Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym α glucosidase và enzym PTP1B in vitro của dịch chiết lá cây ổi (psidium guajava l ) trồng tại việt nam

TỔNG QUAN

Bệnh đái tháo đường

1.1.1 Tổng quan về bệnh đái tháo đường

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), đái tháo đường là một rối loạn chuyển hóa phức tạp, đặc trưng bởi tình trạng tăng đường huyết mạn tính Rối loạn này liên quan đến sự chuyển hóa không bình thường của carbohydrat, chất béo và protein, và thường xảy ra do sự suy giảm tiết insulin cũng như giảm hoạt tính của insulin.

Các tài liệu cổ của người Ấn Độ ghi nhận những bệnh nhân có triệu chứng uống nước nhiều và hiện tượng "ruồi bâu, kiến bậu" vào nước tiểu.

Y học cổ xưa đã áp dụng nhiều phương pháp điều trị hiệu quả, bao gồm sử dụng thuốc lợi tiểu, tắm bồn nước nóng, rạch tĩnh mạch, tẩy giun và các loại thảo mộc.

Vào năm 1674, Thomas Willis đã lần đầu tiên so sánh vị ngọt của đường trong nước tiểu với mật, từ đó thuật ngữ “diabetes mellitus” ra đời và vẫn được sử dụng cho đến ngày nay.

Năm 1869, Paul Langerhans phát hiện ra sự tồn tại của các tế bào có hại trong tụy Đến năm 1872, Bouchardart nhận thấy rằng nồng độ đường trong nước tiểu giảm ở những bệnh nhân nhịn đói lâu ngày hoặc theo chế độ ăn kiêng nghiêm ngặt Từ những phát hiện này, chế độ ăn uống đã trở thành yếu tố quan trọng trong điều trị bệnh đái tháo đường.

Từ năm 1875 đến 1901, nghiên cứu về các tế bào đảo tụy tiếp tục diễn ra Năm 1901, Eugen Opie phát hiện ra rằng bệnh nhân đái tháo đường có tổn thương ở đảo tụy Langerhans Ông cho rằng các tế bào này tiết ra một chất quan trọng, và khi thiếu chất này sẽ dẫn đến bệnh đái tháo đường.

Vào năm 1906, George Zuelzer đã tiến hành thử nghiệm điều trị bệnh đái tháo đường bằng cách tiêm chiết xuất từ tụy Tuy nhiên, thử nghiệm này đã không thành công do bệnh nhân gặp phải tình trạng co giật.

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Năm 1920, Frederick Banting và các đồng nghiệp đã thành công khi dùng chất chiết xuất của tụy để nuôi sống những con chó đã bị cắt tuyến tụy

Họ đã đặt tên cho chất này là “isletin”

Năm 1921, lần đầu tiên chất isletin được thử nghiệm trên một bệnh nhân 14 tuổi, dẫn đến việc mức glucose máu giảm nhanh chóng từ 440 mg/dL xuống 320 mg/dL Cùng thời điểm này, giáo sư Macleod tại trường đại học Toronto đã áp dụng huyết thanh này trong điều trị và đã đổi tên "isletin" thành "insulin".

Từ năm 1922, insulin đã được nghiên cứu và phát triển, trở thành một sản phẩm quan trọng trên thị trường Mặc dù việc sử dụng insulin đã trở nên thuận tiện hơn, nhưng giá thành vẫn còn cao Tuy nhiên, vào năm 1979, công nghệ AND tái tổ hợp đã cho phép sản xuất insulin, và đến năm 1982, insulin tái tổ hợp đã được sản xuất thành công, giúp giảm giá thành và mang lại lợi ích cho hàng triệu bệnh nhân đái tháo đường trên toàn thế giới.

Năm 1998, nghiên cứu tại Anh đã chỉ ra rằng liệu pháp điều trị tích cực có vai trò quan trọng trong việc hỗ trợ người bệnh đái tháo đường type 2, đồng thời giúp giảm thiểu các biến chứng mạn tính liên quan đến bệnh này.

1.1.2 Tình hình bệnh đái tháo đường trên thế giới và tại Việt Nam

Theo Liên đoàn Đái tháo đường Thế giới (IDF), vào năm 2015, có 415 triệu người lớn (20-79 tuổi) mắc bệnh đái tháo đường trên toàn cầu, và dự đoán con số này sẽ tăng lên khoảng 642 triệu người vào năm 2040 Đồng thời, bệnh đái tháo đường type 2 đang gia tăng ở trẻ em do thói quen ăn uống không lành mạnh và thiếu hoạt động thể chất, trở thành một vấn đề sức khỏe cộng đồng nghiêm trọng.

