Báo cáo tiểu luận tìm hiểu về enzyme

Kinh tế ổn định,nhu cầu chăm chút bản thân ngày càng nâng cao, yêu cầu đối với các sảnphẩm tiêu dùng ngày càng khắt khe đặc biệt là các sản phẩm thực phẩm.Nhắm bắt được nhu cầu đó, các c

BỘ CÔNG THƯƠNGĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

BÁO CÁO TIỂU LUẬN TÌM HIỂU VỀ ENZYME

MỤC LỤC

MỤC LỤC 1

LỜI MỞ ĐẦU 3

I SƠ LƯỢC VỀ ENZYME 4

I.1 Khái niệm 4

I.2 Phân loại 4

I.3 Vai trò của enzyme 6

II ENZYME LIGASE 6

II.1 Khái quát về enzyme ligase 6

II.1.1 Khái Niệm 6

II.1.2 Giới thiệu 7

II.1.3 Tìm thấy 8

II.1.4 Chức năng Ligase 8

II.1.5 Sử dụng 8

II.2 Phân loại 9

II.2.1 LigD DNA của vi khuẩn 9

II.2.2 Psychrozymes: Một nguồn tài nguyên mới và đầy hứa hẹn cho các ứng dụng công nghiệp 11

II.2.3 Tiêu hóa bộ gen ty thể 14

II.2.4 Lần đầu tiên phát triển thành công enzym ligase mới 15

III.PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT VÀ TINH SẠCH 17

III.1 Các phương pháp sản xuất và tinh sạch enzyme 17

III.1.1 Phương pháp biến tính chọn lọc 17

III.1.2 Phương pháp kết tủa phân đoạn 18

III.1.3 Phương pháp hấp phụ chọn lọc 18

III.1.4 Phương pháp sắc ký 18

III.1.4 Phương pháp sắc ky cột 19

III.1.5 Phương pháp tách hệ hai pha nước 19

III.1.6 Phương pháp lọc gel sephadex 19

III.2 Sản xuất và tinh sạch enzyme Ligase 20

TÀI LIỆU THAM KHẢO 21

LỜI MỞ ĐẦU

Hiện nay, nước ta đang bước vào thời kỳ cách mạng 4.0 trên tất cả cáclĩnh vực kinh tế- xã hội Các thành quả với những thành tựu khoa học côngnghệ góp phần thúc đẩy nền kinh tế phát triển Cùng với sự phát triển củakinh tế, đời sống xã hội – tinh thần ngày càng được nâng cao Kinh tế ổn định,nhu cầu chăm chút bản thân ngày càng nâng cao, yêu cầu đối với các sảnphẩm tiêu dùng ngày càng khắt khe đặc biệt là các sản phẩm thực phẩm.Nhắm bắt được nhu cầu đó, các công ty thực phẩm đã cho ra các sản phẩmmới, các trường đại đại học cũng đã mở các ngành học nghiên cứu liên quan.May mắn là sinh viên khoa Hoá – ngành thực phẩm của trường Đại HọcCông Nghiệp Hà Nội, được sự giúp đỡ của thầy giáo trong khoa, trong quátrình học tập và rèn luyện, chúng em được tìm hiểu sâu về môn công nghệenzym, hiểu hơn về các enzyme, các chất xúc tác, các cơ chế, các phươngpháp sản xuất, tinh sạch… Môi trường công nghệ rộng lớn ẩn sâu trong cácthực phẩm trong quá trình lên men

Sản xuất chế phẩm enzyme là một trong những phương hướng chínhtrong định hướng phát triển công nghiệp vi sinh Các phân lớp enzyme ngàycàng được hoàng chỉnh, các chế phẩm ngày càng được ứng dụng nhiều hơnvào các ngành sản xuất trong đó có ngành thực phẩm

Để hiểu rõ hơn về những loại enzyme này, hiện nay đã có nhiều bài báocáo phân tích chi tiết các đặc điểm quan trọng của chúng Dựa trên những tíchlũy đạt được trong quá trình học tập và sự tìm hiểu trên các nền tảng khác,chúng em đã đúc kết được một số kiến thức về Enzyme Lygase

