Biểu hiện protein MGG06069 trong Escherichia

NTTU-NCKH-04 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH BÁO CÁO TÔNG KẾT ĐÈ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP co SỞ NĂM 2020 - 2021 Tên đề tài: Biểu protein MGG06069 Escherichia coli Sổ hợp đồng: 2020.01.06 Chủ nhiệm đề tài: Bùi Cơng Chính Đơn vị cơng tác: Viện kỳ thuật cơng nghệ cao Nguyễn Tất Thành Thời gian thực hiện: 8/2020-11/2021 TP Hồ Chỉ Minh, ngày 29 tháng 03 năm 2022 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TÓNG QUAN TÀI LIỆU CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 16 TÀI LIỆU THAM KHẢO 17 iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT E coll Escherichia coli IPTG Isopropyl p- d-1 -thiogalactopyranoside LB Luria Bertani Broth M oryzae Magnaporthe otyzae OD Optical density (Mật độ quang học) PBS Phosphate Buffered Saline PMO Polysaccharide monooxygenase SDS-PAGE Điện di đứng gel poly-acrylamide iv DANH MỤC CÁC BẢNG BIẾU, sơ ĐỊ, HÌNH ẢNH Hình 2.1 Cấu trúc gene mggO6O69 Hình 2.2 Cấu trúc gene mggO6O69 sau chỉnh sửa Hình 2.3: Phân đoạn PMO DDDDK khuếch đại Hình 3.1 Ket colony PCR tế bào chuyến gene mgg06069 Hình 3.2 Hình 3.3 Kết biểu gene mgg06069 nồng độ IPTG khác Hình 3.4 Ket tinh protein mgg06069 Hình 3.5 Kết biểu phân đoạn PMO Hình 3.6 Ket tinh phân đoạn PMO Hình 3.7 Ket xừ lý cat Enterokinase phân đoạn PMO V TÓM TẤT KẾT QUẢ NGHIÊN cứu Kết đạt Công việc thực STT Thiết kế vector pGEX-4t3 chứa Tạo vector pGEX-4t3 chứa gene mgg06069 thiết kế mồi gene mgg06069 mong muốn PCR cho gene mgg06069 Biến nạp vector pGEX-4t3 vào Có chủng E coỉi BL21 E chủng E coli BL21 E coli coỉi DH5a mang gene mgg06069 DH5a STT Biêu gene MGG06069 Biêu thành công cho chủng E cloi BL21 protein kích thước Thu tinh ptrotein Đã thu tinh protein MGG06069 MGG06069 Sản phẩm đăng ký Sản phẩm đạt Chủng vi khuân chứa gene Chủng vi khuấn chứa gene mgg06069 mgg06069 Protein MGG06069 Protein MGG06069 Bài báo khoa học đăng tạp Bản thảo báo khoa học chí nước Thời gian thực hiện: 8/2020-11/2021 Thời gian nộp báo cáo : 31/03/2022 vi MỞ ĐÀU MGG06069 protein có nguồn gốc từ lồi nấm M oiyzae, lồi nấm gây bệnh đạo ôn lúa Theo nghiên cứu, protein MGG06069 có the có khả phân hủy cellulose tham gia trực tiếp đến trình xâm nhiễm loài nấm M Oiyzae lúa Đẻ thực nghiên cứu protein MGG06069, cần có hệ thống biểu protein để tạo lượng protein MGG06069 số lượng lớn Đe đáp ứng nhu cầu trên, đề tài thực nhằm biểu gene mgg06069 E.coli Trình tự gene mgg06069 lấy từ sở dừ liệu Uniprot tổng hợp đưa vào E.coỉi thông qua vector Pgex-4t3 để biểu Kết thực đề tài cho thấy việc biểu gene mgg06069 E.coli khả thi Tuy nhiên, kết cho thấy kích thước protein biểu lớn gây ảnh hưởng đến hiệu suất chất lượng protein thu Việc thu nhỏ kích thước protein biếu thực cách biểu phân đoạn gene mgg06069 Cuối cùng, thí nghiệm xác định hoạt tính cần thực để xác định protein MGG06069 thu từ E.coli có the sử dụng cho nghiên cứu không vii CHƯƠNG TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Polysaccharide Monooxygenase 1.1.1 Sản xuất xăng sinh học từ cellulose Cellulose hợp chất hữu polymer cấu thành từ phân tử D-glucose liên kết với liên kết p( -»4)' Từ thời xưa, cellulose đà người sử dụng đe làm nên giấy hay vải sợi, ngày với kỳ thuật công nghệ, cellulose cịn có the sử dụng làm ngun liệu để làm xăng sinh học.2 Với việc họp chất sinh học phổ biến có trừ lượng nhiều giới, việc biến cellulose thành xăng sinh học sè giúp giảm phụ thuộc người vào lượng hóa thạch tạo nuồn lượng tái tạo thân thiện với môi trường.3 Tuy nhiên để làm điều đó, cellulose cần phải xử lý sơ (pretreatment) phân giải cấu trúc trước đưa vào quy trình sản xuất xăng sinh học Hiện có hai phương pháp để xừ lý sơ hóa học sinh học Trong phương pháp sinh học có ưu điểm cần lượng đầu vào, cần hóa chất, thân thiện với mội trường lại có khuyết điếm suất thấp nhạy cảm với tác động nhiệt hay pH.4 Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu để tìm phương án nâng cao hiệu suất trình phân giải cellulose Trong đáng ý việc tìm nhóm protein có tên gọi Polysaccharide monooxygenase (PMO) 1.1.2 PMOs PMO nhóm protein có khả phân hủy polysaccharide bền, chang hạn chitin, cellulose, tinh bột, thơng qua phản ứng oxy hóa khử liên kết glycosidic polysaccharide nhờ trung tâm hoạt động đơn nhân đồng (monocopper active site) Hiện PMO