2.J979gd
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO |
TRUONG DAI HOC SU PHAM TP HO CHi MINH KHOA SINH eS ogy (NAD VAN, TOT AGHIEP SRT Đề Tài :
PHAN LAP VA TUYEN CHỌN | CHUNG NAM MEN THiCH HOP
CHO QUA TRINH LEN MEN | ĐỒ UỐNG TỪ TINH BỘT ~ =
Cán bộ hướng dẫn : Th.S TRẦN THANH THỦY |
Sinh viên thực hiện : ÑGUYỄNW THỊ THƯƠNG HUYEN -
Trang 2
Loi Cam Ou
Con xin thành kính tỏ lòng biết ơn bố mẹ đã động viên an ủi và là chỗ dựa tỉnh thần cũng như vật chất cho con có điều kiện hoàn thành
tốt luận văn này
Em xin trân trọng cẩm ơn cô Trần Thanh Thủy -cán bộ giảng
dạy bộ môn VỊ Sinh , khoa Sinh lọc trường Đại lọc Sự phạm Thanh
Phố Hồ Chí Minh đã hết lòng hướng dẫn và truyền đạt cho em nhiều
kiến thức quý báu trong suốt quá trình thực hiện luận văn này
Em chân thành cảm ơn các thầy cô khoa Sinh học,các thầy cô
phòng thí nghiệm Sinh hóa — VI sinh — Sinh lí thực và nhà trường đá tận tâm giảng dạy và giúp đỡ em hoàn thành khóa học một cách tốt đẹp
Em xin cảm ơn chị Phạm Thị Hồng Tươi và bạn Thái Kế Quân -
khoa Vì Sinh- Sinh học phân Tử trường ĐHKHTN đã đóng góp nhiều ý
kiến, giúp đỡ và động viên em trong suốt thời gian làm luận văn
Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của Viện Sinh học Nhiệt
đới Miền Nam , cùng các bạn đồng môn
Sinh viên:NGUYÊN THỊ THƯƠNG HUYÊỀN
Trang 3Trang
Đặt vấn đề - HH HH TT ng kg ngờ, l
Phần 1: Tổng quan tài liệu 5 sex SE 2c csczceở 2 I Sơ lược về đồ uống lên men - 2s s6 S3 5888 ezSzszz s2 2
lds DDT WONG quang nàgi tvSïHGIGIGIATGSSISUSAvISQQ48S4430038588 2 [ge ORR, mencrmenncsnll nese celle 2
1.3, DAC GiEM Seo 2
1.4 Nguyên liệu sản xuất đồ uống lên men 3
II Một số đặc tính của tế bào nấm men - sec se s22 4
2.1 Đặc điểm hình thái và kích thước . ‹: 4
2.2 Đặc điểm cấu tạo tế bào: . -.ccccc sec ccea 5 2.3, Đic GIẾT SÌNH BỮT ssvasesageatszssttotaooosfo000ssnsauyan 6
2.4 Sinh trưởng và phát triỂn se se v 2k serkes 7
III Các biến đối xắy ra trong quá trình lên men 8
3.1 EỊHH HEHTE, óascc<020800GU058GRãGG3lNutea 8
322 CWO 2181 G08 tieccnncaannnnnanmmnmarnmnceaw 8 3.3 Các nhóm vi sinh vật chính
tham gia vào quá trình lên men 9
IV Ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình
sinh trưởng, phát triển và lên men của nấm men 11
ALL NAIC dO occ ceeeeeseseecenesnaneeseeeeeneneeenseeeeeseneaees II 42.ĐộpH _ c.cccvccee II ÓC sodaadndatoerditdACdiN31Vi008660050160000955090033909N93034 12 4.4 Thành phần môi trường - -5<<s<+s<<s2 12 V, Vai trò của nấm men trong công nghiệp lên men thực phẩm 13 Phần 2 : Vật liệu và phương pháp nghiên cứu - 15 L, Vat ——— 15
1.1 Nguồn phân lập .- ¿- ©6552 2x cecvereeeees 15
12 n0 1001 THÔI HẨHÐ tot GGIIAGIGHGGGGIEiauig 15
Trang 4L1 t<ng và phưitliygr NHÀ tusereoasreaeioeatindyoonlndlt9401604310666863v054 18 2.1 Phương pháp phân lập, làm thuần - «- 18
2.2 Phương pháp nghiên cứu các đặc điểm hình thai 19
2.3 Phương pháp phát hiện khả năng lên mcn 22 2.4 Phương pháp xác định khả năng
lên men các loại đường cày 23
2.5 Khảo sát sự tăng sinh khối của nấm men
bằng phương pháp đo mật độ quang 25
2.6 Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự tăng
sinh khối của các chủng nấm men 26
2.7Ảnh hưởng đến nhiệt độ môi trường đến sự tăng
sinh khối của các chủng nấm men 27
2.8 Xác định khả năng tạo hương thơm 27
2.9 Bảo quản chủng đã tuyển chọn 27
Phần 3z Ktdua và biỂT HẠT gausseauegodgesgeoaiddiiaediidsaetdadgoridis a
3.1 Phan lap va sơ tuyển các chủng nấm men 29
3.1.1 Phân lập s©2-ceee+vrvsetrseesrrveerre 29
3.1.2 Sơ tuyển các chuẩn dựa trên khả năng lê men rượu tối
KT Ít syngyvsvigbrgntgttgy0E0i1600xtgtitttrret0u00020/000730900007402709/072001010500000190 29
3.1.3 Khảo sát tốc độ lên men qua sự thải CO; 30 3.1.4 Khảo sát khả năng tạo hương thơm của
của các chủng nấm men: <5 32 3.1.5 Nghiên cứu các đặc điểm hình thái cia nấm men 33
3.2 Khả năng lên men các loại đường a]
3.3Khảo sát khả năng tăng sinh khối của các chúng 38
3.4 Ảnh hưởng của pH của môi trường đến
khả năng tăng sinh khối của nấm men 43
3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường đến
khả năng tăng sinh khối 47 3.6 Bảo quản giống nấm men - 5 +++x++<+2 5] PhẩnIV Kết luận và để nghị . - 5555 S +22 £zvezzeezrerzke 52
đIKếIMUẨN scones 52
UP PHO -—- nưyyugnemrssrrernaintstvanrrravaaaeniinvigareuarntoeaww 53
Trang 5Luan Oan C2ốt ((giiệp CBIMOD :Fh.S Frain Thanh Fhaiy
BAT OAN BE
ừ ngàn xưa, thế giới vi sinh vật nhỏ bé sống quanh ta vốn đã có mối
Ề quan hệ mật thiết, gắn bó với con người Khi ấy, dù chưa hiểu nấm
men là gì nhưng họ đã biết sử dụng chúng để tạo ra những sản phẩm cho đời sống như : rượu, bia, cồn, rượu vang, nước giải khát lên men, v v Dân dần, sự tiến bộ của khoa học và kỹ thuật ngày càng cho phép con người
hiểu rõ giá trị dinh dưỡng và hiệu quả kinh tế lớn lao của các sản phẩm này,
khiến giờ đây chúng có mặt ở hầu khắp các nước trên hành tinh và chất lượng không ngừng được hoàn thiện Trên thế giới, nếu chỉ xét riêng các đồ uống lên men có nguồn gốc từ tinh bột đã có số lượng và chủng lọai phong phú vô cùng Mỗi quốc gia, mỗi dân tộc tùy nguồn nguyên liệu có sẵn, tùy phong tục tập quán khác nhau đã tạo cho mình một loại đồ uống đặc trưng mang đậm phong cách truyền thống Bouza, một lọai đồ uống của Ai Cập được chế biến từ lúa mì Kvass, nước uống truyền thống của Nga làm từ malt đại mạch
Chicha, sản phẩm lên men từ ngô ở châu Mỹ La Tinh Ở Nhật có rượu Sakẻ
nổi tiếng, ở Trung Quốc có Shaosing Chu, ở Philippin có Basi, ở Việt Nam có
rượu nếp, rượu cần đều là những sản phẩm lên men rượu từ gạo các loại, rất
thơm ngon và giàu bổ dưỡng
Ở nước ta, bên cạnh lúa gạo, các nông phẩm giàu tỉnh bột, nghèo đạm
