Biểu hiện và tinh sạch protein fructosyl-amino acid oxidase bền nhiệt (FAOX-TE) bằng Escherichia coli .pdf

NTTƯ-NCKH-04 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐÈ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2019 Tên đề tài: Biểu tinh protein fructosyl-amino acid oxidase bền nhiệt (FAOX-TE) Escherichia coli Số hợp đồng: 2018.01.14/HĐ-KHCN Chủ nhiệm đề tài: Hồ Tá Giáp Đơn vị công tác: Viện Kỳ thuật Công nghệ cao NTT Thời gian thực hiện: tháng CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đon vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TÓNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2019 Tên đề tài: Biểu tinh protein fructosyl-amino acid oxidase ben nhiệt (FAOX-TE) Escherichia coli Số hợp đồng: 2019.01.14/HĐ-KHCN Chủ nhiệm đề tài: Hồ Tá Giáp Đơn vị công tác: Viện Kỳ thuật Công nghệ cao NTT Thời gian thực hiện: tháng Các thành viên phối hợp cộng tác: STT Họ tên Chuyên ngành Cơ quan cơng tác Phan Ngọc Hân Hóa học Viện Kĩ thuật Công nghệ cao NTT Ký tên Mục lục MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan enzyme fructosyl-amino acid oxidase (FAOX) 1.2 ứng dụng FAOX-TE chẩn đoán bệnh đái tháo đường 10 1.3 Tình hình nghiên cứu FAOX-TE nước giới 11 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cửu 12 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 12 2.2 Vật liệu hóa chất 12 2.2.1 Dụng cụ thiết bị 12 2.2.2 Vật liệu sinh học 12 2.2.3 Plasmid 13 2.2.4 Hóa chất 13 2.2.5 Môi trường 14 2.3 Phưorng pháp nghiên cứu 14 2.3.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp 14 2.3.2 Tạo plasmid tái tổ hợp 15 2.3.3 Biến nạp plasmid mang gene mà hóa FAOX-TE vào te bào khả nạp 15 2.3.4 Sàng lọc tế bào tái tổ hợp mang gene mã hóa FAOX-TE 15 2.3.5 Biểu protein tái to hợp 17 2.3.6 Tinh protein tái to hợp 17 2.3.7 SDS-PAGE 17 2.3.8 Kiểm tra hoạt tính protein tái tổ hợp 18 CHƯƠNG KÉT QUẢ VÀ THAO LUẬN 19 3.1 Tạo plasmid tái tổ hợp 19 3.2 Biểu Faox-TE hệ thống E coli BL21 (DE3) 20 3.3 Tinh FAOX-TE 21 3.4 Kiểm tra hoạt tính FAOX-TE chất Fructosyl Valine 22 CHƯƠNG KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 23 4.1 Kết luận 23 4.2 Kiến nghị 24 DANH MỤC CÁC TÙ VIẾT TAT FAOX Fructosyl-amino acid oxidase HbAlc Glycated hemoglobin Ale HPLC High Performance Liquid Chromatography HPAEC-PAD High-Performance Anion-Exchange Chromatography - Pulsed Amperometric Detection FV Fructosyl-Lvaline EFLys NE-D-fructosyl-lysine EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid CTAB Cetyl Trimethylammonium Bromide TEMED Tetramethylethylenediamine DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Q trình glycation hemoglobin máu Hình Vector pGEX-4T3 13 Hình Chu kỳ luân nhiệt PCR với cặp mồi Seq_fw/Seq_rv 16 Hình Sản phẩm cắt vector pUCIDT để thu nhận Faox-TE 18 Hình Sản phẩm cắt vector pGEX-4T3 kiểm tra kết tạo dòng 20 Hình Điện di kiếm tra sản pham protein chủng E coỉi tái to hợp 21 Hình Điện di kiếm tra sản phẩm sau trình tinh chế prtotein 22 Hình FAOX-TE phân cắt Fructosyl Valine 22 Hình Hoạt tính FAOX-TE phân tích HPAEC-PAD 23 TÓM TẤT KẾT QUẢ NGHIÊN cứu STT Kết đạt Công việc thực Tạo dịng gene mã hóa fructosyl-amino acid oxidase bền nhiệt (FAOX-TE) Plasmid pGEX4T3-FAOX-TE Biểu protein tái tổ hợp bang hệ thống E.colì Dịch phá tế bào E.coli chứa FAOX-TE tái tổ họp Tinh protein tái tổ họp FAOX-TE tinh 70% Kiểm tra hoạt tính FAOX-TE FAOX-TE có hoạt tính STT Sản phầm đạt Sản phẩm đăng ký Protein tinh (>70%) có hoạt tính Protein tinh (92%) có hoạt tính Bài báo đăng tạp chí nước Bài báo đăng tạp chí KHCN đại học Mở HCM Thời gian thực hiện: từ ngày 01/2018 đến ngày 12/2018 Thời gian nộp báo cáo : 30/10/2020 MỞ ĐẦU Glycated hemoglobin Ale phân tử hemoglobin protein glycation (protein glycation phân tử protein liên kết với gốc đường) đặc biệt quan trọng sử dụng xét nghiệm để chấn đoán sàng lọc bệnh tiểu đường Nồng độ protein glycated đo phương pháp xét nghiệm sử dụng enzyme dựa enzyme fructosyl amino acid oxidase (FAOX) Nghiên cứu nhằm mục đích sản xuất FAOX-TE cho nghiên cứu tương lai lĩnh vực chế