chia làm bốn họ, họ AA9 (trước biết đen với tên GH61) bao gồm PMO có nguồn gốc từ sợi nấm hoạt động chất Cellulose.5 Qua nghiên cứu cho thấy PMO thuộc nhóm AA9 bám vào liên kết glycosidic cắt chúng tạo đoạn kết thúc chuồi (chain ends) bề mặt Cellulose, tạo điều kiện đế enzyme Cellulase khác tiếp tục q trình phân hủy.6 Như thấy protein họ AA9 có tiềm việc hồ trợ nâng cao hiệu suất trình phân hủy Cellulose enzyme Cellulase 1.2 Protein MGG06069 Trong sở dừ liệu CAZy Uniprot, MGG06069 protein thuộc nhóm PMO AA9 có nguồn gốc từ loài nấm Magnaporthe oryzae M otyzae loài nấm gây bệnh đạo ôn, bệnh phổ biến lúa.7 Đã có nghiên cứu cho thấy mức độ biểu gene mgg06069 tăng mạnh trình tạo giác bám (appressorium morphogenesis) loài M oryzae lúa, bước đau q trình lây nhiễm.8 Do đó, có khả protein MGG06069 có vai trị quan trọng trình xâm nhiễm M.oryzae vào lúa đặc biệt việc phá hủy thành tế bào cellulose Như việc nghiên cứu protein MGG06069 cho biết thêm chế xâm nhiễm bênh đạo ơn mà cịn có tiềm tìm protein có khả tăng hiệu suất phân hủy cellulose quy trình cơng nghiệp, tiêu biểu công nghiệp chế tạo xăng sinh học Tuy nhiên để nghiên cứu xa đưa protein MGG06069 vào công nghiệp cần có hệ thống tổng hợp nhân tạo cho protein MGG06069 Công nghệ protein tái tổ họp, với khả sản xuất hoạt chất sinh học với số lượng lớn mức giá thành rẻ,9 giải pháp đáp ứng yêu cầu Được đề xướng lần vào năm 1973 Peter Lobban, công nghệ protein tái to họp công nghệ đưa gene ngoại (foreign genes) nhân tạo vào tế bào vật chủ (host) thông qua vector chuyến gene Trong tế bào vật chủ, gen sè nhân lên, phiên mã dịch mã tạo thành protein nhờ vào hoạt động tế bào vật chủ Hiện tại, có nhiều loại vật (host) sử dụng cho protein tái tổ họp như: vi khan, nấm men, tế bào côn trùng, động vật thực vật v.v 1011 12 Trong số đó, Escherichia coli hệ thống biểu thơng dụng Tuy có nhiều hạn chế hệ thống E.coli vần sử dụng điểm mạnh chi phí rẻ, gen q trình sinh hóa tìm hiểu kỳ lưỡng, mức tăng trưởng nhanh hiệu suất cao.1314 Ngoài ra, có nghiên cứu biểu thành cơng protein thuộc họ AA9 hệ thống E.colỉ 15 Do vậy, E coỉi có khả hệ thống biểu thích hợp cho protein MGG06069 Vậy nên mục tiêu đề tài biếu gene mgg06069 vi khuẩn E coli thu protein MGG06069 sản xuất bời E coỉi 1.3 Các nghiên cứu nước 1.3.1 Trong nước Việt Nam, đà có nhiều nghiên cứu khoa học bệnh đạo ơn Tuy nhiên tính tới thời điểm chưa có nghiên cứu gene PMO mgg06069 loài M oryzae cơng 10 bố Việt Nam 1.3.2 Ngồi nước Hiện giới có số nghiên cứu định gene mgg06069 kể đến Nghiên cứu Hiromasa Saitoh cộng 16 khảo sát gene M.oryzae cho thấy mgg06069 biếu M.oryzae thực trình hình thành cấu trúc xâm nhiễm (apressorium) Nghiên cứu Ying Li cộng đưa cấu trúc gene mgg06069 gene mgg06069 điều hòa bon gene RGS yếu tố phiên mà MoMsn2 Nghiên cứu cho thấy protein MGG06069 có tác động đến việc hình thành phân hóa cấu trúc xâm nhiễm nấm M.oryzae Ngoài MGG06069 cịn có vai trị việc ức chế chế phòng vệ Như qua nghiên cứu cho thấy MGG06069 đóng vai trị quan trọng trình xâm nhiễm lúa M.oryzae Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nghiên cứu khả phân hủy cellulose MGG06069 thực việc tạo protein MGG06069 tái tô hợp Do việc thực biểu gene mgg06069 E.coli cần thiết tạo tiền đề cho việc nghiên cứu hoạt tính phân hủy cellulose MGG06069 11 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cúư 2.1 Vật liệu nghiên cứu Vi khuẩn E coli DH5a BL2 l(được cung cấp viện sinh học Nhiệt Đới) đuợc nuôi cấy môi trường Luria Bertani (LB) Himedia Vector Pgex-4t3 cung cấp Viện sinh học Nhiệt Đới Các loại muối dùng thí nghiệm cung cấp Sigma Các quy trình kỳ thuật tách plasmid, tách gene từ gel agarose cắt dán gene thực theo hướng dần nhà sản xuất New England Biolabs (NEB) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thiết kế gene chuyển gene vào E coli 2.2.1.1 Thiết kế gene để biểu toàn đoạn gene mgg06069 Theo kết nghiên cứu trước đó, cấu trúc gene mgg06069 bao gồm: signal peptides, Glyco_hydro_61 domain (PMO) chitin-binding domain (Hình 2.1) Dựa vào cấu trúc ban đầu, gene mgg06069 thiết kế lại để đưa vào vector Pgex-4t3 Cụ thể, đoạn signal peptide ban đầu loại bỏ thay vào trình tự amino acid DDDDK (Hình 2.2) Hình 2.1,- Cấu trúc gene mgg06069 ban đầu Theo thiết kế ban đầu, sau phần signal peptide amino acid Histidin Theo kết cấu 3D, amino acid Histidin cấu