Bệnh đái tháo đường gây ra nhiều biến chứng nghiêm trọng, bao gồm bệnh tim mạch, mù lòa, suy thận và cắt cụt chi Tuy nhiên, có tới 70% trường hợp đái tháo đường type 2 có thể được dự phòng hoặc làm chậm tiến triển thông qua lối sống lành mạnh, chế độ dinh dưỡng hợp lý và tăng cường luyện tập thể lực.

Tại Việt Nam, tỷ lệ bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) đã tăng đáng kể từ năm 1990, khi tỷ lệ chỉ là 1,1% ở Hà Nội và 2,25% ở Hồ Chí Minh Đến năm 2012, nghiên cứu của Bệnh viện Nội tiết Trung ương cho thấy tỷ lệ mắc đái tháo đường ở người trưởng thành là 5,42%, với 63,6% trường hợp chưa được chẩn đoán Tỷ lệ rối loạn dung nạp glucose toàn quốc là 7,3% và rối loạn glucose máu lúc đói là 1,9% (năm 2003) Kết quả điều tra STEPwise năm 2015 cho thấy ở nhóm tuổi từ 18-69, tỷ lệ đái tháo đường là 4,1% và tiền đái tháo đường là 3,6%.

1.1.3 Các yếu tố nguy cơ của bệnh đái tháo đường type 2

Bệnh đái tháo đường type 2, hay còn gọi là đái tháo đường không phụ thuộc insulin, thường gặp ở người trên 40 tuổi và có tình trạng béo phì Đây là một rối loạn mạn tính, nguyên nhân chính được cho là do sự tương tác giữa yếu tố di truyền và môi trường.

1.1.3.1 Thừa cân và béo phì

Tỷ lệ người trưởng thành bị thừa cân (BMI từ 25 – 30 kg/m 2 ) và béo phì (BMI > 30 kg/m 2 ) trên thế giới được dự đoán sẽ tăng lên 57,8% vào năm

Tổng quan về enzym α-glucosidase và PTP1B

1.2.1 Tổng quan về enzym 1.2.1.1 Khái niệm

Enzym là chất xúc tác sinh học được tạo ra từ các hợp chất protein có cấu trúc hóa học đặc thù trong tế bào Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất của sinh vật, giúp thúc đẩy các phản ứng hóa học diễn ra nhanh chóng ở điều kiện bình thường mà không cần yếu tố bên ngoài như nhiệt độ hay áp suất Enzym có thể được chiết xuất từ nhiều nguồn sống khác nhau, bao gồm động vật, thực vật và vi sinh vật.

Enzym là các chất xúc tác chọn lọc trong cơ thể sinh vật, có vai trò quan trọng trong việc định hướng mọi phản ứng diễn ra trong tế bào Ngoài ra, nhiều enzym vẫn có khả năng hoạt động hiệu quả ngay cả khi ở bên ngoài tế bào.

Chất ức chế enzym là các chất có khả năng làm giảm hoặc ngăn chặn hoàn toàn hoạt động của enzym, với bản chất hóa học đa dạng như ion kim loại, anion, hợp chất hữu cơ nhỏ hoặc protein Các chất ức chế này có thể tương tác với enzym theo hai cách: phản ứng thuận nghịch hoặc không thuận nghịch Trong đó, có hai loại ức chế thuận nghịch chính là ức chế cạnh tranh và ức chế không cạnh tranh.

1.2.2 Tổng quan về enzym α-glucosidase 1.2.2.1 Danh pháp và phân loại

Enzym α-glucosidase (EC 3.2.1.20) còn có những tên gọi khác như maltase, glucoinvertase, glucosidosucrase, maltase glucoamylase, α- glucopyranosidase, glucosidoinvertase, α-D-glucosidase, α-glucoside hydrolase, α-1,4-glucosidase, α-D-glucoside glucohydrolase [7]

Enzym α-glucosidase là một enzym một thành phần có hoạt tính exohydrolysis, xúc tác phản ứng thủy phân liên kết α-1,4-glycoside ở đầu không khử của carbohydrate, giải phóng các phân tử α-D-glucose Chất nền đặc trưng của enzym này bao gồm các disaccharide, oligosaccharide, cùng với các aryl- và akyl-α-glucopyranoside khác.

Enzym α-glucosidase là một loại enzym thuộc lớp glycoside hydrolase, có khả năng phân giải liên kết glycoside giữa các phân tử carbohydrate Đây là một trong những liên kết mạnh nhất trong các polymer tự nhiên Các enzym này có khả năng bẻ gãy các liên kết glycoside nhanh hơn 10^17 lần so với phản ứng không có enzym xúc tác.