như ngô, sắn chiếm một tỉ trọng khá lớn trong trong cơ cấu lương thực cho người Hiện nay trình độ chế biến nông phẩm này còn nhiều hạn chế nên hiệu
suất sử dụng nguyên liệu chưa cao, chưa đáp ứng được nhu cầu người tiêu
dùng Việc cải tiến quy trình lên men và nâng cao giá trị toàn diện của sản
phẩm là mục tiêu quan trọng của công nghệ sinh học trong giai đoạn hiện nay
nên đang được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm Để đạt được mục tiêu đó
khâu đầu tiên có ý nghĩa qua trọng là chất lượng của chủng men giống Việc
sử dụng nấm men có phẩm chất tốt không những đáp ứng yêu cầu của công
nghệ chế biến mà còn góp phần cải thiện chất lượng sản phẩm, tiết kiệm thời gian và nguyên liệu ban đầu
Để góp phân nhỏ bé của mình vào việc làm có ý nghĩa trên, chúng tôi đã tiến hành phân lập và tuyển chọn chủng nấm men thích hợp cho quá trình
lên men từ nguyên liệu tỉnh bột để tạo ra các đồ uống có độ cồn thấp Đó
cũng là mục tiêu đề tài của chúng tôi
Trang 6
Luan Odn Fét Ughiép CBIOD :TFh.S Grain Shanh Fhiiy
Phan I: TONG QUAN TAI LIEU
I SO LUGC VE DO UONG LEN MEN 1.1 Đinh nghiã
Nước giải khát lên men là sản phẩm của quá trình lên men rượu chưa
kết thúc Đó là lọai đồ uống thơm ngon, giàu bổ dưỡng, có lợi cho sức khỏe
người dùng
1.2 Phân loại
Căn cứ vào nguồn nguyên liệu sản xuất, người ta chia nước giải khát lên
men thành 2 nhóm :
$ Nước giải khát lên men từ nguyên liệu tỉnh bội ® Nước giải khát lên men từ nguyên liệu nước quả
Căn cứ vào tên của nguyên liệu cụ thể và chất lượng sản phẩm mà đặt tên cho chúng Ví dụ như nước cam lên men, nước dứa lên men, hay nước
uống lên men từ ngô, sắn 1.3 Đặc điểm
Đồ uống loại này là sắn phẩm của quá trình lên men rượu chưa kết thúc
$ Các quá trình sinh học còn tiếp diễn trong thành phẩm
e Các thành phẩm không bảo quản được lâu dù ở nhiệt độ thấp ( 4"° )
e Cần sử dụng ngay khi còn tươi
Thành phần đồ uống này giàu dinh dưỡng, hương vị hài hòa, đặc trưng,
có tác dụng kính thích tiêu hóa
Đồ uống lên men có thể là sản phẩm lên men bởi nấm men như rượu
nếp, rượu Sakê (Nhật Bản ), bia, hoặc bởi tổ hợp nấm men với vi khuẩn lactic
như Kvass (Nga ), Bouza ( Ai Cập ), Kaffia ( Châu Phi )
Trang 7
Luan Oin Fét VUghiétp OBIOD : TFh.S Tran Thanh Thay
Đồ uống lên men của hầu hết các nước đều có thành phần cơ bắn và hàm lượng các chất tương tự trong khoảng sau :
® Nồng độ chất hòa tan trong sản phẩm : 5-8% khối lượng
® Độ chua : 2 - 4 độ
® Nồng độ rượu : 0,5-1,5 % theo thể tích
® Thời gian tàng trữ : 5-6 giờ
® Thời gian bảo quản: 2 ngày
1.4 Nguyên liệu để sản xuất đồ uống lên men :
Ngô, khoai, sắn ( khoai mì ) là những cây màu lương thực được trồng nhiều ở nước ta Thành phần chính trong các củ và hạt này chủ yếu là bột đường, hàm lượng protein rất thấp ( sắn, khoai lang : 2-3% protein )
Bảng |: Thanh phần hóa học các sản phẩm chính trong công nghiệp sản xuất tỉnh bột ngô ( % ) Thành phần | Tinhbột | Gluten | Bã phôi đã ép dầu Độ ẩm 10-11 10 7 Protein 0,25 65 24 Tro 0,08 l - Lipit 0,65 7 1 -2 Xd 0,02 2 10 Tinh bét 99,00 20 16
(Theo: Nguyễn Hữu Phúc -Các phương pháp lên men thực phẩm truyền thống
ở Việt Nam và các nước trong vùng,tr 202)
Trang 8Ludn Oan Tét Ughiép CBIOD : Fh.S Fein Shanh Fhiy
Bảng 2: Thành phần hóa học của khoai mì Loại lương thực | Gluxi,% | Protein, % | Lipid, % Bột mi loai | 72,9 11,0 11 Sắn củ tươi 36,4 1,1 0,2 Sin khô 80,3 3,0 0,7
( Theo : Nguyễn Hữu Phúc -Các phương pháp lên men tực phẩm truyền thống
ở Việt Nam và các nước trong vùng, tr 204)
Trước đây các nguyên liệu từ tỉnh bột thường được dùng từ ngũ cốc các
loại như đại mạch, lúa mì, gạo Những năm gần đây, đo tình hình lương thực
khan hiếm nên các nhà nghiên cứu và sẳn xuất có xu hướng tăng cường sử
dụng các nguồn tinh bột nghèo đạm như ngô, khoai, sắn để khắc phục phần nào khó khăn trên Song, vấn để đặt ra ở đây là làm sao cải thiện được chất
lượng sản phẩm từ nguồn tinh bột ít đạm trên Đó là một bài toán khó
Để nâng cao giá trị dinh dưỡng của các sản phẩm này bằng con đường lên men, người ta thường bổ sung các nguồn đạm từ thực vật ( như đậu nành ) Tuyệt đối không dùng đạm urê hay sunphat amon để bổ sung vào đồ uống lên
men Muốn lên men nguồn tinh bột cần sử dụng enzyme của vi khuẩn hoặc nấm mốc (œ amylaza và glucoamylaza ) chuyển hóa tinh bột thành đường Sau đó thực hiện quá trình lên men đường thành rượu nhờ nấm men
II MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA TẾ BÀO NẤM MEN
Định nghĩa: Nấm men ( yeast, levure ) là tác nhân cơ bản của quá trình
lên men rượu Đây là nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, sinh sản chủ yếu bằng
lối nảy chổi Chúng phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên (đất, nước, không khí lương thực thực phẩm, hoa quả, ) nên dễ dàng phân lập được Người ta
thường sử dụng nấm men thuộc họ Saccharomycetaceae, loài Saccharomyces
cerevisiae để lên men rượu
2.1 Đặc điểm hình thái và kích thước :
Khuẩn lạc nấm men thường ở 2 dạng : khuẩn lạc lồổitròn đều, nhô cao và khuẩn lac dẹt, tròn đều, nhô không cao
Trang 9
Luin Odin Fét Ughiép CBIOD :Th.S Fein Shanh Fhiiy
Nấm men có nhiều hình dạng khác nhau : hình trứng hay hình bầu dục
(Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces elipsoideus ), hinh elip ( Candidu tropicalis ) , hinh tron ( Torulopsis utilis ) Kich thudéc khodng 3-5 um x 5-10 um
2.2 Đặc điểm cấu tạo tế bào :
Nam men đại diện điển hình cho các vị sinh vật có nhân thật và khá hoàn
chỉnh Cấu tạo gồm :
Thành tế bào : gồm 2 lớp, dày khoảng 1500 — 2000 A” chiếm 25 -
30% trọng lượng khô của tế bào Thành được cấu tạo chủ yếu từ
Hemixenluloza chiếm 60 — 70% trọng lượng khô ( 31% manan và 29%