I SƠ LƯỢC VỀ ENZYME

I.1 Khái niệm

- Enzim hay còn gọi là men(chất xúc tác sinh học-biocatalisateur) có bảnchất protein một số là acid ribonucleic

- Enzim có trong mọi tế bào,làm nhiệm vụ xúc tác đặc hiệu cho các phảnứng sinh hóa nhất định trong cơ thể

- Nhờ enzim mà 1 số phản ứng xảy ra rất khó khăn khi ở điều kiện bên ngoài cơ thể lại có thể phản ứng rất nhanh chóng,liên tục,nhịp nhàng,với nhiều phản ứng liên hợp trong điều kiện bình thường của cơ thể sinh vật

- Hiện nay có khoảng 2000 enzim,trong đó hơn 200 enzim thu nhận ở dạng tinh thể

- Ứng dụng của enzim rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như y dược,chăn nuôi,thú y, chế biến thực phẩm(bia,rượu,bánh mì,tương,nước chấm…)

I.2 Phân loại

Tiểu ban về enzyme (The enzyme Commission EC) được tổ chức bởiHội hóa sinh quốc tế (The internationl Union of Biochemistry, IUB) đã đưa racách phân loại thống nhất dựa trên các loại phản ứng và cơ chế phản ứng.Theo cách phân loại này thì enzyme được chia ra làm sáu lớp lớn đánh số từ 1đến 7 Các số thứ tự này là cố định cho mỗi lớp

Bảy lớp enzyme theo phân loại quốc tế gồm có:

+ EC1 Oxydoreductase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa

-khử

Trong nhóm này có tất cả các enzyme có các tên thông thường đã biếtnhư dehydrogenase, oxydase, cytochromreductase và peroxydase Trong cácphản ứng do chúng xúc tác xảy ta sự vận chuyển hydrogen, sự chuyểnelectron, sự oxy hóa bởi oxy phân tử, bởi hydrogen peroxide hoặc bởi cácchất oxy hóa khác

AH2 + B A + AH2

+ EC 2 Transferase :Các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị.

Các transferase do bản chất của những gốc mà chúng vận chuyển có thểtham gia vào các quá trình trao đổi chất rất khác nhau Trong lớp transferasebên cạnh transaminase và methyltransferase còn có các kinase khác nhau (xúctác chủ yếu cho sự vận chuyển của gốc phosphate từ hợp chất cao năng tớichất khác, một phần lớn các enzyme trước kia gọi là mutase và một vài loạisynthetase, ví dụ các enzyme tổng hợp DNA và RNA)

AX + B BX + A

+ EC 3 Hydrolase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân.

Trong lớp này có các enzyme phân giải este (ví dụ lipid), glucozid, amid,peptid, protein

AB + H2O AH + BOH

+ EC 4 Lyase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng phân cắt không cần

nước, loại nước tạo thành nối đôi hoặc kết hợp phân tử nước vào nối đôi.Thuộc vào lớp này có các enzyme được gọi là hydratase, aldolase,decarboxylase cũng như một số desaminase

AB A + B

+ EC 5 Isomerase:Các enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa.

Tính cho đến cùng thì chúng xúc tác cho những phản ứng chuyển cácnhóm khác nhau bên trong phân tử Trong lớp này không những có nhữngenzyme chuyển hóa các đồng phân hình học và đồng phân quang học (nhưalaninracemase) mà cả các enzyme xúc tác cho các phản ứng ví dụ sự chuyểnhóa aldose thành cetose (glucosophosphate isomerase, trước kia gọi làphosphohexoisomerase) hoặc biến đổi vị trí của liên kết este bên trong phân

tử (ví dụ phosphoglucomutase)

ABC ACB

+ EC 6 Ligase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng tổng hợp có sử dụng

liên kết giàu năng lượng ATP v.v

Ở đây cần chú ý thêm là các enzyme phân cắt được phân loại với tên

“lyase” Nếu cân bằng chuyển dịch về phía tổng hợp thì enzyme đó cũng cóthể được gọi là “synthase” Ngược lại chúng ta gọi các enzyme xúc tác chophản ứng kết hợp 2 phân tử có sự tham gia của ATP hoặc các nucleotidetriphosphate tương tự hoặc có sử dụng mối liên kết giàu năng lượng làsynthetase Tên gọi theo hệ thống phân loại của lớp này là “ligase” để tránh sựđổi tráo với tên “synthase” đã nói ở trên

A + B AB

+ EC 7 Translocases: Xúc tác sự chuyển động của các ion hoặc phân tử

qua màng hoặc sự phân tách của chúng trong màng Đóng vai trò là một người vận chuyển

Đây là lớp enzyme mới được công bố chính thức tại trang web của Ủyban Danh pháp của Liên minh Quốc tế về Hóa sinh và Sinh học phân tử Vàotháng 8 năm 2018, IUBMB đã sửa đổi hệ thống bằng cách thêm danh mục EC

7 cấp cao nhất chứa chuyển vị

I.3 Vai trò của enzyme

- Enzim giúp cho các phản ứng sinh hoá trong tế bào diễn ra nhanh hơn(không quyết định chiều phản ứng) tạo điều kiện cho các hoạt động sống của

II ENZYME LIGASE

II.1 Khái quát về enzyme ligase

II.1.1 Khái Niệm

- Ligase là gì? Từ ' ligase ' bắt nguồn từ từ ' ligare ' trong tiếng Latinh, cónghĩa là "ràng buộc" Trong sinh học, ligase là một loại enzyme

- Ligase là lớp enzyme mang lại sự liên kết hoặc liên kết của hai phân tử.Theo định nghĩa trong sinh học, nó là lớp enzyme xúc tác sự liên kết hoặc liênkết của hai đại phân tử bằng cách hình thành các liên kết mới như CO, CN và

CS Enzyme ligase xúc tác phản ứng ligase, ví dụ:

AD + X AX + dHOẶC

BC + VW BV + c + w + f + g

- Trong đó d, c, w, f, g đại diện cho các nhóm mặt dây chuyền nhỏ đã bịthủy phân trong quá trình thắt hoặc nối của hai đại phân tử (ví dụ AX và BV,trong các phản ứng trên)

- Khoảng 50 enzym ligase đã được biết đến và thường được gọi là “keophân tử” DNA ligase là một ví dụ Nó xúc tác sự liên kết của các đoạn DNAbằng cách hình thành một liên kết phosphodiester giữa các đầu bổ sung củacác đoạn DNA Do đó, DNA ligase đóng một vai trò quan trọng trong việcsửa chữa, sao chép và tái tổ hợp DNA

 Định nghĩa Sinh học / Hóa sinh:

- Ligase là một enzym xúc tác sự liên kết của hai phân tử Một ví

dụ là DNA ligase liên kết hai đoạn DNA bằng cách hình thành liên kếtphosphodiester Chất phối ghép được phân loại thành sáu phân lớp: (1) EC 6.1(ligases tạo liên kết carbon-oxy), (2) EC 6.2 (ligases hình thành liên kếtcarbon-lưu huỳnh), (3) EC 6.3 (ligases hình thành liên kết carbon-nitơ), ( 4)

EC 6.4 (ligases tạo liên kết carbon-carbon), (5) EC 6.5 (ligases tạo liên kếtphosphoric ester) và (6) EC 6.6 (ligases tạo liên kết nitơ-kim loại)

II.1.2 Giới thiệu

- Thuật ngữ ligase được sử dụng cho nhiều loại enzym hoàn toàn khôngliên quan Đặc điểm chung của tất cả chúng là có khả năng liên kết cộng hóatrị hai phân tử cơ chất với nhau Ở đây, thuật ngữ này sẽ được sử dụngcho các DNA-ligase , đóng vai trò trung tâm trong quá trình sao chép, tái tổhợp và sửa chữa DNA Những ligase này được sử dụng để đóng các đứt gãysợi đơn trong đường trục phosphate của phân tử DNA bằng cách hình thànhcác liên kết diester mới Thông thường, điều này giống với bước cuối cùngcủa sự kiện sửa chữa hoặc tái tổ hợp và một trong những bước cuối cùng củaquá trình sao chép DNA Sự sao chép là một nguồn nổi bật của các phân tửDNA bị hỏng do sự tổng hợp không liên tục của sợi trễ

