Nghiên cứu đa dạng di truyền và hoạt tính sinh học của hợp chất thứ cấp từ loài bời lời đắng (litsea umbellata (lour) merr)

Em xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp cơ sở “Nghiên cứu đa dạng di truyền và hoạt tính sinh học của hợp chất thứ cấp từ loài Bời lời đắng Litsea umbellata Lour.. Kê

Trang 1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ––––––––––––––––––––––––

ODAI PHIMMASONE

NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI GIẢI PHẪU VÀ

HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI BỜI LỜI ĐẮNG

(Litsea umbellata (Lour.) Merr)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Trang 2

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ––––––––––––––––––––––––––

ODAI PHIMMASONE

NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI GIẢI PHẪU VÀ

HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI BỜI LỜI ĐẮNG

(Litsea umbellata (Lour.) Merr)

Ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Từ Quang Trung

THÁI NGUYÊN - 2022

Trang 3

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứ u của tôi Mo ̣i trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồ n gố c Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố

Tha ́ i Nguyên, tháng 5 năm 2022

Ta ́ c giả luận văn

Odai PHIMMASONE

Trang 4

LỜI CẢM O ̛ N

Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Từ Quang Trung, giảng viên Khoa Sinh ho ̣c, Trường Đa ̣i ho ̣c Sư pha ̣m - Đa ̣i ho ̣c Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và ta ̣o mo ̣i điều kiện giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Em cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS Phạm Văn Khang, giảng viên Khoa Hóa học đã hướng dẫn em về tách chiết và đi ̣nh tính các chất hóa ho ̣c

Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của cô Trần Thi ̣ Hồng, kỹ thuật viên Phò ng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, cô Cao Thi ̣ Phương Thảo, kỹ thuật viên Phòng thí nghiệm Thực vật ho ̣c thuộc Khoa Sinh ho ̣c Trường Đa ̣i học Sư phạm - Đa ̣i ho ̣c Thái Nguyên đã ta ̣o mo ̣i điều kiện giúp em trong suốt quá trình nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo thuộc Khoa Sinh ho ̣c và các thầy cô giáo thuộc bộ phận sau đại học, Phòng Đào tạo, Trường Đa ̣i ho ̣c Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã ta ̣o mo ̣i điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Em xin bày tỏ lờ i biết ơn đến gia đình, ba ̣n bè đã động viên, khuyến khích và giúp đỡ em trong tiến trình học tập và hoàn thành luận văn

Em xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp cơ sở “Nghiên cứu đa dạng di truyền và hoạt tính sinh học của hợp chất thứ cấp từ loài Bời lời đắng

(Litsea umbellata (Lour.) Merr) ở Việt Nam”, mã số CS.2021.20

Tha ́ i Nguyên, tháng 5 năm 2022

Ta ́ c giả luận văn

Odai PHIMMASONE

Trang 5

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt iv

Danh mục các bảng v

Danh mục các hình vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về loài Bời lời đắng 3

1.1.1 Tên gọi, phân loa ̣i và đă ̣c điểm 3

1.1.2 Phân bố 3

1.2 Thành phần hóa học của loài Bời lời 4

1.2.1 Alkaloid 4

1.2.2 Butanolide và butenolactone 6

1.2.3 Terpen 8

1.2.4 Các flavonoid (247-286) 11

1.2.5 Amide (287-296) 12

1.2.6 Lignan (297-331) 13

1.2.7 Các lớp chất khác (332-407) 14

1.3 Tinh dầu củ a loài Bời lời 16

1.4 Hoạt tính sinh học củ a loài Bời lời 17

1.4.1 Hoạt tính chống ung thư 18

1.4.2 Hoạt tính kháng viêm 19

Trang 6

1.5 Hoạt tính kháng vi sinh vâ ̣t của loài Bời lời 19

1.6 Hoạt tính chống oxy hóa của loài Bời lời 22

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 23

2.1.1 Vật liệu và môi trường nuôi cấy 23

2.1.2 Hóa chất, thiết bị 23

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Phương pháp phân loại hình thái 25

2.2.2 Phương pháp giải phẫu thực vật 25

2.2.3 Phương pháp điều chế mẫu thử hoạt tính và phân tích thành phần hoá học 26

2.2.4 Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu 27

2.2.5 Phương pháp xác định tính độc tế bào ung thư nuôi cấy dạng đơn lớp 28

2.2.6 Phương pháp xác định tính độc tế bào ung thư nuôi cấy dạng đơn lớp 28

2.3 Phương pháp xử lý và phân tích kết quả 29

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Kết quả về đặc điểm hình thái, giải phẫu của loài Bời lời đắng (Litsea umbellata) 30

3.1.1 Đặc điểm hình thái của loài Bời lời đắng (Litsea umbellata) 30

3.1.2 Đặc điểm giải phẫu của loài Bời lời đắng (Litsea umbellata) 31

3.2 Kết quả về thành phần các chất của tinh dầu từ loài Bời lời đắng (Litsea umbellata) 35

3.3 Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu từ loài Bờ i lời đắng (Litsea umbellata) 38

3.4 Hoạt tính kháng tế bào ung thư của tinh dầu từ loài Bờ i lời đắ ng (Litsea umbellata) 42

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46

I Kết luận 46

II Đề nghị 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

Trang 7

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Enzyme linked immunosorbentassay

