Báo cáo tiểu luận tìm hiểu về enzyme

Kinh tế ổn định,nhu cầu chăm chút bản thân ngày càng nâng cao, yêu cầu đối với các sảnphẩm tiêu dùng ngày càng khắt khe đặc biệt là các sản phẩm thực phẩm.Nhắm bắt được nhu cầu đó, các c

lOMoARcPSD|39222806 BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP HÀ NỘI BÁO CÁO TIỂU LUẬN TÌM HIỂU VỀ ENZYME GVHD : Trần Đăng Thuần Lớp : 2020DHHTP01 Thành viên nhóm 11: Năm 2022 Downloaded by MON HOANG (monmon3@gmail.com) lOMoARcPSD|39222806 MỤC LỤC MỤC LỤC .1 LỜI MỞ ĐẦU 3 I SƠ LƯỢC VỀ ENZYME 4 I.1 Khái niệm .4 I.2 Phân loại 4 I.3 Vai trò của enzyme 6 II ENZYME LIGASE 6 II.1 Khái quát về enzyme ligase 6 II.1.1 Khái Niệm 6 II.1.2 Giới thiệu 7 II.1.3 Tìm thấy 8 II.1.4 Chức năng Ligase 8 II.1.5 Sử dụng 8 II.2 Phân loại 9 II.2.1 LigD DNA của vi khuẩn 9 II.2.2 Psychrozymes: Một nguồn tài nguyên mới và đầy hứa hẹn cho các ứng dụng công nghiệp .11 II.2.3 Tiêu hóa bộ gen ty thể 14 II.2.4 Lần đầu tiên phát triển thành công enzym ligase mới 15 III.PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT VÀ TINH SẠCH 17 III.1 Các phương pháp sản xuất và tinh sạch enzyme 17 1 Downloaded by MON HOANG (monmon3@gmail.com) lOMoARcPSD|39222806 III.1.1 Phương pháp biến tính chọn lọc 17 III.1.2 Phương pháp kết tủa phân đoạn 18 III.1.3 Phương pháp hấp phụ chọn lọc 18 III.1.4 Phương pháp sắc ký 18 III.1.4 Phương pháp sắc ky cột 19 III.1.5 Phương pháp tách hệ hai pha nước .19 III.1.6 Phương pháp lọc gel sephadex 19 III.2 Sản xuất và tinh sạch enzyme Ligase .20 TÀI LIỆU THAM KHẢO 21 2 Downloaded by MON HOANG (monmon3@gmail.com) lOMoARcPSD|39222806 LỜI MỞ ĐẦU Hiện nay, nước ta đang bước vào thời kỳ cách mạng 4.0 trên tất cả các lĩnh vực kinh tế- xã hội Các thành quả với những thành tựu khoa học công nghệ góp phần thúc đẩy nền kinh tế phát triển Cùng với sự phát triển của kinh tế, đời sống xã hội – tinh thần ngày càng được nâng cao Kinh tế ổn định, nhu cầu chăm chút bản thân ngày càng nâng cao, yêu cầu đối với các sản phẩm tiêu dùng ngày càng khắt khe đặc biệt là các sản phẩm thực phẩm Nhắm bắt được nhu cầu đó, các công ty thực phẩm đã cho ra các sản phẩm mới, các trường đại đại học cũng đã mở các ngành học nghiên cứu liên quan May mắn là sinh viên khoa Hoá – ngành thực phẩm của trường Đại Học Công Nghiệp Hà Nội, được sự giúp đỡ của thầy giáo trong khoa, trong quá trình học tập và rèn luyện, chúng em được tìm hiểu sâu về môn công nghệ enzym, hiểu hơn về các enzyme, các chất xúc tác, các cơ chế, các phương pháp sản xuất, tinh sạch… Môi trường công nghệ rộng lớn ẩn sâu trong các thực phẩm trong quá trình lên men Sản xuất chế phẩm enzyme là một trong những phương hướng chính trong định hướng phát triển công nghiệp vi sinh Các phân lớp enzyme ngày càng được hoàng chỉnh, các chế phẩm ngày càng được ứng dụng nhiều hơn vào các ngành sản xuất trong đó có ngành thực phẩm Để hiểu rõ hơn về những loại enzyme này, hiện nay đã có nhiều bài báo cáo phân tích chi tiết các đặc điểm quan trọng của chúng Dựa trên những tích lũy đạt được trong quá trình học tập và sự tìm hiểu trên các nền tảng khác, chúng em đã đúc kết được một số kiến thức về Enzyme Lygase 3 Downloaded by MON HOANG (monmon3@gmail.com) lOMoARcPSD|39222806 I SƠ LƯỢC VỀ ENZYME I.1 Khái niệm - Enzim hay còn gọi là men(chất xúc tác sinh học-biocatalisateur) có bản chất protein một số là acid ribonucleic - Enzim có trong mọi tế bào,làm nhiệm vụ xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng sinh hóa nhất định trong cơ thể - Nhờ enzim mà 1 số phản ứng xảy ra rất khó khăn khi ở điều kiện bên ngoài cơ thể lại có thể phản ứng rất nhanh chóng,liên tục,nhịp nhàng,với nhiều phản ứng liên hợp trong điều kiện bình thường của cơ thể sinh vật - Hiện nay có khoảng 2000 enzim,trong