Đánh giá hoạt tính sinh học LH và FSH của hormone eCG tái tổ hợp trên dòng tế bào HEK293 và mLTC 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC QUY NHƠN VÕ THỊ THU HIỀN ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC LH VÀ FSH CỦA HORMONE eCG TÁI TỔ HỢP TRÊN DÒNG TẾ BÀO HEK293 mLTC-1 Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Mã số: 8420114 Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thị Mộng Điệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc phép cơng bố Bình Định, tháng 08 năm 2022 Học viên Võ Thị Thu Hiền LỜI CẢM ƠN Trước hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc kính trọng tới Ban giám hiệu Trường Đại học Quy Nhơn, Quý Thầy Cô trường tạo điều kiện truyền thụ kiến thức q báu để tơi hồn thành khóa học Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Thị Mộng Điệp, người cô đầy tâm huyết tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành luận văn Cơ ln tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu khoa học, nguồn động lực lớn giúp tơi vượt qua khó khăn q trình hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Quỹ Đổi sáng tạo Vingroup (VINIF) tài trợ kinh phí cho chúng tơi thực đề tài nghiên cứu Xin cảm ơn thầy Học viện Quân y Hà Nội hết lòng giúp đỡ, tạo điều kiện cho tơi q trình thực luận văn Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, người thân tập thể lớp Sinh học thực nghiệm K23 động viên giúp đỡ tơi q trình học tập thực đề tài nghiên cứu Do thời gian hiểu biết thân có hạn nên luận văn khó tránh khỏi sai sót Tơi mong nhận lời góp ý, bảo thầy để hồn thiện luận văn Bình Định, tháng 08 năm 2022 Học viên Võ Thị Thu Hiền MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ DANH MỤC HÌNH ẢNH MỞ Đ U 1 Lý chọn đề tài Mục đ ch nhiệm vụ nghi n cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu ngh a khoa học thực ti n đề tài 4.1 ngh a khoa học 4.2 ngh a thực ti n Những đóng góp đề tài CHƢƠNG TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan hormone gonadotropin 1.2 Tổng quan eCG 1.2.1 Nguồn gốc cấu trúc eCG 1.2.2 Hoạt động sinh học eCG 10 1.2.3 Chức eCG 11 1.3 Những nghiên cứu eCG tái tổ hợp 13 1.4 Tổng quan tế bào HEK293 mLTC-1 19 1.4.1 Tổng quan tế bào HEK293 19 1.4.2 Tổng quan tế bào mLTC-1 21 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tượng nghiên cứu: Hoạt tính sinh học LH FSH hormone eCG tái tổ hợp chuỗi đơn 25 2.2 Hóa chất thiết bị 25 2.3 Nội dung nghiên cứu 26 2.3.1 Xác định hoạt tính sinh học LH eCG tái tổ hợp in vitro 26 2.3.1.1 Xác định nồng độ cAMP tạo tế bào mLTC-1 đáp ứng với kích hoạt eCG tái tổ hợp chuỗi đơn 26 2.3.1.2 Xác định nồng độ Progesterone sản sinh tế bào mLTC-1 đáp ứng với kích hoạt eCG tái tổ hợp chuỗi đơn 26 2.3.1.3 Xác định nồng độ ATP sản sinh tế bào mLTC-1 đáp ứng với kích hoạt eCG tái tổ hợp chuỗi đơn 26 2.3.1.4 Xác định tỷ lệ sống tế bào sau kích kích eCG tái tổ hợp chuỗi đơn 26 2.3.2 Xác định hoạt tính sinh học FSH eCG tái tổ hợp in vitro .26 2.3.2.1 Xác định nồng độ cAMP tạo tế bào HEK293 đáp ứng với kích hoạt eCG tái tổ hợp chuỗi đơn 26 2.3.2.2 Xác định nồng độ Progesterone sản sinh tế bào HEK293 đáp ứng với kích hoạt eCG tái tổ hợp chuỗi đơn 26 2.3.2.3 Xác định nồng độ ATP sản sinh tế bào HEK293 đáp ứng với kích hoạt eCG