Tối ưu các điều kiện biểu hiện, tinh sạch protein Nucleocapsid Virus SARSCoV2 trên vật chủ E.Coli BL21 DE3.Virus corona gây hội chứng hô hấp cấp tính nặng 2, viết tắt là SARSCoV2 (tiếng Anh: Severe acute respiratory syndrome corona virus 2), trước đây có tên là virus corona mới 2019 (2019nCoV), là virus thuộc họ Coronaviridae gây ra bệnh viêm đường hô hấp cấp do virus corona 2019 (COVID19). Virus được phát hiện lần đầu tiên vào tháng 12 năm 2019, trong đợt bùng phát dịch bệnh viêm phổi lạ ở thành phố Vũ Hán, Trung Quốc. Bất chấp các nỗ lực ngăn cản và phong tỏa virus của chính quyền thành phố Vũ Hán, virus vẫn tiếp tục lây lan mạnh mẽ ra toàn thế giới.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Tối ưu trình biểu tinh protein Nucleocapsid virus SARS-CoV-2 vi khuẩn E.coli NGUYỄN MINH QUANG quang.nm180366@sis.hust.edu.vn Ngành Kỹ thuật sinh học Chuyên ngành Sinh học phân tử Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Thanh Hịa Chữ ký GVHD Bộ mơn: Vi sinh – Hóa sinh – Sinh học phân tử Viện: Cơng nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm HÀ NỘI, 08/2022 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS Nguyễn Thanh Hòa ĐỀ TÀI TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Nguyễn Minh Quang Khóa: 63 MSSV: 20180366 Viện: Cơng nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm Ngành: Kỹ thuật sinh học Đề tài nghiên cứu: “Tối ưu trình biểu tinh protein Nucleocapsid virus SARS-CoV-2 vi khuẩn E.coli” Nội dung đề tài: • Tối ưu hóa điều kiện biểu protein nucleocapsid virus SARS-CoV-2 vật E.coli • Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện, tinh protein nucleocapsid virus SARS-CoV2 từ E.coli tái tổ hợp • Tinh sạch, đánh giá hoạt tính protein nucleocapsid thu Họ tên cán hướng dẫn: TS Nguyễn Thanh Hòa Ngày giao nhiệm vụ đồ án: Ngày 01 tháng 04 năm 2022 Ngày hoàn thành đồ án: Ngày 20 tháng 07 năm 2022 Ngày 22 tháng 07 năm 2022 Trưởng môn Cán hướng dẫn (Ký, ghi rõ họ tên) (Ký, ghi rõ họ tên) Sinh viên hoàn thành nộp đồ án tốt nghiệp ngày… tháng…năm… ii Người duyệt Sinh viên (Ký, ghi rõ họ tên) (Ký, ghi rõ họ tên) Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS Nguyễn Thanh Hòa LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ thực phẩm, thầy cô trường Đại học Bách Khoa Hà Nội tận tình giảng dạy truyền đạt kiến thức cho em suốt thời gian học tập trường Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới Nguyễn Thanh Hịa, Phó trưởng Bộ mơn vi sinh, hóa sinh, sinh học phân tử Viện CNSH&CNTP hướng dẫn, giúp đỡ em suốt trình thực đồ án Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy Trương Quốc Phong, viện phó Viện CNSH&CNTP khơi dậy niềm cảm hứng, tạo điều kiện giúp đỡ cho em xuyên suốt quãng thời gian nghiên cứu khoa học trường Em xin cảm ơn hướng dẫn, giúp đỡ nhiệt tình anh/chị/em phịng thí nghiệm 307 B1 – Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội thời gian em làm nghiên cứu học tập Với tất lịng kính u biết ơn chân thành nhất, em xin gửi tới gia đình: bố, mẹ, em trai, người ln nhiệt tình động viên, tạo điều kiện chỗ dựa tinh thần cho em trình học tập trường Trong trình thực đề tài tốt nghiệp, thời gian kiến thức cịn hạn chế nên có thiếu sót khơng thể tránh khỏi Em mong nhận đóng góp ý kiến, bảo tận tình q thầy