Biểu hiện tinh chế gm csf granulocyte macrophage colony stimulating factor người tái tổ hợp từ nấm men và thử nghiệm hoạt tính in vitro

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM ĐẠI HỌC QUỐC GIA TPHCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu 31/8/2015 ) BIỂU HIỆN, TINH CHẾ GM-CSF (GRANULOCYTE-MACROPHAGE COLONY STIMULATING FACTOR) NGƢỜI TÁI TỔ HỢP TỪ NẤM MEN VÀ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH IN VITRO TRẦN VĂN HIẾU THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 8/2015 ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM ĐẠI HỌC QUỐC GIA TPHCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC BIỂU HIỆN, TINH CHẾ GM-CSF (GRANULOCYTE-MACROPHAGE COLONY STIMULATING FACTOR) NGƢỜI TÁI TỔ HỢP TỪ NẤM MEN VÀ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH IN VITRO TRẦN VĂN HIẾU Cơ quan chủ trì Chủ nhiệm đề tài Trần Văn Hiếu Cơ quan quản lý THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 9/2015 TĨM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Nhân tố kích thích tạo khóm bạch cầu hạt đại thực bào người tái tổ hợp (recombinant human Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor - rhGMCSF) glycoprotein Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) chấp thuận dùng điều trị suy giảm bạch cầu, ung thư bạch cầu hay kết hợp với hóa trị liệu ung thư rhGM-CSF sản xuất từ Saccharomyces cerevisiae (S cerevisiae) công nhận an tồn phù hợp với quy trình lên men cơng nghiệp Hiện nay, nấm men biến dưỡng methanol Pichia pastoris (P pastoris) lên chủng chủ thay so với S cerevisiaethìP pastoristhể nhiều ưu điểm vượt trội lên men nguồn carbon đơn giản 1C (methanol, methan), có khả tăng trưởng mật độ cao, tiết protein ngoại lai mạnh tạo sản phẩm đường hố sinh miễn dịch Trong nghiên cứu này, tiến hành tạo dòng, biểu hiện, tinh đánh giá hoạt tính rhGM-CSF quy mơ phịng thí nghiệm từ mức độ gen tới sản phẩm qua bước: tối ưu hoá gen mã hoá cho hGM-CSF để biểu tốt nấm men; tạo dòng chủng nấm men S cerevisiae BY4742 mang vector pYES2-hgmcsf Pichia pastoris X33::hgmcsfcó khả biểu rhGM-CSF dạng tiết điều hòa tương ứng promoter cảm ứng GAL1 AXO1; tiến hành lên men mẻ có bổ sung chất (fed-batch) 3,5 L môi trường với chất cảm ứng galactose hay methanol thời gian lên men 72-96 giờ; rhGM-CSF dạng tiết dịch lên men tinh thu nhận sắc ký trao đổi ion kị nước Kết cho thấy, so sánh hai chủng chủ nấm men lượng rhGM-CSF Pichia pastoris X33 tiết cao nhiều so với S cerevisiae BY4742 (7,7 so với mg protein tiết/OD600) Protein tái tổ hợp sau qua cột dung ly 5-20% 80-100% dịch dung ly tương ứng cho sắc ký trao đổi anion sắc ký kỵ nước Kết phân tích SDSPAGE Western blot với kháng thể đặc hiệu cho thấy rhGM-CSF thu có kích thước 30 đến 60 kDa tùy vào mức độ glycosyl hóa Các phân đoạn tinh có khả kích thích tăng sinh dịng tế bào sống phụ thuộc hGMCSF, TF-1 cho kết cao với mẫu tinh từ Pichia pastoris X33 Kết trình bày sở cho nghiên cứu sản xuất rhGM-CSF quy mô sản xuất I SUMMARY OF RESEARCH Recombinant human Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor (rhGMCSF) is an FDA approved therapeutic glycoprotein for the treatment of neutropenia and leukemia in combination with chemotherapies Recombinant