Biểu hiện và tinh chế protein alpha-momorcharin trong E. coli tiềm năng ứng dụng phòng trừ nấm hại nông nghiệp

Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm: phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh trường Đại học Mở Tp.HCM, cơ sở 3 – Bình Dương; Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Tp. HCM; phòng thí nghiệm Trung tâm Khoa học và Công nghệ sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh (CBB).

Vật liệu sinh học

- Plasmid : plasmid pET28a là một vector biểu hiện có gen kháng Kanamycin làm gen chọn lọc và vùng MCS nằm ngay sau promoter T7 (đây là một promoter biểu hiện mạnh ở E. coli và được kiểm soát bằng chất cảm ứng IPTG). - Plasmid và chủng vi sinh được cung cấp bởi Trung tâm Khoa học và CNSH, Đại học Khoa học tự nhiên, TP.Hồ Chí Minh (CBB). ⮚ Nấm Aspergillus nomius và nấm Aspergillus terreus được cung cấp bởi Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Tp.

⮚ Nấm Pyricularia oryzae đã phân lập được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh trường Đại học Mở Tp.HCM, cơ sở 3 – Bình Dương - Thang chuẩn: thang chuẩn dùng trong đề tài được thể hiện trong Hình 2.2. - Các dụng cụ khác: eppendorf, tip, que cấy, đèn cồn, đĩa petri, erlen, ống nghiệm, falcon…. ❖ Hóa chất dùng trong phản ứng cắt giới hạn và nối - Red Buffer dựng cho XhoI 10 U/àl (Fermentas).

- Môi trường LB - Kan: là môi trường LB lỏng đã hấp khử trùng có bổ sung thêm Kanamycin để đạt nồng độ 40 àg/ml. - Môi trường LB-Kan-agar: là môi trường LB lỏng có bổ sung 2% agar đã hấp khử trựng, và sau đú bổ sung thờm Kanamycin để đạt nồng độ cuối 40 àg/ml.

Phương pháp thực hiện

- Các bước thực hiện: Plasmid gốc và sản phẩm PCR thu gene mục tiêu sau khi cắt được dùng để thực hiện phản ứng nối với thành phần phản ứng như Bảng 2.4. Sau quá trình xử lý với nhiệt, môi trường dinh dưỡng được bổ sung vào hỗn hợp dịch biến nạp, ủ ở 370C trong điều kiện lắc để tế bào được phục hồi và trải trên đĩa LB-Kan-agar. +Sau khi ủ qua đêm, quan sát các khuẩn lạc mọc trên môi trường có chứa kháng sinh kanamycin để sàng lọc sơ bộ và thực hiện PCR khuẩn lạc, giải trình tự.

+ Mục đích: Khẳng định sự hiện diện của gen mục tiêu trong plasmid tái tổ hợp bên trong dòng tái tổ hợp dựa theo nguyên tắc phản ứng PCR với cặp mồi chuyên biệt cho gen mục tiêu hoặc cặp mồi chuyên biệt cho vùng trình tự chứa gen mục tiêu. Trong phản ứng PCR khuẩn lạc, các thành phần tương tự như một phản ứng PCR bình thường, chỉ khác ở chỗ mẫu khuếch đại là sinh khối thu từ khuẩn lạc mọc trên đĩa môi trường sàng lọc sau biến nạp. Dòng tế bào mang vector đã được kiểm tra bằng PCR khuẩn lạc sẽ được nuôi cấy và thu nhận vector để gửi đi giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger cải tiến tại công ty Macrogen Hàn Quốc.

Gel cho điện di SDS-PAGE được chia thành 2 phần, phần trên là gel có nồng độ polyacrylamide thấp gọi là gel gom với buffer là Tris-HCl pH 6,8 và gel phần dưới có nồng độ polyacrylamide cao gọi là gel phân tách với buffer là Tris-HCl pH 8,9. Tại đây, pH = 6,8, các phân tử glycine bị chuyển thành dạng trung hòa về điện tích, làm cho tốc độ di chuyển của chúng bị giảm đi đáng kể trong điện trường. Khi phân tử chạy tới lớp gel phân tách có pH = 8,8, các phân tử glycine chuyển sang trạng thái tích điện âm, di chuyển nhanh hơn các ion phân tử Cl‑; chúng vượt qua các phân tử Cl‑ ở phía trước để di chuyển về cực dương.

Cùng với đó, do nồng độ acrylamide trong lớp gel phân tách lớn hơn lớp gel gom, các phân tử protein sẽ di chuyển chậm đi, và quá trình phân tách bắt đầu diễn ra. Protein mục tiêu có đuôi dung hợp His-tag là đuôi peptide được sử dụng phổ biến phục vụ cho mục đích tinh chế, Histidine là amino acid có ái lực cao với ion Ni2+. Do đó, có thể tinh chế protein dung hợp bằng phương pháp sắc kí ái lực sử dụng cột tinh chế HisTrap HP (GE Healthcare) có chứa các hạt sepharose gắn với ion Ni2+.

Phần còn lại của NTA được liên kết với hạt Sepharose (Hình 2.10) nhờ vậy, cột Histrap HP được nhồi các hạt Sepharose có khả năng giữ các protein có His-tag; qua đó sẽ giúp ion kim loại cố định hơn và không bị rửa trôi trong quá trình tinh chế thu được protein mục tiêu có độ tinh sạch cao. Đuôi ái lực thích hợp nhất để vừa đạt hiệu quả tinh sạch cao cũng như không làm ảnh hưởng đến chức năng của prtein mục tiêu thường là polyhistidine với chiều dài gồm 6 phân tử histidine (0,84 kDa). Tùy thuộc vào ái lực của protein mục tiêu với cột tinh chế mà protein đã bị đẩy ra khỏi cột ở các phân đoạn với nồng độ chất cạnh tranh nhất định.

- Protein mục tiêu được dung ly ra khỏi cột bằng dung dịch dung ly chứa Imidazole với nồng độ tăng dần từ 20 mM đến 500 mM, thu với nhiều phân đoạn. ⮚ Khảo sát sơ bộ hoạt tính kháng nấm gây bệnh cho cả cây trồng và con người là nấm Aspergillus nomius và nấm Aspergillus terreus: Sử dụng đệm PBS tiến hành pha loóng protein α-MMC thành 3 nồng độ 0 àM (đối chứng), 5àM, 15àM và đỏnh dấu chia đĩa petri thành 3 phần tương ứng với 3 nồng độ, dựng micropipet hỳt 2àl protein đã pha loãng vào giữa các phần đã đánh dấu trên đĩa petri.