Ethanol Inhibitory concentration 50%

Luria Bertani Methanol Minimalinhibitory concentration

Nồ ng độ 50% tác dụng tố i đa

Thử nghiệm miễn dịch gắn enzyme

Nồ ng độ ức chế 50% cá thể/Tế bào

Môi trường nuôi cấy Chủ ng vi sinh vật

Nồ ng độ tối thiểu ứ c chế

Trang 8

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm 24 Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 24 Bảng 3.1 Thành phần hoá học của tinh dầu từ loài Bờ i lời đắ ng (Litsea

umbellata) 35 Bảng 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu từ loài Bời lời đắng (Litsea

umbellata) 38

Bảng 3.3 Tác động gây độc tế bào ung thư từ tinh dầu của loài Bời lời

đắng (Litsea umbellata) 43

Trang 9

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Các alkaloid phân lập từ chi Bời lời 6

Hình 1.2 Các butanolide và butenlactone phân lập từ chi Bời lời 7

Hình 1.3 Các hơ ̣p chất Terpen được phân lập từ chi Bời lời 11

Hình 1.4 Các flavonoid phân lập từ chi Bời lời 12

Hình 1.5 Các amide phân lập từ chi Bời lời 13

Hình 1.6 Các lignan phân lập từ chi Bời lời 14

Hi ̀nh 1.7 Một số chất khác phân lập từ chi Bời lời 15

Hình 2.1 Sơ đồ điều chế tinh dầu loài Bơ ̀ i lời đắng (Litsea umbellata) 26

Hình 3.1 Cây Bời lời đắng (Litsea umbellata) thu tại rừng phòng hộ Phượng Hoàng, xã Cù Vân, huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên 31

Hình 3.2 Giải phẫu cắt ngang thân Bời lời đắng (Litsea umbellata) 33

Hình 3.3 Giải phẫu cắt ngang lá Bời lời đắng (Litsea umbellata) 34

Hi ̀nh 3.4 Hoa ̣t tính kháng vi khuẩn E coli của tinh dầu từ loài Bời lời đáng (Litsea umbellata) 39

Hi ̀nh 3.5 Hoa ̣t tính kháng vi khuẩn P aeruginosa của tinh dầu từ loài Bời lời đắng (Litsea umbellata) 40

Hi ̀nh 3.6 Hoa ̣t tính kháng vi khuẩn S aureus của tinh dầu từ loài Bời lời đắng (Litsea umbellata) 41

Hình 3.7 Hình ảnh thử nghiệm của tế bào ung thư dạ dày ở người (MKN-7) 44

Hình 3.8 Hình ảnh thử nghiệm của tế bào ung thư phổi ở người (SK-LU-1) 45

Hình 3.9 Hình ảnh thử nghiệm của tế bào ung thư đại tràng ở người (HT29) 45

Trang 10

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Việt Nam là quốc gia nằm trong khu vực Đông Nam Á có khí hâ ̣u nhiệt đới gió mùa, với hệ thực vật phong phú Trong đó có nguồn cây dược liệu có số lượng lớn vô cùng quý giá phục vụ cho các nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên, cũng như những nghiên cứu về hoạt tính sinh học theo hướng hiện đại Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển về lĩnh vực y dược phục vụ cho cuộc sống của con người

Trong các họ thực vật ở Việt Nam và trên thế giới, họ Long não (LAURACEAE) là một trong những họ thực vật lớn của ngành Ngọc lan (Magnoliophyta), phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới Châu Á, Châu Phi, Châu

Úc và Châu Mỹ Kinh nghiệm dân gian cho thấy các bộ phận khác nhau của nhiều loài trong họ Long não được các bà con dân tộc ít người sử dụng làm thuốc và khai thác tinh dầu dùng trong công nghiệp dược và mỹ phẩm Ở Việt

Nam, chi Màng tang (Litsea) có khoảng 45 loài và 10 thứ phân bố ở khắp các

tỉnh trong cả nước Hiện nay, đã có một số công trình bước đầu nghiên cứu về tính đa dạng, phân bố và giá trị sử dụng của một số loài thuộc chi Màng tang

(Litsea), họ Long não (LAURACEAE)

Loài Bời lời đắng (Litsea umbellata (Lour.) Merr) là cây gỗ nhỏ Lá mọc

cách; hình bầu dục, hình thuôn hay hình bầu dục; gốc lá nhọn hoặc tròn; chóp lá nhọn; mặt trên có lông ở phần gân giữa, mặt dưới có lông màu nâu; gân bên 8-16 cặp; cuống lá dài 8-10 mm, có lông Cụm hoa tán ở nách lá, có lông màu nâu Quả hình cầu, đường kính 5-6 mm

Theo Đông y, lá loài Bời lời đắng luộc lên dùng làm cao dán chữa đau

nhức và mụn nhọt Hiê ̣n nay chưa có một công trình nào nghiên cứu về loài Bời lời đắng ở Việt Nam Vì vậy, nghiên cứu của đề tài góp phần tìm hiểu thêm sự

đa dạng di truyền, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất

Trang 11

thứ cấp từ loài Bời lời đắng (Litsea umbellata) Xuất phát từ các cơ sở trên

chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm hình thái giải

Merr)”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được đặc điểm hình thái, giải phẫu và hoạt tính sinh học của các chất phân lập từ loài Bờ i lời đắng (Litsea umbellata (Lour.) Merr)

3 Nội dung nghiên cứu

1 Thu thập mẫu vật, xác định đặc điểm hình thái và giải phẫu của loài Bờ i lời

đắng (Litsea umbellata (Lour.) Merr)

2 Xác đi ̣nh được một số thành phần hóa học của tinh dầu từ loài Bời lời đắng

(Litsea umbellata (Lour.) Merr)