để khố luận hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 22 tháng 07 năm 2022 iii Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS Nguyễn Thanh Hịa TĨM TẮT NỘI DUNG ĐỒ ÁN Cuối năm 2019, giới ghi nhận ca nhiễm Coronavirus Vũ Hán, Trung Quốc Kể từ đó, số lượng ca nhiễm ngày tăng mức độ dịch bệnh ngày nghiêm trọng biến thể virus corona phát Với tốc độ lây lan nhanh chóng, giới trải qua năm đại dịch với nhiều lần phát sinh biến chủng lây lan mạnh hơn, lẩn tránh hệ miễn dịch tốt Các biến chủng không ngừng thay phiên trở thành biến chủng chủ đạo gây khó khăn cho cơng tác phịng chống dịch bệnh Protein nucleocapsid SAR-CoV-2 mục tiêu KIT test nhanh dựa kháng nguyên, kháng thể với ưu tồn lâu, hàm lượng cao thể người bệnh; nhờ đóng vai trị quan trọng sản xuất KIT test nhanh phục vụ cơng tác phịng chống dịch bệnh Chính vậy, nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu thực đề tài: “Tối ưu trình biểu tinh protein Nucleocapsid virus SARSCoV-2 vi khuẩn E.coli” Kết đạt đồ án: • Tối ưu hóa điều kiện biểu protein nucleocapsid virus SARS-CoV-2 tái tổ hợp vật chủ E.coli • Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện, tinh protein nucleocapsid virus SARS-CoV2 từ E.coli tái tổ hợp • Tinh sạch, đánh giá hoạt tính protein nucleocapsid virus SARS-CoV-2 tái tổ hợp thu Sinh viên thực Ký ghi rõ họ tên iv Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS Nguyễn Thanh Hòa DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ACE2 : Angiotensin Converting Enzyme Amp : Ampicillin ARN : Axit Ribonucleic Bp : base pair CTD: C-terminal domain E.coli : Escherichia coli EDTA : Ethylen diamine tetraacetic acid ELISA : Enzyme – Linked ImmunoSorbent Assay ICTV : International Committee on Taxonomy of Viruses IDR: Intrinsically disordered regions Ig : Immunoglobulin IPTG : Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside kDa : Kilo Dalton LB : Luria Bertani LKR: Linker region MERS: Middle East Respiratory Syndrome NTD: N terminal domain OD : Optical Density PBS : Phosphate Buffered Saline PBS-T : Phosphate Buffered Saline – Tween – 20 PCR : Polymerase Chain Reaction PHEIC : Public Health Emergency of International Concern RNP: Ribonucleoprotein particle RT : Room temperature SARS : Severe acute respiratory syndrome SARS-CoV-2 : Severe acute respiratory syndrome corona virus SDS-PAGE : Sodium dodecyl sulfate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis v Đồ án tốt nghiệp TMB : Tetramethybenzidine TEMED: Tetramethylethylenediamine v/v : Volume/ volume WHO : World Health Organization vi GVHD: TS Nguyễn Thanh Hòa Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS Nguyễn Thanh Hịa DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1-1:Tình hình bùng phát dịch Covid-19 toàn giới 12 Hình 1-2: Hình ảnh virus SARS-CoV-2 kính hiển vi điện tử [5] 16 Hình 1-3: Cấu trúc thành phần virus SARS-CoV-2 [6] 17 Hình 1-4: Mơ tổng quan cấu trúc Protein Nucleocapsid SARS-CoV2 [9] 18 Hình 1-5: Sự biến thiên ước tính theo thời gian xét nghiệm chẩn đoán SARS-CoV liên quan đến thời gian khởi phát triệu chứng[22] 20 Hình 2-1: Vector biểu pET22b(+) trình tự ORF 24 Hình 3-1 Kết điện di SDS-PAGE kiểm tra biểu protein N pH môi trường LB lỏng khác 33 Hình 3-2: Kết điện di SDS-PAGE kiểm