hGM-CSF production in the baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae (S cerevisiae) is recognized as safe and is suitable for large-scale industrial fermentation processes Recently, methylotrophic yeast Pichia pastoris (P pastoris) is emerged as an alternative due to its one-carbon metabolism, shorter and less immunogenic glycosylated productions; higher cell density growth and higher foreign protein secretion than those of S cerevisiae In this study, we present the cloning, expression, fermentation, purification and bioactivity evaluation of hGM-CSF at laboratory scale from gene to product of both yeasts P pastoris and S cerevisiae: yeast-biased codon optimization; cloning of S cerevisiae BY4742 haboring pYES2hgmcsf and Pichia pastoris X33::hgmcsf able to express secretive rhGM-CSF under the control of inducible promoter GAL1 and AXO1, respectively; fed-batch fermentation in 3.5 liter medium supplemented with methanol or galactose over 7296 hours and purification of secreted rhGM-CSF by ion exchange (IEX) and hydrophobic interaction chromatography (HIC) Comparison between two yeasts, recombinant rhGM-CSF was highly secreted in P pastoris (7.7 vs mg total secreted protein/OD600) The protein was eluted at to 20 % or 80 to 100 % of elution buffer for IEX or HIC, respectively SDS-PAGE and Western blot probed with a specific antibodyshowed purified rhGM-CSF species of molecular weights ranging from 30 to more than 60 kDa (dependent upon glycosylation status) and IEX gave higher purity and recovery yield to those of HIC These purified rhGMCSF fractions were able to stimulate the proliferation of an rhGM-CSF dependent cell line TF-1, with the highest stimulation from P pastoris derived product The presented data provides further supportive evidence for large scale production of the protein II MỤC LỤC Trang TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU I MỤC LỤC III DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VI DANH SÁCH CÁC BẢNG VII DANH SÁCH CÁC HÌNH ẢNH VIII QUYẾT TỐN KINH PHÍ X PHẦN MỞ ĐẦU CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh giảm bạch cầu hạt sau hóa/xạ trị 1.2 GM-CSF 1.2.1 Vai trị GM-CSF q trình tạo tế bào máu dòng tủy 1.2.2 Cấu trúc phân tử GM-CSF .9 1.2.3 Hoạt tính sinh học phương pháp xác định hoạt tính GM-CSF 11 1.3 Các hệ thống biểu protein tái tổ hợp cho GM-CSF 12 1.3.1 Hệ thống Escherichia coli 12 1.3.2 Hệ thống tế bào động vật hữu nhũ 13 1.3.3 Hệ thống nấm men 13 1.4 GM-CSF tái tổ hợp thƣơng mại tình hình nghiên cứu Việt Nam 14 1.4.1 GM-CSF tái tổ hợp thương mại .14 1.4.2 Tình hình nghiên cứu GM-CSF Việt Nam 15 CHƢƠNG II NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 17 2.1 Nội dung 1: Phân lập dịng gen mã hóa GM-CSF ngƣời 17 2.1.1 Thiết kế gen mã hóa GM-CSF thay đổi codon .17 2.1.2 Phân lập dòng E coli mang gen hgmcsf biểu P pastoris .17 2.1.3 Phân lập dòng E coli mang gen hgmcsf biểu S cerevisiae 26 2.2 Nội dung 2: Phân lập dòng nấm men P pastoris tổng hợp tiết GMCSF ngoại bào .34 III 2.2.1 Tạo dòng P pastoris X33 mang plasmid tái tổ hợp pPICZαA/hGM-CSF 34 2.2.2 Kiểm tra khả biểu protein hGM-CSF dạng tiết môi trường chủng P pastoris X33::hgmcsf 38 2.2.3 Lên men