Imazeki trên mạt cưa cao su tại thành phố Hồ Chí Minh.Môi trường phân lập nấm được khảo sát hai thành phần dịch chiết khoai tây và cà rốtbằng cách thay thế thành phần khoai tây bằng cà r
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ ngày 3 tháng 3 năm 2023 đến ngày tháng 6 năm 2023.Các thí nghiệm được tiến hành tại Phòng nghiên cứu Nấm ăn và Nấm dược liệu, thuộcViện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
Vật liệu, dụng cụ và thiết bị
Quả thể nấm Vân chi đỏ (Trametes sanguinea (L.) Imazeki), được thu nhận từ trại thực nghiệm Nấm ăn và Nấm dược liệu thuộc Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
3.2.2 Vật liệu và hóa chất
Nguyên liệu: khoai tây, cà rốt, lúa, bột bắp, cám gạo, mạt cưa cao su.
Hóa chất: cồn 90º (CAS: 64-17-5), agar (ROBIKA Hải Long 50 g), peptone (CAS: 73049-73-7), cao nấm men (Yeast Extract Powder RM027-500G), D-glucose (CAS: 50-99-7), Kali đihidrophotphat (KH2PO4 CAS: 7778-77-0), Kali hidrophotphat (K2HPO4 CAS: 16788-57-1), Magnesium sulphate (MgSO4.7H2O CAS: 10034-99-8), Natri hidrophotphat (Na2HPO4 CAS 7558-79-4), bột dinh dưỡng (90% protein và các chất khác).
3.2.3 Dụng cụ và thiết bị
Dụng cụ: đèn cồn, dao cấy, que cấy móc, kẹp, ống nghiệm, đĩa petri, ca đong định mức, ống nghiệm, chai thuỷ tinh.
Thiết bị: tủ cấy vô trùng (THIEN TRUONG SCIENTIFIC Co., Ltd), nồi hấp khử trùng Autoclave (P & S KOREA), bếp điện (Panasonic DH - 129T), cân phân tích (SF
- 400), cân đồng hồ 30 kg (Nhơn Hòa), lò vi sóng (Electrolux 20 lít EMM20K18GW).
3.2.4 Môi trường và phương pháp
Môi trường PDA bao gồm: khoai tây 200g, D-glucose 20g, agar 20g, nước cất 1000ml.
Môi trường PDA bổ sung 25% cà rốt bao gồm: khoai tây 150g, cà rốt 50g, D- glucose 20g, agar 20g, nước cất 1000ml.
Môi trường PDA bổ sung 50% cà rốt bao gồm: khoai tây 100g, cà rốt 100g, D- glucose 20g, agar 20g, nước cất 1000ml.
Môi trường PDA bổ sung 75% cà rốt bao gồm: khoai tây 50g, cà rốt 150g, D- glucose 20g, agar 20g, nước cất 1000ml.
Môi trường DA bổ sung 100% cà rốt bao gồm: cà rốt 200g, D-glucose 20g, agar 20g, nước cất 1000ml.
Với thành phần khoai tây được gọt vỏ, rửa sạch, thái lát dày 5mm rồi nấu với nước trong 30 phút, sau đó lọc lấy phần dịch chiết ra cốc đong, vớt bọt và định mức lại.
Với thành phần cà rốt thực hiện tương tự khoai tây: gọt vỏ, rửa sạch, thái lát nhỏ rồi nấu trong nước trong 30 phút, sau đó lọc lấy phần dịch chiết ra cốc đong, vớt bọt bỏ đi và định mức lại Các thành phần còn lại được cân và cho vào chai thủy tinh sau đó sẽ đong tỷ lệ dịch chiết khoai tây và cà rốt thêm từng môi trường Chai thủy tinh hấp khử trùng ở 121 o C, 1 atm trong 20 phút Sau đó đổ vào các đĩa petri đã được hấp khử trùng và sấy khô, đổ môi trường vào đĩa dày khoảng 2mm, phẳng và nhẵn
Bảo quản các đĩa môi trường ở nơi thoáng mát, tránh ánh sáng trực tiếp, điều kiện phòng trong vòng 1 đến 2 ngày, quan sát môi trường có bị nhiễm khuẩn hay nhiễm nấm mốc thì loại bỏ Chọn những đĩa môi trường tốt để tiến hành phân lập.