thành trung tâm hoạt động nhân đồng (Cu2+) protein, nơi protein tương tác với gốc đồng thực phản ứng oxy hóa khử Do đó, việc loại bỏ đoạn signal peptide ban đầu cần thiết đe đảm bảo hoạt tính protein Trong đó, tình tự DDDDK thay nhận diện cat bang enzyme Enterokinase Vì vậy, chúng tơi cho việc thay trình tự signal peptide trình tự DDDDK phù họp với mục tiêu nghiên cứu 12 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ket thiết kế gene biến nạp Đe kiểm tra gene biến nạp thành công hay không, colony khuẩn biến nạp sè dùng làm template để thực colony PCR Do đoạn gene mgg06069 có kích thước tương đối lớn nên việc sử dụng cặp mồi khuếch đại toàn gene để chạy colony PCR sè dẫn đến trường hợp cặp mồi bắt cặp không thành công Thay vào cặp mồi khuếch đại 693 nu đầu gene mgg06069 sử dụng đe kiểm tra diện gene Kích thước sản phẩm cặp mồi 693 bp kết colony PCR (hình 3.1), thấy sản phẩm khuếch đại phản ứng colony PCR có kích thước gần 700 bp Kích thước gần với kích thước sản phẩm cặp mồi lý thuyết (693 bp) Vậy kết luận cặp mồi bắt vào vị trí gene mgg06069 có the kết luận có diện cùa gene mgg06069 gene mgg06069 chuyển thành công vào tế bào E.colỉ C1 C2 C3 C4 Hình 3.1: Kết colony PCR tế bào chuyến gene mgg06069 L: thang DNA C1-C4: Các mầu colony PCR Đối với phân đoạn PMO, cặp mồi dùng để khuếch đại phân đoạn PMO (mục 2.2.1.2) sè sử dụng làm cặp mồi để thực colony PCR kiểm tra colony biến nạp 17 phân đoạn PMO Độ dài sản phẩm cặp mồi 631 bp Kết hình 3.2 cho thấy giếng c 1, C3 C4 (khung đỏ) có band DNA vị trí gần 600 bp Giếng C2 có the thấy band DNA vị trí 600 bp (khung vàng) nhiên band mờ Việc band giếng C2 mờ giải thích lồi thao tác lấy colony khiến lượng khuẩn không đủ nhiều để khuếch đại Do kết sản pham colony PCR có kích thước gần tương đương với kích thước 631 bp nên có the kết luận có diện phân đoạn PMO plasmid của tế bào vi khuẩn phân đoạn PMO chuyển thành công vào tế bào E.coli C2 C1 C3 C4 Hình 3.2 Kết colony PCR tế bào E.coli chuyển phân đoạn PMO gene mgg06069 L: thang DNA; C1-C4: mẫu colony PCR 3.2 Ket biểu tinh 3.2.1 Ket biểu tinh toàn gene nigg06069 Hình 3.3 thể kết biểu gene mgg06069 thơng qua vị trí biêu vượt mức protein Cụ the, kết cho thấy giếng chứa dịch nuôi cấy (khung màu vàng) không xuất band protein biểu vượt mức (khoảng 87 kDa) so với đối chứng âm Các giếng chứa tủa tế bào (khung màu đỏ) xuất hai band protein có kích thước khoảng 87 kDa biểu vượt mức Hai band nằm tương đối sát nên biểu vượt mức chúng chồng đè lên khó phân biệt Hai band protein biếu vượt mức có the quan sát rõ giếng T2 18 (mũi tên đỏ) Đồng thời, thí nghiệm cho phép xác định nồng độ IPTG phù hợp cho nghiên cứu, ứng với độ đậm band protein mục tiêu (0,1 1Ĩ1M giống Tl) L DN ĐI D2 D3 D4 D5 TN TI T2 T3 T4 T5 Hình 3.3: Kết biểu gene mgg06069 nồng độ IPTG khác Giếng DN: dịch đối chứng âm, giếng TN: tùa tế bào đối chứng âm Giếng D1-D5: dịch bình 1-5 tưong ứng với nồng độ IPTG 0,1 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 0,75 1Ĩ1M mM Giếng T1-T5: tủa tế bào bình 1-5 tương ứng với nồng độ IPTG 0,1 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 0,75 1Ĩ1M mM Tiếp theo, tiến hành tinh protein mục tiêu cột Glutathione Agarose Resin Ket tinh (hình 3.4) cho thấy, chúng tơi thu nhận protein tương ứng với hai band protein phân đoạn E1 E2 (phân đoạn rửa giải, đánh dấu khung đỏ) Việc xuất band protein biểu vượt mức lúc biểu sau tinh cho thấy đẫ có lồi plasmid gene Có thể có sai lệch ORF plasmid qua trình tong hợp gene có xảy lồi Cũng khơng loại trừ khả việc xuất hai band tương tác tự nhiên protein với môi trường, nhiên khả thấp Như vậy, thấy việc biểu tồn gene mgg06069 có vấn đề phát sinh Thêm vào đó, việc protein vượt mức xuất phần tủa (Hình 3.3) cho thấy có the protein bị tủa Vì đa so protein nằm tủa chì có the tinh protein phân đoạn dịch nên hiệu thu hoi protein sau tinh thấp Do việc biếu thu protein không đạt suất mong muốn 19 Chúng cho nguyên nhân dần đến vấn đề phát sinh protein biểu có kích thước q lớn Có nhiều phương án đe thu nhỏ kích thước protein biếu Trong chúng tơi xin nêu hai phương án cho khả thi Thứ thay vector biểu vector khác khơng chứa GST để loại bỏ bớt kích thước GST (27kDa) Thứ nhì, có the biếu phần đoạn gene (PMO domain) thay biểu tồn đoạn gene Việc thực vi nghiên cứu PMO tái tổ họp cho thấy đoạn protein tạo từ phân đoạn PMO vần có hoạt tính.19 Do đó, việc biểu phân đoạn PMO gene mgg06069 vần sè tạo protein có hoạt tính khả thi Sau xem xét điều kiện thời gian vật liệu có chúng tơi định thực phương án biếu phần đoạn gene (phân đoạn PMO gene mgg06069) kDa L 97 66 — E1 E2 E3 E4 E5 W2 W1 L————— 45 30 20 Hình 3.4: Kết tinh protein MGG06069 L: thang protein; Cell: protein tông; E1-E5: Các phân đoạn rửa giải; W1-W2: phân đoạn rửa 3.2.2 Ket biểu tinh phân đoạn PMO gene mgg06069 Ket hình 3.3 cho thấy vị trí khoảng 50 kDa (trong khung đỏ) xuất band protein biểu vượt mức Từ đặc điểm vạch protein nghi ngờ lượng phân tử ứng với trọng lượng phân tử protein mục tiêu khả biểu vượt mức protein này, chúng tơi dự đốn phân đoạn protein PMO mục tiêu 20 kDa L C3 C2 Cl C4 C5 C6 20 Hình 3.5: Ket biếu phân đoạn PMO L: thang protein; C1-C6: thành phần protein từ colony biểu hình 3.5, kết cho thấy đà tinh protein mục tiêu phân đoạn rửa giải có chứa band protein vị trí 50 kDa Như vậy, nói việc thu nhỏ protein biểu có the giải vấn đề không mong muốn phát sinh (thu loại protein sau biểu hiện) Tuy vậy, cần thực thí nghiệm xác định hoạt tính để kết luận phân đoạn PMO sử dụng hay khơng Ngồi ra, việc biểu thu protein từ toàn gene mgg06069 cần thiết q trình thực thí nghiệm xác định hoạt tính sè can protein MGG06069 làm đối chứng việc xác định việc biếu phân đoạn PMO có gây ảnh hưởng tới mức độ biểu hoạt tính PMO hay khơng kDa L 97 — E1 E4 E5 W2 I— ■ 66 45 E3 E2 I ■ I 30 • 20 21 W1 Hình 3.6: Ket tinh phân đoạn protein PMO L: thang protein, E1-E5: phân đoạn rửa giải, Wl, 2: phân đoạn rửa 3.3 Ket xử lý cắt enzyme Enterokinase Protein MGG06069 lần phân đoạn PMO đem xử lý cat bang enzyme Enterokinase Tuy nhiên, lượng protein protein MGGG06069 thấp dần đến sau cắt band protein khơng thể SDS-PAGE Do có kết cắt phân đoạn PMO trình bày Ngồi ra, sau lặp lại việc biểu tinh phân đoạn PMO sử dụng phân đoạn PMO đe thực phản ứng cắt cho thấy lượng protein tinh cải thiện kể Hình 3.7: Kết xử lý cắt Enterokinase cùa phân đoạn PMO Ket hình 3.7 cho thấy band protein trước cat bang Enterokinase nằm vị trí 50 kDa band protein sau cắt vị trí 50 kDa khơng cịn Thay vào band chồng lấp khác xuất vị trí 27 kDa Đây kích thước GST Như thấy enzyme Enterokinase cắt thành công protein Việc không thấy band protein mục tiêu (23 kDa) có the 22 kích thước band protein GST sát nên tạo thành band chồng vị trí khoảng 27 kDa Như việc tách rời GST bang Enterokinase thực thành công theo thiết kế ban đầu Tuy nhiên việc band GST protein có kích thước q sát gây khó khăn việc loại bở GST khỏi dung dịch chứa protein 23 CHƯƠNG KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Như vậy, đà biểu thành công gene mggO6O69 hệ thống E coỉỉ Từ kết có được, chúng tơi có the kết luận việc biểu toàn gene mgg06069 E coli khả thi cịn nhiều hạn chế khó tinh protein, dễ xảy lồi kỳ thuật đề cập phần Kết biện luận Ket cho thấy việc giảm kích thước gene mgg06069 biểu (ở đề tài thực cách biếu phân đoạn PMO) có the sè giải hạn che Ngồi ra, vector Pgex-4t3 khơng phù họp cho việc biểu gene mgg06069 GST vector làm tăng kích thước protein lên đáng kể, gây vấn đề liên quan đến thu nhận tinh Thêm vào đó, cần biếu thu protein từ toàn gene mgg06069 đế làm đối chứng cho thí nghiệm cho nghiên cứu chế xâm nhiễm bệnh đạo ôn Việc thực cách thay đổi vector biểu protein Đặc biệt, thí nghiệm xác định hoạt tính protein thu cần thực đe có the kết luận phân đoạn PMO thu có thề sử dụng khơng hay việc sử dụng hệ thống E coli có đáp ứng yêu cầu cho sản xuất protein MGG06069 nhân tạo hay không Chủ nhiệm đề tài (Ký ghi rõ họ tên) 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO (1) Sun, s.; Sun, s.; Cao, X.; Sun, R The Role of Pretreatment in Improving the Enzymatic Hydrolysis of Lignocellulosic Materials Bioresource Technology 2016, 199, 49-58 https://doi.org/10.1016/j biortech.2015.08.061 (2) Demirbaẹ, A Bioethanol from Cellulosic Materials: A Renewable Motor Fuel from Biomass Energy Sources 2005, 27 (4), 327-337 https://doi.org/10.1080/00908310390266643 (3) Klemm, D.; Heublein, B.; Fink, H.-P.; Bohn, A Cellulose: Fascinating Biopolymer and Sustainable Raw Material Angew Chern Int Ed 2005, 44 (22), 3358-3393 https://doi.org/10.1002/anie.200460587 (4) Fatehi, p Production of Biofuels from Cellulose of Woody Biomass In Cellulose - Biomass Conversion', Kadla, J., Ed.; InTech, 2013 https://doi.org/10.5772/50740 (5) Vu, V V.; Marietta, M A Starch-Degrading Polysaccharide Monooxygenases Cell Mol Life Sci 2016, 73 (14), 2809-2819 https://doi.org/I0.1007/s00018-016-2251-9 (6) Vu, V V.; Beeson, w T.; Phillips, c M.; Cate, J H D.; Marietta, M A Determinants of Regioselective Hydroxylation in the Fungal Polysaccharide Monooxygenases J Am Chern Soc 2014,136 (2), 562-565 https://doi.org/10.1021/ja409384b (7) Te Beest Rice Blast PH/2007 https://doi.org/10.1094/PHI-I-2007-0313-07 (8) Li, Y.; Liu, X.; Liu, M.; Wang, Y.; Zou, Y.; You, Y.; Yang, L.; Hu, J.; Zhang, H.; Zheng, X.; Wang, p.; Zhang, z Magnaporthe Oryzae Auxiliary Activity Protein MoAa91 Functions as Chitin-Binding Protein To Induce Appressorium Formation on Artificial Inductive Surfaces and Suppress Plant Immunity mBio 2020, 11 (2) https://doi.org/10.! 128/mBio.03304-19 (9) Tripathi, N K.; Shrivastava, A Recent Developments in Bioprocessing of Recombinant Proteins: Expression Hosts and Process Development Front Bioeng Biotechnol 2019, 7, 420 https://doi.org/10.33 89/fbioe.2019.00420 (10) McKenzie, E A.; Abbott, w M Expression of Recombinant Proteins in Insect and Mammalian Cells Methods 2018,147, 40-49 https://doi.Org/10.1016/j.ymeth.2018.05.013 (11) Owczarek, B.; Gerszberg, A.; Hnatuszko-Konka, K A Brief Reminder of Systems of Production and Chromatography-Based Recovery of Recombinant Protein Biopharmaceuticals BioMed Research International 2019, 2019, 1-13 https://doi.org/10-l 155/2019/4216060 25 (12) Puetz, J.; Wurm, F M Recombinant Proteins for Industrial versus Pharmaceutical Purposes: A Review of Process Pricing and Processes 2019, (8), 476 https://doi.org/10.3390/pr7080476 (13) Gupta, s K.; Shukla, p Advanced Technologies for Improved Expression of Recombinant Proteins in Bacteria: Perspectives and Applications Critical Reviews in Biotechnology 2016, 36 (6), 1089-1098 https://doi.org/10.3109/07388551.2015.1084264 (14) Baeshen, M N.; Al-Hejin, A M.; Bora, R s.; Ahmed, M M M.; Ramadan, H A I.; Saini, K s.; Baeshen, N A.; Redwan, E M Production of Biopharmaceuticals in E Coli: Current Scenario and Future Perspectives Journal ofMicrobiology and Biotechnology 2015, 25 (7), 953- 962 https://doi.org/10.4014/jmb.1412.12079 (15) Kim, I J.; Nam, K H.; Yun, E J.; Kim, s.; Youn, H J.; Lee, H J.; Choi, I.-G.; Kim, K H Optimization of Synergism of a Recombinant Auxiliary Activity from Chaetomium Globosum with Cellulase in Cellulose Hydrolysis Appl Microbiol Biotechnol 2015, 99 (20), 8537-8547 https://doi.org/10.1007/s00253-015-6592-3 (16) Saitoh, H.; Fujisawa, s.; Mitsuoka, c.; Ito, A.; Hirabuchi, A.; Ikeda, K.; Irieda, H.; Yoshino, K.; Yoshida, K.; Matsumura, H.; Tosa, Y.; Win, J.; Kamoun, s.; Takano, Y.; Terauchi, R Large-Scale Gene Disruption in Magnaporthe Oryzae Identifies MC69, a Secreted Protein Required for Infection by Monocot and Dicot Fungal Pathogens PLoS Pathog 2012, (5), e 1002711-e 1002711 https://doi.org/!0.1371/joumal.ppat 1002711 (17) Affinity GST Purification Using Glutathione Bulk Resin 11 (18) E Coli Protein Expression Protocol.Pdf (19) Forsberg, z.; Mackenzie, A K.; Sorlie, M.; Rohr, Ả K.; Helland, R.; Arvai, A s.; Vaaje- Kolstad, G.; Eijsink, V G H Structural and Functional Characterization of a Conserved Pair of Bacterial Cellulose-Oxidizing Lytic Polysaccharide Monooxygenases Proc Natl Acad Sci U.S.A 2014, 111 (23), 8446-8451 https://doi.org/10.1073/pnas.1402771111 26 PHỤ LỤC 3: MINH CHỦNG ĐI KÈM SẢN PHẢM DẠNG (hình ảnh sản phẩm đạt ) SẢN PHÁM DẠNG 2: (quy trình, sơ đồ, bảng vè, sở dừ liệu ) SẢN PHÁM DẠNG 3: (toàn văn báo, sách chuyên khảo ) SẢN PHÁM ĐÀO TẠO: gồm hồ sơ sau - Quyết định hướng dần sinh viên (hoặc giấy xác nhận Ban chủ nhiệm Khoa) - Biên họp hội đong luận văn sinh viên (có thể tên sinh viên, giảng viên hướng dần, tên đề tài, kết quả) 27 Expressing mgg06069 gene in Escherichia coli Chinh Bui Cong *, Giap Ho Ta, Van Vu Van NTT Hi-tech Institute, Nguyen Tat Thanh University ’ chinhbc@ntt.edu.vn Abstract MGG06069 is a PMO protein originating from M.oryzae, the fungus that causes rice blast disease It has the potential to speed up the cellulolysis process, which can be beneficial in the industry In this study, mgg06069 gene was expressed in E.coli to artificially produce protein MGG06069 The