Báo cáo thực hành công nghệ di truyền nâng cao th xác nhận kiểu gen cá ngựa vằn knockout gen nrf2 bằng crispr cas9

Kỹ thuật CRISPR/Cas9 là một công nghệ chỉnh sửa gene hiện đại, cho phép các nhàkhoa học chỉnh sửa, cắt bỏ hoặc thêm các đoạn DNA cụ thể trong bộ gene của sinh vậtmột cách chính xác.. CRI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VĂN HIẾN

KHOA KỸ THUẬT - CÔNG NGHỆ

- -BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ

DI TRUYỀN NÂNG CAO

TH: XÁC NHẬN KIỂU GEN CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT GEN

NRF2 BẰNG CRISPR-CAS9

TP.HỒ CHÍ MINH, NGÀY 13 THÁNG 04 NĂM 2024

GVHD:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VĂN HIẾN

KHOA KỸ THUẬT - CÔNG NGHỆ

BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ

DI TRUYỀN NÂNG CAO

TH: XÁC NHẬN KIỂU GEN CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT GEN

NRF2 BẰNG CRISPR-CAS9

TP.HỒ CHÍ MINH, NGÀY 13 THÁNG 04 NĂM 2024

LỜI CẢM ƠN

Lời cảm ơn này thể hiện lòng biết ơn sâu sắc của tôi đối với …, cùng các anh chị (Tâm, Hiệu, Huệ) Tôi rất trân trọng sự chỉ dẫn và hỗ trợ tận tình của Thầy và anh chị, cũng như những lời khuyên và góp ý giúp tôi hiểu rõ hơn về chủ đề thực hành và hoàn thiện bài thực hành của mình Lời cảm ơn này thể hiện lòng biết ơn và tôn trọng của tôi đối với những người đã đóng góp vào thành công của tôi Tôi xin chân thành cảm ơn

NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

Cá ngựa vằn thường sống trong môi trường nước ngọt, đặc biệt là các suối nhỏ, ao

hồ và kênh rạch có dòng chảy nhẹ Chúng là loài cá có tính xã hội, thường sống thànhđàn và di chuyển theo nhóm

Loài cá này là một trong những loài cá phổ biến trong nghiên cứu khoa học, đặc biệt

là trong lĩnh vực sinh học và y học Cá ngựa vằn có chu kỳ sinh sản nhanh chóng, kíchthước nhỏ và bộ gene tương tự với con người, làm cho chúng trở thành mô hình lý tưởng

để nghiên cứu về di truyền học, phát triển phôi và các bệnh tật của con người

Kỹ thuật CRISPR/Cas9 là một công nghệ chỉnh sửa gene hiện đại, cho phép các nhàkhoa học chỉnh sửa, cắt bỏ hoặc thêm các đoạn DNA cụ thể trong bộ gene của sinh vậtmột cách chính xác CRISPR là viết tắt của cụm từ "Clustered Regularly InterspacedShort Palindromic Repeats" (các đoạn lặp lại ngắn xen kẽ nhau), và Cas9 là tên của mộtloại enzyme được sử dụng trong quá trình này