Môi trường nhân giống cấp một
Môi trường nhân giống cấp một:
Môi trường PDA bổ sung 10% nước dừa bao gồm: khoai tây 200g, D-glucose 20g, agar 20g, nước dừa 20 ml và nước cất 980ml.
Môi trường PDA có cà rốt bổ sung 10 nước dừa bao gồm: khoai tây 100 g, cà rốt
100 g, D-glucose 20 g, agar 20 g, nước dừa 20 ml và nước cất 980ml.
Môi trường PDAY bao gồm: khoai tây 200 g, D-glucose 20 g, agar 20 g, cao nấm men 2 g và nước cất 1000 ml.
Môi trường PDAY có cà rốt bổ sung 10% nước dừa bao gồm: khoai tây 100 g, 100 g cà rốt, D-Glucose 20 g, agar 20 g, nước dừa 20 ml và nước cất 980 ml.
Môi trường RAPER bao gồm: glucose 20 g, agar 20 g, cao nấm men 2 g, pepton 2 g, KH2PO4 0,46 g, K2HPO4 1 g, MgSO4.7H2O 0,5 g và nước cất 1000 ml.
Môi trường Agaricus bao gồm: khoai tây 200 g, glucose 20 g, agar 20 g, peptone 2 g, MgSO4.7H2O 0,5 g, Na2HPO4 2 g và nước cất 1000 ml.
Với thành phần khoai tây được gọt vỏ, rửa sạch, thái lát nhỏ rồi nấu trong nước trong 30 phút sau đó lọc lấy phần dịch chiết ra cốc đong, vớt bọt bỏ đi và định mức lại.
Với thành phần cà rốt thực hiện tương tự khoai tây: gọt vỏ, rửa sạch, thái lát nhỏ rồi nấu trong nước trong 30 phút, sau đó lọc lấy phần dịch chiết ra cốc đong, vớt bọt bỏ đi và định mức lại Các thành phần còn lại được cân và cho vào chai thủy tinh sau đó sẽ đong tỷ lệ dịch chiết khoai tây và cà rốt thêm từng môi trường Chai thủy tinh hấp khử trùng ở 121 o C, 1 atm trong 20 phút Sau đó đổ vào các đĩa petri đã được hấp khử trùng và sấy khô, đổ môi trường vào đĩa dày khoảng 2mm, phẳng và nhẵn
Bảo quản các đĩa môi trường ở nơi thoáng mát, tránh ánh sáng trực tiếp, điều kiện phòng trong vòng 1 đến 2 ngày sau đó quan sát môi trường có bị nhiễm khuẩn hay nhiễm nấm mốc thì phải loại bỏ ngay Chọn những đĩa môi trường tốt để tiến hành cấy.
Môi trường nhân giống cấp hai
Thành phần môi trường gồm: lúa, bột bắp và bột dinh dưỡng.
Chọn hạt lúa căng tròn, ít lép, ngâm qua đêm rồi vo kỹ hạt lúa bằng nước, nấu cho lúa vừa nứt vỏ trấu, khuấy đảo liên tục để thóc đều nhau, vớt ra để ráo nước Sau đó phối trộn thêm bột bắp, bột dinh dưỡng theo tỷ lệ của các nghiệm thức cần thí nghiệm. Sau đó trộn đều, cho vào chai thủy tinh mỗi chai 300 gam, bịt kín bằng nút bông và buộc giấy báo Đem môi trường hấp khử trùng ở 121 o C, 1 atm trong 40 phút Lấy ra để nguội, sau 24h tiến hành cấy chuyền meo từ môi trường cấp một tốt nhất sang môi trường cấp hai.
Môi trường bịch phôi nuôi trồng
Thành phần môi trường bao gồm: mạt cưa cao su (đã qua xử lý), bột bắp và cám gạo.