đó hơn 200 enzim thu nhận ở dạng tinh thể - Ứng dụng của enzim rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như y dược,chăn nuôi,thú y, chế biến thực phẩm(bia,rượu,bánh mì,tương,nước chấm…) I.2 Phân loại Tiểu ban về enzyme (The enzyme Commission EC) được tổ chức bởi Hội hóa sinh quốc tế (The internationl Union of Biochemistry, IUB) đã đưa ra cách phân loại thống nhất dựa trên các loại phản ứng và cơ chế phản ứng Theo cách phân loại này thì enzyme được chia ra làm sáu lớp lớn đánh số từ 1 đến 7 Các số thứ tự này là cố định cho mỗi lớp Bảy lớp enzyme theo phân loại quốc tế gồm có: + EC1 Oxydoreductase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa - khử Trong nhóm này có tất cả các enzyme có các tên thông thường đã biết như dehydrogenase, oxydase, cytochromreductase và peroxydase Trong các phản ứng do chúng xúc tác xảy ta sự vận chuyển hydrogen, sự chuyển electron, sự oxy hóa bởi oxy phân tử, bởi hydrogen peroxide hoặc bởi các chất oxy hóa khác AH2 + B A + AH2 + EC 2 Transferase:Các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị Các transferase do bản chất của những gốc mà chúng vận chuyển có thể tham gia vào các quá trình trao đổi chất rất khác nhau Trong lớp transferase bên cạnh transaminase và methyltransferase còn có các kinase khác nhau (xúc tác chủ yếu cho sự vận chuyển của gốc phosphate từ hợp chất cao năng tới chất khác, một phần lớn các enzyme trước kia gọi là mutase và một vài loại synthetase, ví dụ các enzyme tổng hợp DNA và RNA) AX + B BX + A 4 Downloaded by MON HOANG (monmon3@gmail.com) lOMoARcPSD|39222806 + EC 3 Hydrolase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân Trong lớp này có các enzyme phân giải este (ví dụ lipid), glucozid, amid, peptid, protein AB + H2O AH + BOH + EC 4 Lyase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng phân cắt không cần nước, loại nước tạo thành nối đôi hoặc kết hợp phân tử nước vào nối đôi Thuộc vào lớp này có các enzyme được gọi là hydratase, aldolase, decarboxylase cũng như một số desaminase AB A+ B + EC 5 Isomerase:Các enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa Tính cho đến cùng thì chúng xúc tác cho những phản ứng chuyển các nhóm khác nhau bên trong phân tử Trong lớp này không những có những enzyme chuyển hóa các đồng phân hình học và đồng phân quang học (như alaninracemase) mà cả các enzyme xúc tác cho các phản ứng ví dụ sự chuyển hóa aldose thành cetose (glucosophosphate isomerase, trước kia gọi là phosphohexoisomerase) hoặc biến đổi vị trí của liên kết este bên trong phân tử (ví dụ phosphoglucomutase) ABC ACB + EC 6 Ligase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng tổng hợp có sử dụng liên kết giàu năng lượng ATP v.v Ở đây cần chú ý thêm là các enzyme phân cắt được phân loại với tên “lyase” Nếu cân bằng chuyển dịch về phía tổng hợp thì enzyme đó cũng có thể được gọi là “synthase” Ngược lại chúng ta gọi các enzyme xúc tác cho phản ứng kết hợp 2 phân tử có sự tham gia của ATP hoặc các nucleotide triphosphate tương tự hoặc có sử dụng mối liên kết giàu năng lượng là synthetase Tên gọi theo hệ thống phân loại của lớp này là “ligase” để tránh sự đổi tráo với tên “synthase” đã nói ở trên ATP ADP + Pi A + B AB + EC 7 Translocases: Xúc tác sự chuyển động của các ion hoặc phân tử qua màng hoặc sự phân tách của chúng trong màng Đóng vai trò là một người vận chuyển Đây là lớp enzyme mới được công bố chính thức tại trang web của Ủy ban Danh pháp của Liên minh Quốc tế về Hóa sinh và Sinh học phân tử Vào tháng 8 năm 2018, IUBMB đã sửa đổi hệ thống bằng cách thêm danh mục EC 7 cấp cao nhất chứa chuyển vị 5 Downloaded by MON HOANG (monmon3@gmail.com) lOMoARcPSD|39222806 I.3 Vai trò của enzyme - Enzim giúp cho các phản ứng