tra biểu protein N tỷ lệ cấp giống khác 35 Hình 3-3: Kết điện di SDS-PAGE kiểm tra biểu protein N điều kiện nhiệt độ, thời gian: 36 Hình 3-4: Kết điện di SDS-PAGE kiểm tra ảnh hưởng nồng độ IPTG đến biểu protein N 38 Hình 3-5: Kết điện di kiểm tra khảo sát nồng độ Imidazole đệm rửa tinh 40 Hình 3-6: Kết điện di SDS-PAGE khảo sát nồng độ Imidazole đệm rửa giải protein N tinh 41 Hình 3-7: Kết Western Blot màng nhuộm ink (A) sau dừng phản ứng chất nước Deion (B) 42 vii Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS Nguyễn Thanh Hòa DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2-1: Hóa chất pha gel điện di SDS-PAGE 28 Bảng 2-2: Công thức pha đường chuẩn Bradford 30 Biểu đồ 3-1: Lượng protein đích thu pH môi trường LB lỏng khác nhau…………………………………………………………………………… 34 Biểu đồ 3-2: Lượng protein 48kDa thu tỷ lệ cấp giống khác 35 Biểu đồ 3-3: Lượng protein kích thước 48kDa thu nhiệt độ, thời gian cảm ứng 37 Biểu đồ 3-4: Lượng Protein 48kDa thu nồng độ IPTG cảm ứng khác 38 Biểu đồ 3-5: Kết ELISA đánh giá hoạt tính protein N tái tổ hợp so sánh với protein N thương mại hãng Medicon 43 viii Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS Nguyễn Thanh Hịa MỤC LỤC TĨM TẮT NỘI DUNG ĐỒ ÁN iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC HÌNH VẼ vii DANH MỤC BẢNG BIỂU viii MỤC LỤC CHƯƠNG TỔNG QUAN 12 1.1 Tổng quan tình hình dịch bệnh COVID-19 giới Việt Nam 12 Tình hình dịch bệnh COVID-19 giới: 12 Tình hình dịch bệnh COVID-19 Việt Nam: 13 1.2 Virus SARS-CoV-2, tác nhân gây dịch bệnh COVID-19: 15 Đặc điểm cấu trúc di truyền virus SARS-CoV-2: 16 Đặc điểm protein N virus SARS-CoV-2: 18 Đóng gói gen virus – chức protein N virus SARS-CoV- 2:…………………………………………………………………………… 19 1.3 Các phương pháp chẩn đoán SARS-CoV-2: 20 Phương pháp phát vật liệu di truyền virus SARS-CoV-2 20 Phương pháp phát kháng nguyên/kháng thể virus SARS-CoV- 2:…………………………………………………………………………… 21 1.4 Protein nucleocapsid SARS-CoV-2 ứng dụng: 22 Protein nucleocapsid tái tổ hợp: 22 Sản xuất protein nucleocapsid tái tổ hợp hệ biểu E.coli ứng dụng: 22 SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS Nguyễn Thanh Hòa CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .24 2.1 Vật liệu: 24 Chủng vi sinh vật: .24 Vector biểu pET22b(+) 24 Các kháng thể sử dụng cho Western Blot ELISA: 25 Mơi trường, hóa chất: 25 2.2 Thiết bị: 26 2.3 Phương pháp nghiên cứu: 27 Phương pháp vi sinh 27 Phương pháp hóa sinh: .27 Phương pháp miễn dịch: .31 Phương pháp tin sinh: 31 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Nghiên cứu điều kiện tối ưu biểu protein N tái tổ hợp virus SARS- CoV-2 E.coli BL21 (DE3): 33 Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện pH môi trường đến biểu protein N tái tổ hợp: 33 Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện cấp giống theo thể tích đến biểu protein N tái tổ hợp: 34 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian, nhiệt độ nuôi cảm ứng đến biểu protein N tái tổ hợp: 36 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ IPTG đến biểu protein N tái tổ hợp:………………………………………………………………………… 37 Kết tối ưu biểu protein N tái tổ hợp virus SARS-CoV-2: 39 3.2 Nghiên cứu điều kiện tối ưu tách chiết tinh protein N tái tổ hợp virus SARS-CoV-2 40 10 SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS Nguyễn Thanh Hòa Kết biểu giờ; giờ; 20 giờ; 24 25oC; (C) Kết biểu giờ; giờ; 20 giờ; 24 37oC Kết điện di SDS-PAGE phân tích ImageJ, kết hợp kết đo Bradford tổng số cho ước tính hàm lượng protein 48kDa điều kiện thu Protein 48kDa (mg) biểu đồ: 0,090 0,080 0,070 0,060 0,050 0,040 0,030 0,020 0,010 0,000 4h - 10 8h - 10 20h - 10 24h - 10 4h - 25 8h - 25 20h - 25 24h - 25 4h - 37 8h - 37 20h - 37 24h - 37 độ C độ C độ C độ C độ C độ C độ C độ C độ C độ C độ C độ C Thời gian - nhiệt độ cảm ứng Biểu đồ 3-3: Lượng protein kích thước 48kDa thu nhiệt độ, thời gian cảm ứng Theo kết điện di phân tích hình ảnh ImageJ, ta thấy nhiệt độ 37oC thời gian biểu giờ, protein N tạo nhiều Ở đây, hạ nhiệt độ kéo dài thời gian biểu lượng protein N tan tạo không tăng lên mà chí cịn thấp Có thể biểu protein N tái tổ hợp gắn liền với sinh trưởng phát triển vi khuẩn E.coli nên giảm tốc độ sinh trưởng vi khuẩn kéo theo giảm biểu protein N lượng Vì thế, kết luận điều kiện biểu tối ưu lượng protein N dạng tan nhiệt độ 37oC, thời gian biểu Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ IPTG đến biểu protein N tái tổ hợp: Gen mã hóa protein N E.coli BL21 (DE3)::pET22b(+)//prN điều khiển phiên mã cấu trúc promotor T7; biểu protein điều khiển promotor dựa chất cảm ứng IPTG Khi có mặt IPTG, lacI chất ức chế phiên mã bị IPTG bám vào làm thay đổi cấu trúc không gian khả liên kết với vùng LacO T7 RNA Polymerase lúc hoạt động phiên mã tạo sản phẩm, dẫn đến 37 SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS Nguyễn Thanh Hịa protein tái tổ hợp tạo Vì thế, nồng độ IPTG gây ảnh hưởng trực tiếp đến biểu protein Để kiểm tra ảnh hưởng nồng độ IPTG lên biểu protein N, thí nghiệm tiến hành cảm ứng IPTG với nồng độ: 0µM; 1µM; 10µM; 100µM; 1000µM Hình 3-4: Kết điện di SDS-PAGE kiểm tra ảnh hưởng nồng độ IPTG đến biểu protein N.Đường chạy 0µM; 1µM;10µM; 100µM; 1000µM đường chạy điện di mẫu protein thể tan thu nồng độ IPTG cảm ứng tương ứng Kết điện di SDS-PAGE phân tích ImageJ, kết hợp kết đo Bradford tổng số cho ước tính hàm lượng protein 48kDa điều kiện thu biểu đồ: Protein 48kDa (mg) 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0µM 1µM 10µM 100µM 1000µM Nồng độ IPTG Biểu đồ 3-4: Lượng Protein 48kDa thu nồng độ IPTG cảm ứng khác 38 SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS Nguyễn Thanh Hòa Kết cho thấy nồng độ 100µM protein N biểu tốt Ở nồng độ IPTG cao cạnh tranh vị trí bám gen lac dẫn đến việc biểu thấp Vì thế, với nồng độ IPTG ta chọn điều kiện nồng độ 100µM tiến hành thí nghiệm Kết tối ưu biểu protein N tái tổ hợp virus SARS-CoV-2: Hình 3-5: Kết biểu protein N với điều kiện tối ưu Theo kết biểu protein N với điều kiện: tỷ lệ cấp giống theo thể tích 1% (v/v); pH môi trường 6,5; thời gian nuôi cảm ứng giờ, nhiệt độ nuôi cảm ứng 37oC; IPTG nồng độ cuối 0,1mM; thơng qua phân tích ImageJ kết đo tổng số Bradford, protein N ước tính chiếm 30% tổng số protein thể tan Đây kết khả quan protein N biểu tốt dạng thể tan so sánh với số phương pháp biểu nghiên cứu khác[23, 24] Cụ thể nghiên cứu Li, Guang cộng , protein N biểu thể vùi gây khó khăn cho việc tách chiết, tinh sạch; để sử dụng, nhóm nghiên cứu phải thực thêm bước tái cuộn gấp để đảm bảo hoạt tính Cịn nghiên