tái tổ hợp chuỗi đơn 26 2.3.2.4 Xác định tỷ lệ sống tế bào sau kích kích eCG tái tổ hợp chuỗi đơn 26 2.4 Phương pháp nghi n cứu 26 2.4.1 Nuôi cấy tế bào 26 2.4.2 Phương pháp t nh tỷ lệ sống tế bào hộp nuôi cấy 28 2.4.3 Phương pháp xác định nồng độ cAMP 29 2.4.4 Phương pháp xác định nồng độ progesterone sản xuất tế bào .29 2.4.5 Xác định mức lượng ATP tế bào 30 2.4.6 Phương pháp t nh tỷ lệ sống tế bào đ a nuôi cấy 31 2.4.7 Phương pháp xử lý số liệu 32 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33 3.1 Xác định hoạt tính sinh học LH FSH eCG tái tổ hợp chuỗi đơn in vitro thông qua nồng độ cAMP tạo tế bào mLTC-1, HEK293 đáp ứng với kích thích eCG 33 3.2 Xác định nồng độ Progesterone sản sinh tế bào mLTC-1 HEK293 đáp ứng với kích hoạt eCG tái tổ hợp chuỗi đơn 39 3.3 Xác định nồng độ ATP sản sinh tế bào mLTC-1 HEK293 đáp ứng với kích hoạt eCG tái tổ hợp chuỗi đơn 43 3.4 Xác định tỷ lệ sống tế bào mLTC-1 HEK293 sau kích kích eCG tái tổ hợp chuỗi đơn 46 KẾT LUẬN 49 KẾT LUẬN 49 KIẾN NGHỊ 50 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN THẠC SĨ (BẢN SAO) DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ đầy đủ STT Từ viết tắt eCG PMSG CTP Carboxyl-terminal peptide LH Luteinizing hormone FSH Follicle-stimulating hormone hCG Human chorionic gonadotropin rec-eCG Recombinant equine chorionic gonadotropin GnRHR Gonadotropin releasing hormone receptor rLH/CGR Equine Chorionic Gonadotropin Pregnant Mare's Serum Gonadotropin Rat luteinizing hormone/chorionic receptor 10 FSHR Follicle-stimulating hormone receptor 11 rFSHR Rat follicle-stimulating hormone receptor gonadotropin DANH MỤC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ Bảng 3.1 Tỷ lệ phần trăm (%) tế bào mLTC-1 sống theo nồng độ eCG 46 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1 Cấu trúc gonadotropin FSH, LH, hCG Hình Cấu trúc gonadotropin động vật có vú cho thấy vị trí gắn carbohydrate 10 Hình Tế bào HEK293 nhuộm huỳnh quang 21 Hình Ni cấy kết dính tế bào HEK293 21 Hình Tế bào Leydig mLTC-1 nhuộm Eosine 23 Hình Tế bào Leydig mLTC-1 ni kết dính 24 Hình Hộp nhựa nuôi cấy tế bào động vật 27 Hình 2.2 Tế bào mLTC-1 ni cấy đ a 96 giếng 28 Hình 2.3 Cơ chế phản ứng phát quang Luciferin Cell-Titer-Glo 2.0 xúc tác enzyme luciferase ion Mg2+ 31 Hình 3.1 Biểu tín hiệu cAMP tác động kích thích eCG tái tổ hợp sau ủ tế bào mLTC-1 HEK293 nồng độ khác 36 Hình 3.2 Biểu tín hiệu cAMP (được chuyển đổi sang giá trị AUC) tác động kích thích eCG sau ủ tế bào mLTC-1 nồng độ khác 37 Hình 3.3 Sơ đồ mơ tả q trình sản xuất cAMP tế bào 39 Hình 3.4 Đồ thị chuẩn Gamme progesterone 41 Hình 3.5 Sản xuất progesterone kích thích eCG tái tổ hơp mLTC-1 42 Hình 3.6 Đồ thị chuẩn ATP 44 Hình 3.7 Ảnh hưởng eCG tái tổ hợp đến nồng độ ATP tế bào mLTC-1 HEK293 45 Hình 3.8 Tế bào mLTC-1 sau ủ với eCG tái tổ hợp kiểm tra khả sống CellTiter-Blue 47 Hình 3.9 Tế bào HEK293 sau ủ với eCG tái tổ hợp kiểm tra khả sống CellTiter-Blue 47 MỞ Đ U Lý chọn đề tài Gonadotropin màng đệm ngựa (eCG), gọi gonadotropin huyết ngựa (PMSG), hormone glycoprotein tiết tế bào biểu mơ có nguồn gốc từ bào thai tạo thành nội mạc tử cung [1], [23] Về cấu trúc, eCG có hai tiểu đơn vị alpha beta Các tiểu đơn vị alpha chung cho tất hormone glycoprotein Các tiểu