Báo cáo thực hành công nghệ di truyền nâng cao th xác nhận kiểu gen cá ngựa vằn knockout gen nrf2 bằng crispr cas9

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VĂN HIẾN

KHOA KỸ THUẬT - CÔNG NGHỆ

- -BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆDI TRUYỀN NÂNG CAO

TH: XÁC NHẬN KIỂU GEN CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT GENNRF2 BẰNG CRISPR-CAS9

TP.HỒ CHÍ MINH, NGÀY 13 THÁNG 04 NĂM 2024

GVHD:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VĂN HIẾN

KHOA KỸ THUẬT - CÔNG NGHỆ

BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆDI TRUYỀN NÂNG CAO

TH: XÁC NHẬN KIỂU GEN CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT GENNRF2 BẰNG CRISPR-CAS9

TP.HỒ CHÍ MINH, NGÀY 13 THÁNG 04 NĂM 2024

LỜI CẢM ƠN

Lời cảm ơn này thể hiện lòng biết ơn sâu sắc của tôi đối với …,cùng các anh chị (Tâm, Hiệu, Huệ) Tôi rất trân trọng sự chỉ dẫn và hỗtrợ tận tình của Thầy và anh chị, cũng như những lời khuyên và góp ýgiúp tôi hiểu rõ hơn về chủ đề thực hành và hoàn thiện bài thực hành củamình Lời cảm ơn này thể hiện lòng biết ơn và tôn trọng của tôi đối vớinhững người đã đóng góp vào thành công của tôi Tôi xin chân thànhcảm ơn

NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

Tp.Hồ Chí Minh, ngày tháng năm

Giảng viên hướng dẫn

(Ký tên và ghi rõ )

GIỚI THIỆU

Cá ngựa vằn, hay Danio rerio, là một loài cá nhỏ trong họ Cyprinidae, được tìm thấy ở vùng Nam Á như Ấn Độ, Nepal và Bangladesh Loài cá này nổi tiếng với màu sắc đặc trưng của chúng: những sọc đen và trắng chạy dọc thân, tạo thành một họa tiết giống như vằn ngựa, do đó tên gọi của chúng.

Cá ngựa vằn thường sống trong môi trường nước ngọt, đặc biệt là các suối nhỏ, ao hồ và kênh rạch có dòng chảy nhẹ Chúng là loài cá có tính xã hội, thường sống thành đàn và di chuyển theo nhóm.

Loài cá này là một trong những loài cá phổ biến trong nghiên cứu khoa học, đặc biệt là trong lĩnh vực sinh học và y học Cá ngựa vằn có chu kỳ sinh sản nhanh chóng, kích thước nhỏ và bộ gene tương tự với con người, làm cho chúng trở thành mô hình lý tưởng để nghiên cứu về di truyền học, phát triển phôi và các bệnh tật của con người.

Kỹ thuật CRISPR/Cas9 là một công nghệ chỉnh sửa gene hiện đại, cho phép các nhà khoa học chỉnh sửa, cắt bỏ hoặc thêm các đoạn DNA cụ thể trong bộ gene của sinh vật một cách chính xác CRISPR là viết tắt của cụm từ "Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats" (các đoạn lặp lại ngắn xen kẽ nhau), và Cas9 là tên của một loại enzyme được sử dụng trong quá trình này.

2 KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT DNA 2

2.1 Nguyên lý tách chiết DNA 2

2.2 Vật liệu, hóa chất và thiết bị tách chiết DNA 2

2.3 Tiến hành thí nghiệm tách chiết DNA 3

2.4 Cách tiến hành tách chiết DNA 4

BUỔI 1: TÁCH CHIẾT DNA, CHẠY PCR

1.1 MỤC TIÊU

• Sinh viên được thực hành kỹ thuật cắt vây đuôi cá ngựa vằn, tách chiết DNA và chạy PCR

• Sinh viên được phân tích kết quả điện di để xác nhận kiểu gen cá ngựa vằn knockout gen Nrf2 ở dạng hoang dại, dị hợp tử và đồng hợp tử.