sinh hoá trong tế bào diễn ra nhanh hơn (không quyết định chiều phản ứng) tạo điều kiện cho các hoạt động sống của tế bào - Tế bào có thể tự điều chỉnh quá trình chuyển hoá vật chất để thích ứng với môi trường bằng cách điều chỉnh hoạt tính của các enzim - Ức chế ngược là kiểu điều hoà mà trong đó sản phẩm của con đường chuyển hoá quay lại tác động như 1 chât ức chế làm bất hoạt enzim xúc tác cho phản ứng ở đầu con đường chuyển hoá II ENZYME LIGASE II.1 Khái quát về enzyme ligase II.1.1 Khái Niệm - Ligase là gì? Từ ' ligase ' bắt nguồn từ từ ' ligare ' trong tiếng Latinh, có nghĩa là "ràng buộc" Trong sinh học, ligase là một loại enzyme - Ligase là lớp enzyme mang lại sự liên kết hoặc liên kết của hai phân tử Theo định nghĩa trong sinh học, nó là lớp enzyme xúc tác sự liên kết hoặc liên kết của hai đại phân tử bằng cách hình thành các liên kết mới như CO, CN và CS Enzyme ligase xúc tác phản ứng ligase, ví dụ: AD + X AX + d HOẶC BC + VW BV + c + w + f + g - Trong đó d, c, w, f, g đại diện cho các nhóm mặt dây chuyền nhỏ đã bị thủy phân trong quá trình thắt hoặc nối của hai đại phân tử (ví dụ AX và BV, trong các phản ứng trên) - Khoảng 50 enzym ligase đã được biết đến và thường được gọi là “keo phân tử” DNA ligase là một ví dụ Nó xúc tác sự liên kết của các đoạn DNA bằng cách hình thành một liên kết phosphodiester giữa các đầu bổ sung của các đoạn DNA Do đó, DNA ligase đóng một vai trò quan trọng trong việc sửa chữa, sao chép và tái tổ hợp DNA  Định nghĩa Sinh học / Hóa sinh: - Ligase là một enzym xúc tác sự liên kết của hai phân tử Một ví dụ là DNA ligase liên kết hai đoạn DNA bằng cách hình thành liên kết phosphodiester Chất phối ghép được phân loại thành sáu phân lớp: (1) EC 6.1 (ligases tạo liên kết carbon-oxy), (2) EC 6.2 (ligases hình thành liên kết carbon-lưu huỳnh), (3) EC 6.3 (ligases hình thành liên kết carbon-nitơ), ( 4) EC 6.4 (ligases tạo liên kết carbon-carbon), (5) EC 6.5 (ligases tạo liên kết phosphoric ester) và (6) EC 6.6 (ligases tạo liên kết nitơ-kim loại) 6 Downloaded by MON HOANG (monmon3@gmail.com) lOMoARcPSD|39222806 II.1.2 Giới thiệu - Thuật ngữ ligase được sử dụng cho nhiều loại enzym hoàn toàn không liên quan Đặc điểm chung của tất cả chúng là có khả năng liên kết cộng hóa trị hai phân tử cơ chất với nhau Ở đây, thuật ngữ này sẽ được sử dụng cho các DNA-ligase , đóng vai trò trung tâm trong quá trình sao chép, tái tổ hợp và sửa chữa DNA Những ligase này được sử dụng để đóng các đứt gãy sợi đơn trong đường trục phosphate của phân tử DNA bằng cách hình thành các liên kết diester mới Thông thường, điều này giống với bước cuối cùng của sự kiện sửa chữa hoặc tái tổ hợp và một trong những bước cuối cùng của quá trình sao chép DNA Sự sao chép là một nguồn nổi bật của các phân tử DNA bị hỏng do sự tổng hợp không liên tục của sợi trễ - Các ligase DNA của con người đã biết đều phụ thuộc vào ATP, trái ngược với một số ligase nhân sơ phụ thuộc vào NAD ATP bị thủy phân thành AMP và diphosphat trong quá trình phản ứng Cơ chế phản ứng bao gồm sự hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm epsilon-amino của enzym và AMP Nhóm AMP đã được hoạt hóa này sau đó được chuyển sang nhóm 5'- phosphate của DNA bị đánh dấu, tạo ra phức hợp DNA-AMP có chứa liên kết 5'-5'-phosphoanhydride Nhóm AMP bị thay thế bởi sự tấn công của 3'-OH và liên kết phosphodiester mới được hình thành - Ở người, ba protein ligase DNA đã được biết đến (I, II / III và IV): Ligase I là ligase chính tham gia vào quá trình sao chép và sửa chữa Ligase III tồn tại ở hai dạng, ligase III alpha biểu hiện phổ biến và ligase III beta đặc hiệu cho testis Cả hai dạng đều là kết quả của các sự kiện nối thay thế của một gen đơn lẻ Một đoạn khác của ligase