đơn vị beta đặc trưng theo loài Các tiểu đơn vị beta có tính đặc hiệu với hormone chịu trách nhiệm tính đặc hiệu liên kết với thụ thể, CG liên kết với thụ thể Luteinizing hormone / choriogonadotropin LH eCG thành viên họ hormone glycoprotein hoạt động giống hormone hồng thể (LH) hormone kích thích nang trứng (FSH) lồi khơng ngựa Tuy nhiên, eCG biểu hoạt động giống LH lồi ngựa [21], [54] Cơng dụng eCG bao gồm kích thích dậy thì, tăng cường khả sinh sản rụng trứng [41] Hormone sử dụng rộng rãi, với gonadotropin màng đệm người để kích thích phát triển nang trứng rụng trứng lợn nái chưa trưởng thành [18], [28] eCG sử dụng để gây rụng trứng bò, bị sữa, dê, cừu lợn q trình thụ thai lồi, cho chương trình chuyển phôi eCG thường sử dụng để gây động dục đồng trang trại chăn nuôi lợn, cho phép quản lý lợn hiệu giảm vấn đề an toàn sinh học li n quan đến việc di chuyển động vật vào khỏi chuồng Để chiết xuất tinh chế eCG, ngựa mang thai đặt nơi sản xuất, lượng nhỏ máu rút kiểm tra xét nghiệm hấp thụ mi n dịch liên kết với enzyme (ELISA) để tìm hàm lượng eCG ngựa tiếp cận ngày thứ 40 thai kỳ, xác nhận dương t nh, 46 eCG tái tổ hợp trực tiếp kích thích lên thụ thể kết hợp với protein G (GPCR) màng tế bào, dẫn đến kích hoạt protein Gs để giải phóng tiểu đơn vị Gs α, đến lượt nó, liên kết hoạt hóa adenylate cyclase để chuyển ATP thành cAMP nội bào Như vậy, nghiên cứu này, xác nhận suy giảm lượng ATP tế bào kèm theo gia tăng tổng hợp cAMP tác động kích thích eCG tái tổ hợp 3.4 Xá định tỷ lệ sống tế bào mLTC-1 HEK293 sau kích kích eCG tái tổ hợp chuỗi đơn Tỷ lệ tế bào sống ảnh hưởng trực tiếp đến kết đo nồng độ cAMP ATP tế bào, để khẳng định lại kết phần 3.1 3.3, tế bào sống kiểm tra thông qua chất huỳnh quang CellTiterBlue Tế bào mLTC-1 HEK293 giếng ủ với eCG tái tổ hợp tiếp tục ủ với chất huỳnh quang CellTiter-Blue trước đo t n hiệu Tế bào sống phát huỳnh quang màu vàng sáng, tế bào chết bắt màu xanh đen Bảng 3.1 Tỷ lệ phần trăm (%) tế b o mLTC-1 sống theo nồng độ eCG Tỷ lệ tế bà số eCG (%) mLTC HEK293 100 100 312 µl 98.51 ± 0.07 99.14 ± 0.07 0.625 µl 99.14 ± 0.02 98.70 ± 0.04 1.25 µl 98.34 ± 0.02 98.35 ± 0.02 2.5 µl 98.17 ± 0.03 99.15 ± 0.05 µl 98.53 ± 0.03 98.12 ± 0.05 10 µl 98.43 ± 0.01 99.17 ± 0.03 Ctrl (NZY01) 98.31 ± 0.04 99.20 ± 0.02 µl 47 Hình 3.11 Tế bào mLTC-1 sau ủ với eCG tái tổ hợp v đƣợc kiểm tra khả sống CellTiter-Blue Hình 3.12 Tế bào HEK sau ủ với eCG tái tổ hợp v đƣợc kiểm tra khả sống CellTiter-Blue 48 Kết chúng tơi trình bày bảng 3.1 cho thấy tỷ lệ sống tế bào không bị ảnh hưởng sau ủ so với đối chứng không k ch th ch với eCG hay so với eCG chuẩn NZY01 Như t n hiệu cAMP nội bào tế bào mLTC-1 HEK293 tác động k ch th ch eCG tái tổ hợp hoàn toàn đáng tin cậy không bị ảnh hưởng số lượng tế bào có giếng 49 KẾT LUẬN KẾT LUẬN Qua q trình thực đề tài tơi rút số kết luận việc đánh giá hoạt tính sinh học LH FSH dịng tế bào mLTC-1 HEK293 hormone eCG tái tổ hợp chuỗi đơn Dưới tác động hormone eCG tái tổ hợp chuỗi đơn môi trường in vitro làm tăng nồng độ cAMP nội bào tạo từ tế bào mLTC-1 HEK293 Nồng độ progesterone gia tăng sản xuất tế bào mLTC-1 HEK293 k ch th ch eCG tái tổ hợp chuỗi đơn Dưới k ch hoạt eCG tái tổ hợp nồng độ ATP nội bào sản sinh tế bào mLTC-1 HEK293 giảm dần