Carbohydrate trong thực phẩm là nguồn cung cấp đường cho cơ thể Khi vào cơ thể, carbohydrate sẽ được thủy phân thành các phân tử đường đơn nhờ enzym trong ruột non, và những phân tử này sẽ nuôi dưỡng các tế bào trong cơ thể.

Tiến trình phân hóa carbohydrat bắt đầu khi tụy tiết ra α-amylase, enzyme này có nhiệm vụ phá vỡ các phân tử carbohydrat lớn thành oligosaccharid Sau đó, màng tế bào ruột non tiết ra α-glucosidase để tiếp tục phân hóa oligosaccharide thành các phân tử đường đơn, cho phép chúng thẩm thấu vào máu Chức năng chính của α-glucosidase là xúc tác việc cắt đứt liên kết 1,4-α-D-glucosid của cơ chất, giải phóng α-D-glucose.

Bằng cách kiềm chế sự hoạt động của enzym α-glucosidase, có thể làm giảm sự thủy phân của carbohydrat và làm chậm sự thẩm thấu glucose vào máu [12]

1.2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym α-glucosidase a Các chất tổng hợp Acarbose và miglitol đang được sử dụng rộng rãi như thuốc điều trị đái tháo đường type 2 Cơ chế hoạt động của các thuốc này là ức chế enzym α- glucosidase ở ruột Cụ thể chất ức chế α-glucosidase là các saccharide hoạt động như chất ức chế sự cạnh tranh của các enzym cần thiết để tiêu hóa carbohydrate, đặc biệt là enzym α-glucosidase

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử Acarbose b Các chất tự nhiên

Hiện nay, nhiều hợp chất tự nhiên như flavonoid, anthocyanidin, isoflavone, phenolic, curcuminoids và terpinoid đã được phát hiện có khả năng ức chế enzym α-glucosidase Sự quan tâm toàn cầu đang tăng cao đối với việc tìm kiếm các hợp chất tự nhiên, nhất là khi các hợp chất hóa học thường gây ra nhiều tác dụng phụ không mong muốn.

Bảng 1.1 Các hợp chất tự nhiên ức chế enzym α-glucosidase [22]

STT Nhóm hợp chất Tên hoạt chất

Apigennin Hesperetin (+)-catechin Cyanidin-3-galactoside Cyanidin-3- galactoside 2R,3R,4R,5R)2,5-bis(hydroxymethyl)-3,4- dihydroxypyrrolidine

3b-Acetoxy-16b-hydroxybetulinic axit Axit 28-O-α-larabinopyranosyl-(1→4)-α-l- arabinopyranosyl-(1→3)- β -d- xylopyranosyl-(1→4)-α-lrhamnopyranosyl- (1→2)-β -d-fucopyranosyl ester,…

3b-Acetoxy-16b-hydroxybetulinic axit Axit 28-O-α-larabinopyranosyl-(1→4)-α-l- arabinopyranosyl-(1→3)- β -d- xylopyranosyl-(1→4)-α-lrhamnopyranosyl- (1→2)-β -d-fucopyranosyl ester, …

Chebulanin Chebulagic axit Chebulinic axit (-)-3- O-galloylepicatechin (-)-3-O-galloylcatechin

1.2.3 Tổng quan về enzym PTP1B (protein tyrosine phosphatase 1B) 1.2.3.1 Danh pháp và phân loại

PTP1B (EC 3.1.3.48) là một loại enzym protein tyrosin phosphatase 1B, thuộc phân họ pTyr PTP cổ điển, một trong bốn phân họ của siêu họ enzym Protein Tyrosin Phosphatase.

PTP1B là một loại protein có cấu trúc gồm 435 axit amin, với vùng xúc tác nằm từ axit amin 30 đến 278 Đầu tận C kị nước của protein này là vị trí quan trọng để enzym gắn vào bề mặt lưới nội chất Cấu trúc đặc trưng của PTP1B bao gồm vòng xúc tác với đơn phân xúc tác Cys215, vòng WPD (gồm tryptophan, prolin và axit aspartic) cùng với vị trí liên kết aryl-phosphat thứ cấp.

Trung tâm hoạt động của PTP1B có cấu trúc tương tự như các protein phosphatase khác, với vị trí xúc tác chính nằm ở các axit amin 214-221 (His-Cys-Ser-Ala-Gly-Ile-Gly-Arg), tạo thành một vòng 8 axit amin vững chắc, giúp tương tác với gốc aryl-phosphat của cơ chất Vòng này cũng chứa vị trí ái nhân Cys215 Bên cạnh đó, bốn vòng khác (Asp181, Phe182, Tyr46, Val49, Lys120 và Gln262) tạo thành các cạnh của khe xúc tác, góp phần vào quá trình xúc tác và nhận diện cơ chất Khe xúc tác có chiều sâu từ 8-9Å cho cơ chất đặc hiệu.