III có thể được tạo ra bởi sự phân cắt protein và trước đây được gọi là ligase II Tomkinson và Levin (1997) - Trái ngược với ligase I và III, có liên quan đến việc sửa chữa các đứt gãy sợi đơn, ligase IV dường như đóng một vai trò quan trọng trong việc sửa chữa các đứt gãy sợi kép (DSB) Ligase IV tham gia vào quá trình nối đầu 7 Downloaded by MON HOANG (monmon3@gmail.com) lOMoARcPSD|39222806 không nguyên tử (NHEJ), một quá trình sửa chữa DSB có thể liên kết các đầu DNA với nhau, không phụ thuộc vào cấu hình đầu cuối của chúng II.1.3 Tìm thấy DNA ligase lần đầu tiên được phát hiện bởi ba phòng thí nghiệm vào năm 1967 Sau nhiều thập kỷ nghiên cứu, các nhà khoa học đã phát hiện ra rằng DNA ligase đã được tìm thấy trong virus, vi khuẩn và sinh vật nhân chuẩn, cơ chế hoạt động của các loại DNA ligase khác nhau Trong những trường hợp bình thường, ligase DNA có thể được chia thành adenosine triphosphate (ATP) loại phụ thuộc và nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) loại phụ thuộc theo nguồn năng lượng cần thiết cho phản ứng xúc tác bởi DNA ligase Ligase DNA phụ thuộc có mặt rộng rãi ở eukaryote, vi khuẩn cổ, vi khuẩn và vi rút, trong khi nicotinamide adenine dinucleotide DNA ligase phụ thuộc được phân bố trong vi khuẩn cổ, vi khuẩn và vi rút II.1.4 Chức năng Ligase Loại enzym này đóng một vai trò quan trọng bằng cách tham gia hai đại phân tử bổ sung như axit nucleic Enzyme DNA ligase thực hiện việc sửa chữa, sao chép và tái tổ hợp DNA Dây chằng là một trong những loại enzyme được sử dụng rộng rãi nhất trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử Các dây thắt được sử dụng trong nhân bản DNA tái tổ hợp để liên kết các đoạn đã được ủ của endonuclease giới hạn II.1.5 Sử dụng DNA ligase chủ yếu được sử dụng trong kỹ thuật di truyền để lắp ráp lại các đầu dính bị "cắt ra" bởi các endonucleases giới hạn, vì vậy nó còn được gọi là "khâu di truyền" E · coli DNA ligase được đề cập trong PEP Sinh học Trung học Tự chọn 3 có nguồn gốc từ Escherichia coli và có thể được sử dụng để kết nối các đầu dính; ligase T4DNA, có nguồn gốc từ thực khuẩn thể T4, có thể được sử dụng để kết nối các đầu dính và phẳng, nhưng hiệu quả thắt thấp 8 Downloaded by MON HOANG (monmon3@gmail.com) lOMoARcPSD|39222806 II.2 Phân loại Ligase được phân loại là EC6 trong số EC, và được chia nhỏ thành 6 loại phụ: Bảng sáu phân lớp của ligases Liên kết phân tử liên Lớp con Thí dụ quan Ligase Liên kết Carbon-Oxy EC 6.1 Aminoacyl tRNA synthetase (CO) Liên kết cacbon-lưu EC 6.2 Succinyl coenzyme A synthetase, huỳnh (CS) Thiokinase Liên kết cacbon-nitơ EC 6.3 Ubiquitin ligase, argininosuccinate (CN) synthetase Liên kết cacbon- EC 6.4 Gamma-glutamyl carboxylase, cacbon (CC) polyketide synthase Liên kết este EC 6,5 sợi DNA photphoric Liên kết nitơ-kim loại EC 6,6 Chelatases II.2.1 LigD DNA của vi khuẩn Ku và LigD đại diện cho một hệ thống NHEJ hai thành phần chức năng ở vi khuẩn Việc sửa chữa plasmid đã đạt được trong ống nghiệm chỉ sử dụng Ku và LigD, và việc xóa bỏ cả hai in vivo làm giảm đáng kể tần suất các sự kiện sửa chữa NHEJ Việc loại bỏ LigD trong vi khuẩn là không gây chết người, không giống như LigA thiết yếu được sử dụng trong quá trình sao chép DNA LigD không cần thiết để tồn tại trong điều kiện phát triển bình thường; tuy nhiên, các đột biến không có LigD (ΔLigD) trong mycobacterium nhạy cảm với IR và có tỷ lệ sống sót thấp hơn các tế bào kiểu hoang dã Ở một số vi khuẩn, LigD hoạt động như một enzym sửa chữa đa chức năng nhỏ gọn, với ba miền riêng biệt, mỗi miền có các hoạt động xúc tác liên quan; ligase, 9 Downloaded by MON HOANG (monmon3@gmail.com) lOMoARcPSD|39222806 polymerase và nuclease Thứ tự của ba miền này không được bảo tồn nghiêm