qua liều adenylate cyclase (AC) chuyển ATP thành cAMP nội bào Tỷ lệ sống tế bào không bị ảnh hưởng sau ủ so với đối chứng không k ch th ch với eCG tái tổ hợp hay so với eCG chuẩn NZY01 Như nồng độ cAMP tăng nồng độ ATP giảm k ch th ch eCG tái tổ hợp không ảnh hưởng đến tỷ lệ sống tế bào 50 KIẾN NGHỊ Kết nghi n cứu luận văn làm sở cho nghi n cứu li n quan đến khả tổng hợp sản xuất hormone eCG tái tổ hợp Tiếp tục nghi n cứu, đánh giá chất lượng hormone eCG tái tổ hợp tổng hợp tr n dòng tế bào khác 51 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Allen WR, Stewart F (1993) Equine chorionic gonadotropin In: McKinnon AO, Voss JL, editors Equine Reproduction Lea and Febiger; Philadelphia, 81-96 [2] Aggarwal BB, Papkoff H (1981) Relationship of sialic acid residues to in vitro biological and immunological activities of equine gonadotropins Biol Reprod, 24(5): 1082-1087 [3] Baruselli PS, Ferreira RM, Sá Filho MF, Nasser LFT, Rodrigues CA and Bo GA (2010) Bovine embryo transfer recipient synchronisation and management in tropical environments Reprod Fertil Dev, 22: 67-74 [4] Bevers MM, Dieleman SJ, Tol van HT, Blankenstein DM and Broek JVD (1989) Changes in pulsatile secretion patterns of LH, FSH, progesterone, androstenedione and oestradiol in cows after superovulation with PMSG J Reprod Fertil, 87: 745- 754 [5] Bo GA, Peres LC, Cutaia LE, Pincinato D, Baruselli PS and Mapletoft RJ (2011) Treatments for the synchronisation of bovine recipients for fixed-time embryo transfer and improvement of pregnancy rates Reprod Fertil Dev, 24: 272-277 [6] Boeta M, Zarco L (2010) Endocrine alterations around the time of abortion in mares impregnated with donkey or horse semen Anim Reprod Sci, 121: 124-130 [7] Bousfield GR, Sugino H, Ward DN (1985) Demonstration of a COOHterminal extension on equine lutropin by means of a common acidlabile bond in equine lutropin and equine chorionic gonadotropin J Biol Chem, 260(17): 9531-9533 52 [8] Byambaragchaa M, Choi SH, Joo HE, Kim SG, Kim YJ, Park GE, Kang MH, Min KS (2021) Specific Biological Activity of Equine Chorionic Gonadotropin (eCG) Glycosylation Sites in Cells Expressing Equine Luteinizing Hormone/CG (eLH/CG) Receptor Dev Reprod, 25(4): 199-211 [9] Canfield RE, O'Connor JF, Birken S, Krichevsky A, Wilcox AJ (1987) “Development of an assay for a biomarker of pregnancy and early fetal loss” Environmental Health Perspectives, 74: 57–66 [10] Cassar G, Friendship RM, Zak LJ, Rogan D, Kirkwood RN (2010) Effect of dose of equine chorionic gonadotropin on the estrus responses of gilts and weaned sows and effect of the interval between equine chorionic gonadotropin and luteinizing hormone injections on sow performance J Swine Health Prod, 18: 182–186 [11] Chopineau M, Martinat N, Galet C, Guillou F (2001) β-subunit 102–104 residues are critical to confer FSH activity to equine LH/CG but are not sufficient to confer FSH activity to human CG J Endocrinol, 169: 55–63 [12] Cole LA (2010) Biological functions of hCG and hCG-related molecules Reprod Biol Endocrinol, 24: 8:102 [13] Courot M, Volland-Nail P (1991) Management of reproduction in farm animals: Present and future Biotechnol Equip, 5: 3–12 [14] Crowe MA, Mullen MP (2013) Regulation and function of gonadotropins throughout the bovine oestrous cycle In: Vizcarra J, editor Gonadotropin IntechOpen; London [15] De Rensis F, Lopez-Gatius F (2014) Use of equine chorionic gonadotropin to control reproduction of the dairy cow: A review Reprod Dom Anim, 49: 177–182 53 [16] Dias CC, Wechsler FS, Day ML and Vasconcelos JL (2009) Progesterone concentrations, exogenous equine chorionic gonadotropin, and timing of prostaglandin F(2alpha) treatment affect fertility in postpuberal Nelore heifers Theriogenology, 72: 378-385 [17] Dickerson LM, Shrader SP, Diaz VA (2008) "Chapter 8: Contraception" In Wells BG, DiPiro JT, Talbert RL, Yee GC, Matzke G Pharmacotherapy: a pathophysiologic approach McGraw-Hill Medical 1313–28 [18] Esbenshade KL, Ziecik AJ, Britt JH (1990) Regulation and action of gonadotropins in pigs Reprod, Fert Suppl, 40: 19–32 [19] Ezcurra D, Humaidan P (2014) "A review of luteinising hormone and human chorionic gonadotropin when used in assisted reproductive technology" Reproductive Biology and Endocrinology, 12 (1): 95 [20] Fowler PA, Sorsa-Leslie T, Harris W, Mason HD (2003) "Ovarian gonadotrophin surge-attenuating factor (GnSAF): where are we after 20 years of research?" (PDF) Reproduction, 126 (6): 689 –99 [21] Galet C, Guillou F, Foulon-Gauze F, Combarnous Y, Chopineau M (2009) The β104-109 sequence is essential for the secretion of correctly folded single-chain βα horse LH/CG and for its activity J Endocrinol, 203: 167–174 [22] Gonzalez A, Wang H, Carruthers TD, Murphy BD and Mapletoft RJ (1994) Superovulation in the cow with pregnant mare serum gonadotrophin: effects of dose and antipregnant mare serum gonadotrophin serum Can Vet J, 35: 158-162 [23] Hoppen HO (1994) The equine placenta and equine chorionic gonadotrophin Exp Clin Endocrinol, 102: 235–243 54 [24] Jeoung YH, Yoon JT, Min KS (2010) Biological functions of the COOH-terminal amino acids of the α-subunit of tethered equine chorionic gonadotropin Reprod Dev Sci, 34: 47–53 [25] Jiang X, Liu H, Chen X, Chen PH, Fischer D, Sriraman V, Yu HN, Arkinstall S, He X (2012) "Structure of follicle-stimulating hormone in complex with the entire ectodomain of its receptor" Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 109(31): 12491–12496 [26] Lecompte F, Roy F, Combarnous Y (1998) International collaborative calibration of a preparation of equine chorionic gonadotrophin (eCG NZY-01) proposed as a new standard J Reprod Fertil, 113(1): 145-50 [27] Lee SY, Byambaragchaa M, Choi SH, Kang HJ, Kang MH, Min KS (2021) Roles of N-linked and O-linked glycosylation sites in the activity of equine chorionic gonadotropin in cells expressing rat luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor and folliclestimulating hormone receptor BMC Biotechnol, 21(1): 52 [28] Lundberg PS, Moskowitz GJ, Bellacose C, Demirel E, Trau HA, Duffy DM (2020) Granulosa cell proliferation is inhibited by PGE2 in the primate ovulatory follicle Animal Cells Syst, 24: 125–135 [29] Martemucci G, D'Alessandro AG (2011) Synchronization of oestrus and ovulation by short time combined FGA, PGF(2alpha), GnRH, eCG treatments for natural service or AI fixed-time Anim Reprod Sci, 123: 32-39 [30] Martinuk SD, Manning AW, Black