dòng hóa biểu hiện và tinh chế protein alpha momorcharin trong e coli tiềm năng kháng nấm nguy hại trong nông nghiệp

Để làm giảm thiệt hại và tăng năng suất cho cây trồng chọi với dịch bệnh do nấm gây ra, hiện nay người nông dân đã và đang sử dụng các biện pháp phòng và trị bệnh như chọn giống sạch bện

DÒNG HÓA, BIỂU HIỆN VÀ TINH CHẾ PROTEIN

ALPHA-MOMORCHARIN TRONG E.COU TIỀM

NĂNG KHÁNG NẤM nguy hại

TRONG NÔNG NGHIỆP

-

DÒNG HÓA, BIỂU HIỆN VÀ TINH CHẾ PROTEIN ALPHA-MOMORCHARIN TRONG E.COLĨ TIỀM

NĂNG KHÁNG NẤM nguy HẠI

TRONG NÔNG NGHIỆP

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn:

Học viên thực hiện Lớp

Ngày sinh: Nơi sinh

Tên đề tài:

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép học viên được bảo vệ khóa luận trước Hội đồng:

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng năm

Người nhận xét .

được bước chân vào trường đại học Mở TP.HCM, được học hỏi rất nhiều kiến thức

quý báu cũng như trau dồi kinh nghiệm và nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình từ quý

Thầy Cô khoa Công nghệ Sinh học Những bài học quý báu của thầy cô sẽ là hành

trang giúp em vững bước trên con đường phía trước và hoàn thiện bản thân mình

hơn

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc và đặc biệt nhất đến thầy Đặng Thanh Dũng

– người luôn đồng hành, theo sát và tạo mọi điều kiện để em hoàn thành tốt đề tài

Không chỉ là người định hướng, thầy còn là người truyền đạt cho em những kinh

nghiệm nghiên cứu và những bài học cuộc sống quý giá Cảm ơn thầy vì đã luôn ở

bên cổ vũ, khích lệ để em tiếp tục cố gắng; cảm ơn thầy vì luôn kiên trì nhẫn nại trả

lời vô vàn những câu hỏi, những thắc mắc của em Và sau tất cả, cảm ơn thầy đã là

tấm gương, đã trở thành động lực tích cực giúp em trở thành một người có ích

Em xin gửi lời cảm ơn đến chị Thư – người cô, người chị đã theo sát nghiên

cứu của em cũng như mở ra cho em những cách nhìn mới về khoa học, chị đã chỉ dạy

hướng dẫn em tận tình và luôn luôn hỗ trợ giúp em hoàn thành tốt đề tài Cảm ơn

bạn Ngọc và tất cả những người bạn đã luôn đồng cam cộng khổ chia sẻ kiến thức,

giúp đỡ nhau vượt qua khó khăn trong suốt quá trình học tập

Con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, đến Ba Má đã luôn bên cạnh

động viên, quan tâm và tạo điều kiện tốt nhất để con hoàn thành việc học Cảm ơn

anh hai luôn giúp đỡ và bao bọc em trong những lúc khó khăn xa nơi xứ người

Với tất cả tấm lòng và tình cảm yêu thương nhất, xin chúc cho mọi người luôn

luôn vui vẻ, tràn đầy sức khỏe và nụ cười luôn nở trên môi cũng như sẽ gặt hái được

nhiều thành công trên con đường phía trước!

Bình Dương, ngày 22 tháng 07 năm 2020

NGUYỄN THỊ THU THẢO

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH iii

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

1.1 Protein α-MMC 4

1.1.1 Nguồn gốc 4

1.1.2 Cấu trúc của α-MMC 6

1.1.3 Cơ chế hoạt động của protein α-MMC 7

1.1.4 Vai trò sinh học và tiềm năng của protein α-MMC 9

1.2 Hệ thống dòng hóa và biểu hiện 13

1.2.1 Chủng dòng hóa E coli DH5α 13

1.2.2 Chủng biểu hiện E coli BL21(DE3) 14

1.2.3 Vector biểu hiện 14

1.3 Tổng quan về đặc điểm gậy hại của các loại nấm gây hại cho cây trồng 15

1.3.1 Nấm Pyricularia oryzae (Magnaporthe grisea) 15

1.3.2 Nấm Aspergillus nomius 17

1.3.3 Nấm Aspergillus terreus 17

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 19

2.2 Vật liệu sinh học 19

2.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường 21

2.3.1 Thiết bị, dụng cụ 21

2.3.2 Hóa chất 22

2.3.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 24

2.4 Phương pháp thực hiện 24

2.4.1 Dòng hóa tạo vector pTD7 trong E coli DH5α 25

2.4.1.1 Phản ứng PCR thu nhận gen mục tiêu α –MMC 25

2.4.1.2 Phản ứng cắt mở vòng plasmid pET28a và xử lý gene mục tiêu 27

2.4.1.3 Phản ứng nối gene mục tiêu vào plasmid pET - 28a 28

2.4.1.4 Biến nạp sản phẩm nối vào tế bào chủ E coli DH5α khả nạp 29

2.4.1.5 Sàng lọc dòng tế bào E coli DH5α mang vector pTD7 30

2.4.2 Tạo chủng E coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pTD7 biểu hiện protein α- MMC 33

2.4.2.1 Biến nạp tạo chủng E coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pTD7 33

2.4.2.2 Kiểm tra biểu hiện của protein α-MMC trong chủng E coli BL21(DE3) 33 2.4.3 Tinh chế protein α-MMC 36

2.4.4 Khảo sát hoạt tính kháng nấm của protein α-MMC 38

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 Dòng hóa tạo vector pTD7-MMC 40

3.1.1 Phản ứng PCR thu nhận gen α-MMC 40

3.1.2 Tạo vector tái tổ hợp pTD7 40

3.1.3 Sàng lọc các dòng tế bào E coli DH5α mang vector pTD7 42

3.2 Tạo chủng E coli BL21(DE3) mang vector pTD7-MMC và kiểm tra sự biểu hiện protein α-MMC 44

3.3 Tinh chế protein α-MMC 45

3.4 Khảo sát hoạt tính kháng nấm của protein α-MMC 47

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 47

4.1 Kết luận 50

4.2 Kiến nghị 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHỤ LỤC 53

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 1 Cấu trúc không gian của α –MMC 4