Cách xử lý mạt cưa: mạt cưa được rây qua lưới rây cát để loại bỏ các gỗ vụn, lá cây cành, cành cây, vỏ cây Trộn đều với nước vôi 1% ủ thành đống cao trong 7 ngày, đậy kín bằng bạt không thấm nước, sau 2 ngày đảo trộn 1 lần Sau khi hoàn thành quá trình ủ, phối trộn tỷ lệ cám bắp và cám gạo theo các nghiệm thức cần thí nghiệm và đóng vào các túi màng nhựa chịu nhiệt, mỗi túi chứa 1,2 kg Nén chặt, cột cổ, đậy nắp và đem bịch phôi mạt cưa cao su đi hấp khử trùng ở nhiệt độ là 100 0 C trong 8 giờ Sau48h sau khi hấp bịch phôi hoàn toàn nguội thì bắt đầu cấy môi trường nhân giống cấp hai tốt nhất vào bịch phôi.
Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây và cà rốt lên môi trường phân lập và làm thuần giống nấm Vân chi đỏ
Quả thể nấm Vân chi đỏ được thu thập tại Phòng thí nghiệm Nấm ăn và Nấm dược liệu thuộc Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, chọn tai nấm không quá già, đều và không bị nhiễm nấm bệnh.
Tiến hành phân lập trên quả thể nấm Vân chi đỏ: xử lý bằng cồn 70 0 toàn bộ bề mặt quả thểvà tiến hành thao tác tách quả thể lấy phần túi bào tử nấm dưới mặt dưới của quả thể nấm đặt vào đĩa petri chứa 5 môi trường phân lập với tỷ lệ dịch chiết khoai tây và cà rốt được thay đổi ở các nghiệm thức đã được chuẩn bị (phần 3.2.4.1).
Thí nghiệm khảo sát môi trường phân lập thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của meo nấm Vân chi đỏ được bố trí với sự thay đổi của thành phần khoai tây bằng cà rốt trên 5 nghiệm thức mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại 3 đĩa, ở 3 ngày liên tiếp nhau Cần 9 đĩa cho mỗi môi trường khảo sát, tổng cộng là 45 đĩa.
Các chỉ tiêu theo dõi
Sau 2 ngày cấy tiến hành theo dõi thời gian tăng trưởng của tơ nấm (ngày): theo dõi thời gian tơ nấm bắt đầu lan và thời gian tơ nấm bắt đầu xuất hiện sắc tố cho tới khi tơ nấm lan kính đĩa petri.
Tốc độ tăng trưởng của tơ nấm trên đĩa (mm/ngày) là chiều dài hệ tơ nấm lan được với số ngày.
Chất lượng hệ tơ nấm dựa vào màu sắc và độ dày, độ phân nhánh và sắc tố xuất hiện của tơ nấm.
Thí nghiệm trên 5 môi trường phân lập được tiến hành cùng một thời điểm So sánh các chỉ tiêu theo dõi giữa các nghiệm thức khác nhau Tìm ra tỷ lệ thành phần dịch chiết khoai tây và cà rốt thích hợp để làm môi trường phân lập và làm thuần giống nấm Vân chi đỏ Phương pháp xử lý số liệu thống kê trong các thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Minitab 16 Phân tích phương sai (ANOVA) để phát hiện sự khác biệt giữa các nghiệm thức Sau đó tiến hành trắc nghiệm phân hạng (nếu có) Các biểu đồ được vẽ trong phần mềm Microsoft Excel.
Tốc độ lan tơ (mm/ngày), tốc độ lan tơ trung bình tính theo công thức:
Trong đó có X là tốc độ lan tơ n là số ngày khảo sát
Từ kết quả, so sánh và chọn mẫu tốt nhất Mẫu được chọn phải có hệ tơ phát triển nhanh, dày, độ phân nhánh nhiều, có sắc tố đồng đều trên môi trường.
3.3.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng trên môi trường nhân giống cấp một
Tiến hành chọn nghiệm thức có hệ tơ tốt nhất ở môi trường phân lập Cấy mẫu đã chọn vào các đĩa môi trường nhân giống cấp một để tiếp tục theo dõi các chỉ tiêu cho quá trình tăng sinh.
Thí nghiệm được thực hiện trên 7 môi trường tương ứng với 7 nghiệm thức.
