủng)

Trực khuẩn gây viêm mủ (mủ có màu xanh) Khi có điều kiện thuận lợi chúng gây bệnh toàn thân như nhiễm khuẩn huyết hoặc viêm phế quản, viêm màng não, viêm tai giữa, viêm xương tủy (Nguyễn Thanh Bảo, 2008; Lê Văn Phủng, 2012)

1.3 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước

❖ Ngoài nước:

Gnan và Demello (1999), nghiên cứu và nhận thấy lá ổi chứa hợp chất kháng khuẩn

kháng 9 giống Staphylococcus aureus khác nhau (Gnan và cs., 1999)

Bên cạnh đó, nhiều tác giả đã chứng minh cao lá ổi chiết bằng nước ức chế mạnh một số vi khuẩn sau: Paovalo và cộng sự (1986), nghiên cứu cao lá ổi có khả năng ức

chế Streptococcus spp Đến năm 2002, Abdelrahim và cộng sự đã chứng minh cao lá ổi chống lại sự phát triển của Pseudomonas aeruginosa (Paovalo và cs., 1986).

Mahfuzul Hoque và cộng sự (2007) xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao ổi

bằng dịch chiết ethanol đối với Aeromomas hydrophila là 4000 µg/mL và chiết xuất ổi

bằng ethanol có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất (Mahfuzul Hoque và cs., 2007)

Theo Nobre và cộng sự (2008) cao chiết methanol, hexane, ethyl acetate từ lá ổi

có tác dụng ức chế sự phát triển của Staphylococcus aureus Trong đó cao methanol thể

hiện khả năng kháng khuẩn mạnh nhất (đường kính vòng kháng khuẩn 12,14 ± 0,09 mm) nhưng chưa có thống kê đầy đủ về nồng độ ức chế của cao methanol đối với

Staphylococcus aureus (Nobre và cs., 2008).

Nwinyi và cộng sự (2008) xác định MIC của cao lá ổi chiết bằng ethanol đối với

Staphylococcus aureus là 625 µg /mL (Nwinyi và cs., 2008)

Nwankwo và cộng sự (2013) đã thu cao chiết nước và ethanol từ lá cây ổi (Psidium

guajava L.) Staphylococcus aureus đều bị ức chế bởi cao nước và có đường kính vùng

ức chế kháng khuẩn từ 7,08 ± 0,02 mm đến 12,14 ± 0,09 mm Còn Pseudomonas

aeruginosa bị ức chế bởi cao ethanol và có đường kính vùng ức chế kháng khuẩn là

2,17 ± 0,01 mm đến 2,07 ± 0,07 mm (Nwankwo và cs., 2013)

Cũng từ cao chiết nước từ lá cây ổi (Psidium guajava L.), Mohammed và cộng sự

(2017) đã cho thấy sự hiện diện của tanin, flavonoid, steroid, terpenoid, và phenol có trong dịch chiết với các dung môi nước, ethanol, chloroform Sau nghiên cứu Mohammed và cộng sự đã đưa ra khả năng kháng vi khuẩn Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A và Salmonella paratyphi B của cao chiết nước bằng phương pháp khuếch

tán giếng thạch là cao nhất với đường kính kháng khuẩn tương ứng lần lượt là: 8mm, 9,6 mm, 12 mm (Mohammed và cs., 2017).

Theo nghiên cứu của Garode và cộng sự (2014), hiệu quả kháng khuẩn của Psidium

guajava L chiết xuất từ lá trong các dung môi khác nhau (metanol, ethanol và dung dịch

Gram dương (Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus và

Streptococcus spp.) và ba chủng vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Salmonella typhimurium) bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch

Nghiên cứu hiện tại, dịch chiết nước cho hiệu suất thu hồi cao nhất so với chiết xuất metanol và ethanol Các mẫu cao chiết được thử nghiệm ức chế khác nhau với dung môi

cũng như các vi sinh vật Kết quả cho thấy rằng Micrococcus luteus trong số các Gram dương và E coli trong số các Gram âm là rất nhạy cảm so với các sinh vật được thử nghiệm khác Chiết xuất methanol của P guajava có hiệu quả nhất là vòng kháng rộng

nhất đã được quan sát so với các chiết xuất ethanol và dung dịch nước Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cũng như nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của chiết xuất lá thô được xác định cho các loại sinh vật khác nhau dao động trong khoảng 12,5 đến 100 mg/ml Hoạt tính kháng khuẩn vượt trội của chiết xuất lá kháng lại vi khuẩn Gram dương và