Hình 1 2 Sơ đồ phân loại protein bất hoạt ribosome thực vật (RIPs) 5

Hình 1 3 Hình ảnh quả mướp đắng 5

Hình 1 4 Chuỗi trình tự của α-MMC 6

Hình 1 5 Biểu đồ vị trí cấu trúc thứ cấp của phân tử α -MMC 7

Hình 1 6 Mô hình cơ chế phòng vệ của α-MMC chống lại mầm bệnh 8

Hình 1 7 Cơ chế xúc tác thủy phân liên kết N-glycosidase giữa Adenine và khung đường trong phân tử RNA ribosome 9

Hình 1 8 Mô hình kháng bệnh gây hại cho cây trồng của RIP 10

Hình 1.9 Mức độ sao chép và biểu hiện của virus trong lá cây thuốc lá 10

Hình 1.10 Hoạt tính kháng nấm của protein α-MMC ức chế sự tăng trưởng sợi nấm gây bệnh 11

Hình 1.11 Khả năng ức chế tăng trưởng nấm Fusarium solani 12

Hình 1.12 Sơ đồ plasmid pET-28a(+) 15

Hình 1.13 Bào tử đính (connidia) và cuống mang bào tử (conidiophore) của nấm Pirycularia oryzae gây bệnh đạo ôn và biểu hiện bệnh đạo ôn trên lúa 16

Hình 2.1 Sơ đồ plasmid pET-28a (+) sử dụng trong đề tài 20

Hình 2.2 Thang chuẩn 21

Hình 2.3 Quy trình dòng hóa tạo vector pTD7 25

Hình 2 4 Nguyên tắc khuyết đại của phản ứng PCR 26

Hình 2.5 Sơ đồ chương trình chạy PCR thu gen mục tiêu 27

Hình 2 6 Nguyên tắc PCR khuẩn lạc 31

Hình 2.7 Vị trí bắt cặp của mồi cho phản ứng PCR khuẩn lạc sàng lọc vector pTD7 31

Hình 2.8 Sơ đồ chương trình chạy PCR khuẩn lạc 32

Hình 2.9 Quy trình kiểm tra biểu hiện của protein α-MMC 34

Hình 2.10 Hình cấu trúc tương tác giữa đuôi ái lực polyhistidine với hai ion kim loại Ni 2+ được cố định bằng NTA(Ni 2+ -NTA) 37

Hình 2.11 Quy trình tinh chế protein α-MMC 37

Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR thu gen α-MMC 40

Hình 3.2 Kết quả biến nạp sản phẩm nối của pET28a và gen α-MMC 41

Hình 3.3 Kết quả sàng lọc chủng E coli DH5α mang vector pTD7 bằng phản ứng PCR khuẩn lạc 42

Hình 3.4 Kết quả so sánh trình tự lý thuyết (aMMC) với trình tự dòng hóa 43

Hình 3 5 Sơ đồ vector pTD7 có mang gen α-MMC 43

Hình 3.6 Kết quả biến nạp vector pTD7 vào chủng E coli BL21(DE3) 44

Hình 3.7.Kết quả kiểm tra biểu hiện của protein α-MMC 45

Hình 3.8 Kết quả điện di SDS-PAGE kiểm tra việc tinh chế protein α-MMC 46

Hình 3.9 Sự ức chế tăng trưởng đối với nấm Aspergillus terreus (A) và Aspergillus nomius (B) trên môi trường PDA của protein α-MMC ở các nồng độ 0 (đối chứng), 5µM, 15µM được ủ trong 28 0 C, 24 giờ 48

Hình 3.10 Hoạt tính kháng nấm Pyricularia oryzae của α-MMC ở các nồng độ khác nhau: ĐC (nước), 0 µM, 5 µM, 20 µM, 100 µM và 200 µM được ủ trong 24h, nhiệt độ 28 º C 49

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Trình tự các mồi dùng trong thực tập 19 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR thu gen α –MMC 27 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng cắt plasmid khung sườn và gen mục tiêu với

enzyme cắt giới hạn 28

Bảng 2.4 Các thành phần phản ứng nối 28 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR cho 1 khuẩn lạc 32

FDA Food and Drug Administration

GMO Genetically Modified Organism

MCS Mutiple Cloning Site

NTA Nitrilotriacetic acid

OD600 Optical Density ( Wavelength: 600nm)

PBS Phosphate-buffered saline

PCR Polymerase Chain Reaction

PDA Potato Dextrose Agar

RIPs Ribosome Inactivating Proteins

rRNA Ribosomal ribonucleic acid

SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis

TAE Tris-Acetate-EDTA

TMV Tobacco mosaic virus

TuMV Turnip mosaic potyvirus

VMV Chilli veinal mottle virus

α-MMC Alpha-momorcharin

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là nước có truyền thống phát triển nông nghiệp từ lâu đời nay vì thế việc trồng và xuất khẩu nông sản ngày càng đạt kết quả cao Tuy nhiên vấn đề khó khăn mà nền nông nghiệp ở Việt Nam cũng như trên toàn thế giới đang gặp phải đó

là dịch bệnh phát sinh trong đó nấm, virus và vi khuẩn là các tác nhân gây bệnh chính Đây là nguyên nhân dẫn đến các thiệt hại lớn cho sản xuất nông nghiệp trong nước cũng như trên thế giới (Doehlemann và cs, 2017)

Để làm giảm thiệt hại và tăng năng suất cho cây trồng chọi với dịch bệnh do nấm gây ra, hiện nay người nông dân đã và đang sử dụng các biện pháp phòng và trị bệnh như chọn giống sạch bệnh hay kháng bệnh, luân canh, xen canh, cải tạo đất để tiêu diệt các tác nhân gây bệnh, vệ sinh đồng ruộng sau mỗi vụ thu hoạch tuy nhiên hiệu quả đạt được từ các phương pháp này chưa cao Vì thế họ đã sử dụng liên tục các loại thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học trong canh tác nông nghiệp Điều này gây mất cân bằng sinh thái trầm trọng, ảnh hưởng tới hệ sinh vật và vi sinh vật trong đất, dẫn tới hiện tượng kháng thuốc, gây ô nhiễm môi trường đất, ô nhiễm nguồn nước thậm chí lượng thuốc hóa học bị tích lũy trong nông sản dễ dẫn tới nhiễm độc cho con người Lượng thuốc hóa học tích lũy trong mỡ cơ thể theo thời gian sẽ làm thay đổi kiểu hình hay chức năng miễn dịch và làm tăng khả năng mắc các bệnh tiềm