3 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng tế bào ung thư của tinh dầu thu được từ loài bờ i lời đắng (Litsea umbellata (Lour.) Merr)

Trang 12

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về loa ̀i Bời lời đắng

1.1.1 Tên go ̣i, phân loại và đặc điểm

Tên Việt Nam: Bời lời đắng (Mò lông )

Tên khoa học: Litsea umbellata (Lour.) Merr

Tên tiếng Việt là cây Bời lời đắng, Bời lời hoa tán, Mò lông, Nhan sang Cấp bậc sinh giới

Ngành: Thực vật

Bộ: Cucurbitales

Họ: Long não (LAURACEAE)

Bời lời đắng (Litsea umbellata (Lour.) Merr) là cây gỗ nhỏ có các nhánh

thường có lông màu hung Lá mọc so le, hình bầu dục, thuôn hay trái xoan, thon hẹp hay tròn ở gốc, nhọn ở đầu, bóng và nhẵn ở mặt trên, trừ trên gân giữa, màu tối hay có lông nâu ở dưới; gân bên 8-16 đôi, lõm ở trên, lồi ở dưới; cuống lá khá

to, có lông, dài 8-10 mm Hoa xếp 5-6 cái thành tán tụ họp ở nách lá, có cuống chung ngắn, có lông ngắn màu hung Quả hình cầu, đường kính 5-6 mm, có cuống

nhỏ, hơi phồng lên ở phía dưới quả Loài Bời lời đắng (Litsea umbellata (Lour.)

Merr) thường ra hoa vào tháng 1-2

1.1.2 Phân bố

Bời lời đắng (Litsea umbellata (Lour.) Merr) phân bố ở nhiều quốc gia

như China, Myanma, Campuchia, Vietnam, Malaysia, Indonesia, Philippin Cây khá phổ biến ở nước ta, trong các savan cây bụi, trong rừng thưa và rừng rậm tới độ cao 1200 m ở nhiều nơi: Lào Cai, Lạng Sơn, Vĩnh Phú, Hà Tây, Ninh Bình, Gia Lai, Kontum, Bà Rịa-Vũng Tàu Thu hái lá quanh năm, thường dùng tươi

Trang 13

1.2 Thành phần hóa học của loa ̀i Bời lời

Hiện nay chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa ho ̣c của loài Bời

lờ i đắng (Litsea umbllata) Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu về chi Bời lời rất

đa dạng về mặt hóa học chúng bao gồm nhiều lớp chất có hoạt tính sinh học như alkaloid, lactone, sesquiterpene, flavonoid, lignan… và các dầu bay hơi, ước tính có khoảng 407 chất đã được phân lập từ 69 loài của chi này [8, 9, 17]

1.2.1 Alkaloid

Các alkaloid được phân lập từ chi Bời lời khá đa dạng về cấu trúc cũng như

hoạt tính sinh học có khoảng 63 các alkaloid được phân lập từ chi này (Hình 1.1)

[53] trong đó boldine (19) và laurolitsine (36) là phổ biến nhất, chúng được xem như là chất đánh dấu trong phân loại thực vật của chi Bời lời [19] Năm 1890

alkaloid đầu tiên được phân lập là laurotetanin (37) từ loài L chrysocoma Blum

[33] Một số nghiên cứu khác về chi Bời lời cũng phát hiện ra khá nhiều các alkaloid đại diện là các khung chất aporphine kiểu isoquinoline Theo nghiên cứu các aporphin được chia thành 3 loại khung chính: khung aporphin nguyên mẫu (Aporphine prototype), khung nguyên oxo-aporphine (Oxoaporphine) và khung bị aporphine dehydro hóa (Dehydroaporphine) [13] Trong chi Bời lời thì nhóm khung aporphin là phổ biến nhất Các nghiên cứu còn chỉ ra aporphin alkaloid có hoạt tính sinh học như: chống oxy hoá, chống khối u, chống kết tụ tiểu cầu, chống sốt rét và chống co giật Hiện nay các aporphine alkaloid và dẫn xuất tổng hợp của chúng đóng vai trò là các tiền chất cho sự phát triển các thuốc tiềm năng trong điều trị các bệnh khác nhau [6, 37]

Ở loài Màng tang (L.cubeba) có số lượng các alkaloid được phân lập nhiều

nhất Phenanthrene alkaloid được tách ra lần đầu tiên từ thân cây của Màng tang là Lidebamine (39) [61] Ngoài ra còn một số alkaloid bậc 4 hiếm gặp trong thiên nhiên cũng đã được phân lập từ Màng tang như 2 hợp chất dibenzopyrrocoline alkaloid là (–)-litcubine (2) và (–)-litcubinine (3) [31], 5 hợp chất isoquinoline alkaloid là (+)-8-methoxyisolaurenine-N-oxite (6), (+)-N-(methoxylcarbonyl)-N-

Trang 14

(methoxylcarbonyl)-N-norisocorydione (14), và norpredicentrine (15) [49]

Trang 15

(+)-N-(methoxylcarbonyl)-N-Hình 1.1 Các alkaloid được phân lập từ chi Bời lời [13, 31, 33, 49, 53]

1.2.2 Butanolide và butenolactone

Theo như công bố đầu tiên về các hợp chất lacton được phân lập từ loài

L japonica [32], thì cho tới nay hiện có hơn 69 hợp chất butanolide và butenolactone (64-132) (Hi ̀nh 1.2) được phân lập từ các loài thuộc chi Bời lời

Từ năm 2011-2015 có 7 chất khung butanolide là các litseakolide H-N (98-104)