1.2.1 Thuốc gây mê Benzocain

Thuốc mê cá Benzocaine có khả năng gây mê cho cả người và cá Thuốc có tác dụng gây mê nhanh, được dùng để gây mê phẫu thuật giúp giảm được cơn đau cho cá Đồng thời nhờ sử dụng thuốc cá sẽ giảm các kích động nên quá trình điều trị diễn ra dễ dàng hơn.

1.2.2 Dung dịch TNEST

Là dung dịch đệm thường được sử dụng trong các thí nghiệm sinh học phân tử và hóa học sinh học

Dưới đây là một phân tích chi tiết về các thành phần:

Tris-HCl: Nó hoạt động như một tác nhân đệm, duy trì pH ổn định.

NaCl: Natri clorua giúp duy trì cân bằng osmotic và sức mạnh ion của dung dịch.

EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid kết hợp với các kim loại hai valence như magiê, canxi, và mangan, có thể gây ảnh hưởng đến một số phản ứng enzym.

SDS: Sodium dodecyl sulfate là một chất tẩy rửa làm mạnh hóa protein và phá hủy màng lipid.

1.2.3 Dung dịch prokaryotic prok

Là một thuật ngữ mô tả một dung dịch chứa các hệ thống hoặc các thành phần liên quan đến prokaryotes Prokaryotes là một trong hai loại tế bào cơ bản của các sinh vật Thường thì dung dịch prokaryotic bao gồm vi khuẩn và các thành phần liên quan như enzym, protein, và/hoặc axit nucleic (ADN hoặc ARN) Prokaryotes có vai trò quan trọng trong nhiều môi trường sinh học và có nhiều chức năng khác nhau, bao gồm giúp phân hủy chất hữu cơ, tổng hợp oxy và các nguồn năng lượng khác, cũng như trong việc cung cấp dinh dưỡng cho hệ sinh thái.

1.2.4 Knockout gen

Gene knock-out là một phương pháp được sử dụng làm mất chức năng (hay bất hoạt) một gene đã biết rõ trình tự Để thực hiện, một đoạn DNA được chèn vào cấu trúc của gene đó Nễu kỹ thuật này được thực hiện trên các DNA của tế bào gốc trong phôi chuột sẽ giúp tạo ra thế hệ chuột mới mang những gene bất hoạt Người ta cũng gọi các gene bị biến đổi theo phương pháp này là các gene bị đột biến.

2 KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT DNA

2.1 Nguyên lý tách chiết DNA

Tách chiết DNA gồm 3 bước cơ bản - Lấy mẫu:

Lấy đúng mẫu, tốt nhất không bị nhiễm bệnh Không nên lấy mẫu là các cơ quan dự trữ nhiều protein, gluxit hoặc lipid vì khi chiết xuất phải tốn công loại bỏ các tạp chất này.

1 Phá vỡ màng tế bào và màng nhân: tùy đặc điểm cấu tạo màng/thành tế bào có các phương pháp phá vỡ khác nhau (nghiền, dùng enzyme, nhiệt độ cao…)

2 Hoà tan DNA và loại bỏ các tạp chất: thành phần trong mẫu DNA khi chiết xuất thường chứa cả protein, RNA, carbohydrate và lipid, do vậy cần phải loại bỏ các tạp chất này ra khỏi dung dịch DNA.

3 Kết tủa DNA: mục đích của kết tủa là nhằm thu được DNA

2.2 Vật liệu, hóa chất và thiết bị tách chiết DNA

• Lọ • Thìa inox • Ống nghiệm

( HÌNH 1: Công thức pha dung dịch TNES ) - Thêm 5 µl proK vào 500 µl dung dịch TNES

- Pha dung dịch TNES

- Cài đặt bể ổn nhiệt ở 50 - 60Oc

2.4 Cách tiến hành tách chiết DNA

Các bước thực hiện tách chiết dna từ cá ngựa vằn:

Bước 1: Thêm 5µl dung dịch prokaryotic (prok) vào 500µl dung dịch TNEST Bước 2: Thêm 50µl dung dịch TNEs vào mỗi PCR tube,

Bước 3: Chuẩn bị ống Eppendorf có nắp.