glucan) Đây là cơ quan bảo vệ, duy trì hình dạng tế bào và có tính thấm chọn
lọc
Màng nguyên sinh chất : ( màng tế bào ) có cấu tạo từ protein
(60% va 40% lipit ), day 80 A° Chức năng chính là điều khiển quá trình trao
đổi chất qua màng
Tế bào chất : có trạng thái keo, bán lỏng có độ nhớt cao thay đổi
tùy thuộc vào trạng thái tuổi sinh lý giống Bên trong chứa nhân, mạng lưới nội chất riboxom, bộ máy gôlgi, lizoxom, ty thể, hạt volutin, glycogen, các hạt
lipid và không bào Đây là nơi diễn ra mọi hoạt động sống cuả tế bào
Nhân : được bao bọc bởi hai lớp màng mỏng, kich thuéc 1-2 pm,
trên màng có nhiều riboxom và nhiều lỗ thủng nhỏ đảm bảo sự liên hệ giưã nhân và tế bào chất Thành phần chính của nhân là nhiễm sắc thể Vai trò
của nhân là truyền đạt và bảo vệ thông tin di truyền tronh quá trình phân chia
tế bào
Ty thể : có cấu tạo đa hình (sợi, hạt, phân nhánh), kích thước
0,2 - 0,6um Chức năng của nó là thực hiện qúa trình liên quan tới cung cấp
năng lượng, tổng hợp prôtein
Riboxơm : nấm men có hai loại riboxom 1a 80S trong té bào chất
và 70S trong ty thể Là nơi tổng hợp protein và enzim
Mạng lưới nội chất: là một hệ thống ống phức, dày 40 -50 nm
Chức năng chủ yếu là tham gia vào quá trình tổng hợp lipid và vận chuyển
các chất trong tế bào
Trang 10
“tuân (Qăn Fét Ughiép CBIOD :Th.S Tran Thanh Shay
Ngoài ra trong tế bào chất còn có các bào quan khác :bộ máy golgi có vai trò quan trọng trong việc đào thải các sản phẩm dị hóa và có liên quan đến quá trình sinh tổng hợp các bộ phận của thành tế bào ; các hạt dự trữ
glycogen, hat volutin tham gia vao viéc tổng hợp acid nucleic và quá trình
sinh sản cuả tế bào 2.3.Đặc điểm sinh sản:
2.3.1 Sinh sản bằng cách nảy chổi:
Đây là hình thức sinh sản phổ biến nhất của tế bào nấm men Khi tế
bào phát triển đến một mức độ nhất định thì trên cơ thể của nó đâm ra một chổi nhỏ ( ở vị trí lệch tâm của tế bào mẹ) Cùng một lúc tế bào mẹ có thể
đâm ra nhiều chổi ở nhiều phía khác nhau Mỗi chổi sẽ nhận một phần chất
nhân từ tế bào mẹ Sau khi nảy mầm, tế bào con có thể tách khỏi tế bào mẹ sống độc lập hoặc có thể không tách khỏi tế bào mẹ mà tiếp tục nảy chổi tạo ra một tập hợp tế bào nấm men Trong điều kiện thuận lợi, thời gian một tế bào con được hoàn chỉnh và tách khỏi tế bào mẹ là 20 - 30 phút Kiểu sinh
sản này thường gặp ở nấm men Szccharomyces, Candida,
Bo
{ Co
2.3.2 Sinh sản bằng cách phân chia tế bào :
Phương pháp sinh sản này thường gặp ở giống Schizosaccaromyces Lúc
đầu tế bào dài ra va từ từ thắt lại ở chính giữa Nơi thắt này nhỏ dần đến khi tạo thành 2 tế bào con, hoặc dính với nhau tạo thành một chuỗi tế bào
\ Ỷ ‘ ae ` ă Ea a
Trang 11
Luan Odin Fét Vghiép CBIOD :Th.S Fran Shanh Fhiy
2.3.3 Sự sinh sản bằng bào tử và sự hình thành bào tử :
Nhiều loại nấm men có khả năng hình thành bào tử Bào tử túi được
sinh ra trong những túi nhỏ gọi là túi ( nang) Mỗi túi chứa từ I - 8 bào tử
(thường là I - 4) Bào tử túi có nhiều hình dạng khác nhau : hình cầu, hình
bầu dục, )Túi có thể được sinh ra theo 3 cách là : ® Tiếp hợp đẳng giao
® Tiếp hợp dị giao
® Sinh sản đơn tính
Ở Saccharomyces cerevisiae, tế bào dinh dưỡng đơn bội sinh sản theo cách nảy chổi Sau đó hai tế bào kết hợp với nhau tạo thành tế bào dinh
dưỡng lưỡng bội Tế bào này nảy chổi sinh ra tế bào lưỡng bội khác và sau đó
chuyển thành bào tử túi Nhân phân cắt giảm nhiễm sinh ra 4 bào tử túi rồi
chuyển thành tế bào dinh dưỡng và tiếp tục sinh sản bằng cách nảy chổi 2.4 Sự sinh trưởng và phát triển :
Tế bào nấm men được phát triển qua 4 pha cơ bản :
Pha tiểm tàng ( lag phase ) : giai đoạn các tế bào phù hợp với điều kiện
môi trường và phát triển chậm
Pha log ( log phase ) : sự tăng trưởng bắt đầu và số lượng tế bào tăng lũy tiến
Pha ổn định ( stationary phase ) : sự tăng trưởng dừng lại
Trang 12Ludn Otin Fét Wghiép OCOBIOD :Th.S Frain Shanh Chủ
II CAC BIEN DOI CHU YEU XAY RA TRONG QUA TRINH LEN MEN
3.1 Dinh nghia
Lên men rượu là quá trình hô hấp kị khí, trong đó đường bị phân giải
thành rượu ( C›H;OH ) và CO; dưới tác dụng của vi sinh vật, đặc biệt là nấm
men
Phương trình phản ứng :
C¿H;;O, _ sr, 2 C;H;:OH + 2CO; + 113,4 KJ
3.2 Cac giai doan
Rượu Etylic là một trong những sản phẩm phổ biến của quá trình lên
men đường gây ra bởi vi sinh vật Tác nhân chính của quá trình lên men rượu
là các chủng nấm men thuộc giống Saccharomyces Cơ chế hóa học của quá trình lên men rượu rất phức tạp, bao gồm một chuỗi các phản ứng với sự tham
gia của nhiều enzyme và chia thành 5 giai đọan chính
® Giai đoạn photphoryl hóa : thực hiện nhờ sự tham gia cua enzyme hexokinaza va ATP C4H¡;O, — 2222 › C.H¡¡O¿P ( glucoza — 6P ) isomeraza Glucoza-6P<—" Fructoza-6P
Fructoza-6P photphofructokinaza C6HoO¢P2 (fructo- 1,6 diphotphat)
@ Giai doan cat déi mach:
C,H;oO;P› = — C;H;O¿P ( 3- photphoglyceraldehyt )
Trang 13
Luan (ăn CZốt Vghiép CBIOD : TFh.S$ Fran Thanh Thuy $ Giai đoạn oxy hóa : COOH CH; I enolaza CH-OP C—-OP +H;ạO i | CH, —- OH COOH (phosphoenolpyruvic )
¢ Giai doan tao acid pyruvic :
C;H:O:P + ADP ———» C3H,O; + ATP
$ Giai đoạn acid puruvic tạo thành rượu :
CH:COCOOH decacboxylaza , yé'm khí ‘ CH;CHO + CO;
( axetalđehyd )
CH;CHO + NADH, alcol dehydroge naza_| =9(CH,CH,OH + NAD
Như vậy, sản phẩm của quá trình lên men rượu ngoài etanol và CO»,
còn xuất hiện nhiều hợp chất khác gọi là sản phẩm bậc 2 Đồng thời còn tạo
ra các sản phẩm phụ mà nguồn gốc là amin và các hợp chất khác
3.3 Các nhóm vi sinh vật chính tham gia vào quá trình lên men
Để lên men các sản phẩm đồ uống có độ cồn thấp từ nguyên liệu tỉnh
bột, người ta thường sử dụng hầu hết các đại diện của 3 nhóm vi sinh vật :
nấm mốc, vi khuẩn và nấm men