thu nhận protein hGM-CSF quy mô 3500 mL 43 2.3 Nội dung 3: Phân lập dòng nấm men S cerevisiae tổng hợp tiết GMCSF ngoại bào .48 2.3.1 Tạo dòng S cerevisiae BY4742 mang plasmid pYES2-hgmcsf 48 2.3.2 Kiểm tra khả biểu hGM-CSF S cerevisiae BY4742/pYES2-hgmcsf 52 2.3.3 Lên men thu nhận protein hGM-CSF quy mô 3500 mL 54 2.4 Nội dung 4: Nghiên cứu phƣơng pháp thu nhận GM-CSF đƣợc tổng hợp tiết ngoại bào nấm men P pastoris S cerevisiae .59 2.4.1 Thu nhận GM-CSF tổng hợp tiết ngoại bào nấm men P pastoris .59 2.4.2 Thu nhận GM-CSF tổng hợp tiết ngoại bào nấm men S cerevisiae 60 2.5 Nội dung 5: Bƣớc đầu tinh GM-CSF qui mơ phịng thí nghiệm 61 2.5.1 Tinh hGM-CSF từ sản phẩm lên men chủng P pastoris X33::hgmcsf 61 2.5.2 Tinh hGM-CSF từ sản phẩm lên men chủng S cerevisiae BY4742/hgmcsf 62 2.6 Nội dung 6: Đánh giá chất lƣợng GM-CSF .64 2.6.1 Đánh giá mức độ tinh khiết hGM-CSF sau tinh 64 2.6.2 Đánh giá hoạt tính hGM-CSF sau tinh 64 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 67 3.1 Nội dung 1: Phân lập dòng gen mã hóa GM-CSF ngƣời 67 3.1.1 Thiết kế gen mã hóa GM-CSF thay đổi codon .67 3.1.2 Phân lập dòng E coli mang gen hgmcsf biểu P pastoris S cerevisiae 70 3.2 Nội dung 2: Phân lập dòng nấm men P pastoris tổng hợp tiết GMCSF ngoại bào .81 IV 3.2.1 Tạo dòng P pastoris X33 mang plasmid tái tổ hợp pPICZαA/hGM-CSF 81 3.2.2 Kiểm tra khả biểu protein hGM-CSF dạng tiết môi trường chủng P pastoris X33::hgmcsf 84 3.2.3 Lên men thu nhận protein hGM-CSF quy mô 3500 mL 86 3.3 Nội dung 3: Phân lập dòng nấm men S cerevisiae tổng hợp tiết GMCSF ngoại bào .88 3.3.1 Tạo dòng S cerevisiae BY4742 mang plasmid tái tổ hợp pYES2-hgmcsf 88 3.3.2 Kiểm tra khả biểu protein hGM-CSF S cerevisiae BY4742/pYES2-hgmcsf 90 3.3.3 Lên men thu nhận protein hGM-CSF quy mô 3500 mL 92 3.4 Nội dung 4: Nghiên cứu phƣơng pháp thu nhận GM-CSF đƣợc tổng hợp tiết ngoại bào nấm men P pastoris S cerevisiae .95 3.4.1 Thu nhận GM-CSF tổng hợp tiết ngoại bào P pastoris 95 3.4.2 Thu nhận GM-CSF tổng hợp tiết ngoại bào S cerevisiae 96 Nội dung 5: Bƣớc đầu tinh hGM-CSF qui mơ phịng thí nghiệm 97 3.5.1 Tinh hGM-CSF từ sản phẩm lên men chủng P pastoris X33::hgmcsf 97 3.5.2 Tinh hGM-CSF từ sản phẩm lên men chủng S cerevisiae BY4742/hgmcsf 99 3.6 Nội dung 6: Đánh giá chất lƣợng hGM-CSF sau tinh 102 3.6.1 Đánh giá mức độ tinh khiết hGM-CSF sau tinh 102 3.6.2 Đánh giá hoạt tính hGM-CSF sau tinh 105 3.7 So sánh hiệu biểu hGM-CSF từ P pastoris S cerevisiae 110 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 112 4.1 Kết luận .112 4.2 Đề nghị 113 PHỤ LỤC .114 TÀI LIỆU THAM KHẢO 11824 V DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾTTẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIỆT α-MF α-mating factor bp base pair CSF Colony stimulating factor DNA Deoxyribose Nucleic Acid DTT Dithiothreitol dH2O distilled water (nước cất) dNTP deoxyNucleotide TriPhosphate E coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine TetraAcetic acid G-CSF Granulocyte colony stimulating factor GM-CSF Granulocyte-Macrophage colony stimulating factor gmcsf Gen mã hoá cho protein GM-CSF GMR Thụ thể protein GM-CSF (GM-CSF receptor) HRP Horseradish Peroxidase IL-1 Interleukine-1 IL-3 Interleukine-3 kDa