đã được phân lập từ rễ của loài L hypophaea [35] 2 chất khung butanolide mới

với mạch nhánh 10 carbon là licunolides A (80) và B (81) từ rễ của L

acuminate (Hình 1.2.) [36] Có thể thấy Butanolide và butenolactone cũng là

các lớp chất thứ cấp chính đại diện trong chi Bời lời [20]

Trang 16

Hình 1.2 Cá c butanolide và butenlactone phân lập từ chi Bời lời [35, 36]

Trang 17

1.2.3 Terpen

Có 4 hợp chất terpene đã được phân lập từ chi Bời lời bao gồm:

monoterpene, sesquiterpene, diterpene và triterpenoid (Hình 1.3)

● Monoterpene (133-161)

Các monoterpene chiếm khoảng 90% thành phần tinh dầu trong các loài Bời lời, chúng rất khác nhau về cấu trúc và có thể phân chia thành 3 dạng cấu trúc chính đó là: các acyclic monoterpene, các monocyclic monoterpene, bicyclic monoterpene và những dẫn xuất đã được oxy hoá

Năm 2011 có 17 monoterpene đã phân lập được từ loài Màng tang

(L.cubeba) đó là: camphene (134); 1,8- cineole (136); citronellal (137); citronellol

(138); p-cymene (139); geraniol (142); limonene (Cinene, 143); linalool (144); neral (citral b, 146); β-phellandrene (151); α-pinene (152); β-pinene (153); α-a-isopulegol (154); sabinene (155); α-terpineol (157); α-terpinyl acetate (160); litseacubebic acid (161) [20]

● Sesquiterpene (162-234)

Các sesquiterpene có khoảng 73 hợp chất sesquiterpenoid đã được phân lập từ chi Bời lời, chúng rất khác nhau về khung cấu trúc và hoạt tính sinh học bao gồm các sesquiterpene béo, các sesquiterpene vòng đơn, vòng đôi, vòng ba

và các sesquiterpene bị oxy hoá Các hợp chất khung litseanes duy nhất đã được phân lập Zhang H J và cộng sự (2001) [73]

● Diterpene (235-236)

Các diterpene cũng được phát hiện trong chi Bời lời Năm 2014, dịch chiết

methanol của quả Màng tang (L cubeba) đã phân lập được 1 hợp chất iterpene là

[(+)-6-(4-hydroxy-4-methyl-2- 1,3-cyclohexadienecarbaldehyde] (235) [51] Sau đó nhiều hợp chất với cấu trúc khung tương tự từ loài Bời lời đã được tìm thấy [52]

Trang 18

pentenoyl)-4,6-dimethyl-5-(3-methyl-2-butynyl)-● Triterpenoid (237-244)

Năm 1994, đã phân lập được 5 triterpenoid từ loài L elliptica là:

β-amyrin acetate (238), erythrodiol-3-acetate (239); 3-O-acetyloleanolic acid (240); 3-O-acetyloleanolic aldehyde (241), 3-O-acetyl-28,28-dimethoxyolean-12-ene (242) [45] Năm 2011, có 8 triterpene đã tách được từ các loài L consimilis (Nees) Nees, L elliptica Blume, L acutivena [20] Phân loại theo

cấu trúc thì các triterpene này được phân thành 4 phân nhóm: nhóm 1 là những triterpene 4 vòng kiểu protostane; nhóm 2 là những triterpenoid kiểu oleanane; nhóm 3 là những triterpenoid kiểu taraxasterane; và nhóm 4 là những

triterpenoid kiểu khung lupane [20, 2, 45]

● Monoterpenoid (245-246)

Các monoterpenoid là các hợp chất thứ cấp được tạo ra trong quá trình sinh tổng hợp terpenoid, chẳng hạn như panamonon A (245) và (246) là những hợp chất đã được phân lập từ lá và cành của L panamonja [71]

Trang 20

Hình 1.3 Cá c hơ ̣p chất Terpen được phân lập từ chi Bời lời

1.2.4 Các flavonoid (247-286)

Năm 1953, Puercitrin (248) và astilbin (250) được phân lập từ lá non của

L glauca Siebold [72] Năm 2011, đã phân lập được 8 lavonoid từ loài L acuminata: kaempferol 3-O-β-D-xylopyranoside (257); kaempferol 3-O-α-L-

rhamnopyranoside (Afzelin, 259); và kaempferol 3-O-rutinoside (nicotiflorin, 260); quercetin-3-O-(2-O-β-D-apiofuranosyl)-α-L-arabinopyranoside (274); quercetin 3-O-β-D-galactopyranoside (hyperoside, 276); quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside (isoquercitrin 280); quercetin 3-O-α-D-L-rhamnopyranoside (quercitrin, 278); quercetin 3-O-[2-O- β-D-xylopyranosyl)-β-D-glucopyranoside] (279) [58] Cũng trong năm 2011, những chalcone với những

nhóm epoxy hoặc ethylidenoxy hiếm gặp là litseaone A (264) và B (265) từ L rubescens và L pedunculata [66] Năm 2013, đã phân lập được 8 flavonoid là

pinostrobin (272), pinocembrin (270), pinocembrin chalcone (271), apigenin, kaempferol, astragalin, isoquercetin, kaempferol 3,4 ‟-di-O-L-rhamnopyranoside (258) từ lá của Litsea fruticosa [68] Cho đến nay có khoảng

hơn 39 các khung chất gồm lavanol, lavonol, chalcone và các glycoside của

chúng đã được phân lập từ các loài của chi Bời lời (Hình 1.4) [19, 65]