Vòng WPD, với sự thay đổi hình dạng của PTP1B, đóng vai trò quan trọng trong hoạt động xúc tác của enzym khi liên kết với cơ chất Di chuyển 12Å, vòng WPD giúp tăng cường tương tác kị nước bằng cách đóng vòng phenyl của cơ chất Asp181 chuyển vị trí để hoạt động như một axit, hỗ trợ chuyển proton cho nhóm tyrosyl Arg221 cũng thay đổi vị trí nhằm tối ưu hóa tương tác "cầu muối" với phosphat Trong quá trình này, Cys215 giữ vai trò là vị trí liên kết ái nhân với nguyên tử phospho của cơ chất, cho thấy rằng tác nhân ức chế PTP1B có thể tác động vào cả quá trình chuyển dạng.

“mở” và “đóng” của PTP1B [29]

Vị trí liên kết aryl-phosphat thứ cấp đóng vai trò là vị trí xúc tác không hoạt động, tạo ra liên kết yếu hơn so với vị trí hoạt động cơ bản do có sự tiếp xúc nhiều hơn với môi trường Dù vậy, vị trí này vẫn rất quan trọng trong việc thiết kế các tác nhân ức chế PTP1B.

Vùng xúc tác có chứa 3 tiểu phân (cystein, aspatat và glycin) – là 3 axit amin cần thiết cho quá trình xúc tác

Giai đoạn đầu tiên diễn ra khi đoạn peptid chứa phosphotyrosin tiếp cận vị trí hoạt động Tại đây, tiểu phân aspartat đóng vai trò cung cấp proton, trong khi gốc phenolat vừa là nơi nhận proton vừa là nhóm rời khỏi cấu trúc cơ chất.

Đặc điểm thực vật, phân bố của cây ổi tại Việt Nam

1.3.1 Vị trí phân loại thực vật

Cây ổi thuộc loài Psidium guajava L., chi Psidium L., họ Sim

(Myrtaceae), bộ Sim (Myrtales), phân lớp Hoa hồng (Rosidae), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) [42]

Cây ổi, thuộc họ Sim (Myrtaceae), có khoảng 3.000 loài và phân bố trong 130-150 chi, chủ yếu ở vùng nhiệt đới và ôn đới ấm áp trên toàn cầu Chi Ổi (Psidium) có nguồn gốc từ Trung và Nam Mỹ với khoảng 100 loài cây bụi Hiện nay, cây ổi được trồng phổ biến ở nhiều quốc gia tại Châu Phi, Nam Á, Đông Nam Á, vùng Caribbean, cận nhiệt đới Bắc Mỹ và Úc.

[2] Ở Việt Nam cây ổi thường (Psidium guajava L.) được phát triển trên khắp cả nước từ đồng bằng ven biển cho đến vùng núi có độ cao khoảng 1500 m trở xuống [2]

1.3.3 Đặc điểm thực vật Ổi hay còn gọi là ủi, phan thạch lựu là cây thân gỗ sống lâu năm, thân phân cành nhiều, cao 4-6 m, cao nhất 10 m, đường kính thân tối đa 30 cm Thân cây chắc, khỏe, ngắn Thân nhẵn nhụi, vỏ già có thể tróc ra từng mảng, vỏ mới nhẵn, màu xám, hơi xanh [33] Cành non 4 cạnh, khi già mới tròn dần

Rễ ổi có cấu trúc rễ cọc, với bộ rễ chính có khả năng ăn sâu xuống đất từ 3 đến 4 mét hoặc hơn Lá ổi mọc đối, không có lá kèm, có phiến lá hình bầu dục với chiều dài từ 11 đến 16 cm và chiều rộng từ 5 đến 7 cm Phần gốc lá thuôn tròn, đầu lá có lông gai hoặc lõm, mặt trên lá có màu xanh đậm hơn so với mặt dưới.

Lá non có viền màu hồng tía kéo dài đến cuống, phủ lông trắng nhạt và có vị chát Gân lá hình lông chim, với gân giữa nổi bật ở mặt dưới Cuống lá màu xanh, hình trụ dài từ 1-1,3 cm, có rãnh cạn ở mặt trên Hoa lớn màu trắng, lưỡng tính, thường mọc thành chùm 2-3 bông, chủ yếu ở nách lá thay vì ở đầu cành.