ẩn nguy hiểm như viêm da dị ứng, các bệnh liên quan đến hô hấp, thần kinh, ung thư,… dẫn đến tử vong (WHO,1990) Ngoài ra việc sử dụng kỹ thuật biến đổi gen (GMO) có thể giúp cho cây trồng hạn chế mầm bệnh và tăng năng suất nông sản Tuy nhiên, vấn đề về thực phẩm biến đổi gen vẫn còn tranh luận và việc ứng dụng kỹ thuật này vào cây trồng còn hạn chế

Hiện nay, nhận thức của con người về an toàn thực phẩm ngày càng nâng cao trên toàn thế giới Việc cải cách nông nghiệp và sản xuất lương thực theo hướng phát triển nền nông nghiệp bền vững; sản xuất sản phẩm sạch, an toàn; đẩy mạnh phát triển nông nghiệp hữu cơ để giảm thiểu các tác hại và nâng cao sức khỏe chất lượng thực phẩm cho con người là hết sức cần thiết Tuy nhiên việc sử dụng phân bón hóa

học là không được phép trong canh tác hữu cơ nên cần phải có một giải pháp thay thế hiệu quả giúp tiêu diệt bệnh hại, nâng cao năng suất cho cây trồng Vì vậy, nhu cầu sản xuất chế phẩm có nguồn gốc sinh học để đáp ứng phát triển nền nông nghiệp hữu

cơ là rất cần thiết Theo Varma và cộng sự (1999), việc sử dụng các chất chiết xuất

từ thực vật được xem là lựa chọn tốt nhất vì hạn chế tác động tới môi trường sinh thái

và ít gây nguy hiểm tới người tiêu dùng Trong đó, Alpha-momorcharin (α-MMC) được tách chiết từ hạt cây mướp đắng đã được thử nghiệm cho thấy có nhiều hoạt tính sinh học như ức chế sự phát triển của ung thư vú (Cao và cs, 2015), ức chế sự sao chép của HIV-1 (Zheng, Ben, & Jin, 1999) Đặc biệt, theo công trình nghiên cứu của Zhu và cộng sự (2013), cho thấy hoạt tính kháng virus của chất này khá rộng:

kháng được với Chilli veinal mottle virus (Chi VMV), Cucumber mosaic virus (CMV), Tobacco mosaic virus (TMV), kháng nhiều loại nấm gây bệnh cho cây trồng bao gồm: nấm Fusarium spp., nấm Aspergillus spp., nấm Sclerotinia sclerotiorum, nấm Bipolaris maydis, nấm Magnaporthe grisea Qua đó cho thấy triển vọng to lớn

khi sử dụng α-MMC như là một giải pháp thay thế để đề phòng và kiểm soát bệnh do nấm gây ra

Tuy nhiên, quá trình chiết xuất protein α-MMC từ hạt trái mướp đắng còn gặp nhiều khó khăn trong việc thu nhận protein có độ tinh sạch cao cũng như khó khăn trong việc triển khai ứng dụng α-MMC với quy mô lớn trong nông nghiệp Nhằm giải quyết vấn đề trên, việc sử dụng hệ thống vi khuẩn cho sản xuất α-MMC đang được quan tâm Hiện nay, Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu về protein α-MMC do

đó chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “ DÒNG HOÁ, BIỂU HIỆN VÀ TINH

CHẾ PROTEIN ALPHA-MOMORCHARIN TRONG E COLI TIỀM NĂNG

KHÁNG NẤM NGUY HẠI TRONG NÔNG NGHIỆP”

❖ Mục tiêu

- Tạo dòng, biểu hiện, thu nhận và tinh chế protein α-MMC với độ tinh sạch cao

trong hệ thống vi khuẩn E coli nhằm kháng nấm bệnh trong cây trồng đồng

thời tạo nền tảng cho các nghiên cứu sâu hơn phục vụ cho việc phát triển nền nông nghiệp bền vững

❖ Nội dung nghiên cứu:

- Thiết kế và tạo dòng vector tái tổ hợp pTD7 mang gene α-MMC

- Tạo chủng E coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pTD7

- Biểu hiện, nuôi cấy và cảm ứng với chất cảm ứng sau đó kiểm tra biểu hiện

- Tinh chế protein α-MMC

- Thử nghiệm khảo sát hoạt tính kháng nấm của protein α-MMC

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hình 1 1 Cấu trúc không gian của α –MMC [Protein Data Bank file 1aha]

RIPs được phát hiện ở hơn 50 loài thuộc 14 họ thực vật, bao gồm cả cây một

và hai lá mầm của thực vật hạt kín RIPs không chỉ được tìm thấy ở họ Bầu bí

(Cucurbitaceae) với rất nhiều chi gồm các cây thuốc quý như Trichosanthes, Luffa,

mà còn thấy ở rất nhiều các họ thực vật khác như Cẩm chướng (Caryophylaceae), Thầu dầu (Euphorbiaceae), Hoà thảo (Poaceae), Họ đậu (Fabaceae), họ Hoa phấn (Nygtaginaceae) RIPs được tìm thấy ở hầu hết các bộ phận của cây như hạt, rễ, lá,

củ, quả, vỏ cây đặc biệt tồn tại nhiều ở hạt và quả, ít hơn ở lá và thân Sự phân bố RIPs trên các mô khác nhau tùy thuộc vào từng loài thực vật (Brar, 2017)

Hiện nay, RIPs được phân chia chủ yếu thành hai loại là RIPs loại một và RIPs

loại hai RIPs loại một (Hình 1.2A) bao gồm một chuỗi polypeptide đơn với hoạt tính N-glycosidase RIPs loại hai chứa hai chuỗi polypeptide (chuỗi A và chuỗi B, hình

1.2B) được liên kết với nhau thông qua cầu nối disulfide, chuỗi A hoạt động như RIPs

loại một với trọng lượng khoảng 30 kDa còn chuỗi B là một phân tử có hoạt tính cần

cho sự bám vào thụ thể đầu N galactosyl trên bề mặt tế bào đích và tạo điều kiện cho

chuỗi A xâm nhập vào tế bào chất của tế bào Do đó, RIP loại hai có khả năng gây

độc cao Ngoài ra còn có RIPs loại bốn (Hình 1.2C) gồm hai chuỗi A với hoạt tính

N-glycosidases hoạt động trên rRNA nhân thực và hai chuỗi B với chức năng chưa

được biết đến Khi miền bổ sung có chức năng chưa biết được loại bỏ, protein hoạt

động tương tự như RIP loại một (Zhu và cs, 2018)

Hình 1 2 Sơ đồ phân loại protein bất hoạt ribosome thực vật (RIPs).