ngặt trong các loài vi khuẩn khác nhau và nhiều LigD chỉ sở hữu các miền ligase và polymerase Cũng cần lưu ý rằng nhiều sinh vật nhân sơ mã hóa các hoạt động này trên các gen riêng biệt thường được liên kết với operon Miền ligase của LigD là miền lớn nhất trong ba đơn vị con và được sử dụng riêng cho bước niêm phong nick cuối cùng của NHEJ Sự đột biến của dư lượng xúc tác trong miền ligase ngăn cản NHEJ thành công Miền polymerase thể hiện tính linh hoạt đáng kể của việc kết hợp nucleotide Nucleotide có thể được thêm vào các đầu cùn mà không có khuôn mẫu (end transferase), trong các khoảng trống trong trình tự và các base bị hư hỏng đối diện NHEJ polymerase này không phải là một thành viên của polymerase họ X, giống như các polymerase NHEJ của người μ, λ, β và TdT Thay vào đó, polymerase của vi khuẩn là một thành viên của prichaeo- eukaryoticgia đình siêu nhân Ý nghĩa của khám phá này là polymerase NHEJ có thể đã phát triển thành vai trò kết thúc từ một priase Một số cấu trúc tinh thể của các polymerase NHEJ khác nhau của vi khuẩn đã được giải quyết, trong đó có một cấu trúc liên kết với DNA Các cấu trúc này đã chứng minh các gốc axit amin quan trọng tiếp xúc với DNA ở các vị trí khác nhau và các phần tử hướng dẫn nucleotide đến vào vị trí hoạt động sẵn sàng để bổ sung Cấu trúc tinh thể của một LigD hoàn chỉnh vẫn chưa được giải quyết, mặc dù miền ligase cô lập đã được làm sáng tỏ Cấu trúc của miền phosphoesterase / nuclease (PE) vẫn chưa được giải quyết, điều này có thể giữ chìa khóa cho vai trò cụ thể của nó trong NHEJ Miền PE có khả năng loại bỏ cả hai nucleotidevà các nhóm phosphate từ các đầu tận cùng của DNA, mặc dù việc mất các hoạt động này không ảnh hưởng đến NHEJ trong các xét nghiệm sửa chữa plasmid; do đó, vai trò chính xác của nó vẫn còn được thiết lập Người ta cho rằng một nuclease không xác định có thể cung cấp hoạt tính phân giải nucleotit trong NHEJ của vi khuẩn 10 Downloaded by MON HOANG (monmon3@gmail.com) lOMoARcPSD|39222806 Enzyme như tác nhân khử trực tiếp- mycotoxin Chất nối là các enzym có khả năng xúc tác phản ứng nối hai phân tử lớn bằng cách thiết lập một liên kết hóa học mới, nói chung là thủy phân đồng thời một nhóm hóa học nhỏ trên một trong các phân tử cồng kềnh hoặc đơn giản là liên kết của hai hợp chất với nhau (ví dụ, các enzym xúc tác sự tham gia của C – O, C – S, C – N, v.v.) Chúng được phân loại theo EC 6 lớp chính của các enzym và tiếp tục được chia thành sáu phân lớp được gọi là ligases thiết lập liên kết carbon-oxy, liên kết carbon-lưu huỳnh, liên kết carbon-nitơ, liên kết carbon-carbon, liên kết phosphoric-este và liên kết nitơ-kim loại [7] Tên thông thường của enzyme ligase thường bao gồm từ “ligase”, bao gồm DNA ligase, một loại enzyme thường được sử dụng trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử để nối các đoạn DNA Các tên chung khác của ligases bao gồm synthetase, vì chúng xúc tác phản ứng tổng hợp các phân tử mới và chúng yêu cầu năng lượng từ nucleoside triphosphat để xúc tác phản ứng tổng hợp II.2.2 Psychrozymes: Một nguồn tài nguyên mới và đầy hứa hẹn cho các ứng dụng công nghiệp Sợi DNA DNA ligase là một loại enzyme khác thường được sử dụng trong sinh học phân tử để xúc tác quá trình tổng hợp các liên kết phosphodiester trong các phân tử DNA sợi đôi được cắt ngắn Hiện tại, các ngành công nghiệp sử dụng các ligase T4, T7 và E coli tái tổ hợp, hoạt động ở nhiệt độ cao Tuy nhiên, ở nhiệt độ cao, các nucleaza còn sót lại gây cản trở quá trình thắt nút Vấn đề này có thể được giải quyết dễ dàng bằng cách sử dụng các ligase DNA psychrophilic Nghiên cứu theo hướng này đã dẫn đến việc phát hiện ra một DNA ligase mới từ psychrophile, Pseudoalteromonas haloplankti, được báo cáo