Quả có 4-5 lá đài và 4-5 cánh hoa, với rất nhiều nhị, bầu dưới 5 ô Hình dáng quả có thể là tròn, hình trứng hoặc hình quả lê, dài từ 3-10cm Khi còn non, vỏ quả có màu xanh, nhưng khi chín sẽ chuyển sang màu vàng, với thịt vỏ màu trắng, vàng hoặc ửng đỏ Ruột quả có thể có màu trắng, vàng hoặc đỏ, với vị chua ngọt hoặc ngọt và mùi thơm đặc trưng Hạt quả nhiều, màu vàng nâu, hình đa giác, có vỏ cứng và nằm trong khối thịt quả có màu trắng, hồng hoặc đỏ vàng.

Cây ổi phát triển tốt trong nhiệt độ từ 15,5°C đến 32°C và ưa sáng, thích khí hậu ẩm Loại cây này có thể trồng trên nhiều loại đất với pH phù hợp từ 4,5 đến 8,2.

Theo nghiên cứu của đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh cho biết, trong lá ổi có chứa [5]:

- Tanin (7-10%) gồm gallotanins, axit ellagic

- Tinh dầu (0,31%) trong đó có aromadendrene, beta-bisabolene, caryophyllene, nerolidiol, selinene, dl limonene, các ancol thơm…

- Các axit hữu cơ gồm axit mastinic, axit aleanolic, axit oxalic, axit guaijavolic, axit guajanoic, axit crategolic, axit psidiolic, axit ursolic

- Flavonoid gồm quercetin, leucocyanidin, avicularin, guaijaverin

- Lá non và búp non có khoảng 7-10% tanin loại pyrogallic và 3% nhựa

1.3.5 Tác dụng và công dụng

Theo Y học cổ truyền, lá ổi có vị đắng, tính ấm, giúp tiêu thũng, giải độc và cầm máu; trong khi đó, quả ổi có vị ngọt hơi chua, tính ấm, có tác dụng thu liễm và kiện vị Các bộ phận của cây ổi thường được sử dụng để điều trị nhiều bệnh lý như tiêu chảy, lỵ mạn tính, viêm dạ dày ruột cấp và mãn tính, thấp độc, thấp chẩn, xuất huyết và tiểu đường.

Beta-sitosterol có trong lá ổi được biết đến như một phương thuốc hiệu quả cho việc điều trị cholesterol cao và các bệnh tim mạch Theo FDA, thực phẩm chứa ester sterol thực vật như beta-sitosterol có khả năng giảm nguy cơ mắc bệnh mạch vành.

Quercetin được biết đến như một chất chống oxi hóa mạnh, chống viêm hay giúp làm giảm cholesteron[25] Avicularin, guaijaverin có tác dụng ức chế tụ cầu [44]

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử của Beta-sitosterol

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử của Quercetin [25]

Hình 1.4 Cấu trúc phân tử của Guaijaverin [45]

Hình 1.5 Cấu trúc phân tử của Avicularin [45]

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên vật liệu và thiết bị

Lá ổi tươi được thu hái vào tháng 10 năm 2018 tại Long Biên, Hà Nội và đã được giám định thực vật học bởi Bộ môn Dược liệu - Dược cổ truyền, Khoa Y Dược

Lá ổi tươi được rửa sạch, sau đó sấy khô ở nhiệt độ 75-80°C và nghiền nhỏ Tiến hành chiết 1,04kg lá khô bằng Ethanol 96% (3,24L x 3 lần) theo phương pháp ngấm kiệt Dịch chiết sau khi lọc và gộp lại được cô bằng máy cô quay chân không, thu được 350g cao Ethanol toàn phần Cuối cùng, 30g cao toàn phần được phân tán.

350 mL nước cất rồi chiết phân đoạn lần lượt với n-hexan, EtOAc, BuOH (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 350mL)

2.1.3 Hóa chất và thiết bị 2.1.3.1 Hóa chất

The study utilized various reagents and enzymes sourced from Sigma in Singapore, including α-glucosidase, p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG), 4-Nitrophenol, p-Nitrophenyl phosphate (pNPP), and PTP1B Additionally, 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) was employed, along with ursolic acid obtained from Himedia in India.

Dung môi: n – Hexan, Ethyl acetat (EtOAc), n – Buthanol (n-BuOH), Ethanol 96% (EtOH) (Shouguang, Trung Quốc) và nước cất

Cân phân tích AY 129 (Shimadzu, Nhật Bản)

Máy cô quay chân không Rovapor R- 210 (Buchi- Đức)

Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC-150H, MRC, Isareal

Pipet, bình định mức, cối xứ, giấy lọc (đường kính 11 cm), phễu lọc

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro

Dưới tác dụng của enzym α-glucosidase, cơ chất p-nitrophenyl-α-D- glucopyranosid (PNP-G) bị thủy phân tạo ra α-D-glucose và p-nitrophenol

Nồng độ p-nitrophenol tỷ lệ thuận với hoạt động của enzym α-glucosidase, cho phép đánh giá hiệu quả của enzym này Để xác định nồng độ p-nitrophenol trong dung dịch, phương pháp đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 405nm được sử dụng So sánh độ hấp thụ màu giữa mẫu thử và mẫu chứng ở 405nm giúp đánh giá chính xác hoạt tính của enzym α-glucosidase.