Gram âm được thử nghiệm cho thấy rằng lá cây P guajava có thể là một nguồn thuốc

mới để điều trị các bệnh truyền nhiễm (Garode và cs., 2014)

Theo Huỳnh Kim Diệu năm 2010 cho thấy khả năng kháng với Aeromonas

hydrophila là 17 mm với nồng độ ức chế tối thiểu là 256 μg/mL, Edwardsiella ictaluri

là 20 mm với nồng độ ức chế tối thiểu là 128 μg/mL (Huỳnh Kim Diệu và cs.,2010) Theo Lê Quốc Duy năm 2016 cho thấy cao chiết ethanol từ các mẫu lá ổi đều có khả năng ức chế hoạt tính của enzyme α-glucosidase với nồng độ ức chế tối thiểu là 97,47 µg/mL

1.4 Khái quát về phương pháp chiết cao dược liệu

Theo dược điển Việt Nam IV năm 2009, cao dược liệu là chế phẩm được chế bằng cách cô đặc hoặc sấy đến thể chất quy định các dịch chiết thu được từ cao dược liệu thực vật hay động vật với dung môi Các dược liệu khi chiết xuất được xử lý sơ bộ (sấy khô và nghiền nhỏ đến kích thước thích hợp)

1.4.1 Phân loại cao dược liệu:

Cao lỏng: là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử dụng trong đó có cồn và nước đóng vai trò dung môi chính Nếu không có chỉ dẫn khác, quy ước 1ml cao lỏng tương ứng với 1 g dược liệu dùng để điều chế

Cao đặc: là khối đặc quánh Hàm lượng dung môi còn lại trong cao không quá 20%

Cao khô: là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm Cao khô không được có độ ẩm lớn hơn 5%

Có nhiều phương pháp để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây thuốc Các kỹ thuật đều xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng - lỏng và chiết rắn - lỏng Trong thực nghiệm việc chiết rắn - lỏng được áp dụng nhiều hơn, chiết rắn - lỏng gồm: ngấm kiệt (percolation), ngâm dầm (maceration), chiết với máy Soxhlet, chiết bằng cách nấu nguyên liệu cây với nước còn được gọi là nước sắc Ngoài ra còn có chiết với phương pháp lôi cuốn bằng hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid method), … (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007; Từ Minh Koóng, 2007)

1.4.2 Các kĩ thuật chiết dược liệu:

1.4.2.1 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt (Percolation)

Dụng cụ: bình ngấm kiệt bằng thủy tinh, hình trụ đứng, dưới đáy bình là một van khóa để điều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra; một bình chứa đặt bên dưới để hứng dung dịch chiết Phía trên cao của bình ngấm kiệt là bình lóng để chứa dung môi tinh khiết

Tiến hành: bột cây được xay thô, lọt được qua lỗ rây 3 mm, mẫu không được xay quá mịn hay có tính nhầy nhụa hoặc có thể trương nở… sẽ cản trở dòng chảy Đáy của bình ngấm kiệt được lót bằng bông thủy tinh và một tờ giấy lọc Bột cây được đặt vào bình, lên trên lớp bông thủy tinh, lên gần đầy bình Đậy bề mặt lớp bột bằng một tờ giấy lọc và chặn lên trên bằng những viên bi thủy tinh để cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột Từ từ rót dung môi cần chiết vào bình cho đến khi dung môi phủ xấp xấp phía trên lớp mặt

Để yên sau một thời gian, thường là 12 - 24 giờ Mở van bình ngấm kiệt cho dung dịch chiết chảy ra từng giọt nhanh và đồng thời mở khóa bình lóng để dung môi tinh khiết chảy xuống bình ngấm kiệt Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi tinh khiết chảy vào bình ngấm kiệt bằng với vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình này