Trang 21

Hình 1.4 Cá c flavonoid phân lập từ chi Bời lời

Trang 22

Hình 1.5 Cá c amide phân lập từ chi Bời lời

1.2.6 Lignan (297-331)

Các lignan từ chi Bời lời có số lượng rất nhỏ, hiện nay có khoảng 35

lignan đã được phân lập từ các loài Bời lời (Hình 1.6) Theo nghiên cứu các

lignan phân lập từ chi Bời lời có cấu trúc đa dạng như các neolignan, aryltetralon, dihydrobenzofuran, furofuran, lignanamide, ditetrahydrofuran, tetrahydrofuran, benzofuran, biphenyl lignan, arylnaphthalene lignan và dibenzylbutane lignan Năm (2013) một lignan mới và một oxyneolignan

biseugenol A (310) và B (311) đã được phân lập từ vỏ thân loài L costalis [17]

Trang 23

Hình 1.6 Các lignan phân lập từ chi Bời lời

1.2.7 Ca ́ c lớp chất khác (332-407)

Theo nghiên cứu từ chi Bời lời còn phân lập được khoảng 7 steroi dạng tự

do hoặc dạng glucoside (332-338); 28 acid béo (339-366), khoảng 40 các hợp chất khác như các coumarine, các phenol, các bennzoquinone (367-407) (Hình 1.7) [9, 11]

Trang 24

Hi ̀nh 1.7 Một số chất khác phân lập từ chi Bời lời

Trang 25

1.3 Tinh dầu cu ̉ a loài Bời lời

Tinh dầu khá phong phú và được nghiên cứu nhiều trong chi Bời lời Tinh dầu có thể được chiết từ nhiều bộ phận khác nhau của cây như lá, hoa, quả, thân, rễ… với sự đa dạng về thành phần hoá học và số lượng tinh dầu Đã có nhiều nghiên cứu về tính chất của các thành phần tinh dầu trong đó, thành phần chủ yếu trong tinh dầu từ các loài thuộc chi Bời lời là các monoterpene và

các sesquiterpene bị oxy hoá Loài Màng tang (L cubeba) phân bố ở Ấn độ, có

thành phần tinh dầu từ lá là sabinen (155) chiếm (62,4%), ở quả là limonen (143) chiếm (22,7%), (E)-citral (140) (25,5%) và α-citral (146) (37,9%) có hả

năng kháng khuẩn và kháng nấm [47] Loài Màng tang (L cubeba) có chứa

citral (70%) ở quả, citral (8,1%) ở hoa, cineol (80%) ở lá và geraniol (142) (36,5%) ở thân Ở Thái Lan tinh dầu Màng tang chủ yếu chứa citral (49,6%), ngoài ra còn có các hợp chất alkaloid và các hợp chất khác

Năm 1993, ở Trung Quốc tinh dầu lá của loài L pungen được Zhu L và

cộng sự đã xác định thành phần hóa học bao gồm: 1,3,3-trimetyl-2- oxabicyclooctan (215) (60%), 1,8-cineol (136) (9,0%) Từ lá cây này 24 hợp chất được xác định, trong đó thành phần chính của tinh dầu; (Z)-α-ocimen (150) (25,1%), 3,7-dimethyl-1,6-octadien-3-ol (144) (16,9%) và n-trans-nerolitol (213) (13,9%) [40]

Bighelli A và cộng sự 2005, đã công bố 5 mẫu lá ở các vùng khác nhau của miền Bắc Việt Nam với các chất chính của tinh dầu là 1,8- cineol (136, 0,2-51,7%), linalool (144, 0,4-91,1%), sabinene (155, 0,48,1%) từ quả là lá câu Màng tang [14] Năm 2005, Trần Đình Thắng và cộng sự đã nghiên cứu tinh

dầu một số loài Bời lời như Bời lời hao hoa đơn (L monopetala) phân bố ở Vũ

Quan-Hà Tĩnh với các hợp chất chính được xác định là myrcene (145, 40,5%), limonene (143, 11,7%), α-pinene (152, 8,6%), β-pinene (153, 8,3%), (E)-β-ocimene (149, 5,8%) [59]; lá của Bời lời núi đá (L euosma) có thành phần tinh

dầu chính là α-pinene (152, 11,8%), sabinene (155, 24,9%) và β-pinene (153,

Trang 26

14,0%); lá của Bời lời đắng (Litsea umbellata) có thành phần chính là

α-copaene (176, 11,7%), β-caryophyllene (173, 26,1%) và germacren D (188,

16,2%) [53, 70] Takeda và cộng sự cho biết lá của Bời lời Cam bốt (Litsea cambodiana) ở vườn quốc gia Bạch Mã có 41 hợp chất, chiếm 98,71% tổng

hàm lượng tinh dầu, thành phần chính của tinh dầu là β-caryophyllene (173, 28.36%), camphene (134, 17,10%) [55] Lã Đình Mỡi và cộng sự (2001 và 2002) đã cung cấp các thông tin về phân bố, đặc điểm sinh thái, phân tích thành phần hóa học của tinh dầu và triển vọng ứng dụng trong đó có nhiều loài thuộc chi Bời lời [6] Cũng trong vườn quốc gia Bạch Mã từ lá và cành của Bời lời

trâm (Litsea eugenoides) đã xác định được 55 hợp chất trong đó limonene (143, 25,10- 35,44%); Phellandrene (151, 11,99-16,00%) [44]

Năm 2001, một công trình nghiên cứu của các tác giả ở trường đại học San Carlos (Pháp) đã xác định được trong tinh dầu lá cây Litsea guatemalensis

có 74 hợp chất, trong đó thành phần chính là 1,8-cineole (136) (26,8%); terpineol (157) (14,5%); linalool (144) (10,8%), sesquiterpenes 8,8% [73] Năm