kilo Dalton LB Môi trường Luria-Bertani MCS Multiple Cloning Site Mut- Methanol utilization minus Mut+ Methanol utilization plus MutS Methanol utilization Slow OD Optical Density (Mật độ quang) PBST Phosphate Buffered Saline Tween PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribose Nucleic Acid RNase Enzyme thuỷ giải RNA SDS Sodium Dodecyl Sulphate TEMED N, N, N’, N’- Tetramethylethylene Diamine WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) VI DANH SÁCH CÁC BẢNG SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG 3.1 Tính tốn hiệu suất thu hồi protein từ dịch lên men sau lọc tiếp tuyến 95 3.2 Hiệu suất thu hồi protein từ dịch lên men tủa 75% ammonium sulfate bão hịa 95 3.3 Tính tốn hiệu suất thu hồi protein từ dịch lên men sau lọc tiếp tuyến 96 3.4 Hiệu suất tinh hGM-CSF sắc ký kỵ nước 102 3.5 Hiệu suất tinh hGM-CSF sắc ký trao đổi anion 103 3.6 Hiệu suất tinh hGM-CSF sắc ký kỵ nước 104 3.7 Hiệu suất tinh hGM-CSF sắc ký trao đổi anion 105 3.8 Kết xác định hoạt tính mẫu GM-CSF 108 3.9 Bảng kết xác định hoạt tính mẫu GM-CSF 110 VII DANH SÁCH CÁC HÌNH ẢNH SỐ TÊN HÌNH ẢNH TRANG 1.1 Vai trị GM-CSF q trình hình thành tế bào máu dòng tủy 1.2 Cấu trúc phân tử GM-CSF 10 2.1 Sơ đồ tạo plasmid tái tổ hợp pYES2-hgmcsf 29 2.2 Các thang phân tử lượng 40 2.3 Thứ tự thành phần chuyển protein lên màng lai 42 3.1 Kết gióng cột trình tự GM-CSF người cơng bố 67 3.2 Kết gióng cộtcác trình tự GM-CSF đại diện với trình tự GM-CSF thuốc Leukine 67 3.3 Tần số xuất codon tương ứng với trình tự trước tối ưu (A) sau tối ưu (B) theo bảng mã ưu tiên sử dụng P pastoris S cerevisiae 68 3.4 Kết phân tích cắt giới hạn trình tự trước tối ưu (A) sau tối ưu (B) 69 3.5 Thu nhận genehgmcsf kỹ thuật PCR 70 3.6 Thu nhận pPICZαA 71 3.7 Kết biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E coli DH5α 72 3.8 Sàng lọc thể biến nạp kỹ thuật PCR khuẩn lạc 73 3.9 Kiểm tra plasmid pPICZαA tái tổ hợp kỹ thuật PCR cắt giới hạn 74 3.10 Thu nhận gen hgmcsf kỹ thuật PCR 76 3.11 Kết cắt plasmid pYES2 cặp enzyme cắt giới hạn EcoRI/NotI 77 3.12 Sàng lọc thể biến nạp E coli DH5α môi trường LBampicillin 78 3.13 Sàng lọc thể biến nạp DH5α mang gen hgmcsf kỹ thuật PCR khuẩn lạc 79 3.14 Kết kiểm tra thể biến nạp DH5α mang plasmid tái tổ hợp enzyme cắt giới hạn 80 3.15 Sàng lọc thể biến nạp P pastoris X33 chứa gene hgmcsf 81 3.16 Kiểm tra kiểu hình thể biến nạp 82 VIII Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học Chương III Kết thảo luận Bảng 10 So sánh hiệu biểu P pastoris S cerevisiae P pastoris S cerevisiae 135 32 31,15 7,0 11,8 x 106 0,036 x 106 OD sau 72h lên men Lƣợng protein tiết/OD(g) Hoạt tính/mg protein 111 Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học Chương IV Kết luận đề nghị CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Nội dung 1: Phân lập dịng gen mã hóa GM-CSF ngƣời Từ thông tin tham khảo ngân hàng gen hiểu biết trình tối ưu hoá codon chủng vi sinh vật, đề tài thiết kế in silico gen mã hoá cho GM-CSF người dựa phiên thuốc Leukine Gen sử dụng làm khuôn để chuyển vào hai vector có khả biểu hai chủng nấm men P pastoris S cerevisiae Vector tái tổ hợp kiểm chứng PCR khuẩn lạc, cắt RE giải trình tự (phụ lục 1) Nội dung 2: Phân lập