Trong đó, protein α-MMC thuộc RIPs loại một là một chuỗi polypeptide đơn

với trọng lượng phân tử khoảng 29 kDa được Yeung và cộng sự (1985) tinh chế thành

công từ hạt trái mướp đắng (Momordica charantia) Phân loại trái mướp đắng theo

Singh và cộng sự (2016) như sau:

Hình 1 3 Hình ảnh quả mướp đắng (giống Ấn Độ) (A) lát cắt thẳng đứng của quả (B) mặt cắt

ngang của quả (C) nhìn gần hơn về quả (D)

1.1.2 Cấu trúc của α-MMC

Protein α-MMC (CAA40869.1) thuộc nhóm protein bất hoạt ribosome được tìm thấy trong hạt trái mướp đắng (hay trái khổ qua) gồm 286 amino acid Trong đó, tiểu phần hoạt tính có 246 amino acid (từ vị trí amino acid 24 đến vị trí amino acid 269) với tổng trọng lượng cấu trúc khoảng 29kDa

Empty: không có cấu trúc thứ cấp B: cầu nối beta

S: điểm nối T: chỗ uốn cong E: sợi nếp gấp beta H: chuỗi xoắn alpha

Hình 1 4 Chuỗi trình tự của α-MMC (Nguồn ngân hàng dữ liệu protein PDB)

Cấu trúc của α-MMC đã được xác định thông qua phương pháp nhiễu xạ tia X

ở độ phân giải 2.2 A᷃ Chuỗi polypeptide của α-MMC gấp thành hai miền tương tác tạo thành một khe hở trên bề mặt protein bao gồm 9 α-helices và 10 β-sheets: α1,11-23; α2, 86-91; α3,111-118; α4, 129-139; α5, 144-163; α6, 165-173; α7, 183-191; α8, 192-202; α9, 231-234; β1, 3-5; β2, 27-31; β3, 34-37; β4, 47-53; β5, 59-65; β6, 70-76;

β7, 79-82; β8, 101-104; β9, 208-215; β10, 223-227 Trong đó tương tác kỵ nước, cặp ion và liên kết hydro giúp ổn định toàn bộ nếp gấp và cấu trúc thứ cấp của protein

Hình 1 5 Biểu đồ vị trí cấu trúc thứ cấp của phân tử α -MMC

khi nhìn về phía khe hở vị trí hoạt động ( Ren và cs, 1994)

Vị trí hoạt động của α-MMC nằm ở giữa khe hở và bao gồm các amino axit tham gia vào hoạt động Trong đó Tyr70, Tyr111, Glu160, Argl63 và Trp192 là bất biến hình thành trung tâm hoạt động và phần còn lại được bảo tồn cao trong protein không liên quan trực tiếp đến việc hình thành các trung tâm hoạt động, như Phe-4, Tyr-14, Phe-17, Arg-22, Leu-52 và Arg-122 Những axit amin này liên quan đến sự

ổn định hình học của các trung tâm hoạt động (Ren và cs, 1994)

1.1.3 Cơ chế hoạt động của protein α-MMC

Protein α-MMC đã được chứng minh có nhiều hoạt tính quan trọng trong nông nghiệp như kháng nấm và kháng virus Mô hình cơ chế phòng ngự trực tiếp của α-

MMC chống lại mầm bệnh nấm và virus được mô tả như trong Hình 1.6

α-MMC có thể ức chế mầm bệnh trực tiếp bằng cách xâm nhập vào vách tế bào thông qua lưới nội chất (1) để vào tế bào chất và dựa vào hoạt tính N-glycosidase (2) có thể nhắm đến mầm bệnh ở vùng nội bào hoặc ngoại bào dẫn đến ức chế sự phát triển tổng hợp protein do đó ngăn chặn sự phát triển của nấm và tiêu diệt tế bào nấm (3) Nhưng ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy nguyên nhân chính gây độc trong các tế bào mầm bệnh là do khả năng gây ra ức chế ngược apoptosis của chúng

(4) Protein α-MMC hoạt động ức chế tổng hợp protein nhờ vào hoạt tính xúc tác glycosidase để giải phóng một phân tử adenin đặc trưng (A4324 đánh dấu dựa trên 28S rRNA của gan chuột) do đó phân cắt cầu nối N-glycosidic giữa adenine đặc hiệu

N-và ribose (6) Quá trình khử purine do thủy phân liên kết N-glycosidic diễn ra trên vùng bảo tồn cao Sarcin/Ricin Loop của rRNA làm gián đoạn sự tương tác của yếu

tố kéo dài II (EF-2) khiến ribosome không thể bám vào và cuối cùng ức chế tổng hợp protein ở bước dịch mã gây chết tế bào

Hình 1 6 Mô hình cơ chế phòng vệ của α-MMC chống lại mầm bệnh (Brar, 2017)

Cụ thể trong cấu trúc tiểu phần hoạt tính, ba amino acid: Ile71, Glu160 và Arg163 đóng vai trò quan trọng trong khả năng xúc tác thủy phân của α-MMC Trong khi Glu160 tích điện âm đóng vai trò ổn định ion oxycarbonium, những liên kết hydrogen ở vị trí N1 và N3 của Adenine với Ile71 và Arg163 tạo điều kiện thuận lợi cho việc α-MMC bẻ gãy liên kết cộng hóa trị giữa N9 của Adenine và C1 của khung

đường (Hình 1.7) Sự bẻ gãy liên kết giữa Adenine và khung đường bởi α-MMC dẫn

đến bất hoạt RNA ribosome và ức chế sự tổng hợp protein trong tế bào làm giết chết

tế bào

Hình 1 7 Cơ chế xúc tác thủy phân liên kết N-glycosidase giữa Adenine và khung

đường trong phân tử RNA ribosome (Ren và cs, 1994)

1.1.4 Vai trò sinh học và tiềm năng của protein α-MMC

Hiện nay RIPs đóng vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực và được nghiên cứu phổ biến vì độc tính của chúng với khả năng hoạt động sinh học ức chế tổng hợp protein dựa vào hoạt tính N-glycosidase , do đó RIPs là một nhân tố tiềm năng với ứng dụng hứa hẹn nhất của RIPs trong y học thực nghiệm là phòng chống trị liệu ung thư bằng cách sử dụng protein này như một loại độc tố miễn dịch, liên hợp hoặc các tinh thể tái tổ hợp trong đó chúng được liên kết với các khối u hoặc các kháng thể trung gian gắn kết với các tế bào ác tính (Citores và cs, 2016)