là đã hiển thị hoạt động ở nhiệt độ thấp tới 4 ° C Tuy nhiên, hiệu quả của các ligase DNA hoạt động lạnh như vậy trong các quy trình công nghệ sinh học truyền thống vẫn cần được kiểm tra và xác nhận 11 Downloaded by MON HOANG (monmon3@gmail.com) lOMoARcPSD|39222806 Ligase, một loại enzyme sử dụng ATP để tạo liên kết, được sử dụng trong quá trình nhân bản DNA tái tổ hợp để nối các đoạn endonuclease giới hạn đã được ủ Ligase thường được sử dụng là T4 DNA ligase, lần đầu tiên được phân lập từ E coli đã bị nhiễm vi khuẩn lytic T4 Gen được mã hóa bởi bộ gen T4 và có vai trò trong chu trình lây nhiễm của thể thực khuẩn T4 DNA ligase xúc tác sự hình thành các liên kết phosphodiestergiữa termini 3′- hydroxyl và 5′-phosphaste liền kề trong DNA sợi đôi Hiện nay ligase có sẵn trên thị trường được tạo ra bằng các phương tiện DNA tái tổ hợp T4 DNA ligase là một polypeptide đơn 68 kDa; enzyme yêu cầu Mg 2+ và ATP làm đồng yếu tố Enzyme không hoạt động trên axit nucleic mạch đơn T4 DNA ligase có thể liên kết với termini so le hoặc kết thúc thẳng thừng và nó có thể sửa chữa các lỗ hổng trong DNA sợi đôi Vì ligase DNA T4 đòi hỏi một phosphate 5 ′, nên có thể ngăn chặn sự liên kết lại của DNA vector bằng cách loại bỏ nhóm phosphate khỏi vector bằng cách sử dụng phosphatase kiềm của vi khuẩn hoặc phosphatase kiềm trong ruột bê Để biết chi tiết, xem Sambrook et al (1989, P 1.56) Các nhà cung cấp ligase thường cung cấp các loại muối sử dụng với ligase để tạo ra các điều kiện thích hợp cho hoạt động tối ưu của ligase Ví dụ, Gibco / BRL cung cấp bộ đệm phản ứng thắt chặt 5 × với ligase DNA T4 của nó [đệm phản ứng thắt 5 ×: 0,25 M Tris, pH 7,6, 50 m M MgCl 2,5 m M ATP, 5 m M DTT, 25 % (w / v) polyetylen glycol (8000)] Vì tế bào E coli có chứa ligase của chính nó, vi khuẩn có thể nối các đầu của DNA tái tổ hợp trong tế bào Tuy nhiên, quá trình đó không hiệu quả như thắt trong ống nghiệm Việc sử dụng ligase để nối các đầu của phân tử DNA tái tổ hợp trước khi chúng được đưa vào tế bào E coli có một số ưu điểm so với việc đưa các phân tử DNA tái tổ hợp mà không cần thắt trong ống nghiệm Việc thắt trong ống nghiệm các phân tử DNA tái tổ hợp làm tăng đáng kể tần số biến nạp — số lượng chất biến nạp thu được trên mỗi 12 Downloaded by MON HOANG (monmon3@gmail.com) lOMoARcPSD|39222806 microgram DNA — vì DNA được nối ít bị phân huỷ bởi các nuclease trong tế bào E coli Thắt trong ống nghiệm cũng bảo tồn các vị trí phân cắt endonuclease hạn chế được sử dụng để cắt DNA ban đầu Ngoài ra, trong phản ứng thắt trong ống nghiệm , nồng độ của DNA có thể được điều chỉnh để có lợi cho việc hình thành các phân tử tròn hoặc thẳng Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thắt nút bao gồm nhiệt độ của phản ứng, nồng độ tương đối của các đầu mút của phân tử ADN và bản chất của các đầu tận cùng của phân tử ADN Để xác định nhiệt độ của phản ứng thắt chặt, cả nhiệt độ của hoạt động ligase tối ưu và nhiệt độ để tái tạo lại các đầu của phân tử DNA tái tổ hợp một cách hiệu quả đều được xem xét Nhiệt độ của hoạt động ligase tối ưu là 37 ° C Các đầu kết dính được tạo ra bởi quá trình tiêu hóa endonuclease hạn chế là ngắn Đối với việc nối các mảnh có các đầu cố kết, chiều dài của các đầu cố kết và thành phần cơ bản của các đầu sẽ xác định nhiệt độ ủ lại của các đầu Lưu ý rằng giới hạn endonuclease Eco RI tạo ra phần nhô ra sợi đơn của AATT Nhiệt độ nóng chảy, T m , của dãy 4 bp này là 5 ° C Do đó, ngay cả nhiệt độ tương đối thấp cũng có thể dẫn đến sự phá vỡ liên kết hydro giữa các cặp bazơ Nhiệt độ khuyến nghị cho phản ứng thắt nút đã thay đổi BRL kiểm tra đơn vị hoạt động của ligase ở 37 ° C trong 20 phút Trong những lần đầu sử dụng T4 DNA ligase để nối các đoạn DNA tái