- Các ligase DNA của con người đã biết đều phụ thuộc vào ATP, tráingược với một số ligase nhân sơ phụ thuộc vào NAD ATP bị thủy phân thànhAMP và diphosphat trong quá trình phản ứng Cơ chế phản ứng bao gồm sựhình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm epsilon-amino của enzym vàAMP Nhóm AMP đã được hoạt hóa này sau đó được chuyển sang nhóm 5'-phosphate của DNA bị đánh dấu, tạo ra phức hợp DNA-AMP có chứa liên kết5'-5'-phosphoanhydride Nhóm AMP bị thay thế bởi sự tấn công của 3'-OH

và liên kết phosphodiester mới được hình thành

- Ở người, ba protein ligase DNA đã được biết đến (I, II / III và IV):Ligase I là ligase chính tham gia vào quá trình sao chép và sửa chữa LigaseIII tồn tại ở hai dạng, ligase III alpha biểu hiện phổ biến và ligase III beta đặchiệu cho testis Cả hai dạng đều là kết quả của các sự kiện nối thay thế củamột gen đơn lẻ Một đoạn khác của ligase III có thể được tạo ra bởi sự phâncắt protein và trước đây được gọi là ligase II Tomkinson và Levin (1997)

- Trái ngược với ligase I và III, có liên quan đến việc sửa chữa các đứt gãy sợi đơn, ligase IV dường như đóng một vai trò quan trọng trong việc sửa chữa các đứt gãy sợi kép (DSB) Ligase IV tham gia vào quá trình nối đầu

không nguyên tử (NHEJ), một quá trình sửa chữa DSB có thể liên kết các đầuDNA với nhau, không phụ thuộc vào cấu hình đầu cuối của chúng.

II.1.3 Tìm thấy

DNA ligase lần đầu tiên được phát hiện bởi ba phòng thí nghiệm vàonăm 1967 Sau nhiều thập kỷ nghiên cứu, các nhà khoa học đã phát hiện rarằng DNA ligase đã được tìm thấy trong virus, vi khuẩn và sinh vật nhânchuẩn, cơ chế hoạt động của các loại DNA ligase khác nhau Trong nhữngtrường hợp bình thường, ligase DNA có thể được chia thành adenosinetriphosphate (ATP) loại phụ thuộc và nicotinamide adenine dinucleotide(NAD) loại phụ thuộc theo nguồn năng lượng cần thiết cho phản ứng xúc tácbởi DNA ligase Ligase DNA phụ thuộc có mặt rộng rãi ở eukaryote, vi khuẩn

cổ, vi khuẩn và vi rút, trong khi nicotinamide adenine dinucleotide DNAligase phụ thuộc được phân bố trong vi khuẩn cổ, vi khuẩn và vi rút

II.1.4 Chức năng Ligase

Loại enzym này đóng một vai trò quan trọng bằng cách tham gia hai đạiphân tử bổ sung như axit nucleic Enzyme DNA ligase thực hiện việc sửachữa, sao chép và tái tổ hợp DNA

Dây chằng là một trong những loại enzyme được sử dụng rộng rãi nhấttrong phòng thí nghiệm sinh học phân tử Các dây thắt được sử dụng trongnhân bản DNA tái tổ hợp để liên kết các đoạn đã được ủ của endonucleasegiới hạn

II.1.5 Sử dụng

DNA ligase chủ yếu được sử dụng trong kỹ thuật di truyền để lắp ráp lạicác đầu dính bị "cắt ra" bởi các endonucleases giới hạn, vì vậy nó còn đượcgọi là "khâu di truyền"

E · coli DNA ligase được đề cập trong PEP Sinh học Trung học Tự chọn

3 có nguồn gốc từ Escherichia coli và có thể được sử dụng để kết nối các đầudính; ligase T4DNA, có nguồn gốc từ thực khuẩn thể T4, có thể được sử dụng