Đặc biệt, ứng dụng trong nông nghiệp của RIPs là kháng nấm và kháng lại virus gây hại cho cây trồng.Các nghiên cứu mới gần đây đã chứng minh α-MMC có thể giúp tăng sức đề kháng của thực vật để chống lại các tác nhân gây hại như virus,

vi khuẩn, nấm trong in vitro và in vivo Trong cây trồng chuyển gen như cây lúa, sự

biểu hiện protein α-MMC có thể ngăn chặn bệnh đạo ôn (Huang và cs, 2014) Do đó

có thể ứng dụng protein tiềm năng này vào các cơ chế phòng ngự của cây trồng bằng công nghệ chuyển gen giúp thực vật tăng sức đề kháng nấm, kháng vi khuẩn, kháng

virus và kháng côn trùng ( Hình 1.8.)

Hình 1 8 Mô hình kháng bệnh gây hại cho cây trồng của RIP (Zhu và cs, 2018)

Nghiên cứu của Zhu và cộng sự (2013) đã cho thấy khả năng kháng virus hiệu

quả bao gồm virus gây bệnh khảm trên cây như Chilli veinal mottle virus (Chi VMV),

Cucumber mosaic virus (CMV), Tobacco mosaic virus (TMV) và Turnip mosaic

potyvirus (TuMV) Kết quả được thể hiện như trong Hình 1.9

Hình 1.9 Mức độ sao chép và biểu hiện của virus trong lá cây thuốc lá (Zhu và cs,

2013) (A) Kết quả realtime-PCR phân tích mức độ sao chép của virus (B) Triệu chứng của lá cây khi được ủ với RNA virus Đối chứng: phun 0.02M đệm PBS; Xử

lý: lá cây được tiền xử lý với 0.5 mg/mL α-MMC

Kết quả cho thấy nồng độ của α-MMC tỉ lệ với mức độ kháng virus gây hại cho

thực vật Trong đó, cây bị nhiễm virus Chi VMV cho thấy các triệu chứng như vết

đốm xanh đậm, xuất hiện dải dọc theo gân lá, đốm vòng hoại tử và biến dạng lá Cây

bị nhiễm virus chi CMV bề mặt lá nhăn nheo, khảm Nhiễm virus chi TMV cây xuất

hiện triệu chứng khảm xanh đậm cùng với sự biến dạng và phồng lá cây trong khi ở

lá cây được xử lí với 0,5 mg/mL α-MMC không xuất hiện các triệu chứng trên Hơn nữa, tính chất kháng nấm đầy tiềm năng của α-MMC chống lại nấm gây bệnh

tấn công vào lúa mì, bắp, lúa… đã được báo cáo bao gồm các loại nấm Sclerotinia

sclerotiorum, Fusarium graminearum, Bipolaris maydis, Aspergillus niger,

Aspergillus oryzae, kết quả được thể hiện như Hình 1.10

Hình 1.10 Hoạt tính kháng nấm của protein α-MMC ức chế sự tăng trưởng sợi nấm

gây bệnh ( Zhu và cs , 2013) Đối chứng: đệm PBS; Xử lý: α-MMC 500µg/ml

Kết quả cho thấy protein α-MMC chống lại tất cả các mầm bệnh thực vật thử nghiệm với sự ức chế nảy mầm và thể hiện hoạt tính kháng nấm rộng rãi Cụ thể ở

các loại nấm bị ức chế 67% (Bipolaris maydis), 65% (Aspergillus niger), 53% (Aspergillus oryzae), 51% (Fusarium graminearum) và 50% (Sclerotinia

selerotiorum) khi có sự hiện diện của α-MMC (500 µg/ml) so với các mẫu đối chứng

α-MMC có khả năng kháng trên 50% đối với các chủng nấm, trong đó khả năng

kháng Bipolaris maydis cao nhất lên đến 67% Hiện nay, cơ chế kháng của α-MMC

được cho là giống những protein khác, chúng phá vỡ màng của nấm và xâm nhiễm vào bên trong dẫn đến giết chết tế bào nấm (Zhu và cs, 2018)

Nghiên cứu của Wang và cộng sự (2016) đã xác định hoạt tính kháng nấm của

chiết xuất hạt trái mướp đắng đối với nấm Fusarium solani L - một loại nấm có nhiều

sợi nhỏ là nguyên nhân gây ra hiện tượng thối rễ và chết cây trồng Bệnh thường gây hại nặng ở những vùng thường xuyên ngập nước, đất bị ngập úng thì rễ cây sẽ bị thiếu

oxy, làm rễ suy yếu Nấm Fusarium solani có sẵn trong đất sẽ dễ dàng tấn công vào

chóp rễ, dẫn đến thối rễ trong cánh đồng và trong nhà kính Ngoài ra, ở những vùng đất có tuyến trùng thì khi chúng chích hút tạo vết thương, thuận lợi cho nấm xâm nhập gây hại trầm trọng hơn

Hình 1.11 Khả năng ức chế tăng trưởng nấm Fusarium solani (Wang và cs, 2016)

(A) a-1 đến a-3, F solani được nuôi cấy trong 12 giờ, 24 giờ và 36 giờ (B) b-1 đến b-3, F solani được xử lý với protein α-MMC trong 12 giờ, 24 giờ và 36 giờ

Kết quả cho thấy khả năng kháng của α-MMC tùy thuộc vào nồng độ và thời gian

thử nghiệm Trong đó, ở đĩa đối chứng (A) a-1 đến a-3 sợi nấm F solani phát triển

bình thường và khỏe mạnh khi được nuôi cấy trong 12 giờ, 24 giờ và 36 giờ trong khi