dòng nấm men P pastoris tổng hợp tiết GM-CSF ngoại bào Chủng nấm men tái tổ hợp P pastorismang gen mã hoá cho GM-CSF kiểm chứng khả biểu thông qua SDS-PAGE lai với kháng thể đặc hiệu Nội dung 3: Phân lập dòng nấm men S cerevisiae tổng hợp tiết GMCSF ngoại bào Chủng nấm men tái tổ hợp S cerevisiaemang gen mã hoá cho GM-CSF kiểm chứng khả biểu thông qua SDS-PAGE lai với kháng thể đặc hiệu Nội dung 4: Nghiên cứu phƣơng pháp thu nhận GM-CSF đƣợc tổng hợp tiết ngoại bào nấm men P pastoris S cerevisiae Dịch lên men từ hai chủng tái tổ hợpP pastoris S cerevisiae thu nhận cô đặc Phương pháp lọc tiếp tuyến cho hiệu cô đặc tốt Nội dung 5: Bƣớc đầu tinh chế GM-CSF qui mơ phịng thí nghiệm Thực hai phương pháp sắc ký trao đổi ion kỵ nước để tinh GMCSF từ dịch cô đặc phương pháp sắc ký trao đổi anion cho độ tinh cao 112 Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học Chương IV Kết luận đề nghị hiệu suất thu hồi cao so với sắc kí kỵ nước hai mẫu dịch lên men cô đặc từ P pastorisvàS cerevisiae Nội dung 6: Đánh giá chất lƣợng GM-CSF Mẫu GM-CSF tinh từ P pastorisvàS cerevisiaecó khả kích thích tăng sinh tế bào sống phụ thuộc GM-CSF TF-1 mẫu tinh từ P pastorischo hoạt tính cao mẫu từ S cerevisiae 4.2 Đề nghị Với kết đạt từ đề tài, nhóm nghiên cứu có kiến nghị sau: Với việc sử dụng gen có nguồn gốc từ người cần thực q trình tối ưu hố codon sử dụng hệ thống biểu tương ứng để tránh sản phẩm tái tổ hợp không biểu hay biểu Sử dụng chủng P pastoris làm chủng chủ biểu cho GM-CSF nói riêng protein cần đường hố nói chung thay cho S cerevisiae tốc độ tăng trưởng cao, hiệu suất biểu cao, mức độ glycosyl hoá vừa phải Để tăng tối đa mức độ đồng đường hố nên sử dụng chủng P pastoris đột biến có mang gen mã hố cho q trình đường hố từ người (ví dụ P pastoris SuperMan5) Ngồi ra, xuất phát từ tình hình thực tế thuốc Leukine hết hạn quyền vào tháng 12/2017, giá thành thuốc ngoại nhập cao (lên tới 4,3 triệu đồng/liều tiêm cần tiêm nhiều liều), tạo thêm lựa chọn sản phẩm điều trị cho bệnh nhân với kết nghiên cứu bước đầu nhóm cho thấy nhóm nắm làm chủ cơng nghệ để biểu hGM-CSF (thành phần hoạt tính thuốc Leukine) với lượng lớn, độ tinh cao có hoạt tính cao gấp lần so với thuốc Leukine nên khả phát triển tiếp tục thành thuốc hồn tồn khả thi Vì vậy, nhóm mạnh dạn đề xuất với Sở Khoa học Công nghệ TPHCM tiếp tục đầu tư giai đoạn để nhóm hồn thiện quy trình nhằm hướng tới việc sản xuất thuốc phục vụ cho nhu cầu hỗ trợ điều trị cho bệnh nhân ung thư Việt Nam 113 Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học Tài liệu tham khảo PHỤ LỤC Phụ lục Trình tự mã hố hGM-CSF trước (M11220 hGM) sau tối ưu (Codon optimization) kết giải trình tự từ vector biểu P pastoris (Clone11) S cerevisiae (Clone A3-45) 114 Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học 115 Tài liệu tham khảo Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học Tài liệu tham khảo Phụ lục 2.Bảng ghi nhận kết lên men mẻ có bổ sung chất chủng S cerevisiae BY4742/pYES2-hgmcsf Ký hiệu mẫu T (giờ) [DCW] (g/L) OD595 [protein ] (mg/L) VLM (L) Protein tổng (mg) OD600 S501 1,87 0,427 0,175 41,24 3,18 131,14 S502 0,77 0,628 0,293 69,05 3,18 214,34 S503 3,63 3,400 0,272 64,10 3,18 203,85 S504 12 6,33 6,080 