NT2: PDA + 10% nước dừa + cà rốt
NT5: PDAY + 10% nước dừa + cà rốt
Thí nghiệm khảo sát môi trường nhân giống cấp một thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của hệ tơ nấm Vân chi đỏ được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 7 môi trường phổ biến trong tăng sinh nấm dược liệu Mỗi nghiệm thức lặp lại 5 lần, mỗi lần lặp lại 5 đĩa, ở 5 ngày liên tiếp nhau Cần 25 đĩa cho mỗi môi trường khảo sát, tổng cộng là 175 đĩa.
Các chỉ tiêu theo dõi
Sau 2 ngày cấy tiến hành theo dõi thời gian tăng trưởng của tơ nấm (ngày): theo dõi thời gian tơ nấm bắt đầu lan và thời gian tơ nấm bắt đầu xuất hiện sắc tố cho tới khi tơ nấm lan kính đĩa petri.
Chất lượng hệ tơ nấm dựa vào màu sắc và độ dày, độ phân nhánh của hệ tơ nấm.
Thí nghiệm trên 7 môi trường câp một được tiến hành cùng một thời điểm So sánh các chỉ tiêu theo dõi giữa các nghiệm thức khác nhau Tìm ra tỷ lệ thành phần dịch chiết khoai tây và cà rốt thích hợp để làm môi trường phân lập và làm thuần của hệ sợi nấm Vân chi đỏ.
Phương pháp xử lý số liệu thống kê trong các thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Minitab 16 Phân tích phương sai (ANOVA) để phát hiện sự khác biệt giữa các nghiệm thức Sau đó tiến hành trắc nghiệm phân hạng (nếu có) Các biểu đồ được vẽ trong phần mềm Microsoft Excel.
Tốc độ lan tơ (mm/ngày), tốc độ lan tơ trung bình tính theo công thức
Trong đó có X là tốc độ lan tơ n là số ngày khảo sát.
Từ kết quả, so sánh và chọn mẫu tốt nhất Mẫu được chọn phải có hệ tơ phát triển nhanh, dày, đều, phân nhánh nhiều, sắc tố xuất hiện ở các môi trường.
3.3.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng trên giống cấp hai Tiến hành thí nghiệm
Sau khi đã xác định được môi trường cấp một tốt nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của tơ nấm Vân chi đỏ, chọn tơ nấm tối ưu nhất của môi trường này cấy chuyền sang các chai môi trường nhân giống cấp ba thí nghiệm (tương ứng với các nghiệm thức thí nghiệm).
NT1: 97% lúa + 3% bột bắp + 0% bột dinh dưỡng
NT2: 96% lúa + 4% bột bắp + 0% bột dinh dưỡng
NT3: 95% lúa + 5% bột bắp + 0% bột dinh dưỡng
NT4: 96,5% lúa + 3% bột bắp + 0,5% bột dinh dưỡng
NT5: 95,5% lúa + 4% bột bắp + 0,5% bột dinh dưỡng
NT6: 94,5% lúa + 5% bột bắp + 0,5% bột dinh dưỡng
NT7: 96% lúa + 3% bột bắp + 1% bột dinh dưỡng
NT8: 95% lúa + 4% bột bắp + 1% bột dinh dưỡng
NT9: 94% lúa + 5% bột bắp + 1% bột dinh dưỡng
NT10: 95,5% lúa + 3% bột bắp + 1,5% bột dinh dưỡng NT11: 94,5% lúa + 4% bột bắp + 1,5% bột dinh dưỡng
NT12: 93.5% lúa + 5% bột bắp + 1,5% bột dinh dưỡng.
Thí nghiệm khảo sát môi trường nhân giống cấp hai thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của tơ nấm Vân chi được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố với 13 nghiệm thức là 13 môi trường cấp meo khác nhau, lặp lại 3 lần Cần 9 chai cho mỗi môi trường khảo sát, tổng cộng là 117 chai.
Tiến hành theo dõi thời gian tăng trưởng của hệ tơ nấm (ngày) Theo dõi thời gian hệ tơ nấm bắt đầu lan cho tới khi hệ tơ nấm lan kính chai thủy tinh.
Tốc độ tăng trưởng trung bình của hệ tơ nấm (mm/ngày) trên chai là chiều dài hệ tơ nấm lan được với số ngày.
Chất lượng hệ tơ nấm dựa vào màu sắc và độ dày của hệ tơ nấm.