ở đĩa được xử lí với protein α-MMC (B) b-1 đến b-3 gần như không có sự tăng trưởng của sợi nấm Đường kính sợi nấm phát triển trên đĩa đối chứng đạt tới 3,8 ± 0,2 cm

sau 36 giờ nuôi cấy (Hình 1.11A: a-3), nhưng không có thay đổi về sự tăng trưởng xảy ra trên đĩa xử lý với protein α-MMC (Hình 1.11B: b-3) Ngoài việc ức chế tăng

trưởng, hình thái của nấm F solani cũng bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi việc gây ra

sự biến dạng của các tế bào với sự nảy chồi không đều, mất tính toàn vẹn của thành

tế bào, cũng như sự phá vỡ màng tế bào nấm Ngoài ra, DNA bộ gen nấm cũng bị ảnh hưởng nghiêm trọng Do đó α-MMC được chứng minh là một nhân tố hiệu quả trong việc kiểm soát con đường gây bệnh của nấm và là một sản phẩm tự nhiên có thể sử dụng để thay thể cho thuốc hóa học diệt nấm

1.2 Hệ thống dòng hóa và biểu hiện

Tạo dòng là gắn một đoạn DNA/gene mục tiêu vào một vector tạo dòng (cloning vector) sau đó biến nạp vào một tế bào sống để khuếch đại gene mục tiêu.Mục đích của tạo dòng là lưu trữ và thu nhận số lượng lớn và tinh sạch các đoạn DNA mục tiêu hay thu nhận dòng tế bào có khả năng biểu hiện gene mục tiêu

Việc thu nhận các protein mục tiêu trực tiếp từ trái mướp đắng còn gặp nhiều trở ngại do hiệu suất thấp, khó tinh sạch và không an toàn khi thao tác Do đó việc

lựa chọn một hệ thống dòng hóa và biểu hiện an toàn và phổ biến hiện nay như E

coli để thu nhận protein là cần thiết

1.2.1 Chủng dòng hóa E coli DH5α

Trong số các hệ thống vật chủ, vi khuẩn có nhiều ưu điểm như khả năng tăng

trưởng nhanh, chi phí sản xuất thấp nên thường được ưu tiên sử dụng Vi khuẩn E

coli là đối tượng được quan tâm sử dụng trong nghiên cứu cũng như trong sản xuất

protein tái tổ hợp nhiều nhất hiện nay E coli là vi khuẩn Gram âm, hình que, không tạo nội bào tử, có chiều dài khoảng 2µm và chiều ngang 0,5µm E coli có nhiều ưu

điểm nổi bật như (Broadway, 2016):

• Tăng trưởng nhanh, thời gian thế hệ trong điều kiện tiêu chuẩn của E coli là

20 phút

• Môi trường nuôi cấy đơn giản, ít tốn kém

• Thông tin di truyền đã được hiểu biết rõ

• Cho phép thu nhận plasmid một cách nhanh chóng và dễ dàng, một plasmid

có thể biến nạp vào E coli trong khoảng 5 phút

• Được tổ chức FDA chấp thuận để sử dụng trong nghiên cứu ứng dụng cho con người

Trong đó, E coli DH5α là một chủng được dụng rộng rãi trong tạo dòng và nhân

bản plasmid vì các đặc tính riêng biệt như:

• Có lac Z∆M15 cho phép sàng lọc khuẩn lạc xanh/trắng trên các đĩa thạch có

chứa Bluo-Gal hoặc X-Gal

• Độ ổn định khi chèn gen cao do đột biến rec A1 (giảm khả năng tái hợp không mong muốn của plasmid)

• Kiểu gen endA1 làm bất hoạt endonuclease nội bào đảm bảo hàm lượng endonuclease thấp cho năng suất plasmid cao

1.2.2 Chủng biểu hiện E coli BL21(DE3)

Chủng E coli BL21(DE3) thuộc nhóm E coli nhóm B, chứa thể tiềm tan của

thực khuẩn thể DE3, được xem như một trong những chủng biểu hiện protein ngoại

lai mạnh E coli BL21(DE3) chứa gene mã hóa cho T7 RNA polymerase, được chịu

sự kiểm soát dưới lac UV5 promoter và được cảm ứng bởi lactose hoặc IPTG Ngoài

ra, sự thiếu hụt đột biến Ion protease (protease nội bào) và ompT (protease màng

ngoài tế bào) giúp hạn chế sự phân cắt của protease đối với protein ngoại lai làm

chúng không bị phân hủy và ổn định hơn sau khi tổng hợp Gene lacI trong trình tự

giúp tổng hợp protein LacR, kiểm soát quá trình tổng hợp protein tái tổ hợp thông

qua lac operator chặt chẽ hơn Ngoài ra tế bào thiếu sự hoạt động của hệ thống enzyme cắt giới hạn hsdSB(rB-mB-) đảm bảo cho sự tồn tại của protein tái tổ hợp

1.2.3 Vector biểu hiện

Vector biểu hiện là phân tử DNA được ứng dụng như một phương tiện mang vật liệu di truyền ngoại lai vào một tế bào chủ để có thể sao chép hoặc biểu hiện Vector có thể là phage, plasmid, cosmid, chromosome nhân tạo và trong số đó plasmid là vector được sử dụng nhiều nhất Vector biểu hiện sẽ được dòng hóa mang gene mục tiêu để biểu hiện protein ngoại lai trong tế bào chủ

Hệ thống pET là hệ thống vector phổ biến trong tạo dòng và biểu hiện protein

tái tổ hợp ở E coli pET28a chứa T7 promoter là một promoter mạnh, sau vài tiếng

đã cảm ứng 50% tế bào tổng hợp protein mục tiêu T7 promoter chỉ nhận diện một loại RNA polymerase duy nhất là T7 RNA polymerase, vì vậy RNA polymerase khác

của E coli không thể bám vào vùng T7 promoter và cảm ứng biểu hiện protein mục

tiêu Đây là một cơ chế hoàn hảo tránh sự rò rỉ biểu hiện protein

Hình 1 12 Sơ đồ plasmid pET-28a(+)

f1ori: vị trí khởi đầu sao chép; lacI: gene mã hoá protein lacI; KanR (Kanamycin Resistance): vùng trình tự kháng kháng sinh Kanamycine; His-tag: vùng trình tự quy định đuôi 6×His; Thrombin site: vùng trình tự cắt bằng Thrombin site