để kết nối các đầu dính và phẳng, nhưng hiệu quả thắt thấp

II.2 Phân loại

Ligase được phân loại là EC6 trong số EC, và được chia nhỏ thành 6 loạiphụ:

Bảng sáu phân lớp của ligases

Liên kết phân tử liên

quan

Lớp con Ligase

II.2.1 LigD DNA của vi khuẩn

Ku và LigD đại diện cho một hệ thống NHEJ hai thành phần chức năng

ở vi khuẩn Việc sửa chữa plasmid đã đạt được trong ống nghiệm chỉ sử dụng

Ku và LigD, và việc xóa bỏ cả hai in vivo làm giảm đáng kể tần suất các sựkiện sửa chữa NHEJ Việc loại bỏ LigD trong vi khuẩn là không gây chếtngười, không giống như LigA thiết yếu được sử dụng trong quá trình sao chépDNA LigD không cần thiết để tồn tại trong điều kiện phát triển bình thường;tuy nhiên, các đột biến không có LigD (ΔLigD) trong mycobacterium nhạycảm với IR và có tỷ lệ sống sót thấp hơn các tế bào kiểu hoang dã Ở một số

vi khuẩn, LigD hoạt động như một enzym sửa chữa đa chức năng nhỏ gọn,với ba miền riêng biệt, mỗi miền có các hoạt động xúc tác liên quan; ligase,

polymerase và nuclease Thứ tự của ba miền này không được bảo tồn nghiêmngặt trong các loài vi khuẩn khác nhau và nhiều LigD chỉ sở hữu các miềnligase và polymerase Cũng cần lưu ý rằng nhiều sinh vật nhân sơ mã hóa cáchoạt động này trên các gen riêng biệt thường được liên kết với operon.

Miền ligase của LigD là miền lớn nhất trong ba đơn vị con và được sửdụng riêng cho bước niêm phong nick cuối cùng của NHEJ Sự đột biến của

dư lượng xúc tác trong miền ligase ngăn cản NHEJ thành công Miềnpolymerase thể hiện tính linh hoạt đáng kể của việc kết hợp nucleotide.Nucleotide có thể được thêm vào các đầu cùn mà không có khuôn mẫu (endtransferase), trong các khoảng trống trong trình tự và các base bị hư hỏng đốidiện NHEJ polymerase này không phải là một thành viên của polymerase họ

X, giống như các polymerase NHEJ của người μ, λ, β và TdT Thay vào đó,polymerase của vi khuẩn là một thành viên của prichaeo- eukaryoticgia đìnhsiêu nhân Ý nghĩa của khám phá này là polymerase NHEJ có thể đã pháttriển thành vai trò kết thúc từ một priase

Một số cấu trúc tinh thể của các polymerase NHEJ khác nhau của vikhuẩn đã được giải quyết, trong đó có một cấu trúc liên kết với DNA Các cấutrúc này đã chứng minh các gốc axit amin quan trọng tiếp xúc với DNA ở các

vị trí khác nhau và các phần tử hướng dẫn nucleotide đến vào vị trí hoạt độngsẵn sàng để bổ sung Cấu trúc tinh thể của một LigD hoàn chỉnh vẫn chưađược giải quyết, mặc dù miền ligase cô lập đã được làm sáng tỏ Cấu trúc củamiền phosphoesterase / nuclease (PE) vẫn chưa được giải quyết, điều này cóthể giữ chìa khóa cho vai trò cụ thể của nó trong NHEJ Miền PE có khả năngloại bỏ cả hai nucleotidevà các nhóm phosphate từ các đầu tận cùng củaDNA, mặc dù việc mất các hoạt động này không ảnh hưởng đến NHEJ trongcác xét nghiệm sửa chữa plasmid; do đó, vai trò chính xác của nó vẫn cònđược thiết lập Người ta cho rằng một nuclease không xác định có thể cungcấp hoạt tính phân giải nucleotit trong NHEJ của vi khuẩn