tổ hợp, nhiệt độ phản ứng là 13 ° C Nhiệt độ này là sự thỏa hiệp giữa nhiệt độ tối ưu của hoạt động ligase và nhiệt độ ủ lại các đầu của tái tổ hợp Khi các chế phẩm hoạt tính hơn của ligase được bán trên thị trường, nhiệt độ phản ứng đề xuất của nhà cung cấp đã tăng lên nhiệt độ phòng Ligase hoạt động mạnh và được sử dụng ở nồng độ đủ cao nên khi các phân tử DNA tái tổ hợp được ủ trong thời gian ngắn, ligase ngay lập tức tham gia vào các đầu tận cùng 13 Downloaded by MON HOANG (monmon3@gmail.com) lOMoARcPSD|39222806 Ligase cũng có khả năng xúc tác sự tham gia của các phân tử DNA có đầu cùn, nhưng nồng độ ligase cao hơn được sử dụng để thực hiện phản ứng này một cách hiệu quả Các báo cáo gần đây mô tả việc sử dụng phương pháp điều trị siêu âm ở 16 ° C trong 15 phút để tạo ra các mối nối hữu ích ( Hengen, 1993 ) Phương trình Jacobsen Stockmeyer có thể được sử dụng để xác định nồng độ của các đầu tận cùng của phân tử DNA để sử dụng trong phản ứng thắt II.2.3 Tiêu hóa bộ gen ty thể DNA ligase xúc tác sự tham gia của các polynucleotide liền kề và do đó đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa DNA Thực vật, giống như tất cả các sinh vật nhân chuẩn, có nhiều DNA ligase với các vai trò riêng biệt trong quá trình chuyển hóa DNA Trong số này, DNA ligase 1 (LIG1) có trong tất cả các sinh vật nhân chuẩn Nó đóng vai trò quan trọng trong cả quá trình sửa chữa và sao chép DNA và không thể thiếu đối với khả năng tồn tại của tế bào ( Lohman, Tabor, & Nichols, 2011 ) Trong Arabidopsis , LIG1 chiếm hoạt động chính của DNA ligase và đã được chứng minh là có các chức năng thiết yếu trong cả con đường tái bản DNA và sửa chữa cắt bỏ ( Cordoba- Canero, Roldan-Arjona, & Ariza et al , 2011) LIG1: phản ứng tổng hợp protein huỳnh quang xanh lục (GFP) cho thấy rằng, giống như trong nấm men, LIG1 được nhắm mục tiêu hai mặt tới nhân và tới ty thể ( Sunderland, West, Waterworth, & Bray, 2006 ) Mặc dù các thí nghiệm nhập khẩu này không phát hiện được LIG1 trong lục lạp , nhưng protein được tìm thấy trong proteome của các nucleoid plastidial của ngô ( Majeran và cộng sự , 2012 ) Có lẽ, LIG1 đảm nhận chức năng của nó trong cả ba ngăn bộ gen của tế bào thực vật Vai trò của LIG1 trong sao chép, tái tổ hợp và sửa chữa mtDNA vẫn chưa được nghiên cứu II.2.4 Lần đầu tiên phát triển thành công enzym ligase mới Mới đây, các nhà nghiên cứu tại Trường Đại học Brown (Hoa Kỳ) đã phát triển thành công enzym ligase ARN cho các ứng dụng trong phòng thí 14 Downloaded by MON HOANG (monmon3@gmail.com) lOMoARcPSD|39222806 nghiệm Enzym ligase mới này bắt nguồn từ một loại vi khuẩn phát triển rất nhanh sống gần miệng phun núi lửa, có tên là KOD1Rnl, có khả năng hoạt động trong môi trường nhiệt độ rất cao trong một số thí nghiệm Nó cũng có biểu hiện hoạt động tích cực nhất trong cấu trúc ARN nhất định, được gọi là các template, khiến nó trở nên rất có ích đối với giải trình tự và phát hiện ARN Công trình nghiên cứu đã được công bố trên tạp chí RNA Biology Theo Lei Zhang, sinh viên tốt nghiệp chuyên ngành kỹ thuật y sinh tại Đại học Brown, tác giả chính của bài báo nghiên cứu, cho biết: “Enzym ligase mới này có tất cả các đặc tính cho việc thao tác ARN mà chúng tôi mong muốn Chúng tôi nghĩ rằng nó sẽ là một công cụ hữu ích có thể bổ xung thêm vào hộp công cụ kỹ thuật sinh học” “Mục tiêu của nhóm nghiên cứu là nhắm đến các kỹ thuật chẩn đoán y học, các liệu pháp phân tử, và đặc biệt là sự phân tách ARN”, Tripathi cho biết “Trong nhiều nghiên cứu gần gây, chúng tôi đã thiết kế được các nền tảng và các xét nghiệm phân tử mới giúp phát hiện nhanh chóng sự lây nhiễm vi rút và biểu hiện đột biến của vi rút Trong quá trình chúng tôi thiết kế, xây dựng các tấm kênh dẫn vi lưu