WD, Murphy BD (1991) Effects of carbohydrates on the pharmacokinetics and biological activity of equine chorionic gonadotropin in vivo Biol Reprod, 45: 598-604 55 [31] Matsui T, Sugino H, Miura H, Bousfield GR, Ward DN, Titani K and Mizuochi T (1991) Beta-subunits of equine chorionic gonadotropin and lutenizing hormone with an identical amino acid sequence have different asparagine-linked oligosaccharide chains Biochem Biophys Res Commun, 174: 940-945 [32] Matteri RL, Baldwin DM, Lasley BL, Papkoff H9 (1987) Biological and immunological properties of zebra pituitary gonadotropins: comparison with horse and donkey gonadotropins Biol Reprod, 36: 1134-1141 [33] Mattos MC, Bastos MR, Guardieiro MM, Carvalho JO, Franco MM, Mourao GB, Barros CM and Sartori R (2011) Improvement of embryo production by the replacement of the last two doses of porcine folliclestimulating hormone with equine chorionic gonadotropin in Sindhi donors Anim Reprod Sci, 125: 119-123 [34] Min KS, Hattori N, Aikawa JI, Shiota K, Ogawa T (1996) Site-directed mutagenesis of recombinant gonadotropin/luteinizing hormone: equine differential chorionic role of oligosaccharides in luteinizing hormone- and follicle-stimulating hormone-like activities Endocrine J, 43: 585–593 [35] Min KS, Park JJ, Byambaragchaa M, Kang MH (2019) Characterization of tethered equine chorionic gonadotropin and its deglycosylated mutants by ovulation stimulation in mice BMC Biotechnol, 19: 60 [36] Min KS, Park JJ, Lee YS, Byambaragchaa M, Kang MH (2020) Comparative gene expressing profiling of mouse ovaries upon stimulation with natural equine chorionic gonadotropin (N-eCG) and tethered recombinant-eCG (R-eCG) BMC Biotechnol, 20(1): 59 56 [37] Min KS, Hiyama T, Seong HH, Hattori N, Tanaka S, Shiota K (2004) Biological activities of tethered equine chorionic gonadotropin (eCG) and its deglycosylated mutants J Reprod Dev, 50(3): 297–304 [38] Mohammad GS (2019) Progesterone induced Warburg effect in HEK293 cells is associated with post-translational modifications and proteasomal degradation of progesterone receptor membrane component J Steroid Biochem Mol Biol [39] Monniaux D, Mariana JC, Gibson WR (1984) Action of PMSG on follicular populations in the heifer J Reprod Fertil, 70: 243-253 [40] Moore WTJr, Ward DN (1980) Pregnant mare serum gonadotropin Rapid chromatographic procedures for the purification of intact hormone and isolation of subunits J Biol Chem, 255: 6923-6929 [41] Murphy B (2012) Equine chorionic gonadotropin: an enigmatic but essential tool Anim Reprod, 9: 223-230 [42] Murphy BD, Martinuk SD (1991) Equine chorionic gonadotropin Endocr Rev, 12: 27-44 [43] Nguyen TMD, Klett D, Filliatreau L, Combarnous Y (2019) Inhibition by fluoxetine of LH-stimulated cyclic AMP synthesis in tumor Leydig cells partly involves AMPK activation PLoS One, 14 (6) : e0217519 [44] Nogueira MF, Melo DS, Carvalho LM, Fuck EJ, Trinca LA, Barros CM (2004) Do high progesterone concentrations decrease pregnancy rates in embryo recipients synchronized with PGF2alpha and eCG? Theriogenology, 61: 1283-1290 [45] Park JJ, JarGal N, Yoon JT, Min KS (2010) β-subunit 94–96 residues of tethered recombinant equine chorionic gonadotropin are important 57 sites