3.3.1 Nấm mốc :
Một số loài chính có khả năng tạo enzyme amylaza để phân giải tỉnh
bột thành đường
Aspergillus usamii : là mốc màu xám trắng, giàu enzyme amylaza, hiện
nay được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất rượu
Aspergillus awamori : mau xám, giàu hệ enzyme amylaza
Trang 14
Luan Oan Fét Vghiép COBIOD :Fh.S Fran Shanh Thy
Mucor rouxii : mau x4m trắng, được sử dụng rộng rãi trong nhà máy
rượu sản xuất theo phương pháp amylo Chúng phát triển tốt trong môi trường
lỏng, tạo nhiều enzyme amyloza
3.3.2 Vị khuẩn
Một trong những yêu cầu đối với nước giải khát lên men là phải có độ chua xác định nhưng khi sử dụng nấm men thì yêu cầu này khó đạt được và
không ổn định Để khắc phục, người ta thường sử dụng một số vi khuẩn lên men lactic Thường là vi khuẩn lactic không điển hình , ví dụ nhu Leuconostoc
có khả năng lên men đường thành axit lactic và một lượng lớn axit acetic, CO: và rượu
3.3.3 Nấm men
Nấm men là tác nhân cơ bản gây ra quá trình lên men rượu, thường sử
dụng nấm men thuộc họ Saccharơmycetaceae, loài Saccharomyces cereviside
Theo đặc tính lên men, người ta chia loài này ra làm 2 nhóm :
Nấm men lên men nổi : là những nấm men lên men mạnh và nhanh ở
nhiét d6 20 — 28° Trong khi lên men tạo nhiều bọt, tế bào nấm men thường
nổi trên bể mặt dịch lên men Nhóm này sử dụng trong sản xuất rượu và nấm
men bánh mì
Nấm men lên men chìm : ( thường lên men ở nhiệt độ thấp ).Trong quá
trình lên men, nấm men không chuyển lên bề mặt mà ở dưới đáy của dịch
lên men chậm, yếu ở nhiệt độ 5 — 10% Sau khi lên men, chúng kết lắng xuống dưới đáy tạo thành lắng cặn Nhóm này thường dùng trong sản xuất
bia
Để sản xuất rượu từ các nguyên liệu chứa tỉnh bột, ngày nay người ta
thường sử dụng các chủng sau :
¢ Ching 12: ( tach từ nhà máy men bánh mì 1902 ) : tế bào hình thoi hình elip, kích thước 0,2 — 5 x 5 —- 8 um Sinh sản bằng cách nảy chồi, nhiệt độ
25°° trong vòng 1 ngày để tạo bào tử ( 1 - 4 bào tử ) Tế bào già chứa nhiều
glycogen va metaxromatin Sinh san manh 12 giờ đầu nuôi cấy, sau đó chậm
dần và lên men rất mạnh Chúng có khả năng lên men các lọai đường :
glucoza, maltoza, fructoza, galactoza, cazaroza, 1/3 rafinga Khi lên men co khả năng tích lũy trong môi trường 13% rượu
Trang 15
Luan Oan Fét Ughiép CBIOD : TFh.S Fein Thanh Thy
® Chúng số 2 : ( tách ra từ 1889 do Linder trong nhà máy rượu ) Tế
bào hình dài, lớn, sinh sản nảy chổi Ở 25°€ trong 30 giờ nuôi cấy có thể tạo
thành bào tử ( 3 bào tử ) Lên men được các loại đường như chủng 12 nhưng khả năng sinh sản kém hơn
¢ Ching B : té bào hình trụ, hình oval, kích thước 3,9 - 9,7 x 3,9 - 8,9 um Lên men rượu rất tốt
Hiện nay nhờ phương pháp di truyền học mà người ta đã chọn được
nhiều thế hệ mới và ứng dụng rộng rãi trong sản xuất rượu
( 72 - 174, Công nghệ vi sinh vật — T1 - NÐ Lượng )
Iv ANH HUGNG CUA MOT SO YEU TO DEN QUA TRINH SINH
TRUONG, PHAT TRIEN VA QUA TRINH LEN MEN CUA NAM MEN
4.1 Nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng quyết định đến đời sống của nấm men, đến quá
trình lên men và chất lượng sản phẩm Mỗi giống, mỗi loài nấm men có khả
năng chịu nhiệt khác nhau Đối với nấm men lên men rượu, nhiệt độ tối ưu để
nấm men phát triển là 28 - 30°“ Nếu giảm nhiệt độ quá thấp sẽ ức chế sự
phát triển của nấm men và sự lên men kéo dài Ở nhiệt độ quá cao tốc độ
sinh trưởng phát triển của tế bào mạnh, dễ bị tiêu diệt
Trong quá trình lên men, nấm men có thể chịu được nhiệt độ từ 4— 10" nhưng thích hợp nhất là 25 — 30°“ Ở nhiệt độ lớn hơn 35°“ coi như sự lên men không an toàn, từ 36 —- 38°“ sự lên men bị hạn chế và ngừng ở 40“ Sự lên
men ở nhiệt độ thấp tốt hơn sự lên men ở nhiệt độ cao Vì khi lên men ở
nhiệt độ thấp sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm men dại, tạo hương
vị thơm ngon cho sản phẩm Còn ở nhiệt độ cao thích hợp cho vi khuẩn và
nấm men đại phát triển ( vi khuẩn acetic, vi khuẩn lactic ) nên rượu thu được
không ngon 4.2 Độ pH
Nấm men có thể phát triển trong môi trường có chỉ số pH từ 2 - 8
nhưng thích hợp nhất là 4 -5 Ở pH nhỏ, từ 2 - 3 hoặc lớn, từ 6,5 - 7,5, sự sinh trưởng của nấm men bị ức chế, đồng thời quá trình lên men bị yếu đi
Trang 16
Lugn Oan Fét VUohiép CBIOD :TFh.S Fein Fhanh Fhuiy
4.3 Oxy
Su thông khí ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất và sự tích lũy các
sản phẩm trong môi trường Khi có đủ oxy, nấm men phân hủy đường làm
nguồn năng lượng cho tế bào và tăng sinh khối
C¿H¡zO, +6CO; _ "ế"“ 6CO,+6H20 + Q
Trong điều kiện yếm khí, nấm men phân giải đường thành rượu và giải
phóng năng lượng
C¿H¡2O, —yêm khi 2C,H;oOs + 2CO; + Q
Nhu cầu thông khí phụ thuộc vào tốc độ phát triển của nấm men và
điều kiện môi trường Ở giai đoạn đầu của quá trình lên men ( giai đoạn nhân
giống ) phải cung cấp oxy liên tục bằng cách nuôi trên máy lắc để tăng nhanh
số lượng, còn giai đoạn sau phải đảm bảo điều kiện yếm khí để tăng sự tạo
rượu và ức chế sự phát triển của nấm men
4.4 Thành phần môi trường
Thành phần chất dinh dưỡng của môi trường ảnh hưởng quan trọng đến
sự sinh trưởng, phát triển của nấm men, do đó ảnh hưởng trực tiếp đến thành phần và chất lượng sản phẩm sau này Thành phần chính của môi trường ảnh
hưởng đến chất lượng sản phẩm ( rượu ) là : đường, các muối khoáng, vitamin,
đạm
4.4.1 Hàm lương đường
Đường là nguyên liệu để lên men, nồng độ đường ảnh hưởng đến năng
lực lên men của nấm men và ảnh hưởng trực tiếp tới tế bào nấm men Do đó, hàm lượng đường tỉ lệ thuận với áp suất thẩm thấu có trong dịch lên men
Nồng độ đường thích hợp nhất trong dịch lên men là 10 - 20% Nếu
ngoài giới hạn trên thì tế bào ngừng phát triển và năng lực lên men giảm, chất