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN iii

NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN iv

GIỚI THIỆU v

MỤC LỤC vi

BUỔI 1: TÁCH CHIẾT DNA, CHẠY PCR 1

1.1 MỤC TIÊU 1

1.1.1 Chuẩn bị 1

1.2 MỘT SỐ KHÁI NIỆM 1

1.2.1 Thuốc gây mê Benzocain 1

1.2.2 Dung dịch TNEST 1

1.2.3 Dung dịch prokaryotic prok 2

1.2.4 Knockout gen 2

2 KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT DNA 2

2.1 Nguyên lý tách chiết DNA 2

2.2 Vật liệu, hóa chất và thiết bị tách chiết DNA 2

2.3 Tiến hành thí nghiệm tách chiết DNA 3

2.4 Cách tiến hành tách chiết DNA 4

2.5 Lưu ý 5

3 KỸ THUẬT CHẠY PCR 6

3.1 Nguyên tắc chạy PCR 6

3.2 Dụng cụ và hóa chất 6

3.3 Tiến hành thí nghiệm chạy PCR: 6

3.4 Cách tiến hành thao tác 7

3.5 Lưu ý 8

BUỔI 2,3: ĐIỆN DI, ĐỌC KẾT VÀ BÁO CÁO THỰC HÀNH 9

4.1 Nguyên tắc 9

4.2 Dụng cụ và hóa chất 9

4.3 Tiến hành thí nghiệm điện di 10

4.4 Cách tiến hành thao tác 10

NHẬN XÉT: 15

KẾT LUẬN: 16

BUỔI 1: TÁCH CHIẾT DNA, CHẠY PCR

1.2.1 Thuốc gây mê Benzocain

Thuốc mê cá Benzocaine có khả năng gây mê cho cả người và cá Thuốc có tác dụng gây mê nhanh, được dùng để gây mê phẫu thuật giúp giảm được cơn đau cho cá Đồng thời nhờ sử dụng thuốc cá sẽ giảm các kích động nên quá trình điều trị diễn ra dễ dàng hơn.

1.2.2 Dung dịch TNEST

Là dung dịch đệm thường được sử dụng trong các thí nghiệm sinh học phân

tử và hóa học sinh học

Dưới đây là một phân tích chi tiết về các thành phần:

Tris-HCl: Nó hoạt động như một tác nhân đệm, duy trì pH ổn định.

NaCl: Natri clorua giúp duy trì cân bằng osmotic và sức mạnh ion của dung dịch.

EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid kết hợp với các kim loại hai valence như magiê, canxi, và mangan, có thể gây ảnh hưởng đến một số phản ứng enzym SDS: Sodium dodecyl sulfate là một chất tẩy rửa làm mạnh hóa protein và phá hủy màng lipid.

1.2.3 Dung dịch prokaryotic prok

Là một thuật ngữ mô tả một dung dịch chứa các hệ thống hoặc các thành phần liên quan đến prokaryotes Prokaryotes là một trong hai loại tế bào cơ bản của các sinh vật Thường thì dung dịch prokaryotic bao gồm vi khuẩn và các thành phần liên quan như enzym, protein, và/hoặc axit nucleic (ADN hoặc ARN) Prokaryotes có vai trò quan trọng trong nhiều môi trường sinh học và có nhiều chức năng khác nhau, bao gồm giúp phân hủy chất hữu cơ, tổng hợp oxy và các nguồn năng lượng khác, cũng như trong việc cung cấp dinh dưỡng cho hệ sinh thái.

1.2.4 Knockout gen

Gene knock-out là một phương pháp được sử dụng làm mất chức năng (hay bất hoạt) một gene đã biết rõ trình tự Để thực hiện, một đoạn DNA được chèn vào cấu trúc của gene đó Nễu kỹ thuật này được thực hiện trên các DNA của tế bào gốc trong phôi chuột sẽ giúp tạo ra thế hệ chuột mới mang những gene bất hoạt Người ta cũng gọi các gene bị biến đổi theo phương pháp này là các gene bị đột biến.

2 KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT DNA

2.1 Nguyên lý tách chiết DNA

Tách chiết DNA gồm 3 bước cơ bản

- Lấy mẫu:

Lấy đúng mẫu, tốt nhất không bị nhiễm bệnh Không nên lấy mẫu là các cơ quan dựtrữ nhiều protein, gluxit hoặc lipid vì khi chiết xuất phải tốn công loại bỏ các tạp chấtnày

1 Phá vỡ màng tế bào và màng nhân: tùy đặc điểm cấu tạo màng/thành tế bào cócác phương pháp phá vỡ khác nhau (nghiền, dùng enzyme, nhiệt độ cao…)

2 Hoà tan DNA và loại bỏ các tạp chất: thành phần trong mẫu DNA khi chiết xuấtthường chứa cả protein, RNA, carbohydrate và lipid, do vậy cần phải loại bỏ các tạp chấtnày ra khỏi dung dịch DNA