tạo cảm biến dựa FAOX cho protein glycated Nghiên thành công việc nhân bản, biểu hiện, tinh thử nghiệm hoạt tính FAOX-TE FAOX-TE tái to hợp đại diện cho khoảng 0,151 mg / ml với độ tinh khiết ước tính 93% Trong kết thử nghiệm hoạt tính ban đầu FAOX-TE tái tố hợp cho thấy hoạt tính Fructosyl Valine CHƯƠNG 1: TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan enzyme fructosyl-amino acid oxidase (FAOX) Năm 1988, Tatsuo H cộng phát loại enzyme có khả phân hủy hợp chất mang trình tự Amadori rearrangement fructosyl-amino acid oxidase (FAOX)[1] FAOX enzyme tiềm việc định lượng phản ứng glycation (phản ứng nhóm đường với protein mà khơng có tham gia enzyme)[2] Khi có diện cùa FAOX xảy phản ứng oxy hóa f-aVal giải phóng glucosone, amino acid; sau đó, hoạt động enzyme giảm oxy hóa Flavin Adenine Dinucleotide (FAD) cofactor oxygen giải phóng hydrogen peroxide Bang việc đo hàm lượng hydroxygen peroxide sản sinh sè đo lượng đường sản sinh máu thơng qua q trình glycation[3] CH(CH3)2 A CH(CH3)j CH(CH3)2 NHj0h HC=O HCOH HOCH c=o R + HCOH HCOH HjC-NHCH HC=N-CH HCOH HOCH Hemoglobin (p subunit) CHjOH c=o c=o * HOCH R c=o R HVOH Aldimine HfOH HCOH (Schiff base) HCOH CHjOH HbA1c CHjOH Glucose CH(CH3)2 HjC-NHCH c=o COjH HOCH HCOH HCOH CHjOH CH(CH3)2 CH(CH3)2 HC=N-CH HCOH COjH H;o \ HOCH HCOH Aldimine HCOH (Schi,f base) CHjOH Fructosy I valine NH2CH HC=O c=o HOỘH + CO2H Valine HCOH HCOH CHjOH Glucosone Hình 1: Quá trình glycation hemoglobin máu[3] FAOX tìm thấy nhiều chúng vi khuẩn nấm khác như: Coỉynebacterium sp 2-4-1 [1], Ulocladium sp JS-//73[4], Eupenicillium terrenum\5}, nghiên cứu ứng dụng sản xuất hệ thống sinh học có độ nhạy cao nhận diện trình glycation protein tế bào[6] cảm biến sinh học HbAlc[7] FAOX cho thấy hoạt với nhóm D-fructosyl-Lvaline (FV) NE-D-fructosyllysine (sFLys) Nhưng theo số nghiên cứu cho thấy, để đo hàm lượng tong số HbAlc việc hoạt động với nhóm Ns-D-fructosyl-lysine (sFLys) thường khơng cho kết xác[8] Vì vậy, FAOX có nguồn gốc từ Cotynebacterium sp 2-4-1 (FAOX-C) vần lựa chọn tối ưu cho nghiên cứu thời điểm Đen năm 2003, Ryoichi Sakauke Naoki Kajiyama rang enzyme FAOX-C bền nhiệt nên họ tạo đột biến điểm T60A, A188G, M244L, N257S L261M tạo FAOX-TE bền nhiệt để sản xuất Corynebacterium sp 2-4-1 [9] Trong phạm vi đề tài này, FAOX-TE tạo dòng, biểu tinh chế nhằm mục đích sản xuất FAOX-TE cho nghiên cứu 1.2 ủng dụng FAOX-TE chẩn đoán bệnh đái thảo đường Bệnh đái tháo đường, gọi bệnh tiểu đường bệnh bệnh nguy với tỉ lệ mắc bệnh ngày tăng mối quan tâm tồn cầu Việt Nam khơng ngoại lệ[10] Xét nghiệm HbAlc ba phương pháp áp dụng để chẩn đoán bệnh đái tháo đường[ll], [12] HbAlc phân tử haemoglobin HbA với cấu trúc bao gồm phân từ glucose liên kết với đầu N phân tử Valine cùa chuồi beta cấu trúc Hemoglobin[13] Theo dõi nồng độ HbAlc không ứng dụng chấn đoán bệnh tăng đường huyết mà cịn tiêu chí đánh giá nguy mắc bệnh tim mạch[13], [14] Do đó, việc theo dõi đường huyết cho người bệnh cần thiết Cho đến nay, có 150 phương pháp mơ tả đe xác định nong độ HbAlc Hầu hết phương pháp sử dụng phương pháp HPLC, miền dịch, sắc kí lực, điện di mao quản xét nghiệm enzyme[13] Phương pháp phù họp đê lựa chon phải đáp ứng với yêu cầu lâm sàng, tùy theo môi trường cụ the phải đánh đổi tính đặc hiệu biến the Hemoglobin với biến thể di truyền, giừa thời gian phân tích với kỳ chuyên môn, yêu cầu sở vật chất với chi phí xét 10 ... gene mã hóa fructosyl-amino acid oxidase bền nhiệt (FAOX-TE) Plasmid pGEX4T3-FAOX-TE Biểu protein tái tổ hợp bang hệ thống E.colì Dịch phá tế bào E .coli chứa FAOX-TE tái tổ họp Tinh protein tái... ĐỀ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2019 Tên đề tài: Biểu tinh protein fructosyl-amino acid oxidase ben nhiệt (FAOX-TE) Escherichia coli Số hợp đồng: 2019.01.14/HĐ-KHCN Chủ nhiệm đề tài: Hồ... việc biểu tinh enzyme fructosyl-amino acid oxidase ben nhiệt đề ứng dụng vào việc sản xuất cảm biến sinh học đe kiếm tra nhanh xác lượng đường máu bệnh nhân tiểu đường 11 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG