Khóa luận tốt nghiệp bước đầu nghiên cứu cảm ứng và nuôi cấy callus hà thủ ô đỏ (polygonum multiflorum thunb ) mục tiêu thu nhận hợp chất thứ cấp

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CẢM ỨNG VÀ NUÔI CẤY CALLUS HÀ THỦ Ô ĐỎ (Polygonum multiflorum Thunb.) MỤC TIÊU THU NHẬN HỢP CHẤT THỨ CẤP” Sinh viên thực : NGUYỄN NGỌC TIẾN Lớp : K62-CNSHB Mã SV : 620545 Người hướng dẫn : TS NÔNG THỊ HUỆ Bộ môn : Công nghệ sinh học thực vật HÀ NỘI – 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực chưa sử dụng công bố Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khóa luận tốt nghiệp cảm ơn thơng tin trích dẫn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2021 Sinh viên Nguyễn Ngọc Tiến   i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin trân trọng cảm ơn ban Giám đốc Học viện, khoa Công nghệ sinh học thầy, khoa tận tình giảng dạy, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập, rèn luyện Học viện Nông nghiệp Việt Nam, giúp trưởng thành nhân cách trình độ chun mơn Tôi xin chân thành biết ơn cô TS Nông Thị Huệ – Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật, khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tơi q trình thực đề tài hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn anh chị, bạn bè làm việc Bộ môn Công nghệ Sinh học thực vật tận tình giúp đỡ, giải đáp thắc mắc suốt q trình tơi làm khóa luận tốt nghiệp Nhân dịp xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè, người tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tơi vượt qua khó khăn q trình học tập, nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2021 Sinh viên Nguyễn Ngọc Tiến     ii MỤC LỤC   LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC VIẾT TẮT vii TÓM TẮT viii PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Yêu cầu 1.4 Ý nghĩa đề tài nghiên cứu 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Hà thủ ô đỏ 2.1.1 Nguồn gốc phân bố 2.1.2 Mô tả 2.1.3 Phương pháp nhân giống 2.1.4 Thành phần hóa học 2.2 Nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật 2.2.1 Cảm ưng tạo callus 2.2.2 Nuôi cấy huyền phù tế bào sản xuất hợp chất thứ cấp 2.2.3 Các yếu tố đánh giá khả sinh trưởng tế bào 10 2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình nuối cấy tế bào thực vật 11 iii 2.2.5 Nuôi cấy quy mô lớn 14 2.2.6 Các nghiên cứu sản xuất sinh khối thực vật 15 PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Đối tượng, vật liệu, thời gian địa điểm nghiên cứu 18 3.2 Nội dung phương pháp nghiên cứu 18 3.2.1 Nội dung nghiên cứu 18 3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 4.1 Nội dung 1: Tạo vật liệu khởi đầu 22 4.1.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng 2,4D đến khả tạo callus từ mô Hà thủ ô đỏ 22 4.1.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng BA đến khả tạo callus từ mô Hà thủ ô đỏ 25 4.2 Nội dung 2: Khảo sát số yếu tố đến khả tăng sinh khối callus bước đầu nuôi cấy sinh khối tế bào Hà thủ ô đỏ 27 4.2.1 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng tuổi callus đến khả tăng sinh khối mô callus Hà thủ ô đỏ 27 4.2.2 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng casein đến khả tăng sinh khối mô callus hà thủ ô đỏ 29 4.2.3 Thí nghiệm 5: Bước đầu thăm dị ảnh hưởng khối lượng mẫu ban đầu đến phát triển callus Hà thủ ô đỏ môi trường lỏng 31 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33 5.1 Kết Luận 33 5.2 Kiến nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 PHỤ LỤC 39    iv DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Ảnh hưởng 2,4D đến khả tạo callus từ mô Hà thủ ô đỏ sau tuần nuôi cấy 22 Bảng 3.2: Ảnh hưởng BA đến khả tạo callus từ mô Hà thủ ô đỏ sau tuần nuôi cấy 26 Bảng 3.3: Ảnh hưởng tuổi callus đến khả tăng sinh khối mô callus Hà thủ ô đỏ sau tuần 28 Bảng 3.4: Ảnh hưởng Casein đến khả tăng sinh khối mô callus hà thủ ô đỏ sau tuần 30 Bảng 3.5: Ảnh hưởng khối lượng mẫu ban đầu đến phát triển callus Hà thủ ô đỏ môi trường lỏng 31 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo emodin chất tương tự Hình 1.2: Công thức cấu tạo 2-3-5-4' tetrahydroxystilben-2-O-β-Dglucosid Hình 3.1: Chồi Hà thủ ô đỏ in vitro 18 Hình 4.1 Ảnh hưởng 2,4D đến khả tạo callus từ mô Hà thủ đỏ sau tuần nuôi cấy 24 Hình 4.2: Ảnh hưởng BA đến khả tạo callus từ mô Hà thủ ô đỏ sau tuần nuôi cấy 27 Hình 4.3: Ảnh hưởng tuổi callus đến khả tăng sinh khối mô callus Hà thủ ô đỏ sau tuần 29 Hình 4.4: Ảnh hưởng casein đến khả tăng sinh khối mô callus hà thủ ô đỏ sau tuần 31 Hình 3.5: Ảnh hưởng khối lượng mẫu ban đầu đến phát triển callus Hà thủ ô đỏ môi trường lỏng 32 vi DANH MỤC VIẾT TẮT Chữ viết tắt 2,4D α-NAA Tên đầy đủ 2,4- dichlorophenoxyacetic acid α-naphthaleneacetic acid BA 6- benzyladenin CH Casein hydrolysate IAA 1H- indole-3-acetic acid IBA 1H-indole-3-butyric acid ĐC Đối chứng MS Murashige and Skoog CT Công thức Cs Cộng   vii TÓM TẮT Đối tượng nghiên cứu dự án ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy sinh khối Hà thủ ô đỏ ( Polygonum multiflorum Thunb.) mơi trường in vitro nhằm thúc đẩy q trình tổng hợp hợp chất thứ cấp Nghiên cứu tảng để thực nghiên cứu nuôi cấy hiệu sinh khối Hà thủ ô đỏ để thu nhận hợp chất thứ cấp Các yếu tố khảo sát nghiên cứu cho thấy điều kiện tốt để tạo callus từ mô Hà thủ ô đỏ điều kiện tối hoàn toàn, môi trường MS bổ sung 2,0 mg/l 2,4D Ảnh hưởng BA đến khả tạo callus Hà thủ ô đỏ cho thấy BA cho khả tạo callus từ mô Khảo sát độ tuổi callus Hà thủ ô đỏ cho thấy độ tuổi callus cho khả nhân sinh khối tốt 3-4 tuần tuổi Khảo sát ảnh hưởng CH đến khả phát triển callus cho thấy nồng độ 50 mg/l CH nồng độ tốt để phát triển sinh khối callus Bước đầu nuôi cấy môi trường lỏng tế bào Hà thủ ô đỏ cho kết không mong đợi cần nghiên cứu thêm viii PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài Hà thủ đỏ biết đến loại thảo dược trường sinh người sử dụng từ thời xa xưa Hà thủ đỏ có vị chát, ngọt, đắng, tính ấm Theo Đơng y, Hà thủ đỏ có cơng dụng làm đen tóc, có tác dụng bổ máu, an thần, dưỡng can, ích thận, cố tinh, nhuận tràng, chữa sốt rét Nó vị thuốc bổ gan thận, bổ máu, chữa đau lưng mỏi gối, uống lâu làm đen râu tóc Theo Tây y, hà thủ đỏ điều trị suy nhược thần kinh bệnh thần kinh, bổ tim, giúp sinh huyết dịch, kích thích co bóp ruột, kích thích tiêu hóa, cải thiện dinh dưỡng Vì vậy, có nhiều nghiên cứu cho thấy hà thủ đỏ có chứa hợp chất quan trọng như: emodin, physcion, rhein, lecithin, catechin, chất hữu cơ, vô Nhiều loại hợp chất hữu chất chuyển hóa tạo thực vật trình trao đổi chất Các chất chuyển hóa chia thành chất chuyển hóa sơ cấp thứ cấp Các hợp chất thứ cấp tìm thấy vài lồi thực vật nhóm lồi có liên quan, hợp chất sơ cấp tìm thấy hầu hết loài (Taiz & Zeiger., 2006) Trong vài thập kỷ qua, chứng thực nghiệm xuất cho thấy hóa chất thực vật thực có chức sau: bảo vệ thể khỏi động vật ăn cỏ; Chống nấm, vi khuẩn, virus; Chịu cạnh tranh ánh sáng, nước chất dinh dưỡng; Thu hút động vật trình thụ phấn phát tán hạt giống; Tạo tín hiệu giao tiếp thực vật vi sinh vật cộng sinh; Khả chống tia cực tím tác động vật lý bất lợi khác (Wink & cs., 1999) Năm 1995 Arnason cs báo cáo thực vật tạo 80.000 hợp chất khác thơng qua q trình trao đổi chất thứ cấp Nồng độ chủ yếu lưu trữ cấu trúc đặc biệt quan dự trữ rễ, tế bào dự trữ, không bào, hệ thống màng Các hợp chất hóa học sử dụng dược phẩm, hóa chất nơng nghiệp, thuốc nhuộm, gia vị, hương vị, thuốc trừ sâu; họ đóng góp hàng tỷ la cho sản xuất công nghiệp (Gautam & cs., 1998) Tuy nhiên đa phần nghiên cứu Hà thủ ô đỏ tập trung vào việc nghiên cứu tách chiết thu nhận hoạt chất thứ cấp (Nguyễn Thị Hà Ly & i nuôi cấy callus Cây Nhàu (Morinda citrifolia L.) cho thấy môi trường 2,4D kết hợp với BA hiệu việc phát triển callus thu cao công thức MS bổ sung 2,4-D riêng lẻ.  Trên sở chúng tơi sử dụng môi trường tốt kết nghiên cứu MS + 2,0 mg/l 2,4D + 0,5 mg/l BA làm công thức môi trường để nghiên cứu tác động tuổi callus đến khả tăng sinh khối Kết nghiên cứu trình bày bảng 3.4 sau tuần: Bảng 4.3: Ảnh hưởng tuổi callus đến khả tăng sinh khối mô callus Hà thủ ô đỏ sau tuần Công thức Tuổi callus Khối lượng Khối lượng Đặc điểm callus (tuần tuổi) đầu vào (g) tươi (g) CT1 0,01 0,1ab Trắng - rắn CT2 0,01 0,12b Trắng - rắn CT3 0,01 0,12b Trắng - xốp CT4 0,01 0,08a Trắng - mọng nước CV 23,68 p-value 0,0427 LSD 0,05 0,03330 MT nền: MS + 30 g/l đường + g/l agar + 2,0 mg/l 2,4D + 0,5 mg/l BA, Từ bảng 3.4 kết cho thấy sau ni cấy tuần mơi trường MS có bổ sung 2,0 mg/l 2,4D + 0,5 mg/l BA tất mẫu thí nghiệm có phát triển kính thước khối lượng: CT1 callus tuần tuổi có khối lượng tươi trung bình 0,1 g; CT2 callus tuần tuổi cho khối lượng tươi trung bình mẫu 0,12 g; CT3 callus tuần tuổi khối lượng tươi trung bình 0,12 g CT4 callus tuần tuổi cho khối lượng tươi trung bình 0,08 g 28 tuần tuần tuần tuần Hình 4.3: Ảnh hưởng tuổi callus đến khả tăng sinh khối mô callus Hà thủ ô đỏ sau tuần Ở thí nghiệm hình thái callus có thay đổi qua công thức khác sau tuần ni cấy: CT1 callus tuần tuổi có callus phát triển dạng trắng rắn; sau tuần nuôi cấy CT2 callus tuần tuổi có callus dạng trắng - rắn; nuôi cấy callus CT3 callus tuần tuổi cho thấy xuất callus phát triển dạng trắng xốp; CT4 callus tuần tuổi sau tuần ni cấy có callus dạng trắng - mọng nước Callus tuần tuổi Chúng thấy callus đạt tuần tuổi tế bào callus bị lão hóa nên khả phát triển chậm hợn tế bào trẻ Từ số liệu cho thấy callus tuần tuổi phù hợp để nuôi cấy tăng sinh khối callus, callus sinh trưởng phát triển tốt 4.2.2 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng casein đến khả tăng sinh khối mô callus hà thủ ô đỏ Axit amin cung cấp cho tế bào thực vật với nguồn nitơ có sẵn tăng khả hấp thu nhanh nhiều so với thành phần hữu môi trường Casein giúp thực vật tổng hợp nhanh hợp chất có chứa nitơ (Thom cs., 1981) Các mơ callus tuần tuổi tách với khối lượng khoảng 0,01 g ni cấy mơi trường có bổ sung 0-200 mg/l CH Bảng 3.5 thể kết ảnh hưởng CH lên callus Hà thủ ô đỏ sau tuần: 29 Bảng 4.4: Ảnh hưởng casein đến khả tăng sinh khối mô callus hà thủ ô đỏ sau tuần Công thức Nồng độ CH (mg/l) Khối lượng đầu vào (g) Khối lượng mẫu (g) Đặc điểm callus CT1 0,01 0,02b Trắng – rắn CT2 50 0,01 0,04d Trắng – rắn CT3 100 0,01 0,02bc Trắng – rắn c CT4 150 0,01 0,02 Trắng – rắn CT5 200 0,01 0,01a Chết CV 14,04 p-value