Khóa luận tốt nghiệp: Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của mẫu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam

Luận văn Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của mẫu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam nghiên cứu nhằm phân tích các thành phần saponin chính của mẫu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao; định lượng sơ bộ các thành phần saponin chính của mẫu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC PHÙNG TIẾN HẢI BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA MẪU RỄ TĨC NI CẤY CỦA SÂM VIỆT NAM KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Hà Nội – 2022 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC Người thực hiện: PHÙNG TIẾN HẢI BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MẪU RỄ TĨC NI CẤY CỦA SÂM VIỆT NAM KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƢỢC HỌC) Khố: QH.2017.Y Người hướng dẫn: PGS.TS NGUYỄN HỮU TÙNG ThS ĐẶNG THỊ NGẦN Hà Nội – 2022 LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình thực nghiệm hồn thành khóa luận này, em nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ vô quý báu thầy cô giáo, Ban giám hiệu Trường Đại học PHENIKAA Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội với gia đình bạn bè Trước tiên, em xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Hữu Tùng – Khoa Dược, Trường Đại học PHENIKAA, người thầy trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều thời gian, quan tâm bảo tận tình, tạo điều kiện đóng góp ý kiến cho em suốt trình thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn tới ThS Đặng Thị Ngần – Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội dành thời gian hướng dẫn, góp ý cho em q trình hồn thiện khóa luận Đồng thời em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến hai thầy TS Vũ Văn Tuấn TS Nguyễn Ngọc Hiếu – Trường ĐH PHENIKAA, hai thầy nhiệt tình, giúp đỡ bảo, hướng dẫn, góp ý cho em suốt q trình thực nghiệm hoàn thiện đề tài trường ĐH PHENIKAA Và em muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Thị Thanh Bình, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội trao cho em hội để em làm hồn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới Trường ĐH PHENIKAA Trường ĐH Y Dược – ĐHQGHN tạo điều kiện để em hồn thành khóa luận mình, cảm ơn tập thể lớp Dược học khóa QH.2017.Y đồng hành em suốt năm học qua Và lời cảm ơn đặc biệt tới gia đình em, em vơ biết ơn gia đình ln bên động viên, khích lệ sát cánh, giúp em có thêm động lực cố gắng để em vượt qua giai đoạn khó khăn Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 24 tháng 06 năm 2022 Sinh viên Phùng Tiến Hải DANH MỤC KÝ HIỆU CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT CH3CN CCl4 DAD D-GalN G-Rb1 G-Rd G-Re G-Rg1 HPLC IL LPS MC MeOH M-R2 n-BuOH OT PPD PPT PRT4 TNF-α TPA SVN VG Acetonitrile Cacbon tetrachloride Detector mảng điốt (Diode array detector) D-galactosamine Ginsenosid-Rb1 Ginsenosid-Rd Ginsenosid-Re Ginsenosid-Rg1 Sắc ký lỏng hiệu cao (High performace liquid chromatography) Interleukin Lipopolysaccharide Tế bào (mitral cells) Methanol Majonosid-R2 n-butanol Occotillol Protopanaxadiol Protopanaxatriol Pseudoginsenoside RT4 Yếu tố hoại tử khối u-alpha (Tumor Necrosis Factors anpha) Chất hoạt hóa plasminogen mơ (tissue plasminogen activator) Sâm Việt Nam Vietnamese ginseng DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các saponin dẫn chất 20(S)-protopanaxadiol Bảng 1.2 Các saponin dẫn chất 20(S)-protopanaxatriol 11 Bảng 1.3 Các saponin có cấu trúc Ocotillol 13 Bảng 1.4 Các saponin dẫn chất acid oleanolic 14 Bảng 1.5 Thành phần acid béo phần mặt đất sâm Việt Nam 15 Bảng 1.6 Thành phần acid amin phần mặt đất sâm Việt Nam 16 Bảng 1.7 Thành phần nguyên tố đa vi lượng phần mặt đất sâm Việt Nam 16 Bảng 3.1 Chương trình rửa giải pha động sắc ký lỏng hiệu cao 32 Bảng 3.2 Kết nồng độ diện tích pic mẫu chuẩn 37 Bảng 3.3 Kết nồng độ diện tích pic mẫu thử 37 Bảng 3.4 Kết định lượng hàm lượng chất có mẫu dược liệu 38 DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Nhân sâm Việt Nam (Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha and Grushv) Sơ lược nhân sâm Việt Nam phân bố tự nhiên nhân sâm Việt Nam Việt Nam (A) Bản phác thảo màu sắc nhân sâm Việt Nam (B) Hình 1.2 Hình ảnh sâm Việt Nam (P vietnamensis Ha & Grushv) Hình 1.3 Hình ảnh sâm Việt Nam Hình 1.4 Cấu trúc dẫn xuất 20(S)-protopanaxadiol Hình 1.5 Cấu trúc hóa học ginsenoside-Rb1 10 Hình 1.6 Cấu trúc saponin dẫn chất 20(S)-protopanaxatriol 10 Hình 1.7 Cấu trúc hóa học ginsenoside-Rg1 ginsenoside-Re 12 Hình 1.8 Cấu trúc saponin dẫn chất Ocotillol 12 Hình 1.9 Cấu trúc hóa học majonoside-R2 13 Hình 1.10 Cấu trúc hóa học Hemsloside –Ma3 14 Hình 2.1 Mẫu dược liệu rễ tóc ni cấy Sâm Việt Nam sử dụng nghiên cứu 25 Hình 2.2 Hệ thống máy cất quay Rotavapor R-100 (BUCHI) 26 Hình 2.3 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn Butanol mẫu rễ tóc SVN 28 Hình 3.1 Hệ thống máy sắc kí lỏng cao áp Agilent 1260 Infinity LC 31 Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu chuẩn M-R2 32 Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu chuẩn G-Rb1 33 Hình 3.4 Sắc ký đồ mẫu chuẩn G-Rd 33 Hình 3.5 Sắc ký đồ mẫu chuẩn G-Rg1 34 Hình 3.6 Sắc ký đồ hỗn hợp mẫu chuẩn 35 Hình 3.7 Sắc ký đồ chất mẫu rễ tóc nghiên cứu phân đoạn Butanol 36 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Sâm Việt Nam 1.1.1 Lịch sử phát đặc điểm phân bố 1.1.2 Thực vật học Sâm Việt Nam 1.1.3 Đặc điểm thực vật sinh thái Sâm Việt Nam 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Tác dụng sinh học 17 1.1.6 Công dụng 22 1.1.7 Nguồn dược liệu thay 23 CHƢƠNG - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 25 2.1.1 Mẫu rễ tóc Sâm Việt Nam nuôi cấy 25 2.1.2 Chất chuẩn 25 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 25 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Phương pháp xử lý chiết mẫu 26 2.2.2 Phương pháp phân tích sử dụng sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 28 CHƢƠNG – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 31 3.1 Phân tích thành phần saponin mẫu rễ tóc ni cấy sâm Việt Nam sắc ký lỏng hiệu cao 31 3.1.1 Cài đặt chương trình chạy sắc ký lỏng hiệu cao để phân tích thành phần saponin có mẫu rễ tóc ni cấy Sâm Việt Nam 31 3.1.2 Kết phân tích mẫu chuẩn 32 3.1.3 Áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao để phân tích số saponin có mẫu rễ tóc ni cấy sâm sâm Việt Nam 36 3.1.4 Áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao để định lượng số saponin có mẫu rễ tóc ni cấy sâm sâm Việt Nam 37 3.2 Bàn luận 39 3.2.1 Phương pháp định tính số saponin có mẫu rễ tóc nuôi cấy Sâm Việt Nam HPLC 39 3.2.2 Phương pháp định lượng số saponin có mẫu rễ tóc nuôi cấy Sâm Việt Nam HPLC 40 3.2.3 Hạn chế nghiên cứu 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO ĐẶT VẤN ĐỀ Trong thập kỷ gần đây, người dần có xu hướng sử dụng sản phẩm có nguồn gốc thảo dược để phịng điều trị bệnh đặc tính an tồn, gây tác dụng phụ hiệu điều trị cao, việc sâu vào nghiên cứu, tìm kiếm hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao quan tâm Đặc biệt Việt Nam, quốc gia có hệ sinh thái vơ phong phú, đa dạng, có tiềm to lớn tài nguyên thuốc với 4000 loài thuốc, 50 loài tảo biển, 75 lồi khống vật gần 410 động vật làm thuốc [7] Sâm Việt Nam loài thảo dược quý hiếm, có nhiều tác dụng loại nhân sâm thứ 20 tìm thấy giới, loài đặc hữu hệ thực vật Việt Nam, phát lần vào năm 1973 vùng núi Ngọc Linh Ngoài 26 hợp chất saponin tương tự sâm Mỹ sâm Triều Tiên, sâm Ngọc Linh phát 20 loại saponin khác majonosid R1-2, vinaginsenosid R1-11 saponin khác thuộc nhóm glycosid, saponin phải kể đến majonosid-R2, ginsenosid-Rb1, ginsenosid-Rg1 ginsenosid-Rd Những saponin quý có tác dụng bồi bổ sức khỏe, tăng cường sinh lực, điều hịa huyết áp, chống oxy hóa, phịng chống ung thư, chống lão hóa, kích thích hệ miễn dịch, chống trầm cảm, giảm căng thẳng, gan, thận [16] Loài sâm quý có giá trị kinh tế cao thuộc danh mục sách đỏ cần bảo tồn, nhà nước có chủ trương bảo vệ nguồn thuốc quý nguồn sâm tự nhiên bị khai thác lút, trái phép cách nghiêm trọng, ảnh hưởng đến nguồn gen quý, dẫn đến cạn kiệt, đồng thời tạo áp lực cho ngành dược liệu nước ta Hơn nữa, việc sử dụng hợp chất từ sâm Việt Nam vào sản xuất dược phẩm cịn gặp nhiều khó khăn nguồn cung cấp sâm Việt Nam giới hạn vùng núi Ngọc Linh, việc trồng trọt phải nhiều thời gian, thường từ 5–7 năm trước thu hoạch thân rễ rễ sâm Việt Nam khó ni trồng nhân rộng [8] Đứng trước thách thức đó, ni cấy rễ xem giải pháp thay đầy tiềm để thu nhận hoạt chất thứ cấp từ loài sâm quý này, khả sản xuất ổn định lượng lớn sinh khối thời gian ngắn Việc nghiên cứu thành phần hóa học mẫu rễ nuôi cấy sâm Việt Nam đem lại ý nghĩa khoa học giá trị thực tiễn cao Hiện kỹ thuật sắc ký sử dụng rộng rãi, phổ biến dùng để tách, nhận biết, định lượng thành phần hỗn hợp ứng dụng lĩnh vực dược phẩm, thực phẩm, mơi trường,… nhiều lý có độ nhạy cao, khả định lượng tốt, thích hợp tách hợp chất khó bay dễ phân hủy nhiệt [11] Trên sở đánh giá thành phần hóa học có mẫu rễ nuôi cấy sâm Việt Nam phịng thí nghiệm, chúng tơi tiến hành đề tài “Bƣớc đầu nghiên cứu thành phần hóa học mẫu rễ tóc ni cấy Sâm Việt Nam” với mục tiêu chính: Phân tích thành phần saponin mẫu rễ tóc ni cấy Sâm Việt Nam kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao Định lượng sơ thành phần saponin mẫu rễ tóc ni cấy Sâm Việt Nam kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao Dựa kết đó, bước đầu đưa kết luận sơ tiềm phương pháp ni cấy mẫu rễ tóc Sâm Việt Nam tương lai ... phần hóa học có mẫu rễ ni cấy sâm Việt Nam phịng thí nghiệm, chúng tơi tiến hành đề tài “Bƣớc đầu nghiên cứu thành phần hóa học mẫu rễ tóc ni cấy Sâm Việt Nam? ?? với mục tiêu chính: Phân tích thành. ..ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC Người thực hiện: PHÙNG TIẾN HẢI BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA MẪU RỄ TĨC NI CẤY CỦA SÂM VIỆT NAM KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH... thành phần saponin mẫu rễ tóc ni cấy Sâm Việt Nam kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao Định lượng sơ thành phần saponin mẫu rễ tóc ni cấy Sâm Việt Nam kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao Dựa kết đó, bước đầu