α-2012, Linlin Si và cộng sự đã xác định được 59 hợp chất trong thành phần của

tinh dầu Màng tang (L cubeba) ở Trung Quốc, trong đó neral (146) và geranial

(140) chiếm chủ yếu (78,7-87,4%), ngoài ra còn có α-pinene (152), β-pinene (153), β-myrcene (145), limonene (143), 1,8-cineole (136), linalool (144), citronellal (137), isopulegol (154), α-terpineol (157), citronellol (138), geraniol (142), β-caryophyllene (173) và caryophyllene oxite (174) [39]

1.4 Hoạt tính sinh học cu ̉ a loài Bời lời

Các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra tách chiết ở các loài trong chi Bời lời có hoạt tính sinh học rất đa dạng và phong phú như: hoạt tính chống ung thư; hoạt

tính chống viêm nhiễm; hoạt tính kháng khuẩn; hoạt tính chống oxi hoá; hoạt

tính chống tiểu đường (Hạ đường huyết); hoạt tính bảo vệ tim; hoạt tính bảo vệ gan; hoạt tính chống HIV; và nhiều hoạt tính sinh học quý báu khác Các kết quả nghiên cứu cụ thể như sau

Trang 27

1.4.1 Hoạt ti ́nh chống ung thư

Các alkaloid được phân lập từ vỏ của thân cây Màng tang như: (methoxylcarbonyl)-N-norbulbodione (12) và (+)-N-(methoxylcarbonyl)-N-norisocorydion (14) với hai nhóm carbonyl ở C-8 và C-11 có tác du ̣ng gây độc mạnh nhất trên tất cả các dòng tế bào khối u được kiểm tra, với giá trị IC50 lần lượt là 9,54-12,22 và 9,83-11,96 μm [49] Hợp chất cubelin (235) có vai trò là hung chất dẫn đường cho việc phát triển các hợp chất chống ung thư hiệu quả [52] Tinh dầu Màng tang có hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư

(+)-N-gan, phổi và miệng ở người [60] Mới đây, hợp chất methylenedioxycinnamoyl-3-methoxytyramine (295), 9,9‟-O-di- (E)-feruloyl-

N-cis-3,4-(+)-secoisolariciresinol (327), salvigenin (285), và balanophonin B (329) từ Màng tang có hoạt tính ức chế đáng kể sự phát triển tế bào ung thư gan (HepG2) với IC50 là 10,0-48,2 mm [62] Tinh dầu hạt Màng tang tiêu diệt các tế bào ung thư phổi không nhỏ (NSCLC) của người (A549) bằng cách gây ra quá trình tự chết tế bào theo chương trình (Apoptosis) và tác động lên chu tế bào [74]

Phần lớn các butanolide phân lập từ chi Bời lời được minh hoạ có hoạt

tính chống ung thư với nhiều dòng tế bào khác nhau Litsealiicolide A (110) và isolitsealiicolide A (78) thể hiện độc tế bào hiệu quả trên dòng tế bào SF-268 với IC50 là 3,38 và 3,11 μg/ml và dòng tế bào NCI-H460 với IC50 là 3,53 và 2,74 μg/ml Các hợp chất 110 và 78 cũng đã được chứng minh hiệu quả gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư vú M F-7 với IC50 bằng 4,64 [59]

Litsenolide B1 (117) từ L akoensis có IC50 bằng 11,77; 9,57 và 12,16 μg/ml với các dòng tế bào M F-7, N I-H460, và SF-268 tương ứng [18]

Các chalcone như litseaone A (264) và (265), được tách ra từ L rubescens và L pedunculata đã thể hiện hoạt tính độc tế bào hiệu quả đối với dòng tế bào bạch cầu tuỷ (HL-60) và tế bào ung thư biểu mô (A431) với IC50 là

< 14.0 (μg/ml); đố i vớ i tế bào ung thư gan HepG-2 với IC là 23,0 và 21,5

Trang 28

μg/ml tương ứng [62] Biseugenol A (310) và B (311) được phân lập từ vỏ thân

cây của L costalis có IC50 bằng 18, 1,1 và 28 mm với 3 dòng tế bào ung thư HepG2, PC-3, và MCF-7 [17] Hợp chất furanosesquiterpene longifolin (125)

và sesquirosefuran (132) có tác du ̣ng gây độc tế bào đáng kể trên dòng tế bào HeLa với IC50 là 0,21 và 0,36 μg/ml tương ứng [36] Dầu thiết yếu của L pungens cũng chỉ ra hoạt tính chống khối u [67] Alkaloid boldine (19) ức chế hữu hiệu với dòng tế bào ung thư vú MDA-MB-231 (48-h IC50 46,5 3 1 μg/ml)

và MDA-MB-468 (48-h IC50 50,8 + 2 7 μg/ml) [17]

Nhiều loài trong chi Bời lời là các thảo dược truyền thống đã được sử

dụng cho việc điều trị viêm nhiễm đường tiêu hoá, phù nề, khớp Cho đến nay,

chỉ có 5 loài trong chi bao gồm Màng tang (L cubeba), Bời lời nhớt (L glutinosa), L akoensis, L japonica và L guatemalensis đã được đánh giá chống viêm có hiệu quả Trong một nghiên cứu gần đây, Lin và các cộng sự đã công bố dịch chiết ethanol và dịch chiết nước của rễ Màng tang làm giảm đáng

kể viêm hớp ph (AA) ở chuột nhắt với liều 200 và 50 mg/kg thể trọng Hơn nữa,

cả 2 loại dịch chiết làm giảm đáng kể sự sản sinh tác nhân gây viêm TNF-α, 1β và IL-6 trong huyết thanh của chuột được điều trị bằng Màng tang ở liều 50 mg/kg Những nghiên cứu này giải thích cho ứng du ̣ng dân gian và gợi vai trò của Màng tang như là một tác nhân cho điều trị viêm khớp ở người [38, 53, 55,