result shows that it is possible to express the whole gene mgg06069 in E.coli but it would have some drawbacks and the yield was low Expressing a segment of the gene (PMO domain) instead of the whole gene would give a better result with a better yield However, it is necessary to carry out the protein activity assay to determine whether the protein produced by E.coli can be used or not successfully expressed in E.coli.7 Therefore, E.coli can be Introduction the suitable host to express and produce MGG06069 Polysaccharide monooxygenase (PMO) is a group of protein, which is also belonged to the AA9 group In this proteins that have the ability to oxidize the glycosidic study, the objective is to express gene mgg06069 in the linkage of the polysaccharide thanks to its monocopper E.coli and purify the protein MGG06069 that was active site This ability allows PMO to break down or produced enhance other enzymes breaking down long and complex Materials and methods polysaccharide chains (cellulose, chitin, etc).1 In the CAZy and Uniprot database, MGG06069 is a PMO belonging to AA9 group In nature, this protein is secreted by Magnaporthe oryzae, the fungi that cause rice blast, a common disease in rice.2 In one study, it has shown that during the appressorium morphogenesis, one of the first steps in the M.oryzae’s infection process, the expression of the mgg06069 gene increases dramatically.3 This suggests that MGG06069 may have an essential role in the infection process It is possible that protein MGG06069 assists M.oryzae in breaking down the cellulose wall, thus making way for the pathogen to enter the host Therefore, by studying MGG06069 we can have a better understanding of how M.oryzae infects rice and there is a chance that MGG06069 can be utilized as an enzyme to speed up the cellulolysis However, in order to study or utilize MGG06069 for the industry, we need to find a way to artificially produce MGG06069 Recombinant protein, which can mass-produce bio­ substance at a low price, is one of the solutions Nowadays, there have been many hosts, e.g bacteria, insect, fungal, plant, animal cell that can be used for recombinant protein.4 Among them, Escherichia coli is one of the most common hosts Even though E.coli has many drawbacks, it is still widely used because its genome and metabolism pathway has been studied thoroughly, has a fast growth rate, high efficiency, the equipment required is simple and the price is relatively low Moreover, in one study, a protein belonging to the AA9 group has been 2.1 Materials In this study, Pgex-4t3 vector was used to express the gene in the E.coli Pgex-4t3 is a commercial vector, designed for gene expression in E.coli The BL-21 E.coli, a commercial strain that was suitable for transformation and protein expression was used as the host for protein expression The mgg06069 sequence was obtained from the Uniprot database According to a prior study, the gene mgg06069 consists of signal peptides, a Glyco_hydro_61 domain (PMO domain), and a chitin-binding domain PMO Chitin Rindinơ Figure 1: mgg06069 gene’s structure Base on that structure, some modifications had been made to the gene before it was integrated into the vector The signal peptide would be replaced by the DDDDK coding sequence DDDDK is a sequence of peptides that can be recognized and cut by the Entero Kinase enzyme After that, the sequence would be synthesized and inserted into the Pgex-4t3 vector The vector would be transformed into the BL-21 E.coli by heat shock Figure 2: Modified mgg06069 gene 28 The PMO domain together with the DDDDK sequence was also expressed Using PCR with modified mgg06069 gene as the template, the DDDDK and the PMO domain were amplified, stop codon was added at the end of the PMO sequence and restriction sites (RS) were added on both ends The amplified sequence was inserted into the Pgex-4t3 vector by using restriction enzymes and ligase enzyme and transformed into the BL-21 E.coli by heat shock The transformed bacteria cells were isolated by the LB plate containing Ampicillin cells were broken down by sonification, the lysate of each colony would be electrophoresed by SDS-PAGE to analyze Bacteria cells from the colony that has overexpressed protein at the right size (~50 kDa) would be kept and their plasmid