Ngoài ra pET28a còn chứa vùng gen lacI nằm sau T7 promoter, mã hóa cho lac

repressor Khi chưa có chất cảm ứng IPTG, lac repressor sẽ bám vào operator ngăn cản tạo ra T7 RNA polymerase, lúc này gene mục tiêu vẫn chưa được biểu hiện IPTG

có chức năng cảm ứng như lactose nhưng không bị phân cắt trong tế bào vì vậy có thể cảm ứng protein liên tục trong thời gian tế bào tăng trưởng Việc kết hợp gene

lacI và chất cảm ứng tổng hợp IPTG sẽ dễ kiểm soát sự biểu hiện protein Vector

pET28a còn chứa gene kháng kháng sinh Kanamycin để sàng lọc tế bào E coli

BL21(DE3) mang gene mục tiêu Vùng gene mã hóa đuôi 6×His và vùng trình tự Thrombin site cũng là yếu tố quan trọng giúp tinh chế tốt protein mục tiêu

1.3 Tổng quan về đặc điểm của các loại nấm gây hại cho cây trồng

1.3.1 Nấm Pyricularia oryzae (Magnaporthe grisea)

- Tác nhân phát sinh bệnh đạo ôn: Nấm gây bệnh đạo ôn trên cây lúa ở giai đoạn vô

tính là Pyricularia oryzae (syn Pyricularia oryzae, Pyricularia grisea, Pleospora

oryzae) Giai đoạn hữu sinh của nấm đã được đặt tên là Magnaporthe grisea

Hình 1 13 Bào tử đính (connidia) và cuống mang bào tử (conidiophore) của

nấm Pirycularia oryzae gây bệnh đạo ôn và biểu hiện bệnh đạo ôn trên lúa nguồn:

Chi cục bảo về thực vật TPHCM

- Mô tả: Phân loại thuộc ngành Ascomycota (nấm túi) là một chủng nấm gây bệnh

đạo ôn thường làm ảnh hưởng lớn đến năng suất và chất lượng lúa Bệnh có thể gây thiệt hại đến hơn 80% năng suất lúa, khi nhiễm nặng có nguy cơ mất trắng gây thiệt hại to lớn trong nông nghiệp trồng lúa (Boddy, L., 2016) Cơ quan sinh trưởng của nấm là sợi nấm không màu, phân nhánh , có vách ngăn, sống kí sinh bên trong mô thực vật, có bào tử và bào tử nấm phát triển sinh sản phát tán bào tử đi xa để truyền lan bệnh Cành bào tử phân sinh là cơ quan sinh ra bào tử vô tính tạo thành một lớp

mốc mịn màu xám trên bề mặt vết bệnh ở lá, ở cổ bông và đốt thân

- Triệu chứng bệnh: Nấm bệnh có thể tấn công trên lá, thân, cổ bông, cổ gié hoặc hạt

lúa Trong cây lúa, các vùng hoại tử nhỏ xuất hiện ban đầu, trở nên lớn rộng ra thành một vòng tròn bao quanh trên bề mặt vết bệnh ở lá, đốt thân, cổ bông Khi bào tử được hình thành đều có một lớp giống như mốc xám gây ra các bệnh như đốt thân bị mềm nhũn gãy gập, bông có nhiều hạt lép lửng, bông lúa nhỏ, dễ gãy cổ bông, rụng gié, làm giảm năng suất (Nguyễn Văn Viên và cs, 2013)

- Đặc điểm phát sinh và phát triển: Nấm đạo ôn sinh trưởng thích hợp ở nhiệt độ 25

– 28oC và độ ẩm không khí là 93% trở lên Điều kiện ánh sáng âm u có tác dụng thúc đẩy quá trình tạo bào tử của nấm (Vũ Triệu Mân, 2007) Độ ẩm không khí và độ ẩm

đất ảnh hưởng đến sự lây lan và phát triển của nấm bệnh Ngoài ra mật độ gieo trồng, giống lúa, phân bón cũng ảnh hưởng đáng kể đến khả năng phát sinh nấm bệnh

1.3.2 Nấm Aspergillus nomius

- Nguồn: Aspergillus nomius thường có trong các mặt hàng nông sản như cây ngũ

cốc, đậu phộng, bông, ngô, lúa mì, mía và hạt cây

- Phát sinh bệnh: A nomius sinh sản hữu tính gây bệnh cho con người thông qua

nhiễm độc tố Aflatoxin qua các mặt hàng nông sản

- Độc tố: A nomius sản sinh ra độc tố aflatoxins B và G là các chất chuyển hóa thứ

cấp tiềm năng gây ung thư cho con người và gây quái thai, làm cho sản phẩm không thể sử dụng dẫn đến tổn thất kinh tế nặng nề Sự nhiễm nấm vào nông sản sẽ sản sinh

ra một lượng aflatoxins không chỉ gây nguy hiểm nghiêm trọng cho sức khỏe của con người và động vật, gây nhiễm độc gan là độc tính cấp tính hoặc ung thư gan là độc tính mãn tính mà còn là nguyên nhân gây thiệt hại kinh tế lớn trên toàn thế giới đặc biệt trên cây ngũ cốc, đậu phộng, bông, ngô lúa mì, mía và hạt cây (Yabe và cs , 2018)

- Mô tả: Aspergillus nomius là một loài nấm thuộc chi Aspergillus phần Flavi , được

mô tả lần đầu tiên vào năm 1987 có kiểu hình giống với Aspergillus flavus Những

loài nấm này có màu từ ô liu đến xanh rêu nhạt, sợi nấm có hình cầu, bề mặt nhám

và đường kính khoảng 4,6μm Chúng tạo ra aflatoxin B1, B2, G1 và G2 nhưng không tạo ra axit cyclopiazonic (CPA - là một độc tố chuyển hóa thứ cấp được sản xuất ra

bởi một số chi nấm) (Ito và cs, 1998)

1.3.3 Nấm Aspergillus terreus

- Nguồn: Aspergillus terreus là một loại nấm hoại sinh cư trú trong đất, phân hữu cơ,

bụi

- Phát sinh bệnh: A terreus là mầm bệnh cơ hội gây ra bệnh nhiễm trùng ở phổi hoặc

lây lan khắp cơ thể của người và động vật Khi bào tử nấm xâm nhập vào cơ thể, mầm bệnh đi dọc theo đường hô hấp gây ra bệnh nhiễm trùng đường hô hấp điển hình, các nhiễm trùng khác cũng có thể xảy ra như bệnh nấm móng và bệnh tai mũi

họng Trong nông nghiệp, A terreus phá hủy chu kỳ sinh sản hữu tính ở cây

Arabidopsis thaliana và được báo cáo gây bệnh ở cây lúa mì và lúa mạch đen (Dewan

và Sivasithamparam, 1988); là mầm bệnh gây ra cháy lá ở cây khoai tây (Louis và cs, 2013), hoạt động tổn thất lớn sau thu hoạch mất nhiều hoa màu (Kozakiewicz và cs,