Bước 4: Chọn con cá khỏe mạnh không bị nhiễm bệnh trong hồ cá tiến hành gây mê với 1ml/L dung dịch Benzocain trong vòng 10 giây tùy vào cơ thể và đặc điểm có thể sẽ lâu hơn tầm 10 giây đén 20 giây sau đó vớt cá ra.

Bước 4: Dùng kính hiển vi để xác định vị Bước 5: Dùng dao mổ hoặc lưỡi dao cạo để cắt vây đuôi, chuyển cá vào lọ nước.

Bước 6: Cho vây đuôi vào Eppendorf chứa 50 µL dung dịch tách chiết DNA.

Bước 7: Ủ mẫu trong nồi cách thủy ở nhiệt độ 55°C trong 3 giờ nữa Sau 3 giờ lấy mẫu ra và ly tâm spindown 7000 vòng/phút.

Bước 8: Pha loãng mẫu DNA 10 lần bằng nước cất.( dùng pipet hút 18 µl h20 + hút 2 µl mẫu pha loãng ) mix lại với pipet Sau đó ly tâm spindown 7000 vòng/phút.

Pha loãng DNA 1:10

Pha loãng DNA

Pha loãng DNA 1:10

3 KỸ THUẬT CHẠY PCR

3.1 Nguyên tắc chạy PCR

Phản ứng chuỗi polymerase là một kỹ thuật đơn giản cho phép nhân bản nhanh một trình tự DNA lên rất nhiều lần trong vài giờ PCR được thực hiện khi có khuôn, Taq-polymerase, các mỗi chuyên biệt gồm, bốn loại deoxyribonucleotide triphotphate

Chạy PCR:

o Chuẩn bị dung dịch PCR theo hướng dẫn của nhà sản xuất o Cho 2 µL mẫu DNA đã pha loãng vào mỗi giếng PCR o Chạy PCR với chương trình sau:

▪ 95°C, 2 phút

▪ (95°C, 10 giây; 60°C, 30 giây; 72°C, 30 giây) x 35 chu kỳ ▪ 72°C, 5 phút

3.4 Cách tiến hành thao tác

Bước 1: Hút 43,2 µl h20 vào eppendorf ( PCR permix )

Bước 2: Hút 54,6 µL DreamTag Green PCR master mix vào eppendorf eppendorf ( PCR permix )

Bước 3: Lần lượt hút 0,3 µl 10uM-nrf2.hma.f3 vào eppendorf ( PCR permix )và 0,3µl 10uM-nrf2.hma.r3 vào eppendorf ( PCR permix ).

Bước 4: Mix lại eppendorf ( PCR permix ) bằng pipet, ly tâm spindown 7000 vòng/ phút

Bước 5: Hút 9 µl PCR permix vào PCR tube.

Bước 6: Dùng pipet hút thêm 1 µl DNA pha loãng vào PCR permix Bước 7: Mix lại với pipet Sau đó ly tâm spindown 7000 vòng/phút Bước 8: Chạy PCR với chương trình sau:

Bước 9: Để máy chạy PCR qua đêm đến sáng hôm sau đợi máy hiển thị nút enter nhấn nút tiến hành mở máy lấy mẫu ủ ở nhiệt độ 5°C rồi tắt máy tiến hành kiểm tra sản phẩm nhân gel bằng phương pháp điện di gel acrylamide 9% trong 1 giờ.

BUỔI 2,3: ĐIỆN DI, ĐỌC KẾT VÀ BÁO CÁO THỰC HÀNH

4.1 Nguyên tắc

Trong một điện trường, các phân tử năm trong pha lỏng sẽ di chuyển với vận tốc phụ thuộc tỉ lệ giữa điện tích và khối lượng của chúng, nếu hai phân từ cùng khối lượng, phân tử nào có diện tích lớn hơn sẽ di chuyển về điện cực ngược dấu nhanh hơn.

Kỹ thuật này thường được sử dụng để phân tách các nucleic acid và protein Bài này chỉ đề cập đến kĩ thuật điện di nucleic acid.