Ưu điểm: dược liệu được chiết kiệt, giữ được hoạt tính

Nhược điểm: năng suất thấp, thủ công, phức tạp, tốn dung môi (Từ Minh Koóng, 2007)

1.4.2.2 Kỹ thuật chiết ngâm dầm (Maceration)

Bột cây được chứa trong một bình thủy tinh hay bình thép không rỉ có nắp đậy Rót dung môi trong bình cho đến xấp xấp bề mặt của bột dược liệu Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên

Sau đó dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc; thu hồi dung môi sẽ có được cao chiết Tiếp tục rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục chiết thêm một vài lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây Có thể gia tăng hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn bình vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung ra làm dung dịch chiết bị trào ra ngoài) Mỗi lần ngâm dung môi chỉ cần 24 giờ là đủ, vì với một lượng dung môi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan dung môi đến đạt mức bão hòa, không thể hòa tan thêm được nhiều hơn, có ngâm lâu hơn chỉ mất thời gian Quy tắc chiết là chiết nhiều lần, mỗi lần một ít lượng dung môi

Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền Phương pháp làm ở nhiệt độ phòng nên giữ hoạt tính của các hoạt chất chiết được

Nhược điểm: năng suất thấp, thao tác thủ công, chiết nhiều lần tốn dung môi và thời gian chiết (Từ Minh Koóng, 2007)

1.4.2.3 Kỹ thuật chiết Sohxlet

Bột cây xay thô được đặt trực tiếp trong túi vải trắng hay giấy lọc dày rồi cho vào trụ chiết (đặt vài viên bi thủy tinh dưới đáy để tránh làm nghẹt ống thông nhau), không

Rót dung môi vào bình cầu cho thấm ướt bột cây rồi mới chạy xuống bình cầu (không được để lượng thể tích trong bình cầu nhiều hơn hai phần ba thể tích bình cầu) Kiểm tra hệ thống kín Mở cho nước chảy hoàn lưu trong ống ngưng hơi Cắm bếp điện và điều chỉnh nhiệt độ sao cho dung môi trong bình cầu sôi nhẹ đều Tiếp tục đến khi chiết kiệt chất trong bột cây Kiểm tra sự chiết kiệt bằng cách tắt máy để nguội và mở hệ thống chỗ nút mài, rút lấy một giọt dung môi và thử lên mặt kiếng, nếu thấy không có vết gì trên kiếng là đã chiết kiệt Sau khi hoàn tất lấy dung môi ra khỏi bình cầu A, đuổi dung môi thu được cao chiết

Đối với dịch chiết ethanol 100 ml, chiết liên tục 10 g bột dược liệu ở 60 - 80oC trong 10 giờ, dịch chiết đem sấy khô 40oC, ly tâm 5.000 vòng/ 10 phút, lọc với giấy lọc, cô quay cho bay ethanol

Ưu điểm: tiết kiệm dung môi, không tốn thao tác lọc và châm dung môi, chiết kiệt hợp chất trong bột cây

Nhược điểm: hạn chế lượng bột cây cần chiết do kích thước máy nhỏ, các hợp chất kém bền nhiệt có chứa trong bột cây dễ bị phân hủy Giá thành máy khá cao, máy làm bằng thủy tinh nên dễ vỡ, nhất là các nút mài được gia công bằng thủ công nên khi bị vỡ rất khó tìm được bộ phận khác để thay thế (Từ Minh Koóng, 2007)

1.4.2.4 Cô đặc và sấy khô

Để điều chế cao dược liệu, thường phải tiến hành bốc hơi dung môi

Có thể dùng nhiều thiết bị cô, sấy khác nhau, nhưng tốt nhất là tiến hành ở áp suất giảm và ở nhiệt độ sao cho sự phân hủy hoạt chất là tối thiểu (thường không quá 60oC) Tránh cô hoặc sấy kéo dài ở nhiệt độ cao (Từ Minh Koóng, 2007)

Cao dược liệu phải đạt các chỉ tiêu chất lượng cao thuốc được quy định trong dược điển Việt Nam IV năm 2009:

- Cảm quan: cao thuốc phải có thể chất, màu sắc, độ đồng nhất theo quy định; có mùi, vị của dược liệu tương ứng,