0,309 72,82 3,18 231,58 S505 16 5,57 8,000 0,272 64,10 3,18 203,85 S506 20 7,87 12,600 0,371 87,44 3,18 278,05 S507 24 10,50 18,200 0,369 86,96 3,18 276,55 S508 28 13,40 23,200 0,353 83,19 3,21 266,78 S509 32 15,03 28,100 0,346 81,54 3,23 263,68 S510 36 14,80 34,000 0,306 72,12 3,26 235,13 S511 40 15,47 35,500 0,345 81,31 3,29 267,27 S512 44 16,40 32,000 0,318 74,94 3,31 285,08 S513 48 17,30 32,000 0,305 71,88 3,34 240,14 S514 52 16,87 29,000 0,290 68,34 3,37 230,16 S515 56 16,20 31,800 0,341 80,36 3,39 272,79 S516 60 16,60 30,000 0,309 72,82 3,42 249,14 S517 64 17,00 37,000 0,268 63,16 3,45 217,77 S518 68 15,60 30,700 0,332 78,24 3,47 271,88 S519 72 17,40 32,000 0,272 64,10 3,50 224,35 Chú thích: T: thời gian lên men; [DCW]: khối lượng sinh khối khô (g) L dịch lên men; [protein]: nồng độ protein; VLM: tổng thể tích dịch lên men 116 Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học Tài liệu tham khảo Phụ lục 3.Bảng ghi nhận kết lên men mẻ có bổ sung chất chủng P pastoris X33::hgmcsf Ký hiệu mẫu T [DCW] (g/L) (giờ) OD600 OD550 [protein] (mg/L) P501 4,20 0,370 0,215 6,111 P502 3,47 1,060 0,214 8,034 P503 3,73 2,160 0,219 1,583 P504 12 6,80 4,920 0,216 4,187 P505 16 10,27 14,600 0,242 45,819 P506 20 21,03 32,000 0,228 18,892 P507 24 31,07 43,200 0,227 16,969 P508 28 40,57 69,200 0,246 53,512 P509 32 45,00 73,000 0,273 105,441 P510 36 43,87 71,200 0,266 91,978 P511 40 40,90 66,400 0,287 132,367 P512 44 42,80 72,000 0,287 132,367 P513 48 44,33 77,000 0,284 126,597 P514 52 50,27 82,400 0,221 54,293 P515 56 58,93 100,000 0,231 246,623 P516 60 65,17 118,200 0,226 150,458 P517 64 62,90 126,800 0,236 342,788 P518 68 77,60 134,000 0,233 285,089 P519 72 79,90 134,600 0,233 285,089 P520 76 85,63 147,200 0,250 612,050 P521 80 89,87 153,800 0,249 592,817 P522 84 93,30 150,600 0,267 939,011 P523 88 115,20 158,800 0,255 708,215 P524 92 97,00 154,200 0,271 1015,943 P525 96 69,97 156,000 0,281 1208,273 Chú thích: T: thời gian lên men; [DCW]: khối lượng sinh khối khô (g) L dịch lên men; [protein]: nồng độ protein; VLM: tổng thể tích dịch lên men 117 Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học Tài liệu tham khảo Phụ lục Kết xác định thơng số hoạt tính Pp EXC 20% Pp HIC 10% Sc EXC 10% Sc crude Pp crude Bottom 0,2206 0,2033 0,2013 0,1368 0,1387 Top 0,4805 0,519 0,6947 0,1899 0,2014 LogEC50 1,927 2,298 4,445 4,571 3,273 HillSlope 2,123 2,149 1,373 1,368 1,276 EC50 84,46 198,7 27880 37238 1876 Span 0,2599 0,3157 0,4934 0,05307 0,06267 Bottom 0,005292 0,004466 0,003276 0,000909 0,002278 Top 0,004313 0,004449 0,006439 0,001624 0,002163 LogEC50 0,07261 0,01914 0,02075 0,05953 0,06031 HillSlope 0,3668 1,169 0,1076 0,2097 0,3496 Span 0,006865 0,006899 0,007858 0,001951 0,00363 Phụ lục Kết phân tích Quantity One mẫu trước sau tinh chế kị nước chủng P pastoris X33::hgmcsf 118 Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học Tài liệu tham khảo Phụ lục 6.Kết phân tích ImageJmẫu tinh chế trao đổi anion chủngP pastorisX33::hgmcsf Giếng Giếng 119 Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học Tài liệu tham khảo Phụ lục Kết phân tích ImageJmẫu tinh chế kỵ nước chủngS cerevisiae BY4742/hgmcsf Giếng 11 Giếng 15 120 Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học Tài liệu tham khảo Phụ lục Kết phân tích ImageJmẫu tinh chế trao đổi anion chủngS cerevisiae BY4742/hgmcsf Giếng Giếng 121 Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học Giếng6 122 Tài liệu tham khảo Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học Tài liệu tham khảo TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Abbas A.K., et al., Cellular and molecular immunology, Saunders, 2010 [2] Dale D.C., The discovery, development and clinical applications of granulocyte colony-stimulating factor, Transactions of the American Clinical and Climatological Association, 1998, 109: 27-36 [3] Enzler T., et al., Granulocyte–macrophage colony stimulating factor, in: The Cytokine Handbook, Elsevier Science, 2003, 1: 503-514 [4] Kitamura T., et al., Establishment and characterization of a unique human cell line that proliferates dependently on GM‐CSF, IL‐3, or erythropoietin, Journal of Cellular Physiology, 1989, 140: 323-334 [5] Loudon P.T., et al., GM-CSF Increases Mucosal and Systemic Immunogenicity of an H1N1 Influenza DNA Vaccine Administered into the Epidermis of Non-Human Primates, PLoS ONE, 2010, 5: e11021 [6] Lyman G.H., Risks and consequences of chemotherapy-induced neutropenia, Clinical Cornerstone, 2006, 8: S12-S18 [7] Moonen P., et al., Increased biological activity of deglycosylated recombinant human granulocyte/macrophage colony-stimulating factor produced by yeast or animal cells, Proceedings of the National Academy of Sciences, 1987, 84: 4428-4431 [8] Muller C.E., et al., Relationships of cytokine (GM-CSF) serum concentration to blood cell count and the inflammatory parameters in children with malignant diseases, Pediatric Hematology and Oncology, 1999, 16: 509-518 [9] Schwartzberg L.S., Neutropenia: etiology and pathogenesis, Clinical cornerstone, 2006, 8: S5-S11 [10] Shurin M.R., et al., Dendritic Cells In Cancer, Springer, 2009 [11] Barouch D.H., et al., Potent CD4+ T cell responses elicited by a bicistronic HIV-1 DNA vaccine expressing gp120 and GM-CSF, Journal of Immunology, 2002, 168: 562-568 [12] Benavides L.C., et al., Comparison of different HER2/neu vaccines in adjuvant breast cancer trials: implications for dosing of peptide vaccines, Expert review of vaccines, 2011, 10: 201-210 [13] Bhatacharya P., et al., Production and purification of recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) from high cell density cultures of Pichia pastoris, Bioprocess and biosystems engineering, 2007, 30: 305-312 [14] Cebon J., et al., Granulocyte-macrophage colony stimulating factor from human lymphocytes The effect of glycosylation on receptor binding and biological activity, Journal of Biological Chemistry, 1990, 265: 4483-4491 123 Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học Tài liệu tham khảo [15] Ghosh P.K., et al., Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: The protein and its current & emerging applications, Indian Journal of Biotechnology, 2007, 6: 435–441 [16] Hamilton J.A., et al., GM-CSF Biology, Growth factors (Chur, Switzerland), 2004, 22: 225-231 [17] Ishii N., et al., Immunologic characterization of HIV-specific DNA vaccine, Journal of Investigative