cứu Djukic cộng sự, protein N biểu thể tan mức độ biểu thấp, band protein đích mỏng sản phẩm thu phân mảnh protein N protein N nguyên vẹn 39 SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS Nguyễn Thanh Hòa 3.2 Nghiên cứu điều kiện tối ưu tách chiết tinh protein N tái tổ hợp virus SARS-CoV-2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Imidazole đệm rửa tinh protein N phương pháp sắc ký lực gắn gel Ni2+-IDA: Theo thiết kế protein N tái tổ hợp có chứa 6xHis-tag đầu C 6xHis-tag trình tự bao gồm acid amin Histidine liên tiếp Do 6xHis-tag có lực với kim loại hóa trị nên protein N tái tổ hợp tinh phương pháp sắc ký lực gel Ni2+-IDA Hình 3-6: Kết điện di kiểm tra khảo sát nồng độ Imidazole đệm rửa tinh Protein N cho gắn lên gel Ni2+-IDA máy lắc 4oC qua đêm, dịch protein cịn khơng gắn lên gel thu lại Flow Through (FT) Sau đó, phức hợp GelNi-prN rửa với đệm có bổ sung nồng độ Imidazole 0mM; 5mM; 10mM; 20mM; 50mM để kiểm tra khả rửa Imidazole có lực mạnh với Ni2+ Khi bổ sung Imidazole nồng độ thấp vào đệm rửa, Imidazole có khả đẩy protein không bám đặc hiệu protein không bám gel Nồng độ Imidazole tối ưu nồng độ mà protein bám k đặc hiệu rửa mà protein N với đuôi Histag bám đặc hiệu chưa rửa giải 40 SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS Nguyễn Thanh Hòa Theo kết điện di thấy nồng độ 5mM, hầu hết Protein không bám đặc hiệu rửa giải khỏi gel, tăng nồng độ lên 10 20mM khơng có thêm protein bị rửa Hơn nữa, tăng nồng độ Imidazole lên 50mM bắt đầu có tượng protein N bị đẩy khỏi gel Vì thế, thí nghiệm chọn đệm TrisHCl 50mM pH 8,5 bổ sung nồng độ Imidazole 5mM để rửa gel Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Imidazole đệm rửa giải tinh protein N phương pháp sắc ký lực gắn gel Ni2+- IDA: Hình 3-7: Kết điện di SDS-PAGE khảo sát nồng độ Imidazole đệm rửa giải protein N tinh Imidazole có lực mạnh với Ni2+ Vì thế, sau rửa gel bổ sung Imidazole với nồng độ cao vào đệm rửa giải, Imidazole có khả xen vào liên kết Ni2+ protein N dẫn đến protein N bị rửa giải khỏi gel Tuy nhiên, nồng độ Imidazole cao ảnh hưởng đến mục đích sử dụng mẫu protein N tinh sau này; ngược lại nồng độ thấp không đẩy hết protein N khỏi gel Thí nghiệm tiến hành đẩy protein N gel với nồng độ Imidazole 50mM; 100mM; 200mM để kiểm tra khả đẩy nồng độ Theo kết điện di đo Bradford, nồng độ 100mM, Imidazole đẩy hầu hết protein N khỏi gel 41 SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS Nguyễn Thanh Hịa nồng độ khơng q cao dẫn đến thuận lợi cho việc loại bỏ Imidazole Vì thế, Imidazole chọn bổ sung vào đệm rửa giải nồng độ 100mM Phân tích mẫu tinh phần mềm ImageJ cho thấy độ đạt 94% đủ điều kiện để đem gây miễn dịch động vật thu kháng thể 3.3 Kết Western Blot kiểm tra protein N: Để khẳng định chắn băng protein có kích thước 48kDa protein N protein tinh protein N, thí nghiệm tiến hành phân tích phổ protein phương pháp Western Blot (WB) Kháng thể bậc sử dụng kháng thể chuột kháng protein N Kháng thể bậc kháng thể kháng Kháng thể kháng – kháng thể IgG chuột gắn AP Hình 3-8: Kết Western Blot màng nhuộm ink (A) sau dừng phản ứng chất nước deion (B).