- Độ tan: cao lỏng phải tan hoàn toàn trong dung môi đã dùng để điều chế cao - Mất khối lượng do làm khô: thông thường cao đặc không quá 20%, cao khô

1.4.3 Phương pháp chiết lỏng- lỏng

Việc chiết lỏng - lỏng được thực hiện bằng bình lóng Sử dụng lần lượt các dung môi hữu cơ để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực nước khác nhau (tùy vào độ phân cực của dung môi) Tùy vào tỉ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ nằm ở lớp trên hoặc lớp dưới so với pha nước (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung

môi phân cực thí dụ như: ester dầu hỏa và n-hexane, ether ethyl, chloroform, ethyl

acetate, butanol… với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi; chiết đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi thì đổ sang chiết với dung môi có tính phân cực hơn Dung dịch của các lần chiết được gom chung lại, làm khan nước với các chất làm khan như Na2SO4, MgSO4, CaSO4, …, đuổi dung môi, thu được cao chiết (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Kỹ thuật này còn được gọi là sự chiết bằng dung môi (Solvent extraction) Cao alcol thô ban đầu (ví dụ bột cây được tận trích với methanol 80%, đuổi dung môi thu được cao alcol thô ban đầu) hoặc dung dịch ban đầu (ví dụ dung dịch sinh học) đều chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến không phân cực vì thế rất khó cô lập được riêng những hợp chất tinh khiết để thực hiện các khảo sát tiếp theo Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng được áp dụng để phân chia cao alcol thô ban đầu hoặc dung dịch ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau

Nguyên tắc của sự chiết là dung môi không phân cực (ví dụ ester dầu hỏa ) sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính không phân cực (ví dụ các alcol béo, ester béo ), dung môi phân cực trung bình ( ví dụ dietyl ester, chlorofrom ) hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình ( các hợp chất có chứa nhóm chức ester –O–, aldehyd –CH=O, ceton –CO–, ester –COO– ) và dung môi phân cực mạnh (ví dụ methanol ) hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh ( các hợp chất có chứa nhóm chức –OH, –COOH ) (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

1.5 Khái quát về phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn

1.5.1 Phương pháp khuếch tán

❖ Nguyên tắc

Chất thử từ đĩa giấy hay từ giếng đục trong thạch sẽ khuếch tán vào môi trường thạch được cấy vi khuẩn hay vi nấm thử nghiệm Mức độ tác động của chất thử được đánh giá dựa vào đường kính vòng tác động

Phương pháp khuếch tán cho kết quả định tính và bán định lượng hoạt tính của chất thử

❖ Môi trường cơ bản thực hiện thử nghiệm

Môi trường thạch Mueller Hinton Agar (MHA) là môi trường tốt nhất để thử nghiệm (đối với vi khuẩn dễ mọc) vì các lý do sau:

- Cho kết quả có tính lặp lại cao khi thử nghiệm với các loạt môi trường - Ít chất ức chế đối với sulfonamide, trimethprim và tetracycline

- Thích hợp tăng trưởng cho hầu hết các vi khuẩn dễ mọc

- Một số lượng lớn các dữ liệu và kinh nghiệm là có từ kháng sinh đồ thực hiện trên môi trường này

Đối với các vi khuẩn khó mọc thì tiêu chuẩn môi trường phải được biến đổi cho phù hợp, bổ sung các chất đối với mỗi loại vi khuẩn

❖ Quy trình thực hiện thử nghiệm khuếch tán

Lượng cao chiết ban đầu đưa vào sàng lọc được xác định sơ bộ theo 100 mg dược liệu khô và được hòa tan trong dung dịch DMSO

Tác nhân gây bệnh là vi khuẩn, vi nấm được điều chỉnh đến ở nồng độ 106 CFU/ml Môi trường sử dụng là Muller Hinton Agar (MHA) vô trùng được đổ vào mỗi đĩa petri là 20 ml và ủ cùng tác nhân gây bệnh được trải trên đĩa