lượng sản phẩm kém Về lý thuyết, khi nồng độ đường tới 35 —40% thì sự lên
men gần như đình chỉ
Trang 17
Luan Oin Fét Wghiép CBIOD :TFh.S- Fein Shanh Thuy
4.4.2 Ham lượng đạm
Nấm men cũng như các cơ thể sống khác cần nitơ trong quá trình sống để xây dựng tế bào Nitơ là thành phần hóa học của nấm men Do vậy, trong quá trình sinh trưởng của nấm men cần phải được cung cấp nitơ để tạo thành
nhóm amin ( -NH; ), nhóm Imin ( -NH- ) trong phân tử các acid amin, các
nucleotit purin và pirimidin, trong nhiều vitamin và một số hợp chất khác Bổ sung nitơ sẽ làm nâng cao tốc độ phát triển của nấm men Hiện nay trong sản xuất sinh khối, người ta thường dùng nitơ vô cơ là (NH,);HPO,, (NH.)›SO,, NH,NO,, vi day 14 nguồn nitơ mà nấm men dễ hấp thụ
4.4.3 Muối khoáng và vitamin :
Muối khoáng cần thiết cho nấm men để xây dựng cấu trúc tế bào, hoạt
hóa các enzyme, là tác nhân gây ra các phản ứng sinh hóa Các nguyên tố khoáng chủ yếu là S, P, Mg, Fe, Ca, Zn, Na, K, Cl, SO,” gitip cho việc ổn
định sự lên men của tế bào nấm men
Vitamin có tác dụng kích thích sự sinh trưởng hoặc cần thiết đối với quá
trình sinh trưởng, phát triển của nấm men Các vitamin quan trọng là vitamin
nhóm B ( Bị, Bạ, Be, biotin, PP, wea)
V VAI TRO CUA NAM MEN TRONG CÔNG NGHIỆP LÊN MEN
THUC PHAM
Trong suốt nhiều thé ky qua, nấm men được sử dụng vào nhiều mục đích kinh tế khác nhau Khi kể đến phạm vi ứng dụng của nấm men, người ta
cơ thể kể đến một số ngành sản xuất:
® Cơng nghệ sản xuất bánh mì
® Cơng nghệ sản xuất cồn, đồ uống có độ rượu cao và độ rượu thấp
® Sản xuất các sản phẩm giàu dinh dưỡng, các phức hệ vitamin, các
axit amin, cdc enzyme
® Công nghệ lên men rượu bia
Đặt biệt trong chế biến thực phẩm, từ nấm men, người ta đã tạo ra các
loại sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao: cốm bổ, bột dinh dưỡng trẻ
em thậm chí cả trong việc chế biến thức ăn cho gia súc, gia cầm Đặc biệt
Trang 18
Luin Oan Fé (giiệp CBIOD : TFh.S Fein Shanh Thuy là đã tạo ra các loại đồ uống lên men: rượu, bia, rượu vang, rượu cần, nước
uống có ga
Sở dĩ nấm men có được ứng dụng rộng rải như vậy là do chúng có thể
chuyển hoá nhanh chóng và biến đổi có hiệu quả các loại đường thành rượu
va CO;, chẳng hạn như đường có trong các dịch chiết ngũ cốc, dịch nho, nhờ
vậy có thể làm tăng giá trị dinh dưỡng của thực phẩm và tạo ra được nhiều
huơng vị khác nhau thỏa mãn nhu cầu đa dạng của con người
Sau quá trình chế biến, sản phẩm tiếp tục được bảo quan trongthời gian
dài hơn đồng thời hương vị của sản phẩm cũng được tích lũy nhiều hơn
Trong những năm tới, số lượng các chúng loại sản phẩm từ nấm men còn tăng lên nhanh chóng do việc áp dụng kỹ thuật di truyền, đưa những gen
xác định từ động vật, thực vật vào nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men YAC
(plasmid dạng vòng có nhiều trong tế bào nấm men Saccharomyces
cerevisiae) và sử dụng nấm men như những “nhà máy tí hon” nhưng năng suất
cao để sản xuất những hoạt chất mà trước đây chỉ tách chiết ở số lượng ít ỏi,
khó khăn từ các bộ phận của thực vật, động vật như các enzyme, hormon
Trang 19
Luin Oan Fét Ughiép OCBIOD : Fh.S Fein Shanh Fhiiy
Thành phần môi trường giống như môi trường Hansen đặc nhưng khơng có agar
® Mơi trường nước chiết khoai tây :
Dịch chiết khoai tây : 500 ml
Đường kính 50g
Nước cất thêm vào cho đủ 1000 ml Cách chế tạo dịch chiết khoai tây :
Khoai tây gọt vỏ, rửa, cân 30 g, thái nhỏ Thêm 500 ml nước, đun
sôi 30 phút, lọc lấy nước trong, thu được dịch chiết khoai tây
® Mơi trường Sabouraund : Glucose 40 g Pepton I0Og Agar 20g Nước cất 1000 ml pH=5
Trong 3 loại môi trường trên, thì môi trường Hansen đặc là thu được kết quả phân lập nhanh và phù hợp với điều kiện của phòng thú nghiệm Do
đó, chúng tôi chọn môi trường này để nghiên cứu
Để ức chế sự phát triển của một số vi sinh vật khác ( vi khuẩn, nấm
mốc ), trong quá trình phân lập cần bổ sung Rose - bengal với tỉ lệ 10 mg /1 vào thành phần môi trường Sau khi đã khử trùng xong, lắc cho Rose — bengal
tan đều mới phân phối ra thạch đĩa
Trang 20Luan Oan Fét Wghiép CBIOD : Fh.S Fein Thanh TFhiy Nước cất 1000 ml pH =5,5 1.2.3 Môi trường nhân giống : Cao nấm men lg Glucose 50 g Pepton lOg KH;PO, 3g Nước cất 1000 ml pH =6 1.2.4 Môi trường lên men : Glucose 200g KH;PO, 1,5 g (NH.);SO; 25 Ø Cao nấm men 5g Nước cất 1000 ml
1.2.5 Môi trường thử khả năng lên men các loại đường :
Nước chiết giá đậu 1000 ml
Đường nghiên cứu 40g
Cách chế tạo : Cân 200 g giá và 200 ml nước cất, đun sôi 30 phút Lọc
lấy nước trong và thêm nước cất cho đủ 1000 ml Bổ sung đường nghiên cứu
theo tỉ lệ 4% Hấp vô trùng ở 1 atm / 15 phút
Trang 21
Luin Odin Fét VUghiép CBIOD :TFh.S Fein Fhanh Fhuiy 1.3 Hóa chất : Thuốc nhuộm xanh methylen 0,1% ; l % Dầu soi kính Thuốc nhuộm Fuchin Ziehl Glycerine 40% H:SO., đặc Acid citric NaOH 0,1 N
Keo dan parafilm
I NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU :
2.1 Phân lập làm thuần 2.1.1 Phan lap :
® Nguồn phân lập :
Nguồn phân lập là cơ chất ở dạng đặc, thực hiện cần | g mẫu,
nghiền nát, cho vào bình tam giác chứa 99 ml nước cất vô trùng, ta
được độ pha loãng 107 Lắc đều, rồi tiếp tục hút 1 ml dung dịch
mẫu chuyển sang ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng, ta được độ pha loãng 10” Tiến hành tương tự cho đến khi mẫu được pha loãng ở nồng độ thích hợp
Nguồn phân lập là cơ chất dạng lỏng hay dạng sệt : thực hiện pha
loãng bằng cách hút | ml mau chuyển sang ống nghiệm chứa sẵn 9 mÌ nước cất vơ trùng, ta được độ pha loãng 10 ˆ Lắc đều và tiếp
tục pha loãng như vậy cho tới khi đạt hệ số pha loãng thích hợp
Nguồn phân lập là những giống gốc được bảo quản ở trạng thái