Ở lĩnh vực này, điện di thường được tiến hành trên những giá thể bản rắn là các gel Các gel này là môi trường xốp với các lỗ nhỏ cho phép các phân tử nucleic acid đi qua, phân tử có kích thước càng lớn thì di chuyển trong gel càng chậm Tùy theo kích thước các phân tử cần phân tách và mức độ phân tách, người ta sẽ sử dụng một trong hai loại gel là agarose hay polyacrylamide.

Đối với gel polyacrylamide, các phân từ DNA thường được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ và vị trí của chúng sẽ được phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi Chúng còn có thể được đánh dấu bằng các chất nhuộm chuyên biệt.

Hình 2: Sơ đồ một mẫu khuôn bản gel polyacrylamide đơn giản Trước khi đổ dịch tạo gel cần dán các mép bằng băng keo dán và kẹp chặt (hoặc kẹp trong giá chuyên dụng) cho kín các mép hai bên và đáy.

Trong điện di, người ta sử dụng thang DNA chuẩn (DNA ladder) Đó là hỗn hợp của nhiều đoạn DNA có kích thước đã biết, khi cho điện di cùng khúc với mẫu sẽ cho phép xác định kích thước các đoạn DNA mẫu dựa vào sự so sánh vị trí của các phân tử trên gel với thang chuẩn Một số thang DNA thông dụng: ΦΧ174-Hae III, λ-Hind III

4.2 Dụng cụ và hóa chất

- Gel acrylamide 9%

- Dung dịch điện di TAE 1X (pha từ dung dịch TAE 50X) - Dung dịch nạp mẫu

- Ống nghiệm nhựa 50ml - Ethidium bromide (10mg/ml) - AgNO3 1%

- Vật liệu và dụng cụ Dung dịch DNA - Pipetman 0,5µl - 10µl, đầu tip

Bước 1: Rửa sạch các tấm thủy tinh kỹ bằng nước sạch, để khô rồi lau lại bằng ethanol Ráp các tấm thủy tinh theo hướng dẫn của hãng sản xuất sao cho tạo được khoảng hở giữa hai tấm thủy tinh được bịt kín ba phía để không làm chảy nguyên liệu tạo gel khi rót vào Trước tiên đặt tấm thủy tinh nguyên, đặt các thanh cách dọc theo mép tấm thủy tinh đó, rồi đặt tấm thủy tinh có "tai" lên trên sao cho các cạnh của hai tấm thủy tinh trùng khít nhau Trong một số trường hợp, tùy thiết kế, có thể cần dán các mép bên và khe hở đáy bản gel bằng băng keo rồi dùng kẹp để kẹp các tấm thủy tinh (kẹp trước để các tấm thủy tinh ổn định, dán từng cạnh rồi thay kẹp) Tuy nhiên, cũng có thiết kế gài vào khuôn ngoài không cần kẹp

Trong trường hợp cần bổ sung lớp gel tập trung ở trên thì khuôn bản gel phải cố định theo đúng phương thẳng đứng , sau khi rót đủ lượng gel phân tách (chừa lại một khoảng ở trên) cần bổ sung lớp nước cất ở phía trên mà không cần cài lược Chờ đến khi gel phân tách hóa rắn thì rót bỏ lớp nước này, thay bằng gel tập trung (gel nồng độ thấp) rồi ráp lược lên trên để tạo các lỗ giếng tải mẫu điện di Thông thường gel cứng trong vòng 30 phút

Bước 2: Chế gel theo nồng độ thích hợp cho việc phân tách DNA như phần 4.3 chuẩn bị 2 gel Tiếp theo bắt đầu đổ gel vào khuôn.

Bước 3: Sau khi gel cứng lấy lược ra khỏi khuôn bản gel, tháo khuôn bản gel khỏi khuôn ngoài hoặc kẹp cũng như vật chắn khác sao cho gel có hai đầu (trên và dưới) thông với bên ngoài Gắn khuôn bản gel vào chậu điện di

Bước 4: Hút từng mẫu đã chạy pcr xong vào từng khuôn với dung dịch màu tải mẫu điện di , cho vào mỗi lỗ răng lược khoảng 20 µl (với lỗ 0,5 cm).