luteinizing hormone and follicle stimulating hormone like activities Reprod Dev Biol, 34: 33–40 [46] Park JJ, Seong HK, Kim JS, Munkhzaya B, Kang MH, Min KS (2017) Internalization of Rat FSH and LH/CG Receptors by rec-eCG in CHO-K1 Cells Dev Reprod, 21(2): 111-120 [47] Pierce JG, Parsons TF (1981) Glycoprotein hormones: structure and function Annual Review of Biochemistry, 50 (1): 465–95 [48] Sá Filho MF, Torres-Junior JR, Penteado L, Gimenes LU, Ferreira RM, Ayres H, Castro EPLA, Sales JN and Baruselli PS (2010) Equine chorionic gonadotropin improves the efficacy of a progestin-based fixed-time artificial insemination protocol in Nelore (Bos indicus) heifers Anim Reprod Sci, 118: 182-187 [49] Saint-Dizier M, Foulon-Gauze F, Lecompte F, Combarnous Y, Chopineau M (2011) The additional N-glycosylation site of the equine LH/CG receptor is not responsible for the limited cyclic AMP pathway activation by equine chorionic gonadotropin relative to luteinizing hormone Reprod Biol, 11: 157-164 [50] Saint-Dizier M, Foulon-Gauze F, Lecompte F, Combarnous Y, Chopineau M (2004) Cloning and functional expression of the equine luteinizing hormone/chorionic gonadotrophin receptor J Endocrinol, 183: 551-559 [51] Saneyoshi T, Min KS, Ma JX, Nambo Y, Hiyama T, Tanaka S, Shiota K (2001) Equine follicle-stimulating hormone: molecular cloning of beta subunit and biological role of the asparagine-linked oligosaccharide at asparagine56 of alpha subunit Biol Reprod, 65: 1686–1690 58 [52] Sherman GB, Wolfe MW, Farmerie TA, Clay CM, Threadgill DS, Sharp DC and Nilson JH (1992) A single gene encodes the beta-subunits of equine luteinizing hormone and chorionic gonadotropin Mol Endocrinol, : 951-959 [53] Shiota K, Min KS, Ogawa T (1997) Production of recombinant eCG with potent FSH-like activity by site-directed mutagenesis Nihon Yakurigaku Zasshi, 110 Suppl 1:59 - 62 [54] Stewart F, Allen WR (1981) Biological functions and receptor binding activities of equine chorionic gonadotropins J Reprod Ferti, 62: 527– 536 [55] Sugino H, Bousfiedl GR, Moore WT Jr, Ward DN (1987) Structural studies on equine glycoprotein hormones: amino acid sequence of equine chorionic gonadotropin β-subunit J Biol Chem 262(18): 8603–8609 [56] Ulloa-Aguirre A, Dias JA, Bousfield GR (2017) Gonadotropins Simoni M, Huhtaniemi I (eds) Endocrinology of the Testis and Male Reproduction Endocrinology Springer, Cham [57] LiverTox: Clinical and Research Information on Drug-Induced Liver Injury [Internet] (2012) Bethesda (MD): National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Gonadotropins PHỤ LỤC Một số hình ảnh trình thự luận văn ... này, đánh giá hoạt tính sinh học LH FSH eCG tái tổ hợp chuỗi đơn tr n dòng tế bào HEK293 mLTC- 1 Đây hai dòng tế bào với đặc điểm đặc trưng có chứa thụ thể LH mLTC- 1và FSH HEK293, lựa chọn hai dòng. .. dòng tế bào để thử hoạt tính sinh học eCG tái tổ hợp chuỗi đơn Mục tiêu nội dung nghi n ứu - Mục ti u đề tài đánh giá hoạt t nh LH FSH hormone eCG tái tổ hợp tr n dòng tế bào HEK293 mLTC- 1 3... tính sinh học LH eCG (LH/ CG) dòng tế bào mLTC- 1 hoạt tính sinh học FSH (FSH/ CG) dịng tế bào HEK293 thơng qua tín hiệu cAMP sau sử dụng eCG tái tổ hợp chuỗi đơn sản xuất từ dòng tế bào HEK293 Trong