Dermatology Symposium Proceedings, 2001, 6: 7680 [18] Izquierdo M.A., et al., Effects of PIXY321, a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin fusion protein, on human tumor colony-forming units taken directly from patients, Clinical Cancer Research, 1996, 2: 1713-1716 [19] Jones T., et al., Potential role of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor as vaccine adjuvant, European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases, 1994, 13 Suppl 2: S47-S53 [20] Korzenik J.R., et al., Sargramostim for active Crohn's disease, New England Journal of Medicine, 2005, 352: 2193-2201 [21] Libby R.T., et al., Expression and purification of native human granulocytemacrophage colony-stimulating factor from an Escherichia coli secretion vector, Dna, 1987, 6: 221-229 [22] Miyajima A., et al., Expression of murine and human granulocytemacrophage colony-stimulating factors in S cerevisiae: mutagenesis of the potential glycosylation sites, EMBO Journal, 1986, 5: 1193-1197 [23] Nambiar J.K., et al., Modulation of pulmonary DC function by vaccineencoded GM-CSF enhances protective immunity against Mycobacterium tuberculosis infection, European journal of immunology, 2010, 40: 153-161 [24] Operschall E., et al., Enhanced protection against viral infection by coadministration of plasmid DNA coding for viral antigen and cytokines in mice, Journal of Clinical Virology, 1999, 13: 17-27 [25] Parker S.E., et al., Safety of a GM-CSF adjuvant-plasmid DNA malaria vaccine, Gene therapy, 2001, 8: 1011-1023 [26] Sasaki M., et al., Efficacy of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) as a vaccine adjuvant for hepatitis B virus in patients with HIV infection, Vaccine, 2003, 21: 4545-4549 [27] Schrimsher J.L., et al., Characterization of human and mouse granulocytemacrophage-colony-stimulating factors derived from Escherichia coli, Biochemical Journal, 1987, 247: 195-199 [28] Senzer N.N., et al., Phase II clinical trial of a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-encoding, second-generation oncolytic herpesvirus in patients with unresectable metastatic melanoma, Journal of Clinical Oncology, 2009, 27: 5763-5771 124 Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học Tài liệu tham khảo [29] Shu C.H., et al., Kinetics of continuous GM-CSF production by recombinant Saccharomyces cerevisiae in an airlift bioreactor, Journal of biotechnology, 1996, 48: 107-116 [30] Singh N.P., et al., Efficacy of GM-CSF as an adjuvant to hepatitis B vaccination in patients with chronic renal failure results of a prospective, randomized trial, Renal failure, 2003, 25: 255-266 [31] Sonpavde G., et al., Emerging Vaccine Therapy Approaches for Prostate Cancer, Reviews in Urology, 2010, 12: 25-34 [32] Wingfield P., et al., The conformation and stability of recombinant-derived granulocyte-macrophage colony stimulating factors, European Journal of Biochemistry, 1988, 173: 65-72 [33] Yang S.T., et al., Kinetics and stability of GM-CSF production by recombinant yeast cells immobilized in a fibrous-bed bioreactor, Biotechnology progress, 1996, 12: 449-456 [34] RxList - The Internet Drug Index http://www.rxlist.com/leukine-drug.htm 125