Trang 22-uậm “Uăm Cốt (2(giiệp CBIOD : Th.8 Fein Thanh Fhiy
Dung pipet v6 tring hút và nhỏ một giọt mẫu nghiên cứu vào giữa mặt
thạch ( hé mở nắp hộp petri sát ngọn lửa đèn côn ) Dùng que trang đã khử
trùng dàn đều dịch tế bào nấm men khắp mặt thạch Cấy một mẫu 3 hộp, cấy
xong đậy nắp hộp lại, bao gói và nuôi cấy ở nhiệt độ 28-30°C trong 3 ngày Sau đó lấy ra quan sát và phân biệt các khuẩn lạc khác nhau về kích thước
màu sắc,hình dạng trên thạch đĩa
Chọn những khuẩn lạc có đường kính lớn, tròn, trắng đục, bóng, mọc riêng
rẽ và khác nhau để cấy chuyền sang thạch nghiêng
2.1.2 Làm thuần các chủng nấm men :
Dùng que cấy vô trùng lấy một ít giống nấm men từ ống thạch nghiêng mới phân lập, cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước cất vô trùng Lắc thật đều được dịch huyền phù nấm men Dùng pipet hút 0,1 ml dịch huyền phù này nhỏ
lên bề mặt thạch đĩa Sử dụng que trang vô trùng gạt đều giọt dịch đó, rồi gạt
đều tiếp lên thạch đĩa thứ 2, thứ 3 mà không lấy thêm dịch nấm men
Các tế bào nấm men nhờ đó được tách riêng rẽ và mỗi tế bào cho mét
khuẩn lạc thuần chúng Nuôi cấy ở nhiệt độ 28- 30 °“ trong 3 ngày Để kiểm
tra khuẩn lạc vừa thu được có thuần chủng hay không , làm tiêu bản nhuộm đơn với thuốc nhuộm xanh methylen 0,1 % và quan sát ở vật kính X100
Chọn các khuẩn lạc thuần chủng sau 3 ngày tuổi, cấy chuyền sang ống
thạch nghiêng Sau đó bảo quản các ống giống ở nhiệt độ 4-5°“ để sử dụng
dân ( Sau 2 tháng cấy chuyền một lần )
2.2 Phương pháp nghiên cứu các đặc điểm hình thái 2.2.1 Hình thái tế bao
Việc xác định hình thái và kích thước tế bào nấm men tiến hành khi tế bào còn trẻ Đó là thời kỳ hình thái của chúng tương đối ổn định nhất
Các chủng nghiên cứu được cấy chuyền từ thạch nghiêng sang ống nghiệm
Trang 23Luin Van Fét UAghiép CBD : Th.S Gein Thanh Thiry
Số lượng tế bào nẩy chồi Số lượng tế bào chết
( Dùng phòng đếm Thoma- Goriaev )
Muốn phân biệt tế bào sống chết ta tiến hành làm tiêu bản giọt ép bằng thuốc nhuộm xanh Methylen 1%
Tế bào sống không bắt màu hoặc bắt màu xanh nhạt Tế bào chết bắt
màu xanh đậm hơn
Muốn xác định tế bào trẻ, ta tiến hành nhuộm đơn tiêu bản bằng
thuốc nhuộm lugol Do tác dụng của lugol, hạt dự trữ glycogen có màu đỏ
nâu, tế bào nấm men có màu vàng nhạt
@ Yéu cau:
Xác định tỉ lệ % tế bào nảy chổi so với tổng số tế bào trong l ml
Xác định tỉ lệ % tế bào chết so với tổng số tế bào trong 1 ml 2.2.2 Đo kích thước tế bào
$ Các dụng cụ đo:
Thước đo vật kính là một phiến kính tốt, ở giữa có một vạch
khắc dài 1 mm, chia thành 100 khoảng, mỗi khoảng dai 10 pm
® Cách đo :
Nuôi nấm men trên môi trường Hansen lỏng sau 48 giờ đem
làm tiêu bản giọt ép để đo
Đặt thước đo vật kính lên bàn kính ( chỗ để tiêu bản ), điều chỉnh sao cho vạch chia nằm giữa quang trường
Lắp thước đo thị kính vào, quay thước đo thị kính sao cho các vạch chia của nó nằm song song các vạch chia của thước đo vật kính Làm trùng 1 vạch chia của thước đo vật kính với l vạch của thước đo thị kính, sau đó tìm vạch trùng tiếp theo
Trang 24
Luin Odn Fét Vghiép CBIOD : TFh.S Tein Shanh Thuy Xác định bao nhiêu khoảng chia của thước đo vật kính, tương ứng với một vạch của thước do thị kính và tính giá trị mỗi khoảng
chia bằng um
Thước đo vật kính
Ví dụ : Trong 4 vạch của thước đo vật kính ( 40 um ), chứa 13 vạch của
thước đo thị kính => mỗi vạch của thước đo thị kính ở độ phóng đại tương ứng 40/13= 3,08 ( um )
Bỏ thước đo vật kính ra, thay bằng tiêu bản vi sinh vật, điều chỉnh thước đo thị kính trùng hướng tiêu bản muốn đo
Kích thước tế bào bằng số khoảng chia của thước đo thị kính nhân với hệ
~
số đo
$ Yêu cầu : mỗi tế bào được đo chiều dài và chiều rộng, mỗi mẫu đo nhiều tế bào, sau đó lấy trị số trung bình
2.2.3 Đếm số lương tế bào :
Sử dụng khung đếm Thoma-Goriaev (phòng đếm hồng cầu ) Khung
đếm là một phiến kính dày, ở giữa có một chỗ lõm phẳng, tại đây có kẻ | lưới
gồm 400 hình vuông, có diện tích tổng cộng ImniẺ -> điện tích 1 ô vuông nhỏ
=1/400 mm”, và một ô vuông lớn =1/25 mm
e Cách đếm :
Pha loãng dịch huyền phù nấm men đến nồng độ thích hợp
Trang 25Luan Oan C7ốt ()(giiệp OBIOD :TFTh.S Fein Shanh Thuy
*Chú ý : Sau khi nhỏ giọt dịch vào khung đếm, để 3-5 phút, các tế
bào lắng xuống và cùng nằm trên một mặt phẳng mới bắt đầu xác định số lượng ® Cáchtính N ='ax 25x 10'xn N : S6 té bao /ml
a : Số tế bào trung bình trong | 6 lớn n : độ pha loãng huyền phù
2.2.4 Hình thái khuẩn lạc :
* Quan sát đại thể :
Nuôi cấy nấm men trên môi trường Hansen đặc ( ở thạch đĩa ) ở nhiệt
độ 28 — 30 °€ trong 3 ngày Sau đó lấy ra, quan sát và mô tả đặc điểm : Hình dạng, kích thước Màu sắc khuẩn lạc Bề mặt khuẩn lạc Mép của khuẩn lạc * Quan sát vi thể :
Nuôi cấy nấm men trong ống nghiệm chứa 5 ml môi trường mạch nha
lỏng, lắc với tốc độ 130 vòng /phút ở nhiệt độ 28 - 30“ trong 24 giờ
Trang 26Luin Oan TFét Aghiép CBIOD : Th.S Fein Thanh Thuy
Khả năng lên men rượu được xác định bằng số lượng CO: bay ra từ
một thể tích môi trường nhất định trong một đơn vị thời gian
CH Oy —S a > ACH + 8CO; + 27 Real,
Số lượng CO; được xác định bằng sự giảm trọng lượng của bình có lắp
ống thoát Tính xem có bao nhiêu gram CO; đã bay ra từ 100 ml môi trường trong I giờ ở mỗi khoảng cách giữa hai lần cân
Nhân giống trong ống nghiệm chứa 5 ml môi trường nhân giống, nuôi trên máy lắc 28 — 30 trong 24 gid
Chuẩn bị bình lên men loại 250 ml với 100 ml môi trường lên men đã
được vô trùng Cấy giống từ môi trường nhân giống với tỷ lệ 10% ( số tế bào / I ml của các chủng phải tương đương nhau ) Nắp bình là một nút cao su đã khử trùng có nối với một ống thoát ( giống như hình vẽ ) dùng