Hình 2.1 Phản ứng thủy phân PNP-G dưới tác dụng của enzym α- glucosidase [7]

Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của hoạt chất nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp của Moradi-Afrapoli F và cộng sự [21] Cụ thể như sau:

- Chất thử được hòa tan trong DMSO và pha loãng trong đệm phosphate

10 mM (pH 6.8) và 50 l được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ 256 g/ml, 64 g/ml; 16 g/ml; 4 g/ml

- 20 àl α- glucosidase (0,5U/ml) và 130 àl đệm phosphate 100 mM (pH 6.8) được thêm vào mỗi giếng, trộn đều và ủ ở 37 o C trong 15 phút p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid

- Cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG) được đưa tiếp vào từng giếng thí nghiệm rồi ủ tiếp ở 37 o C trong 60 phút

Đĩa thí nghiệm chứa mẫu thử, đệm phosphate và pNPG được sử dụng làm đối chứng trắng, trong khi giếng thí nghiệm chỉ có DMSO 10%, đệm phosphate, enzym và pNPG làm đối chứng Thí nghiệm được lặp lại ba lần để đảm bảo độ chính xác cao.

- Dừng thớ nghiệm bằng cỏch thờm vào 80 àl Na 2 CO 3 0,2M và đo OD ở bước sóng 405nm bằng máy đo ELISA Plate Reader (Bio-Rad)

- Khả năng ức chế enzym α- glucosidase của mẫu thử được xác định theo công thức sau:

% ức chế = 100 - (A mẫu thử / A đối chứng *100) Trong đó: A đối chứng = OD đối chứng - OD blank

A mẫu thử = OD mẫu thử - OD blank mauthu

2.2.1.2 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu thực nghiệm được tổng hợp và phân tích xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4

2.2.2 Đánh giá khả năng ức chế enzym PTP1B in vitro

Phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzym PTP1B được thực hiện ở nhiệt độ 30°C, trong đó cơ chất p-nitrophenyl phosphate (pNPP) bị phosphoryl hóa thành p-nitrophenol (PNP dưới tác động của PTP1B Nồng độ PNP trong dung dịch được xác định bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 405nm Sự hiện diện của chất ức chế dẫn đến sự giảm nồng độ PNP, từ đó có thể xác định nồng độ enzym PTP1B dựa vào sự chênh lệch nồng độ giữa mẫu thử và mẫu chứng.

Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym PTP1B được thực hiện dựa trên quy trình được Hung và cộng sự mô tả, với các điều chỉnh phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.

Cơ chất là p-nitrophenyl phosphate (pNPP) được sử dụng trong thí nghiệm Dung dịch đệm gồm có 1 mM dithiothreitol (DTT), 0.1 M NaCl, 1 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic axit), và 50 mM citrate (pH 6.0)

Thí nghiệm được thực hiện bằng cách kết hợp 10 L mẫu thử với 20 L enzym PTP1B (1 g/ml) và trộn đều với 40 L pNPP 4 mM trong 130 L dung dịch đệm trong đĩa 96 giếng Sau đó, hỗn hợp được ủ ở 37 o C trong 30 phút, tiếp theo là thêm 10 L NaOH 1M để dừng phản ứng Cuối cùng, lượng p-nitrophenol được đo bằng cách xác định độ hấp thụ quang tại bước sóng 405 nm.

Tất cả các thí nghiệm được thực hiện ba lần để đảm bảo tính chính xác Axit ursolic được sử dụng làm chất đối chứng dương Phần trăm ức chế hoạt độ enzym PTP1B (% I) được tính toán theo công thức cụ thể.

Trong đó: I% phần trăm hoạt tính PTP1B bị ức chế

A c : độ hấp thu của mẫu chứng (khụng chứa 10 àL dung dịch thử)

A t : độ hấp thu của mẫu thử

A o : độ hấp thu của mẫu trắng

Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê sử dụng phần mềm SigmaPlot 10 (Systat Software Inc, Mỹ) Số liệu được biểu diễn dưới dạng X ± SD

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Kết quả chiết xuất và phân đoạn dịch chiết lá ổi

Lá ổi (1kg) sau khi sấy khô và nghiền nhỏ, được chiết xuất bằng Ethanol 96% để thu được 350g cao toàn phần Từ 30g cao toàn phần, tiến hành chiết phân đoạn với n-Hexan, EtOAc và n-Buthanol, cho ra ba loại cao phân đoạn: 8,31g cao n-Hexan, 2,43g cao EtOAc và 18,12g cao n-Buthanol.

Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn lá ổi

Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro

Cao toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ lỏ ổi đã được thử nghiệm tác dụng ức chế enzym α-glucosidase ở các nồng độ 128; 32; 8; 2 àg/mL, với mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác và lấy kết quả trung bình Acarbose được sử dụng làm chất đối chứng dương Kết quả cho thấy khả năng ức chế enzym của cao toàn phần và các phân đoạn dịch chiết tăng dần theo nồng độ, như được thể hiện trong bảng 3.1.

Bảng 3.1 Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của cao chiết toàn phần, các phân đoạn dịch chiết lá ổi và Acarbose

STT Mẫu ức chế tại các nồng đ

Bảng 3.1 trình bày giá trị IC 50 của cao chiết toàn phần, các phân đoạn dịch chiết và Acarbose, cho thấy tác dụng ức chế α-glucosidase của các phân đoạn dịch chiết tăng dần theo nồng độ Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng cao toàn phần EtOH, phân đoạn n-Hexan, phân đoạn EtOAc và phân đoạn BuOH có khả năng ức chế α-glucosidase cao với giá trị IC 50 lần lượt là 2,20; 2,53; 2,24 và 2,16 àg/mL, so với chứng dương Acarbose có IC 50 là 139,52 àg/mL Đặc biệt, phân đoạn BuOH cho thấy khả năng ức chế tốt tại nồng độ 128 àg/ml (99,86%) và 32 àg/ml (98,05%) Cao chiết toàn phần cũng cho thấy tác dụng ức chế khả quan tại 128 àg/ml (98,73%), trong khi hai phân đoạn EtOAc và n-Hexan cần được nghiên cứu thêm.

The study conducted by the School of Medicine and Pharmacy at VNU indicates that the inhibitory effect is weaker at a concentration of 128 µg/ml, with percentages of 96.08% and 90.84% Additionally, the positive control, acarbose, demonstrated stable activity throughout the experiment.

Tác dụng ức chế enzym PTP1B in vitro

Cao toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ lá ổi đã được thử nghiệm khả năng ức chế enzym PTP1B tại các nồng độ 1000; 500; 250; 125; 62,5; và 31,25 µg/mL, với mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác và lấy kết quả trung bình Axit usolic được sử dụng làm chất đối chứng dương Kết quả cho thấy khả năng ức chế enzym của các mẫu tăng dần theo nồng độ, như được thể hiện trong bảng 3.2.

Bảng 3.2 Tác dụng ức chế enzym PTP1B của cao chiết toàn phần, các phân đoạn dịch chiết lá ổi

Bảng 3.3 Tác dụng ức chế enzym PTP1B của axit ursolic

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế hoạt độ enzym PTP1B của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết lá ổi

Phần trăm ức chế (I%) Axit ursolic

EtOH n-Hexane EtOAc BuOH Ức chế

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế hoạt độ enzym PTP1B của axit ursolic

Bảng 3.2 và 3.3 trình bày giá trị IC50 của dịch chiết toàn phần, các phân đoạn dịch chiết và axit ursolic Tác dụng ức chế PTP1B của các phân đoạn dịch chiết tăng dần theo nồng độ Trong đó, phân đoạn dịch chiết EtOAc và BuOH cho thấy khả năng ức chế cao nhất với IC50 lần lượt là 120,23 và 97,72 µg/mL, so với chứng dương axit ursolic là 19,7 µg/mL Ngược lại, phân đoạn n-Hexan có tác dụng ức chế enzym PTP1B thấp nhất với IC50 là 204,17 µg/mL.

BÀN LUẬN

Đái tháo đường type 2 đang ngày càng trở nên phổ biến trên toàn cầu, chiếm 90% tổng số ca mắc tiểu đường và có tỷ lệ tử vong cao Đây là một bệnh lý chuyển hóa mạn tính, gây ra nhiều biến chứng nguy hiểm cho các cơ quan như tim, thận và mạch máu Các biến chứng này có thể dẫn đến di chứng nghiêm trọng như mù mắt hoặc phải cắt cụt chi Bệnh đái tháo đường type 2 và các biến chứng của nó không chỉ ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng cuộc sống của người bệnh mà còn đang có xu hướng trẻ hóa độ tuổi mắc bệnh.