Dùng ống thép vô trùng đường kính 6 mm đục trên thạch 4 giếng và thêm vào đó 50 µL dịch chiết đã chuẩn bị Sử dụng streptomycin (20 μg/ml) và DMSO 1% làm mẫu đối chứng dương và chứng âm Dùng parafin dán kín đĩa petri và ủ ở 37oC trong 18 đến 24 giờ đối với vi khuẩn và 28oC trong 48 giờ đối với vi nấm gây bệnh Lặp lại thí nghiệm

3 lần và ghi nhận kết quả ức chế của dịch chiết (Rajasekaran và cs., 2008; Kalita và cs., 2012)

1.5.2 Phương pháp pha loãng liên tiếp

Nguyên tắc: dựa trên sự tương quan giữa nồng độ pha loãng của chất thử đối với sự tăng trưởng của vi khuẩn trong mỗi nồng độ chất thử khác nhau mà ta xác định được nống độ ức chế tối thiểu của chất thử có khả năng ngăn chặn sự tăng trưởng của vi sinh vật

Chất thử được pha loãng thành dãy nồng độ từ cao đến thấp theo cấp số nhân Tác động kháng vi sinh vật được xác định dựa vào nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật của chất thử (Minimum Inhibitory Concetration - MIC) Đây là nồng độ thấp nhất trong dãy nồng độ ức chế được sự phát triển của vi sinh vật Phương pháp có ý nghĩa định lượng MIC càng thấp chất thử tác động càng mạnh

Phương pháp này được Ủy Ban Quốc Gia về các Chuẩn Mực Phòng Thí Nghiệm Lâm Sàng (CLSI) chấp thuận và biện luận theo CLSI (Clinical & Laboratory Standards Institute)

Phương pháp chuẩn của CLSI có thể được biến đổi để phù hợp với các đặc điểm phát triển riêng biệt cho từng chủng loại vi sinh vật khác nhau, hoặc thuận tiện hơn, kinh tế hơn, dễ thực hiện và nhanh hơn,… với điều kiện phương pháp biến đổi cho kết quả phù hợp với phương pháp chuẩn, có sự liên thông kết quả giữa các phòng thí nghiệm, được nhiều phòng thí nghiệm sử dụng

Kết quả của các phương pháp thử nghiệm chịu ảnh hưởng của các điều kiện thử nghiệm như mật độ tế bào vi sinh vật, môi trường thử, thời gian đọc kết quả, pH môi trường, … vì vậy cần phải tiêu chuẩn hóa các điều kiện trên Để chuẩn hóa các phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất tự nhiên hay tổng hợp hóa học, CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) đã qui định các điều kiện thí nghiệm để đảm bảo độ lặp lại và tính liên thông giữa các phòng thí nghiệm trong các tiêu chuẩn đang được áp dụng trên thế giới:

Các tiêu chuẩn về phương pháp pha loãng hiện đang được sử dụng:

CLSI, 2008, M27 – A3: Phương pháp pha loãng xác định hoạt tính kháng nấm men

CLSI, 2008, M38 – A2: Phương pháp pha loãng xác định hoạt tính kháng nấm sợi CLSI, 2009, M7-A8: Phương pháp pha loãng xác định hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn hiếu khí

1.6 Phương pháp sắc ký cột

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel Merck pha thường và pha đảo Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040 – 0,063 mm (240-430 mesh) Silica gel pha đảo RP-18 F254 (Merck 5559; 0,2 mm) hoặc YMC có cỡ hạt là 30-50 µm (Fujisilisa Chemical Ltd.)

Từ cao chiết có hoạt tính mạnh nhất tiến hành sắc ký cột pha thường, kết hợp với sắc ký bản mỏng (TLC) để chia ra nhiều phân đoạn nhỏ có hệ dung môi rửa giải khác nhau

- Chuẩn bị cột

• Chọn cột phù hợp với lượng cao chuẩn bị phân lập, làm khô cột

• Cho một ít bông gòn ở đáy cột (ngay phía dưới vòi nhỏ giọt) để silica gel không chảy ra ngoài

• Cân lượng silica gel vừa đủ cho vào cốc thủy tinh cùng với dung môi ít phân cực và trộn đều

• Đổ hỗn hợp silica gel vào cột cùng với một ít dung môi, mở cột cho dung môi nhỏ giọt để ổn định cột