IL-56, 73, 60, 74, 62, 59, 67, 40, 24] Saikia và Cộng sự (2013) [47] đã nghiên cứu

sâu về ảnh hưởng của dịch chiết L coreana (TFLC) đến bệnh thấp khớp trên chuột

dưới tác dụng của CFA ở liều (100, 200 mg/kg, thể trọng trong 10 ngày) đã làm giảm đáng kể sự phù nề và hàm lượng TNF-α and IL-1β trong huyết tương chuột

Dịch chiết của L akoensis ức chế sự sản sinh ra NO trong đại thực bào dưới tác

dụng của lipopolysaccharid (LPS) đến 81,07% ở liều lượng 25 mg/ml [69] Dịch

chiết thanol của L guatemalensis (LGE) và 5,7,3‟,4‟-tetrahydroxyisoflavone (286)

đã ức chế phù nề chân gây ra bởi carrageenan đến 62,7% và 62,2% tương ứng;

Trang 29

indometacin 2 mg/kg) được sử dụng như đối chứng dương trong thí nghiệm này; LGE và (286) cũng làm giảm lượng bạch cầu, đặc biệt là bạch cầu trung

tính với sự ức chế 45,3% và 62,5%, đến hoang phổi (Với sự ức chế 55,6% và 77,5%), phù hợp với đánh giá viêm màng phổi gây ra bởi carrageenan sau 4 h

Các kết quả nghiên cứu trên cho thấy rằng chất (286) có thể được sử du ̣ng làm tiền chất cho quá trình tìm kiếm các thuốc điều trị viêm và giảm đau [64] Các

dihydrostilbenoid glycosides từ L coreana thể hiện hoạt tính kháng viêm nhiễm điển hình qua phép thử ức chế sự sản sinh ra TNF và IL1 bởi dòng tế bào RAW264,7 được hoạt hoá bởi LPS ở liều 0,2 và 0,02 mm như 5- (2-phenylethyl)-3-hydroxyphenol-1-O-β-D-glucopyranoside (395), 6-(2-phenylethyl)- 2,4-dihydroxybenzoic acid-2-O-β-D-glucopyranoside (396), Cubebanone (405), 9,9‟-O-di-(E)-feruloyl-5,5‟-(+)-dimethoxysecoisolariciresinol (328), balano-phonin B (330), (+)-medioresinol (331), −)-syringaresinol (314), và 2,6-dimethoxy-p-benzoquinone (394) đã chỉ ra hoạt tính chống viêm nhiễm đáng

kể in vitro ức chế sự sản sinh ra NO trong đại thực bào của dòng tế bào vi thần

kinh đệm chuột V-2) và đại thực bào RAW 264,7 dưới tác du ̣ng của LPS, trong đó chất (330) và (394) thể hiện hiệu quả nhất với IC50 là 18,3 và 5,5 mm tương ứng, mạnh hơn đối chứng tương quercetin (IC50 26,1 mm), các hợp chất 9,9‟-O-di-(E)-feruloyl-5,5‟-(+)- dimethoxy secoisolaricire-sinol (328), −)-syringare sinol (314), và 2,6-dimethoxy-p-benzoquinone (394) đã chỉ ra ức chế 53,0%, 58,0%, và 48.8% tương ứng) sự sản sinh NO trên đại thực bào RAW264,7 dưới tác dụng của LPS ở nồng độ 40 mm [62, 8, 57, 14]

1.5 Hoa ̣t tính kháng vi sinh vâ ̣t của loài Bời lời

Một số dịch chiết và hoạt chất từ các loài Bời lời đã chứng minh có hoạt

tính kháng khuẩn, kháng nấm và chống lại nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh Dầu Màng tang, ở cấp độ thử nghiệm lâm sàng có phổ rộng các hoạt tính kháng

nấm Tinh dầu màng tang, có tác du ̣ng kháng nấm trên 9 loại nấm như Candita, Sporothrix, Cryptococcus… ở những nồng độ khác nhau [57] Dầu chiết của

Trang 30

quả Màng tang có khả năng kháng một số loại nấm có hại cho cây trồng như

Thanatephorus cucumeris và Sclerotinia sclerotiorum ở nồng độ 300 μg/ml với

giá trị IC50 lần lượt là 115,58 và 151,25 μg/ml, sử dụng carbendazim là đối chứng dương [9] Dầu chiết từ lá Màng tang có nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

là 0,03-0,4 mg/ml chống lại các mầm bệnh nấm [11] Các loại tinh dầu của Màng tang cho thấy hoạt tính kháng khuẩn vừa phải, phép thử khuếch tán đĩa thạch (DD) và các giá trị MIC tương ứng là trong khoảng 10,1-35,0 mm và 100-1000 µg/ml [39] Các monoterpenoid acid như litseacubebic acid (161) và monoterpene lactone (6R)-3,7- dimethyl-7-hydroxy-2-octen-6-olide (404) được

phân lập từ Màng tang cũng cho thấy hoạt tính kháng nấm tốt đối với S sclerotiorum, T cucumeris, Pseudocercospora musae, và Colletotrichum gloeosporioides ở nồng độ 588 và 272 μm [9, 11] Các alkaloid (+)-N-