would be collected The plasmid would be transformed into the E.coli again The newly transformed bacteria cells would be expressed at a large scale (0.5-1 Litre) The expression procedure and the protein purification procedure were described in 2.2.1 All the wash fractions and the elution fractions were electrophoresed by SDS-PAGE to analyze 2.3 Removing GST using Entero Kinase enzyme After the protein was purified, the GST would be cleaved out by using Entero Kinase In this study we used Entero Kinase purchased from Sigma—Aldrich (code number E5144) The reaction was carried out following the instruction from the producer Figure 3: PMO domain and DDDDK sequence after amplification 2.2 Methods 2.2.1 Expressing mgg06069 gene Six Erlenmeyer flasks, each containing 100ml LB medium were prepared Five of the flasks were numbered from to These flasks were inoculated with 10 ml overnight­ culture of transformed E.coli Ampicillin was also added to those flasks The remaining flask was labeled as “N” and was inoculated with 10 ml overnight-culture of non­ transformed E.coli to serve as the negative control All the flasks were incubated at 37°c until the OD in each flask reach 0.4-0.6 After the OD was reached, IPTG was added to the flask The concentration of IPTG in each flask from to would be 0.1 mM, 0.25 mM, 0.5 IĨ1M, 0.75 IĨ1M, mM respectively IPTG would not be added to the negative control flask All the flasks would be incubated at 25°c with shaking for 16 hours for gene expression After that, bacteria cells in each flask were collected by centrifugation The cells were resuspended in Phosphate Buffered Saline (PBS) Then the cells were broken down by sonification The lysate was centrifuged at 6000 ipm for 15 minutes The pellet and the supernatant from each flask were electrophoresed by SDS-PAGE to analyze the protein and identify the optimal IPTG concentration After optimal IPTG concentration was identified, the transformed E.coli would be expressed at a larger scale (0.5-1 Litre) using the procedure described above and with the optimal concentration of 1PTG The supernatant of the lysate was added to the Glutathione Agarose Resin column The procedure of purifying protein was conducted following the manual provided by GoldBio.8 All the wash fractions and the eluted fractions were electrophoresed by SDS-PAGE to analyze 2.2.2 Expressing PMO segment of the mgg06069 gene Each colony that was isolated in the Ampicillin-contained LB plate would be picked, expressed following the same procedure that has been described above After bacterial Result and discussion 3.1 Express! ng mgg06069 gene Figure 4: Expression of mggO6O69 gene S: Supernatant, P: Pellet N, 1,2,3,4,5: The label of each flask that has been described above I É1 É2 É3 É4 É5 W2 97 —66 -• 45 30 *•— 20 Figure 7: Purification of PMO 29 W1 L: protein ladder; E1-E5: Elution fractions; W1-W2: Wash fractions From the SDS-PAGE result, we can see that there are two overexpressed proteins band at the expected size (~90 kDa) The optimal IPTG is 0.1 mM (flask 1) The result also showed that most of the overexpressed proteins were in the pellet of the lysate Since only the supernatant of the lysate could be used to purify the protein in the Glutathione Agarose Resin column, the amount of purified protein was very low Therefore it is not efficient to use E.coli to express the whole mgg06069 gene unless there is a solution to increase the yield of purified protein Furthermore, a second overexpressed band at the expected location (~90 kDa) indicates that some error could have occurred during the synthesis of the gene 3.2 Expressing PMO domain of the mgg06069 gene C2 Cl I C3 C4 C5 expressing a short segment of the gene is more efficient than expressing the whole gene However, it is unclear whether the PMO protein of the mgg06069 has the ability to speed up the cellulolysis or not and a protein activity assay is necessary to determine that 3.3 Removing GST using Entero Kinase enzyme Since the amount of MGG06069 protein was too little we only carried out the reaction for the PMO domain of the mgg06069 gene C6 30 20 Figure 8: Result of Entero Kinase reaction Figure 6: Expressing PMO domain L: protein ladder; C1-C6: Colonies expression W1 W2 É5 É4 É3 É2 • Él The SDS-PAGE result showed that after the