So sánh tác dụng của một số enzyme thuỷ phân để xác định hàm lượng vitamin b1 trong gạo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC ********** KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: SO SÁNH TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ ENZYME THUỶ PHÂN ĐỂ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN B1 TRONG GẠO Người hướng dẫn: TS Lê Thị Hồng Hảo DS Trần Cao Sơn Sinh viên thực hiện: Lê Thị Khánh Loan Lớp: CNSH 06-04 Hà Nội 2010 LỜI CẢM ƠN Nhân dịp hồn thành khố luận tốt nghiệp cho phép tơi bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc lời cảm ơn chân thành tới: TS Lê Thị Hồng Hảo -Viện phó Viện Kiểm Nghiệm Vệ Sinh An Toàn Thực Phẩm Quốc Gia, DS Trần Cao Sơn KS Lê Thị Thuý, người trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ Đồng thời, xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Kiểm Nghiệm Vệ Sinh An Toàn Thực Phẩm Quốc Gia toàn thể anh chị cán viên viện giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi q trình nghiên cứu thực khố luận Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô, cán cuả khoa Công Nghệ Sinh Học - Viện Đại Học Mở Hà Nội dạy dỗ, bảo, tạo điều kiện tốt cho học tập, tạo hội cho tơi thực tập làm khố luận tốt nghiệp Cuối xin cảm ơn gia đình, bạn bè động viên,giúp đỡ thời gian qua Hà Nội, tháng năm 2010 Sinh viên Lê Thị Khánh Loan DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AOAC (Association Official Analytical Chemists): Hiệp hội nhà hố học phân tích ACN: Acetonitril DDT: Dichlor-Diphenyl-Trichloroethane HPLC (High Performance Liquid Chromatography): Sắc ký lỏng hiệu cao MeOH: Methanol NXB: Nhà xuất PDA: Photo Diode Array ppm (part per million): nồng độ phần triệu STT: Số thứ tự TTHD: Trung tâm hoạt động UV-VIS: Ultra Violet-Visible: Tử ngoại khả biến VTM B1: Vitamin B1 DANH MỤC BẢNG Bảng1.2.1: Nguồn vitamin B1 số thực phẩm Bảng 3.1.2: Kết khảo sát ảnh hưởng thành phần pha động 35 Bảng 3.1.3: Khảo sát tốc độ pha động 36 Bảng 3.1.4: Các điều kiện chạy HPLC phân tích hàm lượng vitamin B1 gạo 37 Bảng 3.2.5: Ảnh hưởng hàm lượng enzyme tới trình chiết vitamin B1 gạo .38 Bảng 3.2.6: Ảnh hưởng enzyme tới hiệu suất thu hồi 39 Bảng 3.2.7: Sự phụ thuộc diện tích píc vào nồng độ vitamin B1 41 Bảng 3.3.8: Kết độ lặp lại phương pháp 44 Bảng 3.3.9 Hiệu suất thu hồi vitamin B1 nồng độ khác 45 Bảng 3.3.10: Kết phân tích mẫu thực tế 46 DANH MỤC HÌNH Hình 1.3.1: Ảnh hưởng nhiệt độ tới tốc độ phản ứng có enzyme xúc tác 11 Hình 1.3.2: Ảnh hưởng pH tới tốc độ phản ứng có enzyme xúc tác 12 Hình 2.3.3: Sơ đồ mơ tả hệ thống HPLC 27 Hình 3.1.4: Sắc đồ Vitamin B1 sử dụng cột Symmestry Water C18 .34 (250mm ì 4,6mm ì 5àm) .34 Hình 3.1.5: Sắc đồ chạy chuẩn 0,50 ppm tốc độ dịng 0,8 ml/phút 37 Hình 3.3.6: Sắc đồ chạy chuẩn vitamin B1 0,025ppm 43 Hình 3.3.7: Sắc đồ chạy mẫu giới hạn phát (7µg/kg) .43 Hình 3.4.8: Sắc đồ chạy mẫu gạo RN64 .47 Hình3.4.9: Sắc đồ chạy mẫu gạo Nàng Xuân .48 Hình3.4.10: Sắc đồ chạy mẫu gạo nếp Ốc 48 Hình 3.4.11: Sắc đồ chạy mẫu gạo Tám .48 Hình 3.4.12: Sắc đồ chạy mẫu gạo tẻ thường 49 Hình3.4.13: Sắc đồ chạy mẫu gạo nếp nương Điện Biên .49 Hình3.4.14: Sắc đồ chạy mẫu gạo Tài Nguyên .49 Hình 3.4.15: Sắc đồ chạy mẫu gạo nếp Cái Hoa Vàng 50 Hình 3.4.16: Sắc đồ chạy mẫu gạo lứt 50 MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN I TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung vitamin 1.1.1 Định nghiã .3 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Vai trò vitamin Vài nét vitamin B1 1.2.1 Lịch sử 1.2.2 Cấu tạo tính chất 1.2.3 Vai trò vitamin B1 sức khoẻ người 1.2.4 Nhu cầu 1.2.5 Nguồn thực phẩm cung cấp vitamin B1 1.3 Tổng quan enzyme 1.3.1 Khái niệm .8 1.3.2 Vai trò .8 1.3.3 Cấu tạo hoá học enzyme 1.3.4 Cơ chế hoạt động 10 1.