(methoxylcarbonyl)-N-nordicentrin(13),(+)-N-(methoxylcarbonyl)-N-norpredi centrine (15) và (+)-N-(methoxylcarbonyl)-N-norglaucine (111) từ Màng tang

có MI là 0,60-0,80, 0,74-1,04, và 1,41-2,14 mm tương ứng, với rifampicin và nystatin là đối chứng dương [49] Rất nhiều loài trong chi Bời lời thể hiện hoạt

tính kháng khuẩn cao như dầu L laevigata ở Ấn Độ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn ở mức trung như chống lại các vi khuẩn gram dương như Streptococcus albus, và nấm A niger [15] Dầu la ́ của L kostermansii, L mushaensis, L akoensis và L nakaii, dầu cành của L acutivena cũng thể hiện hoạt tính kháng

vi khuẩn tốt [26, 48, 25, 63] Mới đây, dầu lá tươi của L acuminata ở Đài Loan

ức chế đáng kể sự phát triển của vi khuẩn gram dương và men trong vùng

45-50 mm với gi trị MIC là 31,25-62,5 μg/ml, nguồn gốc hoạt tính này được xem là từ các hoạt chất α-cadinol (171), và β-eudesmol (182), chúng ức chế hoàn

toàn sự phát triển của Trametes versicolor, Phaeolus chrysosporium, Phaeolus schweinitzii, và Lenzites sulphureu ở nồng độ 25, 25, 12,5, và 12,5 μg/ml tương

ứng [18]

Trang 31

1.6 Hoa ̣t tính chống oxy hóa của loài Bời lời

Nhiều dịch chiết của các loài khác nhau trong chi Bời lời đã được nghiên cứu về hoạt tính bắt gốc tự do của chúng [31] Dịch chiết các phân đoạn MeOH, CHCl3 và BuOH của loài Màng tang ức chế 89-90% quá trình peroxit hoá lipit theo phương pháp TBA Các phenolic từ vỏ thân L monopetala thể hiện hoạt tính kháng oxy hoá tổng từ 1,90 tới 7,06 mmol

Trolox/g [38] Dịch chiết vỏ thân Bời lời nhớt và L laeta đã cho thấy hoạt

tính tạo phức kim loại FWT với IC50 là 15,25 và 16,14 µg/ml tương ứng Hợp chất biseugenol A (310), biseugenol B (311) và 5-methoxy-2-hydroxybenzaldehyd (385) có hoạt tính bắt gốc tự do với IC50 là 4,77 + 0,006%, 41,92 + 0,02 và 17 + 0,03 μg/ml tương ứng [24] Dịch chiết MeOH

của rễ và thân cây của L elliptica và L resinosa có EC50 từ 11,2-41,69 μg/l có thể so sánh với chất chuẩn butylated hydroxytoluene [43] Ba flavonoid là kaempferol (256), quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside (280) và kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside (261) từ lá của L coreana đã được kiểm tra mối

liên quan giữa liều lượng và hoạt tính chống oxy hoá qua phức thử MDA, kết quả cho thấy hoạt tính chống oxi hóa của kaempferol>quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside>kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside [46, 16] Các kết quả nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hoá của các loài trong chi Bời lời cho thấy đây là nguồn chống oxy hoá tự nhiên phong phú trong việc điều trị, ngăn ngừa và làm chậm quá trình lão hoá, thoái hoá liên quan đến tuổi tác

Trang 32

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu và môi trường nuôi cấy

Loài Bờ i lời đắng (Litsea umbellata) sử dụng trong nghiên cứu được

thu tại Rừng phòng hộ Phượng Hoàng, xã Cù Vân, huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên, Việt Nam

Các loài vi khuẩn kiểm định: Vi khuẩn Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa do Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm

- Đại học Thái Nguyên cung cấp để nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn từ tinh

dầu của loài Bời lời đắng (Litsea umbellata)

Các dòng tế bào ung thư gồm: Ung thư đại tràng ở người (HT29), Ung thư dạ dày ở người (MKN-7), Ung thư gan ở người (HepG2), Ung thư vú ở người (MCF-7) và Ung thư phổi ở người (SK-LU-1) có nguồn gốc từ Trường Đại học Long Island, Mỹ và GS Jeanette Maier, Trường Đại học Milan, Italia cung cấp được bảo quản tại Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ Sinh học-Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam để xác định hoạt tính gây

độc tế bào từ tinh dầu của loài Bời lời đắng (Litsea umbellata)

Môi trường LB được sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn kiểm định có thành phần gồm cao nấm men 0,5%; NaCl 1,0%; pepton 1,0% Môi trường LB đặc bổ sung 2,0% thạch agar

2.1.2 Hóa chất, thiết bị

2.1.2.1 Hóa chất

Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết và được cung cấp bởi các hãng khác nhau được liệt kê ở bảng 2.1

Tiêu đề	Nghiên Cứu Đa Dạng Di Truyền Và Hoạt Tính Sinh Học Của Hợp Chất Thứ Cấp Từ Loài Bời Lời Đắng (Litsea Umbellata (Lour.) Merr)
Tác giả	Odai Phimmasone
Người hướng dẫn	TS. Từ Quang Trung
Trường học	Đại học Thái Nguyên
Chuyên ngành	Sinh học thực nghiệm
Thể loại	luận văn thạc sĩ
Năm xuất bản	2022
Thành phố	Thái Nguyên

Định dạng
Số trang	64
Dung lượng	3,75 MB