để thu hồi nước bốc hơi từ môi trường ra Trong ống thoát, ta cho vào
H;SO¿ đặc để hấp thụ lượng nước bốc hơi Do đó, sự giảm trọng lượng
của bình chỉ do CO; thoát ra
-_ Xác định lượng CO; thoát ra bằng phương pháp cân bình tại các thời điểm :
0 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ lên men
- Dé rit ngắn thời gian thực nghiệm, trong giai đoạn sơ tuyển các chủng
nấm men ban đầu, có thể xác định tốc độ lên men của các chủng bằng phương pháp đơn giản hơn :
Trang 27
Luin Oin Fét Wghiép CBIOD : Th.8 Grin Thanh hủy
+ Cay cdc chủng nấm men đã nhân giống vào ống nghiệm (loại 25 ml
) chứa đầy môi trường lên men Dùng tay úp ngược ống nghiệm này xuống
bô-can cũng chứa môi trường lên men tương tự ( động tác phải khéo léo, phải
nhanh và dứt khoát ) Lượng CO; tạo ra trong ống sẽ tạo thành áp lực đẩy dịch
lên men từ ống nghiệm ra ngồi bơ-can Khoảng trống ở đáy ống nghiệm
càng lớn chứng tổ lực lên men của các chủng càng mạnh
a pa x
L | i
Theo dõi trong điều kiện nhiệt độ, và ghi nhận kết quả ở các thời điểm tương
tự như phương pháp trên ( 0 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ )
2.4 Phương pháp xác định khả năng lên men các loại đường :
Đây là chỉ tiêu quan trọng để phân loại nấm men và định hướng sử
dụng trong các nguồn cơ chất khác nhau
Chuẩn bị bình tam giác loại 250 ml chứa 100 ml môi trường nước chiết giá
đậu với 4% đường nghiên cứu
Cấy nấm men đã được nhân giống với tỷ lệ 10% so với môi trường lên men ( số lượng tế bào / 1 ml của mỗi chủng được điều chỉnh bằng nhau )
Thông qua sự biến đổi màu sắc, bọt khí, độ đục của môi trường để ghi nhận
kết quả
++ +: Lên men mạnh ( môi trường chuyển màu rõ, nhiều bọt khí,
đục )
++ : Lên men trung bình
+: Lên men yếu ( môi trường chuyển màu không rõ, ít bọt khí )
: Không lên men ( môi trường không chuyển màu, không có
bọt khí )
Trang 28
Luin Oan Fét Aghiép COBID : TFh.8 Fein Thanh Thuy
2.5 Khảo sát sự tăng sinh khối của nấm men bằng phương pháp đo mật
độ quan
Sự tăng trưởng của vi sinh vật là sự gia tăng số lượng vi sinh vật trong
quần thể Với nấm men, sự tăng trưởng của chúng được biểu thị bằng sự gia
tăng sinh khối theo thời gian nuôi cấy @ Chuan bi:
Chọn phiến kính lọc ánh sáng sao cho ánh sáng đi qua huyền phù nay
ở mức độ tối đa ( có trị số mật độ quang cao nhất )
Giống được hoạt hóa trên máy lắc 24 giờ ở nhiệt độ 28 - 30°“, tốc độ
130 vòng/phút
Môi trường Hansen lỏng được vô trùng, dùng để pha loãng mẫu
Chọn cuvette làm sao để chỉ cần một kích cỡ và một phiến lọc ánh
sáng đo được các trị số mật độ quang cả dãy độ pha loãng
2.5.1.Xây dựng đường cong chuẩn :
Pha các dịnh huyền phù nấm men có nồng độ khác nhau và điều chỉnh độ pha loãng để mật độ quang của chúng đạt các giá trị : 0,05 ; 0,1 ; 0.2
:0D3;04) 05:
Dùng phòng đếm Thoma - Goriaêv để xác định số lượng tế bào cho
mỗi giá trị mật độ quang ở trên và tính ra số tế bào / 1 ml ( cách tính ở phần
B; )
Vẽ đường cong chuẩn với chỉ số trên trục tung là giá trị mật độ quan,
trục hòanh là số tế bào / 1 ml vừa tương ứng với mỗi giá trị mật độ quang
e Mỗi chủng lập một đường cong chuẩn riêng
2.5.2 Xác định số lượng tế bào dưa trên đường cong chuẩn :
Đo trị số mật độ quang của huyền phù nấm men cần nghiên cứu
Tìm điểm tương ứng với đô thị trên trục tung Qua điểm này vẽ đường thẳng song song với trục hoành và cắt đường cong chuẩn Tại giao điểm này
vẽ đường thẳng góc với trục hoành
Trang 29
Luin Odn Fit Aghiép OBIHD : Th.S Trin Thank Thay
Căn cứ vào giao điểm (cắt trục hoành) ta xác định được số lượng tế
bào/I ml mẫu phân tích Nếu có pha loãng thì phải nhân với hệ số pha lỗng
nấm men:
® Chuẩn bị môi trường Hansen lỏng vơ trùng
® Dùng NaOH 0,1N hoặc acid citric điều chỉnh pH môi trường đạt
các giá trị 3; 3,5; 4; 4,5: 5; 5,5
® Dùng máy đo mật độ quang xác định chỉ số mật độ quang của
mỗi chủng để điểu chỉng lượng giống đưa vào bằng nhau
(10%),(~ 2 triệu tế bào/ml)
® Ni cấy ở 28-30” trong 24 giờ
Trang 30Luin Odin Fét Wghiép CBIOD : Fh.S Fran Fhanh Thy
2.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường đến sự tăng sinh khối của các chủng nấm men: Cách bố trí thí nghiệm tương tự như mục 2.6, chỉ khác yếu tố cần thay đổi là nhiệt độ Xác định số lượng tế bào tại các thời điểm tương tự thí nghiệm 2.6 ở các nhiét d6: 25°C; 28%; 30%; 32° 35°
2.8 Xác đỉnh khả năng tạo hương thơm:
Để tiết kiệm thời gian và nguyên liệu, chúng tôi đã kiểm tra khả năng
tạo hương thơm của các chủng nấm men bằng giác quan như sau:
Cấy nấm men cần thử vào môi trường thạch đĩa Hansen đặc, nuôi ở 28-
30 trong 4-5 ngày Sau đó lấy ra, mở nắp hộp petri để ngửi và đánh giá
khả năng tạo hương của các chúng
So với phương pháp cổ điển, phương pháp này cho phép thu kết quả
nhanh chóng, ít tốn kém và khá chính xác 2.9 Bảo quản giống đã tuyển chọn:
Sau khi đã chọn ra những chủng đạt các tiêu chuẩn của yêu cầu đề tài, cần giữ giống để phục vụ cho thời gian thí nghiệm và bảo quản giống
trong thời gian dài
Có rất nhiều phương pháp giữ giống khác nhau Trong đó bảo quản
giống bằng glycerin 40% ở tủ âm là phương pháp bảo quản có hiệu quả và phù hợp với cơ sở vật chất của phòng thí nghiệm
* Cách làm:
Chuẩn bị ống eppendorf chứa Iml glycerin 40% đã được khử trùng ớ
latm trong 30 phút
Trang 32Luan Oan Fét Wghiép CBIOD : TFh.S Fein Thanh Fhiiy
Phan III
KET QUA VA BIEN LUAN
3.1 Phân lập và sơ tuyển các chủng nấm men :
3.1.1 Phân lập:
Tiến hành phân lập các chủng nấm men từ các nguồn nguyên liệu theo phương pháp Koch ( phần 2 - II - 4.1.1 ) Thực hiện ở nồng độ pha loãng thích hợp, chúng tôi thu được 16 chủng nấm men (vì chưa đi vào phần
phân loain nén chúng tôi tạm gọi là chủng để tiện cho việc nghiên cứu) Sau