Đường chạy M: đường chạy thang chuẩn Protein; đường chạy 1: đường chạy mẫu protein thể tan thu từ E.coli BL21 (DE3) pET22b(+)::prN sau tối ưu biểu hiện; đường chạy 2: mẫu protein tinh sạch; đường chạy KC: mẫu protein thể tan E.coli BL21 (DE3) chứa pET22b(+) 42 SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS Nguyễn Thanh Hòa Kết phân tích WB cho thấy mẫu protein từ E.coli BL21(DE3) mang pET22b::prN xuất băng tín hiệu đậm có kích thước khoảng 48kDa mẫu protein từ E.coli BL21(DE3) chứa pET22b khơng có phản ứng Vậy khẳng định, protein thu sau thu nhận thể tan tinh protein N tái tổ hợp 3.4 Kết ELISA kiểm tra hoạt tính protein N tái tổ hợp: Để đánh giá hoạt tính protein N tái tổ hợp, thí nghiệm ELISA tiến hành song song với protein N thương mại hãng Medicon Biểu đồ 3-5: Kết ELISA đánh giá hoạt tính protein N tái tổ hợp so sánh với protein N thương mại hãng Medicon Thí nghiệm tiến hành coating loại protein N lên giếng ELISA, blocking sữa gầy 10%, hoạt tính kiểm tra với loại kháng thể: Kháng thể đơn dòng chuột kháng thể từ huyết người nhiễm bệnh Kháng thể bậc tương ứng kháng thể kháng kháng thể chuột kháng thể kháng kháng thể người gắn HRP, phản ứng chất TMB 15 phút Kết đo OD450nm cho thấy protein N tái tổ hợp cho phản ứng với mẫu kháng thể tương tự protein N thương mại Medicon Điều chứng tỏ protein N tái tổ hợp tinh giữ hoạt tính protein N tự nhiên 43 SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS Nguyễn Thanh Hòa CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận: Các kết nghiên cứu thu được: Protein N tái tổ hợp biểu tối ưu thể tan E.coli BL21 (DE3) với điều kiện: - tỷ lệ cấp giống theo thể tích 1% (v/v); - pH mơi trường 6,5; - thời gian nuôi cảm ứng giờ, nhiệt độ nuôi cảm ứng 37oC; - IPTG nồng độ cuối 0,1mM Ước tính hàm lượng protein N chiếm 30% tổng số protein thể tan Protein N tái tổ hợp tách chiết từ thể tan tinh sử dụng sắc ký lực với gel Ni2+-IDA, gắn protein đệm Tris-HCl 50mM pH 8,5; rửa protein không bám bám không đặc hiệu gel Imidazole 5mM Tris-HCl 50mM pH 8,5; rửa giải thu protein đích với Imidazole 100mM Tris-HCl 50mM pH 8,5 Độ 94% Protein N tái tổ hợp sau tinh giữ cấu trúc tương tự protein N tự nhiên, có hoạt tính tương đương với protein N thương mại 4.2 Kiến nghị: - Sử dụng protein N tái tổ hợp gây miễn dịch động vật thu kháng thể, đánh giá hoạt tính kháng thể thu - Sử dụng kháng thể đa dòng kháng protein N tái tổ hợp phát triển que thử nhanh kỹ thuật sắc ký miễn dịch 44 SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS Nguyễn Thanh Hịa PHỤ LỤC Mơi trường Lurian Beria (1 lít) Môi trường LB lỏng LB đặc Thành phần Nồng độ (g/l) Peptone 10 Yeast Extract NaCl 10 Peptone 10 Yeast Extract NaCl 10 Agar 20 Đệm ELISA Tên dung dịch Thành phần Nồng độ NaHCO3 0,795g NaHCO3 1,46g H2 O Điền đầy 500ml PBS 1X 50ml Sữa gầy 5% w/v PBS 1X 100ml Tween 0,05% Citrate pH 4,0 0,9ml TMB 0,01ml H2 O2 10 L Đệm phủ Đệm Blocking Washing Buffer Developing Buffer Đệm dung dịch phủ ản điện di protein: Tên dung dịch Dung dịch cố đinh Thành phần Nồng độ Ethanol 40% v/v Acetic acid 10% v/v H2 O Điền đầy 100ml 45 SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS Nguyễn Thanh Hòa Đệm Tris-Glycine 10X Tris-base 30,3 g/l Glycerine 144g/l SDS 10g/l Dung dịch nhuộm màu Coomassie Brillant Blue Ethanol 0,125% 40% Acetic acid 10% H2 O Điền đầy 50ml Đệm Western Blot Tên dung dịch Transfer Buffer PBS 10X Tris-base 3,03g Glycine 