Bước 5: Gắn điện cực vào chậu điện di sao cho cực âm (cathode) ở trên còn cực dương (anode) ở dưới (Các cặp dây dẫn và ổ cắm trên máy có màu tương phản, thường là đỏ và đen; trong khi thực hiện không làm giao chéo)

Bước 6: Cắm điện bật công tắc điện di Cài đặt thời gian chạy điện di sử dụng 2 phím   Thời gian có thể cài đặt trong khoảng 60 phút, hiệu điện thế 200V,cường độ dòng điện 60mA Để điện di liên tục đặt giá trị 0 và chữ “c” sẽ xuất hiện trên màn hình hiển thị.

Cài đặt điện thế chạy điện di:

+ Nhấn phím Voltage Selector để lựa chọn các hiệu điện thế đã cài sẵn (200V)+ Để lựa chọn các hiệu điện thế còn lại (18V, 35V hoặc 70V) nhấn phím Voltage

Selector cho đến khi đèn LED chỉ thị Additional sáng, vẫn giữ phím Voltage Selector,

điện thế sẽ hiển thị trên màn hình; sử dụng các phím   để lựa chọn điện thế, thả tay khỏi

phím Voltage Selector để kết thúc quá trình cài đặt.+ Nhấn phím Run để bắt đầu chạy điện di.

Bước 7: Khi máy đã chạy hết thời gian cài đặt hoặc quan sát độ di chuyển của thuốc nhuộm trên gel để dừng quá trình điện di.Tắt công tắc nguồn.

Bước 8 : Mở nắp buồng điện di, lấy bản gel ra và ngâm trong dung dịch EtBr ( 30 phút) và tiến hành chụp ảnh gel hoặc soi trên bàn soi gel để kiểm tra kết quả.

Bước 9: Kiểm tra sản phẩm tách chiết bằng điện di gel acrylamide

( Hình 3: điện di tách chiết dna từ cá ngựa vằn )

NHẬN XÉT:

Tách chiết DNA tổng số thành công, băng vạch gọn nhỏ, không có DNA bị đứt gãy, tuy nhiên vẫn có vạch không sáng rõ, còn mờ, ngoài ra vẫn còn tạp chất như protein, không bị lẫn RNA,các mẫu 1,2,3,4,5,6,7,8 và 10 thành công,còn mẫu số 9 không thành công do không có DNA hoặc bị nhiễm tạp chất

Thông qua hình ảnh điện di, thì có thể xác định được kiểu gen cá ngựa vằn knockout gen Nrf2 dựa vào vị trí và số lượng băng DNA có: WT:2; He:4; Ho:3; 1 ô

Hiểu rõ hơn về kỹ thuật di truyền: Buổi thực hành đã giúp người tham gia hiểu rõ hơn về các kỹ thuật di truyền hiện đại như CRISPR/Cas9, PCR, và các phương pháp chỉnh sửa gene khác Các kỹ thuật này cho phép chỉnh sửa, thêm, hoặc xóa các đoạn DNA cụ thể trong bộ gene.

Ứng dụng trong nghiên cứu: Người tham gia có thể thấy cách công nghệ di truyền được áp dụng trong các nghiên cứu khoa học, đặc biệt là trong việc phát triển các mô hình sinh học để nghiên cứu bệnh tật, phát triển thuốc, và hiểu rõ hơn về cơ chế di truyền.

Cải thiện năng lực thực hành: Buổi thực hành cung cấp cơ hội cho người tham gia rèn luyện kỹ năng thực hành trong việc sử dụng các công nghệ di truyền, bao gồm quy trình thí nghiệm, thiết lập thiết bị, và phân tích kết quả.

Qua thực hành, người tham gia nhận ra các thách thức về đạo đức và trách nhiệm khi sử dụng công nghệ di truyền, đặc biệt là trong việc chỉnh sửa gene của con người Cần có sự thận trọng và đánh giá kỹ lưỡng trước khi áp dụng trong thực tiễn.