reaction, there were two bands near the 26 marker One was the GST (~27 kda) and the other was the PMO domain (~24 kda) This indicates that the reaction had successfully cleaved out the GST tag from the PMO domain L — 97 — “ — 66 45 • Conclusion It is possible to express the whole mgg06069 gene in E.coli However, expressing the whole gene would have many drawbacks thus it is not practical for mass-producing the MGG06069 protein Expressing a short segment of the mgg06069 gene (PMO domain) has given a better result Despite that, it is unknown whether a short version of the MGG06069 protein has the ability to speed up cellulolysis or not Therefore it is necessary to carry out the protein activity assay to determine whether the PMO protein that was produced is suitable for research and cellulolysis or not 30 20 Figure 7: Purification of PMO L: protein ladder; E1-E5: Elution fractions; W1-W2: Wash fractions The SDS-PAGE result showed that there was only one overexpressed band at the expected size (~50 kDa) The purification result also showed that there was only one purified protein at the expected size (~50 kDa) and the amount of purified protein was higher This means the error mentioned earlier could have been fixed and 30 Acknowledgement This research is funded by NTTU Foundation for Science and Technology Development under grant number 2020.01.160 Reference Vu, V V.; Beeson, w T.; Phillips, c M.; Cate, J H D.; Marietta, M A Determinants of Regioselective Hydroxylation in the Fungal Polysaccharide Monooxygenases J Am Chern Soc 2014, 136 (2), 562-565 https://doi.org/10.102 l/ja409384b Te Beest Rice Blast PHI 2007 https://doi.org/10.1094/PHI-I-2007-0313-07 Soanes, D M.; Chakrabarti, A.; Paszkiewicz, K H.; Dawe, A L.; Talbot, N J Genome-Wide Transcriptional Profiling of Appressorium Development by the Rice Blast Fungus Magnaporthe Oryzae PLoS Pathog 2012, (2), el002514 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1002514 McKenzie, E A.; Abbott, w M Expression of Recombinant Proteins in Insect and Mammalian Cells Methods 2018,147, 40-49 https://doi.Org/10.1016/j.ymeth.2018.05.013 Owczarek, B.; Gerszberg, A.; Hnatuszko-Konka, K A Brief Reminder of Systems of Production and Chromatography-Based Recovery of Recombinant Protein Biopharmaceuticals BioMed Research International 2019, 2019, 1-13 https://doi.org/10.! 155/2019/4216060 Puetz, J.; Wurm, F M Recombinant Proteins for Industrial versus Pharmaceutical Purposes: A Review of Process and Pricing Processes 2019, (8), 476 https://doi.org/10.3390/pr7080476 Kim, I J.; Nam, K H.; Yun, E J.; Kim, s.; Youn, H J.; Lee, H J.; Choi, I.-G.; Kim, K H Optimization of Synergism of a Recombinant Auxiliary Activity from Chaetomium Globosum with Cellulase in Cellulose Hydrolysis Appl Microbiol Biotechnol 2015, 99(20), 8537-8547 https://doi.org/10.1007/s00253-015-6592-3 Affinity GST Purification Using Glutathione Bulk Resin 11 Biểu gene ntggO6O69 Escherichia coli Bùi Cơng Chính*, Hồ Tá Giáp, Vũ Văn Vân Viện Kỹ thuật Công nghệ cao Nguyễn Tât Thành, Đại học Nguyền Tất Thành * chinhbc@ntt.edu.vn Tóm tắt MGG06069 protein PMO có nguồn gốc từ lồi nấm M.oryzae gây bệnh đạo ơn lúa Đây protein có tiềm việc đẩy nhanh trình phân húy Xen-lu-lo Trong nghiên cứu này, gene mgg06069 biếu E.coli đế sàn xuất nhân tạo protein MGG06069 Ket cho thấy việc biểu toàn gene mgg06069 E.coli co the thự nhiên có nhiều hạn che lượng protein thu ỡ mức thấp Thay vào đó, biểu phan đoạn gene (phân đoạn chứa PMO) cho kết quà quan với lượng protein thu lớn hơn.Tuy nhiên càn thực test hoạt tính protein đế xác định protein thu từ E.coli có the sừ dụng hay khơng Từ khóa AA9, MGG06069, Escherichia coli, Polysaccharide Monooxygenase, PMOs ... nghiên cứu protein MGG06069, cần có hệ thống biểu protein để tạo lượng protein MGG06069 số lượng lớn Đe đáp ứng nhu cầu trên, đề tài thực nhằm biểu gene mgg06069 E.coli Trình tự gene mgg06069 lấy... mgg06069 mgg06069 Protein MGG06069 Protein MGG06069 Bài báo khoa học đăng tạp Bản thảo báo khoa học chí nước Thời gian thực hiện: 8/2020-11/2021 Thời gian nộp báo cáo : 31/03/2022 vi MỞ ĐÀU MGG06069. .. cứu biểu thành cơng protein thuộc họ AA9 hệ thống E.colỉ 15 Do vậy, E coỉi có khả hệ thống biểu thích hợp cho protein MGG06069 Vậy nên mục tiêu đề tài biếu gene mgg06069 vi khuẩn E coli thu protein