14,41g Methanol 200ml H2 O Điền đầy lít NaCl 80g KCl 2,0g Na2HPO4 14,4g KH2PO4 2,4g H2 O Điền đầy lít Washing Buffer PBS-T PBS 1X Blocking Buffer AP Buffer Nồng độ Thành phần 100ml Tween 20 0,1% PBS 1X 5ml Sữa gầy 5% Tris-base 12,11g NaCl 5,844g MgCl2.H2O 1,016g H2 O Điền đầy lít Bảng kết định lượng protein tổng số Bradford (tính cho ml dịch ni) qt ImageJ: a Tỷ lệ cấp giống 46 SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS Nguyễn Thanh Hòa % tỷ lệ cấp giống 0,5 10 15 20 7,3 5,9 5,8 5,8 5,8 0,88 1,50 1,47 1,27 1,34 1,24 0,053 0,110 0,086 0,074 0,078 0,072 % band 48kDa Tổng Protein Protein 48kDa b pH môi trường pH môi trường 5,5 6,5 7,5 8,0 8,5 0,64 0,5 0,85 0,74 0,71 0,63 0,57 7,91 7,85 6,58 7,14 7,68 7,7 0,051 0,035 0,067 0,049 0,051 0,048 0,044 Hàm lượng (mg) %Protein 48kDa Protein 48kDa c Thời gian nhiệt độ: 10oC 20h - 10 độ 24h - 10 độ C C 0,81 0,89 1,12 2,4 3,4 3,0 3,2 0,012 0,027 0,027 0,036 4h - 10 độ C 8h - 10 độ C 0,52 Hàm lượng Protein thể Tan(mg) % Protein 48kDa Protein 48kDa 25oC 47 SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS Nguyễn Thanh Hòa 20h - 25 độ 24h - 25 độ C C 0,74 1,05 1,28 5,2 6,2 4,0 4,0 0,025 0,046 0,042 0,051 4h - 37 độ C 8h - 37 độ C 20h - 37 độ 24h - 37 độ C C 0,78 1,02 1,10 0,94 10,2 7,2 4,0 2,6 0,080 0,074 0,044 0,025 4h - 25 độ C 8h - 25 độ C 0,48 48kDa Protein 48kDa Protein tổng (mg) % Protein 37oC Protein tổng(mg) % Protein 48kDa Protein 48kDa d Nồng độ IPTG: IPTG (µM) µM µM 10 µM 100 µM 1000 µM (mg) 1,05 0,903 0,967 0,985 0,917 % Band 2,6 3,6 5.1 10,1 7,6 0,041 0,049 0,05 0,0985 0,7 Protein tổng Protein 48kDa 48 SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366 Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS Nguyễn Thanh Hòa TÀI LIỆU THAM KHẢO: WHO, WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard 2022 Ong, S.W.X., et al., Clinical and Virological Features of SARS-CoV-2 Variants of Concern: A Retrospective Cohort Study Comparing B.1.1.7 (Alpha), B.1.315 (Beta), and B.1.617.2 (Delta) 2021, SSRN Ren, S.Y., et al., Omicron variant (B.1.1.529) of SARS-CoV-2: Mutation, infectivity, transmission, and vaccine resistance World J Clin Cases, 2022 10(1): p 1-11 Mohapatra, R.K., et al., The recently emerged BA.4 and BA.5 lineages of Omicron and their global health concerns amid the ongoing wave of COVID-19 pandemic - Correspondence Int J Surg, 2022 103: p 106698 Ban đạo phòng, c.d.C.- Báo cáo kết 02 năm triển khai cơng tác phịng, chống dịch COVID-19 2022 Ehre, C., SARS-CoV-2 Infection of Airway Cells 2020 383(10): p 969-969 Gitman, M.R., et al., Laboratory Diagnosis of SARS-CoV-2 Pneumonia 2021 11(7): p 1270 Bahrami, A and G.A.J.F.V Ferns, Genetic and pathogenic characterization of SARS-CoV-2: a review 2020 15(8): p 533-549 Chang, C.K., et al., Modular organization of SARS coronavirus nucleocapsid protein 2006, J Biomed Sci p 13, 59–72 10 Cubuk, J., et al., The SARS-CoV-2 nucleocapsid protein is dynamic, disordered, and phase separates with RNA Nature Communications, 2021 12(1): p 1936 11 Ye, Q., et al., Architecture and self‐assembly of the SARS‐CoV‐2 nucleocapsid protein 2020 29(9): p 1890-1901 12 Luo, H., et al., Carboxyl terminus of severe acute respiratory syndrome coronavirus nucleocapsid protein: self-association analysis and nucleic acid binding characterization 2006 45(39): p 11827-11835 13 Peng, Y., et al., Structures of the SARS‐CoV‐2 nucleocapsid and their perspectives for drug design 2020 39(20): p e105938 49 SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366 Đồ án tốt nghiệp 14 GVHD: TS Nguyễn Thanh Hòa Chen, C.