Nhiều nghiên cứu toàn cầu đang tìm kiếm thuốc mới để điều trị hiệu quả bệnh đái tháo đường type 2, nhằm hạn chế biến chứng và nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân Các nhà khoa học đang chuyển hướng sang các loại thuốc thảo dược an toàn với ít tác dụng phụ, trong đó có những thuốc ức chế enzym α-glucosidase và PTP1B Cây ổi, với lá và quả được sử dụng rộng rãi, từ lâu đã được biết đến với nhiều công dụng Quả ổi không chỉ là thực phẩm mà còn có tác dụng chữa bệnh, trong khi lá ổi theo y học cổ truyền có vị đắng, tính ấm, giúp tiêu thũng, giải độc và cầm máu Nghiên cứu cho thấy các hợp chất trong lá ổi có khả năng kháng khuẩn, chống oxi hóa và giảm cholesterol, cho thấy tiềm năng của lá ổi trong sản xuất thuốc tự nhiên điều trị nhiều bệnh, bao gồm cả đái tháo đường type 2 Nghiên cứu của chúng tôi đã chứng minh tác dụng ức chế enzym α-glucosidase và PTP1B từ các phân đoạn dịch chiết lá ổi, mở ra hướng nghiên cứu sâu hơn về loại lá này.

Enzym α-glusidase, có mặt trong màng đường ruột, đóng vai trò quan trọng trong giai đoạn cuối của quá trình tiêu hóa bằng cách xúc tác phân hủy các disaccaride như sucrose và maltose thành monosaccharide như glucose Vì vậy, các chất ức chế α-glusidase sẽ có vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh quá trình tiêu hóa đường.

Nghiên cứu tại Trường Y Dược, ĐHQGHN chỉ ra rằng các chất ức chế α-glucosidase như acarbose, voglibose và miglitol thường gây ra tác dụng phụ như đau bụng và tiêu chảy trong điều trị đái tháo đường type 2 Kết quả cho thấy các phân đoạn dịch chiết từ lá ổi, đặc biệt là phân đoạn BuOH với IC 50 là 2,16, có khả năng ức chế enzym tốt Đái tháo đường type 2 liên quan đến đề kháng insulin, do suy giảm tín hiệu từ thụ thể insulin, trong đó enzym PTP1B đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa tín hiệu insulin Tăng hoạt động của PTP1B dẫn đến giảm tín hiệu insulin và kháng insulin Do đó, giảm hoạt động của PTP1B có thể cải thiện độ nhạy insulin Các hợp chất từ lá ổi như morin flavonoid, quercetin và nhiều hợp chất khác có tiềm năng trong điều trị đái tháo đường type 2 và béo phì.

Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra tác dụng hạ đường huyết của cây ổi Một nghiên cứu của Haseena Banu và cộng sự cho thấy, việc sử dụng cao chiết lá ổi với liều 300 mg/kg thể trọng có hiệu quả trong việc hạ đường huyết ở chuột bị tiểu đường do streptozotocin Kết quả nghiên cứu cho thấy cao chiết lá ổi làm giảm nồng độ glucose máu, giảm HbA1c và tăng đáng kể lượng insulin trong huyết tương, đồng thời cải thiện hoạt tính của các enzym chuyển hóa carbohydrate như hexokinase và pyruvate kinase.

Nghiên cứu cho thấy cao chiết nước từ lá ổi với liều 250 mg/kg có tác dụng hạ đường huyết đáng kể trên mô hình chuột tiểu đường do alloxan Ngoài ra, tiêm dịch chiết lá ổi với liều 10 mg/kg có khả năng ức chế protein tyrosine phosphatase 1B ở chuột tiểu đường mang gen Lepr(db)/Lepr(db).

Nghiên cứu dài hạn trên chuột cho thấy việc uống cao chiết từ lá ổi, cả nước và ethanol, làm tăng nồng độ insulin huyết tương và cải thiện vận chuyển glucose vào gan, cơ, đồng thời kích thích hoạt tính của các enzym như hexokinase, phosphofructokinase và glucose-6-phosphate dehydrogenase ở chuột tiểu đường Kết quả này chỉ ra rằng lá ổi hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường thông qua cơ chế ức chế enzym glucosidase và Protein Tyrosin Phosphatase 1B.

Tiêu đề	Nghiên Cứu Tác Dụng Ức Chế Enzym α-Glucosidase Và Enzym PTP1B In Vitro Của Dịch Chiết Lá Cây Ổi (Psidium Guajava L.) Trồng Tại Việt Nam
Tác giả	Trần Trọng Nghĩa
Người hướng dẫn	PGS.TS. Bùi Thanh Tùng
Trường học	Đại học Quốc gia Hà Nội
Chuyên ngành	Dược học
Thể loại	khóa luận tốt nghiệp
Năm xuất bản	2019
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	49
Dung lượng	697,22 KB