3 Kết tủa DNA: mục đích của kết tủa là nhằm thu được DNA

2.2 Vật liệu, hóa chất và thiết bị tách chiết DNA

• Lọ

• Thìa inox

• Ống nghiệm

EDTA5M NaCl 1 µl 20 µl 1600 µl

10%

SDS 0.25 µl 5 µl 400 µlH20 23 µl 460 µl 36800 µlTOTAL 25 µl 500 µl 40000 µl

( HÌNH 1: Công thức pha dung dịch TNES )

- Thêm 5 µl proK vào 500 µl dung dịch TNES

- Pha dung dịch TNES

- Cài đặt bể ổn nhiệt ở 50 - 60Oc

2.4 Cách tiến hành tách chiết DNA

Các bước thực hiện tách chiết dna từ cá ngựa vằn:

Bước 1: Thêm 5µl dung dịch prokaryotic (prok) vào 500µl dung dịch TNEST.Bước 2: Thêm 50µl dung dịch TNEs vào mỗi PCR tube,

Bước 3: Chuẩn bị ống Eppendorf có nắp

Bước 4: Chọn con cá khỏe mạnh không bị nhiễm bệnh trong hồ cá tiến hành gây mêvới 1ml/L dung dịch Benzocain trong vòng 10 giây tùy vào cơ thể và đặc điểm có thể sẽlâu hơn tầm 10 giây đén 20 giây sau đó vớt cá ra

Bước 4: Dùng kính hiển vi để xác định vịBước 5: Dùng dao mổ hoặc lưỡi dao cạo để cắt vây đuôi, chuyển cá vào lọ nước

Bước 6: Cho vây đuôi vào Eppendorf chứa 50 µL dung dịch tách chiết DNA.

Bước 7: Ủ mẫu trong nồi cách thủy ở nhiệt độ 55°C trong 3 giờ nữa Sau 3 giờ lấy mẫu ra và ly tâm spindown 7000 vòng/phút

Bước 8: Pha loãng mẫu DNA 10 lần bằng nước cất.( dùng pipet hút 18 µl h20 + hút

2 µl mẫu pha loãng ) mix lại với pipet Sau đó ly tâm spindown 7000 vòng/phút

Pha loãng DNA 1:10

Pha loãng DNA

Pha loãng DNA 1:10

PCR master mix 4.8 µL 53.0 µL

Total 9.0 µL 99.0 µLMix bằng pipet

Chạy PCR:

o Chuẩn bị dung dịch PCR theo hướng dẫn của nhà sản xuất

o Cho 2 µL mẫu DNA đã pha loãng vào mỗi giếng PCR

o Chạy PCR với chương trình sau:

▪ 95°C, 2 phút

▪ (95°C, 10 giây; 60°C, 30 giây; 72°C, 30 giây) x 35 chu kỳ

▪ 72°C, 5 phút

3.4 Cách tiến hành thao tác

Bước 1: Hút 43,2 µl h20 vào eppendorf ( PCR permix )

Bước 2: Hút 54,6 µL DreamTag Green PCR master mix vào eppendorf eppendorf( PCR permix )

Bước 3: Lần lượt hút 0,3 µl 10uM-nrf2.hma.f3 vào eppendorf ( PCR permix )và 0,3

µl 10uM-nrf2.hma.r3 vào eppendorf ( PCR permix ).

Bước 4: Mix lại eppendorf ( PCR permix ) bằng pipet, ly tâm spindown 7000 vòng/phút

Bước 5: Hút 9 µl PCR permix vào PCR tube

Bước 6: Dùng pipet hút thêm 1 µl DNA pha loãng vào PCR permix

Bước 7: Mix lại với pipet Sau đó ly tâm spindown 7000 vòng/phút

Bước 8: Chạy PCR với chương trình sau:

Chương trình chạy PCR95°C 2 phút

95°C 10s

35 chu kỳ60°C, 30s

72°C 30s72°C 5 phút

Bước 9: Để máy chạy PCR qua đêm đến sáng hôm sau đợi máy hiển thị nút enternhấn nút tiến hành mở máy lấy mẫu ủ ở nhiệt độ 5°C rồi tắt máy tiến hành kiểm tra sảnphẩm nhân gel bằng phương pháp điện di gel acrylamide 9% trong 1 giờ.