1989)

- Độc tố: A terreus sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp như erritrem A, citreoviridin, citrinin, gliotoxin, patulin, axit terreic, terretonin Trong đó, axit aspterric và 6-hydroxymellein ức chế sản xuất phấn hoa, ảnh hưởng đến sự đa dạng di truyền ở các loài thực vật

- Mô tả: A terreus có màu nâu trong môi trường nuôi cấy, chúng sinh ra các bào tử

đính Các tế bào bào tử đính trên các túi sinh ra dạng nấm đính hình cột dày đặc

Cuống bào tử đính của A terreus trơn và trong suốt Hạt đính của A terreus có kích

thước nhỏ, đường kính khoảng 2 µm, có hình cầu, thành trơn và có thể thay đổi từ

màu vàng nhạt đến trong suốt Nấm A terreus dễ dàng được phân biệt với các loài Aspergillus khác bởi màu sắc của khuẩn lạc là màu nâu quế và sản xuất aleurioconidia A terreus là một loài chịu nhiệt vì nó tăng trưởng tối ưu ở nhiệt độ

trong khoảng 35-40°C (95-104°F) và tăng trưởng tối đa trong 45-48°C (113-118°F) (Anderson và cs, 1980)

CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Thời gian: Từ tháng 8 năm 2019 đến tháng 7 năm 2020

- Địa điểm: phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh trường Đại học Mở Tp.HCM,

cơ sở 3 – Bình Dương; Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Tp HCM; phòng thí nghiệm Trung tâm Khoa học và Công nghệ sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh (CBB)

2.2 Vật liệu sinh học.

- Gen α-MMC được tối ưu hóa một số codon cho việc biểu hiện trong E coli

bằng phần mềm Optimal codon (Firstbase, Singapore) trước khi được tổng hợp tại công ty Macrogen (Hàn Quốc)

- Mồi:các mồi đặc hiệu sau khi thiết kế bằng phần mềm Clone Manager được tổng hợp bởi công ty Macrogen (Hàn Quốc) Trình tự các mồi sử dụng trong quá trình

ON-D15 GGTGCTCGAGTCAGTAGCTCGAAAAGCCATGTG

ON-D15 GGTGCTCGAGTCAGTAGCTCGAAAAGCCATGTG PCR

khuẩn lạc ON30 GGTGATGTCGGCGATATAGG

- Chủng vi sinh vật:

⮚ Chủng E coli DH5α [F-, Ø80lacZ∆M15, recA1, endA1, hsdR17 (rk-, mk+),

phoA, supE44, λ-, thi-1, gyrA96, relA1] (Invitrogen) là chủng chủ dùng trong bước dòng hóa và để nhân bản plasmid

⮚ Chủng E coli BL21 (DE3) F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm (DE3)

(Invitrogen): được sử dụng làm chủng chủ để biểu hiện protein mục tiêu dưới sự cảm ứng của IPTG

- Plasmid : plasmid pET28a là một vector biểu hiện có gen kháng Kanamycin làm gen chọn lọc và vùng MCS nằm ngay sau promoter T7 (đây là một promoter biểu

hiện mạnh ở E coli và được kiểm soát bằng chất cảm ứng IPTG) Sơ đồ plasmid

pET28a sau khi được tối ưu hóa bằng phần mềm Clone Manager Hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ plasmid pET-28a (+) sử dụng trong đề tài

- Plasmid và chủng vi sinh được cung cấp bởi Trung tâm Khoa học và CNSH, Đại học Khoa học tự nhiên, TP.Hồ Chí Minh (CBB)

- Chủng nấm:

⮚ Nấm Aspergillus nomius và nấm Aspergillus terreus được cung cấp bởi Trung

tâm Công Nghệ Sinh Học Tp HCM phường Trung Mỹ Tây, Q.12, TP HCM

⮚ Nấm Pyricularia oryzae đã phân lập được cung cấp bởi phòng thí nghiệm

Công nghệ Vi sinh trường Đại học Mở Tp.HCM, cơ sở 3 – Bình Dương

- Thang chuẩn: thang chuẩn dùng trong đề tài được thể hiện trong Hình 2.2

Hình 2.2 Thang chuẩn

(A): Thang DNA 2 (DNA Ladder 200bp HT200D400V, HT Biotech) (B): Thang protein HT-P1(HT Biotech) (C): Thang Protein PageRuler Unstained Protein

Ladder (Thermo Fisher Scientific)

2.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường.

2.3.1 Thiết bị, dụng cụ

- Bồn điện di DNA (Clever scientific)

- Bộ điện di protein (BioRad)

- Máy đo nồng độ chuyện dụng ( Nanodrop)

- Máy đó pH (TRANS Intrusment)

- Bàn soi gel UV ( Gel company)

- Máy khuấy từ gia nhiệt (Benchmark)

- Máy phá tế bào bằng sóng siêu âm (Qsonica)

- Cân điện tử (Kern)

- Máy đo mật độ quang (Boeco)

- Máy heat nhiệt (Benchmark)

- Máy lắc (Pol-Eko)

- Máy ly tâm (Eppendorf Đức)

- Máy ly tâm falcon (Hermle)

- Máy PCR (Eppendorf)

- Máy Vortex (Biocote, Mỹ)

- Micro pipette (Eppendorf)

- Nồi hấp Autoclave (SS325-TOMY)

- QIAquick PCR Purification Kit

- Tủ ấm, tủ sấy (Pol-Eko, Ba Lan)

- Đệm: Buffer Taq DNA polymerase (Fermentas)

- Enzyme: Taq DNA polymerase 5U/µl (Fermentas)

- Deep Vent®Buffer (Thermo Scientific)

- Deep Vent®DNA Polymerase (Thermo Scientific)

❖ Hóa chất điện di DNA

- Agarose 2% (Invitrogen)

- SafeView 10,000X (ABM)

- Dung dịch nạp mẫu điện di DNA 6X (30% Glycerol; 0,25% bromophenol blue)

- Dung dịch điện di TAE 1X (40 mM Tris base; 20 mM acetic acid; 1 mM EDTA

pH 8,0)

❖ Hóa chất dùng trong phản ứng cắt giới hạn và nối

- Red Buffer dùng cho XhoI 10 U/µl (Fermentas)

- Orange Buffer dùng cho NdeI 10 U/µl (Fermentas)