khi làm thuần và kiểm tra sơ bộ các chủng trên kính hiển vi, rồi loại bớt còn
I3 chúng Các chủng được ký hiệu như sau :
Nguồn phân lập Số chủng Ký hiệu các chủng
Bánh men hiệu “Con Mèo” 5 CM,, CM2, CM; CM, CM; Banh men “ Mori Langa” 2 M,, M2
Men bánh mì l BM
Nước dứa lên men 2 Dị và Dạ
Nước nho lên men 2 N;vàN;
Bánh men thuốc Bắc l TB
3.1.2 Sơ tuyển các chủng nấm men dưa trên khả năng lên men rượu
Sơ tuyển các chủng nấm men dựa trên khả năng lên men rượu Từ I3 chủng nấm men vừa phân lập được, thực hiện lên men rượu với từng chủng
bằng phương pháp lên men nhanh trong ống nghiệm như đã nêu trên ( phần
2.3) trong môi trường chứa nồng độ đường 20% Sau 24 giờ lên men, hầu hết các chủng đều lên men được nhưng mức độ có khác nhau Chúng tôi chọn
Trang 33
-“Đuận “ăn Fét Wghiép CBIOD : Fh.S Fein Shanh Fluiy
5/13 chủng có biểu hiện lên men mạnh nhất đó là :BM, D;, CM, M và TB để
tiếp tục nghiên cứu cùng với chủng Saccharomyces cerevisiae ( có ký hiệu là
Sac lấy từ bộ sưu tập Viện Công nghệ Thực phẩm 3.1.3 Khảo sát tốc đô lên men qua sư thải CO; :
Hoạt lực lên men là một trong những chỉ tiêu quan trọng để lựa chọn chủng
nấm men vì nó cho biết khả năng lên men mạnh hay yếu của chủng đó Hoạt
lực lên men mạnh ngoài tác dụng rút ngắn thời gian lên men, nó còn làm hạn
chế sự phát triển của các vi sinh vật không có lợi cho quá trình lên men nhờ
khả năng nhanh chóng sử dụng các chất dinh dưỡng có trong môi thường lên men, sinh ra sản phẩm của quá trình lên men là rượu, mà rượu là chất hạn chế
sự phát triển của nhiều vi sinh vật
Đối với quá trình lên men rượu nói chung, để xác định hoạt lực lên men của
mỗi chủng nấm men, người ta thường căn cứ vào lượng CO; tạo thành sau
khoảng thời gian xác định Trình tự thí nghiệm được tiến hành như phần 2.3
Tốc độ lên men được khảo sát qua sự thải CO; bằng phương pháp cânbình lên men sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ Kết quả được ghi trong bảng sau:
Bảng 3 : Khả năng lên men của các chủng nấm men
Trang 35
Lugn Odin Fét Wghiép CBIOD : Fh.S- Fein Thanh Thy
Nhân xét : Khả năng lên men của các chủng đều khá mạnh Trong đó chủng
Sac có tốc độ lên men cao nhất ở cả 3 thời điểm 24 giờ ( 5,5 g CO: ) ; 48 giờ
(6,2 g CO; ) ; 72 giờ ( 6,75 g CO; ) Chủng TB cho kết quả thấp nhất ở 3 thời
điểm tương ứng cho 3 g ; 3,7 g; 4,95 g CO> Kết quả gần với kết quả thu được
của Nguyễn Lân Dũng ( 1992 ) là 4,48 g CO; /100 ml ; của Nguyễn Hải
Phương ( 1994 ) 1a 4,75 g CO, /100ml trong quá trình lên men bởi nấm men tại
thời điểm 48 giờ Như vậy kết quả của chúng tôi bước đầu có cơ sở Dựa vào
bảng trên, có thể xếp khả năng lên men của các chúng theo thứ tự giảm dần
như sau :
Sac > Dạ >BM >M è>CM >TB
3.1.4 Khảo sát khả năng tao hương thơm của các chủng nấm men :
Khả năng tạo hương thơm là một chỉ tiêu quan trọng của một chủng nấm men có khả năng lên men rượu Chỉ tiêu này đặc biệt có ý nghĩa với các
chủng được sử dụng để lên men các sản phẩm đồ uống.Chúng tôi xác định
khả năng này bằng khứu giác sau khi tiến hành lên men các chủng trong môi
trường dịch thể ở 72 giờ và trên môi trường thạch đĩa khi nuôi cấy ở 30“ / 72-
96 giờ Kết quả được ghi trong bảng dưới đây :
Bảng 4 : Khả năng tạo hương thơm của các chủng nấm men Hương cảm quan Ký hiệu chủng | Trên môi trường lên men | Trên thạch đĩa dịch thể
BM Thơm Mùi thơm nhẹ
Da Thơm địu Thơm diu ngọt
Sac Không thơm Không thơm
Trang 36-“uận “Qdăn <Zốt WUghiép CBIOD :TFh.S Frain C7lautit C7 lui, Nhân xét : Chỉ có 3 trong 6 chủng nấm men có khả năng tạo mùi thơm nhẹ
Các chủng còn lại không có khả năng tạo mùi hoặc gây mùi nồng khó chịu Kết quả này tương đối thống nhất ở cả 2 loại môi trường lên men và môi
trường thạch đĩa
Kết hợp với kết quả khảo sát khả năng lên men, chúng tôi quyết định chọn 3 chủng sau đây vừa có khả năng lên men tốt vừa có khả năng tạo mùi thơm để
tiếp tục nghién ctfu 14 CM, BM, D3
3.1.5 Nghiên cứu các đặc điểm hình thái của nấm men :
Đây là những chỉ tiêu ban đầu và cần thiết cho người nghiên cứu trước khi
tìm hiểu các đặc tính sinh lý, sinh hóa của nấm men Bằng việc quan sát bằng
mắt thường, quan sát dưới kính lúp không gian 3 chiểu, dưới kính hiển vi
quang học, các đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào được mô tả trong bảng sau : Bảng 5 : Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của nấm men ý hiệu chủng BM D; CM Đặc điểm Nguồn gốc Bánh men Nước dứa lên men Bánh men “Con mèo * Hình dạng Tròn lồi Tròn lôi Tròn lồi Kích thước ( cm ) 3—5 25-4 2-3
Màu sắc Trắng sữa Trắng ngà Trắng trong | Bề mặt Trơn, ướt nhô cao | Trơn, bóng và nhô cao | Trơn,không ướt
Trang 38Luin Oan Fét Aghiép CBIOD : Fh.8.Gutin Thanh Fhiy
Hình 4: hình thái khuẩn lạc của chủng CM
Tỷ lệ tế bào nảy chổi và tế bào sống được xác định trên phòng hồng cầu sau 24 giờ nuôi cấy
Trang 40-uậum “du Cốt (X(giuệp CBID : 7h.Š Fean Fhank They
Hình 7: hình thái tế bào ching CM ( x 100 )
Nhân xét :
Về hình thái khuẩn lạc, chủng CM có kích thích lớn hơn cả Về hình thái tế bào, chủng BM có những đặc điểm tiêu chuẩn của một chủng men dùng trong
công nghiệp, đó là : tế bào có kích thước lớn ( 10um x 7uụm ), dạng tròn, tỷ lệ nảy chổi khá cao ( 3% ) ( Theo Vương Trọng Hào - 1994) Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Lê Thị Thanh Hà ( 1994 ) Khi nuôi cấy Sac vini Việt Nam đạt tỷ lệ nảy chồi đạt 30 — 35%
3.2 Khả năng lên men các loại đường
Việc nghiên cứu khả năng lên men các loại đường khác nhau của các chủng được thực hiện trong môi trường ( 1.2.5) Khảo sát khả năng tạo CO:
trong môi trường có 4% đường bằng phương pháp cân bình lên men tại các
thời điểm 24, 48, 72 giờ Kết quả ghi trong bắng 7 :
-