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính enzyme .11 1.3.6 Đặc tính số enzyme sử dụng 13 1.4 Các phương pháp xác định thiamin 15 1.4.1 Định lượng thiamin phương pháp khối lượng .16 1.4.2 Phương pháp sinh vật học vi trùng học 16 1.4.3 Phương pháp chuẩn độ điện 17 1.4.4 Phương pháp sắc ký điện di mao quản cao .17 1.4.5 Phương pháp phổ huỳnh quang .18 1.4.6 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC 20 PHẦN II ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .22 2.1 Đối tượng, thiết bị, hóa chất .22 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất thuốc thử 22 2.2 Nội dung nghiên cứu 25 2.2.1 Khảo sát xây dựng phương pháp xác định vitamin B1 gạo 25 2.2.2 Đánh giá phương pháp xây dựng .25 2.2.3 Ứng dụng phương pháp xác định vitamin B1 số loại gạo 25 2.3 Phương pháp nghiên cứu 25 2.3.1 Phương pháp lấy mẫu 25 2.3.2 Phương pháp phân tích vitamin B1 .26 2.3.3 Phương pháp xử lý kết 32 PHẦN II KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Tối ưu hoá điều kiện để tách xác định vitamin B1 HPLC 33 3.1.1 Lựa chọn detector bước sóng phát 33 3.1.2 Lựa chọn cột tách 34 3.1.3 Lựa chọn pha động .34 3.1.4 Khảo sát tốc độ dòng 36 3.2 So sánh số enzyme thủy phân để tối ưu hố quy trình xử lý mẫu 38 3.2.1 Khảo sát hàm lượng enzyme tối ưu cho trình xử lý mẫu .38 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng enzyme tới hiệu suất thu hồi 39 3.3 Đánh giá phương pháp phân tích 41 3.3.1 Khảo sát khoảng tuyến tính lập đường chuẩn 41 3.3.2 Giới hạn phát (LOD) 43 3.3.3 Giới hạn định lượng (LOQ) 44 3.3.4 Xác định độ lặp lại 44 3.3.5 Xác định độ thu hồi .45 3.4 Ứng dụng phân tích mẫu thực tế 45 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .51 4.1 Kết luận 51 4.2 Đề nghị .52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC .56 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội MỞ ĐẦU Sự khám phá vitamin thành tựu lớn hoá sinh Vitamin nhóm hợp chất hố học có mặt hầu hết loại thực phẩm, phân loại làm hai nhóm chính: vitamin tan dầu vitamin tan nước Mặc dù, vitamin không cung cấp lượng chúng cần thiết cho hoạt động sống người Trong loại vitamin vitamin B1 (thiamin) giữ vai trò quan trọng nhiều hoạt động thể Thiamin có mặt nhiều loại thực phẩm, loại ngũ cốc mà đặc biệt gạo có hàm lượng thiamin cao Gạo loại lương thực thiếu sống hàng ngày người, Việt Nam Xác định hàm lượng vitamin B1 yêu cầu kiểm nghiệm hoá sinh gạo Để xác định hàm lượng vitamin B thực phẩm có hàm lượng tinh bột cao gạo q trình phân tích thường phải sử dụng enzyme, enzyme có khả phá vỡ liên kết polysaccarid tạo dịch đường hoà tan, phá vỡ liên kiết vitamin B protein Bên cạnh đó, enzyme xúc tác phản ứng dephosphoryl để tách dạng thiamin phosphate ester thành thiamin tự do[22],[27] Điều quan trọng thực phẩm vitamin B1 tồn dạng tự (thiamin) B 1, dạng phosphate ester, chúng cịn có ràng buộc với protein Sau đó, thiamin tự oxy hóa thành thiochrom định lượng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC sử dụng detectơ huỳnh quang RF Hiện Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu hàm lượng vitamin B1 ngũ cốc nói chung gạo nói riêng Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “So sánh tác dụng số enzyme thuỷ phân để xác định hàm lượng vitamin B1 gạo” với mục tiêu: - Khảo sát điều kiện chạy máy sắc ký lỏng hiệu cao để phân tích vitamin B1 Lê Thị Khánh Loan CNSH 06-04 K13 Khoa Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội - So sánh tác dụng số enzyme thuỷ phân để khảo sát trình tách chiết vitamin B1 gạo - Đánh giá phương pháp xác định hàm lượng vitamin B1 - Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng vitamin B1 số loại gạo thị trường Hà Nội Lê Thị Khánh Loan CNSH 06-04 K13 Khoa