BUỔI 2,3: ĐIỆN DI, ĐỌC KẾT VÀ BÁO CÁO THỰC HÀNH

4.1 Nguyên tắc

Trong một điện trường, các phân tử năm trong pha lỏng sẽ di chuyển với vận tốcphụ thuộc tỉ lệ giữa điện tích và khối lượng của chúng, nếu hai phân từ cùng khối lượng,phân tử nào có diện tích lớn hơn sẽ di chuyển về điện cực ngược dấu nhanh hơn

Kỹ thuật này thường được sử dụng để phân tách các nucleic acid và protein Bài nàychỉ đề cập đến kĩ thuật điện di nucleic acid

Ở lĩnh vực này, điện di thường được tiến hành trên những giá thể bản rắn là các gel.Các gel này là môi trường xốp với các lỗ nhỏ cho phép các phân tử nucleic acid đi qua,phân tử có kích thước càng lớn thì di chuyển trong gel càng chậm Tùy theo kích thướccác phân tử cần phân tách và mức độ phân tách, người ta sẽ sử dụng một trong hai loạigel là agarose hay polyacrylamide

Đối với gel polyacrylamide, các phân từ DNA thường được đánh dấu bằng đồng vịphóng xạ và vị trí của chúng sẽ được phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi Chúng còn

có thể được đánh dấu bằng các chất nhuộm chuyên biệt

Hình 2: Sơ đồ một mẫu khuôn bản gel polyacrylamide đơn giản Trước khi đổ dịchtạo gel cần dán các mép bằng băng keo dán và kẹp chặt (hoặc kẹp trong giá chuyên dụng)cho kín các mép hai bên và đáy

Trong điện di, người ta sử dụng thang DNA chuẩn (DNA ladder) Đó là hỗn hợpcủa nhiều đoạn DNA có kích thước đã biết, khi cho điện di cùng khúc với mẫu sẽ chophép xác định kích thước các đoạn DNA mẫu dựa vào sự so sánh vị trí của các phân tửtrên gel với thang chuẩn Một số thang DNA thông dụng: ΦΧ174-Hae III, λ-Hind III

4.2 Dụng cụ và hóa chất

- Gel acrylamide 9%

- Dung dịch điện di TAE 1X (pha từ dung dịch TAE 50X)

- Dung dịch nạp mẫu

- Ống nghiệm nhựa 50ml

- Ethidium bromide (10mg/ml)

- AgNO3 1%

- Vật liệu và dụng cụ Dung dịch DNA

- Pipetman 0,5µl - 10µl, đầu tip

và khe hở đáy bản gel bằng băng keo rồi dùng kẹp để kẹp các tấm thủy tinh (kẹp trước đểcác tấm thủy tinh ổn định, dán từng cạnh rồi thay kẹp) Tuy nhiên, cũng có thiết kế gàivào khuôn ngoài không cần kẹp

Trong trường hợp cần bổ sung lớp gel tập trung ở trên thì khuôn bản gel phải cốđịnh theo đúng phương thẳng đứng , sau khi rót đủ lượng gel phân tách (chừa lại mộtkhoảng ở trên) cần bổ sung lớp nước cất ở phía trên mà không cần cài lược Chờ đến khigel phân tách hóa rắn thì rót bỏ lớp nước này, thay bằng gel tập trung (gel nồng độ thấp)rồi ráp lược lên trên để tạo các lỗ giếng tải mẫu điện di Thông thường gel cứng trongvòng 30 phút

Bước 2: Chế gel theo nồng độ thích hợp cho việc phân tách DNA như phần 4.3chuẩn bị 2 gel Tiếp theo bắt đầu đổ gel vào khuôn