-Y., et al., Structure of the SARS coronavirus nucleocapsid protein RNA-binding dimerization domain suggests a mechanism for helical packaging of viral RNA 2007 368(4): p 1075-1086 15 Takeda, M., et al., Solution structure of the c-terminal dimerization domain of SARS coronavirus nucleocapsid protein solved by the SAIL-NMR method 2008 380(4): p 608-622 16 Peng, T.Y., K.R Lee, and W.Y.J.T.F.j Tarn, Phosphorylation of the arginine/serine dipeptide‐rich motif of the severe acute respiratory syndrome coronavirus nucleocapsid protein modulates its multimerization, translation inhibitory activity and cellular localization 2008 275(16): p 4152-4163 17 Yu, I.-M., et al., Recombinant severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus nucleocapsid protein forms a dimer through its C-terminal domain 2005 280(24): p 23280-23286 18 Surjit, M., et al., The nucleocapsid protein of the SARS coronavirus is capable of self-association through a C-terminal 209 amino acid interaction domain 2004 317(4): p 1030-1036 19 He, R., et al., Analysis of multimerization of the SARS coronavirus nucleocapsid protein 2004 316(2): p 476-483 20 Surjit, M., et al., The severe acute respiratory syndrome coronavirus nucleocapsid protein is phosphorylated and localizes in the cytoplasm by 14-33-mediated translocation 2005 79(17): p 11476-11486 21 Chang, C.-k., et al., Transient oligomerization of the SARS-CoV N protein– implication for virus ribonucleoprotein packaging 2013 8(5): p e65045 22 Sethuraman, N., S.S Jeremiah, and A.J.J Ryo, Interpreting diagnostic tests for SARS-CoV-2 2020 323(22): p 2249-2251 23 Djukic, T., et al., Expression, purification and immunological characterization of recombinant nucleocapsid protein fragment from SARS-CoV-2 2021 557: p 15-22 24 Li, G., et al., Expression and purification of recombinant SARS-CoV-2 nucleocapsid protein in inclusion bodies and its application in serological detection 2021 186: p 105908 50 SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366 Đồ án tốt nghiệp 25 GVHD: TS Nguyễn Thanh Hòa Nowakowski, A.B., W.J Wobig, and D.H Petering, Native SDS-PAGE: high resolution electrophoretic separation of proteins with retention of native properties including bound metal ions Metallomics, 2014 6(5): p 1068-78 26 Bornhorst, J.A and J.J Falke, Purification of proteins using polyhistidine affinity tags Methods Enzymol, 2000 326: p 245-54 27 Kruger, N., The Bradford Method For Protein Quantitation 2002 p 15-21 28 Mahmood, T and P.C Yang, Western blot: technique, theory, and trouble shooting N Am J Med Sci, 2012 4(9): p 429-34 29 Aydin, S., A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA Peptides, 2015 72: p 415 30 Palmer, I and P.T Wingfield, Preparation and extraction of insoluble (inclusion-body) proteins from Escherichia coli Curr Protoc Protein Sci, 2004 Chapter 6: p Unit 6.3 51 SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366