và các xét nghiệm trong phòng thí nghiệm, chúng tôi luôn dựa vào các loại thuốc thử có sẵn để tăng hiệu quả của các xét nghiệm này Khi các nghiên cứu của chúng tôi trở nên phức tạp hơn, chúng tôi thấy thất vọng hơn bởi vì chúng tôi cần có các enzym đặc biệt để thực hiện nghiên cứu, chẳng hạn như enzym ligases, mà lại không có”, Tripathi cho biết Chỉ có một vài enzym ligase ARN có khả năng chịu được nhiệt độ cao, điều này có nghĩa là chỉ có những enzym đó mới có thể hoạt động dưới một môi trường nhiệt độ cao Việc nghiên cứu ARN trong môi trường nhiệt độ cao hơn có thể giúp các quá trình diễn ra dễ dàng hơn Ở nhiệt độ phòng hoặc nhiệt độ cơ thể, các phân tử ARN ở trong một tình trạng hỗn độn nhưng khi 15 Downloaded by MON HOANG (monmon3@gmail.com) lOMoARcPSD|39222806 được nung nóng lên, những hỗn độn này được nới lỏng và các phân tử duỗi thẳng ra “Khi nghiên cứu ARN, bạn thường muốn lai ghép hoặc kết hợp một acid nucleic với nó Điều đó dễ dàng hơn nhiều khi các phân tử được sắp xếp theo một đường thẳng (tuyến tính) Khi nó ở trong một tình trạng rối rắm, nhiều vị trí để lai ghép sẽ bị chặn lại”, Tripathi nói Vấn đề là mức nhiệt độ cần để có thể duỗi thẳng ARN thường quá cao để enzym ligase có thể làm nóng các phân tử một cách hiệu quả Tuy nhiên, KOD1Rnl lại có thể hoạt động ở nhiệt độ lên đến gần 140 độ F Do đó cho phép enzym này có thể làm việc ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ cơ thể trong phòng thí nghiệm Sự phụ thuộc nhiệt độ của enzym này cũng rất quan trọng Một enzym ligase ARN phụ thuộc nhiệt độ nào đó sẽ hợp nhất hai sợi ARN chỉ khi một sợi nào đó được sắp cận kề với một sợi khác lên trên một template nào đó Các nhà khoa học sẽ sử dụng đặc điểm này để phát hiện và sắp chuỗi ARN Trong nghiên cứu của họ, Zhang và Tripathi đã sử dụng enzym KOD1Rnl để thắt buộc các mẫu dò đã được tạo ra để phát hiện bản sao ARN Ebola đã được tạo ra trong phòng thí nghiệm Tuy nhiên, sự phụ thuộc cũng mang lại lợi ích trong việc phát hiện các đột biến trong ARN Điều này là nhờ vào việc tạo ra các mẫu dò ARN-các sợi ARN có chứa các đột biến liên quan Các hạt thăm dò (probes) sẽ tìm thấy những chỗ rạn nứt hoặc các khía nhỏ tại các điểm dọc theo các sợi ở những vị trí xuất hiện đột biến Các hạt thăm dò này sau đó được gép cặp hoặc lai ghép với một sợi ARN nhắm đích trong enzym ligase phụ thuộc nhiệt độ cư ngụ tại đó Khi đột biến xuất hiện trong các sợi nhắm đích, hạt thăm dò ARN sẽ lai ghép chính xác, và những khía nhỏ sẽ được bít kín bởi các enzym ligase Nếu không có biểu hiện đột biến, cấu trúc của các phân tử lai sẽ bị phá vỡ và enzym ligase sẽ không 16 Downloaded by MON HOANG (monmon3@gmail.com) lOMoARcPSD|39222806 bít kín các khía rãnh này Bằng cách quan sát, phân tích các khía rãnh nhỏ này có được enzym bít chặt hay không, các nhà khoa học có thể xác định được biểu hiện đột biến hay không đột biến “KOD1Rnl là một nhóm enzym lần đầu tiên được phát triển thành công trong cộng đồng y sinh Là những kỹ sư thuộc lĩnh vưc y sinh học, giấc mơ của chúng tôi là đưa được các kết quả nghiên cứu của mình vào các thử nghiệm lâm sàng, và kết quả nghiên cứu này là một dấu mốc quan trọng để hướng chúng tôi đến mục tiêu đó”, Tripathi cho biết Hiện enzym mới này đã được cấp bằng sáng chế Và nhóm nghiên cứu kỳ vọng có thể sớm đưa enzym ra thị trường III PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT VÀ TINH SẠCH III.1 Các phương pháp sản xuất và tinh sạch enzyme III.1.1 Phương pháp biến tính chọn lọc - Phương pháp này dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH làm biến tính các loại protein tạp Phương pháp này chỉ thích hợp với enzyme chịu axít và bền nhiệt - Người ta đưa nhiệt độ của dung dịch enzyme lên 50-70 0C và pH