Bước 3: Sau khi gel cứng lấy lược ra khỏi khuôn bản gel, tháo khuôn bản gel khỏikhuôn ngoài hoặc kẹp cũng như vật chắn khác sao cho gel có hai đầu (trên và dưới) thôngvới bên ngoài Gắn khuôn bản gel vào chậu điện di

Bước 4: Hút từng mẫu đã chạy pcr xong vào từng khuôn với dung dịch màu tải mẫuđiện di , cho vào mỗi lỗ răng lược khoảng 20 µl (với lỗ 0,5 cm).

Bước 5: Gắn điện cực vào chậu điện di sao cho cực âm (cathode) ở trên còn cựcdương (anode) ở dưới (Các cặp dây dẫn và ổ cắm trên máy có màu tương phản, thường

là đỏ và đen; trong khi thực hiện không làm giao chéo)

Bước 6: Cắm điện bật công tắc điện di Cài đặt thời gian chạy điện di sử dụng 2phím   Thời gian có thể cài đặt trong khoảng 60 phút, hiệu điện thế 200V,cường độdòng điện 60mA Để điện di liên tục đặt giá trị 0 và chữ “c” sẽ xuất hiện trên màn hìnhhiển thị.

Cài đặt điện thế chạy điện di:

+ Nhấn phím Voltage Selector để lựa chọn các hiệu điện thế đã cài sẵn (200V) + Để lựa chọn các hiệu điện thế còn lại (18V, 35V hoặc 70V) nhấn phím Voltage

Selector cho đến khi đèn LED chỉ thị Additional sáng, vẫn giữ phím Voltage Selector,

điện thế sẽ hiển thị trên màn hình; sử dụng các phím   để lựa chọn điện thế, thả tay khỏi

phím Voltage Selector để kết thúc quá trình cài đặt.

+ Nhấn phím Run để bắt đầu chạy điện di.

Bước 7: Khi máy đã chạy hết thời gian cài đặt hoặc quan sát độ di chuyển của thuốcnhuộm trên gel để dừng quá trình điện di.Tắt công tắc nguồn

Bước 8 : Mở nắp buồng điện di, lấy bản gel ra và ngâm trong dung dịch EtBr ( 30phút) và tiến hành chụp ảnh gel hoặc soi trên bàn soi gel để kiểm tra kết quả

Bước 9: Kiểm tra sản phẩm tách chiết bằng điện di gel acrylamide

( Hình 3: điện di tách chiết dna từ cá ngựa vằn )

NHẬN XÉT:

Tách chiết DNA tổng số thành công, băng vạch gọn nhỏ, không có DNA bị đứtgãy, tuy nhiên vẫn có vạch không sáng rõ, còn mờ, ngoài ra vẫn còn tạp chất như protein,không bị lẫn RNA,các mẫu 1,2,3,4,5,6,7,8 và 10 thành công,còn mẫu số 9 không thànhcông do không có DNA hoặc bị nhiễm tạp chất

Thông qua hình ảnh điện di, thì có thể xác định được kiểu gen cá ngựa vằnknockout gen Nrf2 dựa vào vị trí và số lượng băng DNA có: WT:2; He:4; Ho:3; 1 ôkhông hiển thị

Các vạch mờ và vạch đậm do trong quá trình cắt vây đuôi trích ít hay nhiều DNA

Cải thiện năng lực thực hành: Buổi thực hành cung cấp cơ hội cho người tham gia rènluyện kỹ năng thực hành trong việc sử dụng các công nghệ di truyền, bao gồm quy trình thínghiệm, thiết lập thiết bị, và phân tích kết quả.

Qua thực hành, người tham gia nhận ra các thách thức về đạo đức và trách nhiệm khi sửdụng công nghệ di truyền, đặc biệt là trong việc chỉnh sửa gene của con người Cần có sự thậntrọng và đánh giá kỹ lưỡng trước khi áp dụng trong thực tiễn.