Định tính samonella tiểu luận phân tích vi sinh thực phẩm

Quy trình định tính Samonella2.1 Phạm vi áp dụngPhương pháp này tham chiếu theo TCVN 4829:2005 dùng để phát hiện Trang 9 2.2 Nguyên tắcQuy trình phát hiện Salmonella bắt buộc phải

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

-o0o BÀI TẬP LỚN/ -o0o BÀI TẬP DỰ ÁN HỌC PHẦN:

PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM TÊN ĐỀ TÀI: ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

NHÓM: 02

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2022

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

-o0o TÊN ĐỀ TÀI: ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2022

LỜI CAM ĐOAN

Chúng em xin cam đoan đề tài: “Định tính Salmonella” do nhóm 02 nghiên cứu

và thực hiện

Chúng em đã kiểm tra dữ liệu theo quy định hiện hành

Kết quả bài làm của đề tài: “Định tính Salmonella” là trung thực và không sao

chép từ bất kỳ bài tập của nhóm khác

Các tài liệu được sử dụng trong tiểu luận có nguồn gốc, xuất xứ rõ ràng

(Ký và ghi rõ họ tên)

Nhóm 02

LỜI CẢM ƠN

Nhóm 02 xin chân thành cảm ơn khoa Công nghệ thực phẩm và nhà trường đãgiúp nhóm tiếp cận và tìm hiểu về môn Phân tích vi sinh thực phẩm Nhóm 02 cũngxin cảm ơn cô Đinh Thị Hải Thuận đã giảng dạy và hướng dẫn nhóm nghiêncứu và hoàn thành bài tiểu luận một cách hoàn chỉnh nhất

Trong quá trình nghiên cứu và làm bài tiểu luận do kiến thức còn hạn chế nên

có thể dẫn đến một vài quan điểm cũng như cách nhìn nhận còn thiếu sót hay chưachính xác mong cô và các bạn thông cảm bỏ qua Nhóm rất mong sẽ nhận được nhậnxét, góp ý của cô và các bạn để có thể cải thiện hơn trong những bài luận sau

Nhóm 02 xin chân thành cảm ơn

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1-2 S cholera-sius gây bệnh nhiễm trùng máu 2Hình 1-3 S.typhymurium gây bệnh rối loạn tiêu hoá 3

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây có rất nhiều báo cáo cho thấy phần lớn các vụ ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật Đã có nhiều cảnh báo, nhưng tình trạng ngộ độc thực phẩm vẫn đang leo thang và ngày càng trở nên càng nghiêm trọng

Có rất nhiều vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm như Clostridium botulinum,

Escherichia Coli, Listeria monocytogenes, trong đó, Salmonella là loài vi sinh vật

gây ngộ độc rất nguy hiểm Salmonella gây ra bệnh thương hàn, nhiễm khuẩn đường

ruột và nhiều bệnh nghiêm trọng khác Thế nên định tính, phát hiện sự có mặt của

Salmonella trong thực phẩm là vô cùng quan trọng.

NỘI DUNG

1 Tổng quan về Salmonella

Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae, trực khuẩn gram âm, hô hấp hiếu khí

hoặc kị khí tuỳ ý, có khả năng di động (trừ S.gallinarum và S.pullorum), sinh acid từ glucose và manitol nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh phân giải ure Không tạo bào tử, hầu hết các chủng đều sinh ra H2S (trừ S.typhi)

Salmonella là một trong những tác nhân gây ra bệnh chủ yếu trong thực phẩm

Có ba dạng bệnh do Salmonella gây ra Sốt thương hàn do S.typhy, nhiễm trùng máu

do S.cholera-sius, rối loạn tiêu hoá do S.typhymurium và S.enteritidis

Hình 1-1 S.typhy gây bệnh sốt thương hàn

Hình 1-2 S cholera-sius gây bệnh nhiễm trùng máu

Hình 1-3 S.typhymurium gây bệnh rối loạn tiêu hoá

Hầu hết các tiêu chuẩn về an toàn thực phẩm đều không cho phép có sự hiện

diện của Salmonella trong 25g/25ml mẫu Theo phương pháp truyền thống việc phát hiện Salmonella bao gồm những bước như tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập,

phục hồi và khẳng định

Vi khuẩn này kém chịu nhiệt, dễ dàng bị tiêu diệt khi thức ăn được đun nấu phù hợp Việc làm lạnh, cấp đông, đảm bảo vệ sinh có tác dụng quan trọng làm giảm thiểu nguy cơ nhiễm bệnh

2 Quy trình định tính Samonella

2.1 Phạm vi áp dụng

Phương pháp này tham chiếu theo TCVN 4829:2005 dùng để phát hiện

Salmonella trong tất cả các loại thực phẩm.

2.2 Nguyên tắc

Quy trình phát hiện Salmonella bắt buộc phải qua năm giai đoạn và phải sử dụng

chủng đối chứng trong toàn bộ quá trình phân tích

Tiền tăng sinh: mẫu được tiền tăng sinh trong môi trường tăng sinh không chọn lọc (BPW) ủ ở 370C trong khoảng 18h

Tăng sinh chọn lọc: Sau giai đoạn tiền tăng sinh, dịch mẫu được chuyển qua môitrường tăng sinh chọn lọc RVS ủ ở 41,50C và MKTTn ủ ở 370C trong khoảng 24h.Phân lập: cấy ria dịch mẫu từ môi trường tăng sinh chọn lọc sang hai môi trường rắn chọn lọc (XLD và HE), ủ ở 370C trong khoảng 24h

Phục hồi: cấy chuyển các khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella trên các môi trường

phân lập sang môi trường dinh dưỡng

Khẳng định: cấy chuyển sinh khối trên môi trường dinh dưỡng sang các môi trường thử nghiệm sinh hóa và thử nghiệm kháng huyết thanh học

2.3 Môi trường và hóa chất

⮚ Môi trường XLD (Xylose Lysine Desoxycholate)

Môi trường XLD: khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hay không có tâm đen

Một số dòng Salmonella có thể có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn

Vai trò: Tạo acid dư thừa để ngăn cản sự đảo ngược thành pH kiềm bởi vi khuẩn

Vai trò: Ức chế sự phát triển của vi khuẩn gram dương

- Ferric ammonium citrate: 0.8g

Vai trò: Xác định sự sản xuất khí H2S

Vai trò: Chất chỉ thị giúp nhận biết sự phân huỷ của xylose, lactose và sucrose

⮚ Môi trường HE:

Khuẩn lạc có màu thay đổi từ xanh dương đến màu xanh lục, có hay không có tâm đen

Môi trường thành phần HE (Hektoen Entric Agar)

- Proteose Peptone: 12.0g

Vai trò: Cung cấp Nitơ, nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật đặc biệt là amino acid

- Yeast Extract: 3.0g

Vai trò: Cung cấp protein (N) và vitamin

- Bile Salts No 3: 9.0g

Vai trò: Ức chế sự sinh trường của tất cả vi khuẩn gram dương

Vai trò: Điều chỉnh trương lực

- Ferric Ammonium Citrate: 1.5g

Vai trò: Xác định sự sản xuất khí H_2S

Bismuth sulfite và brilliant green: ức chế gram (+)

Disodium phosphate: tạo tính đệm cho môi trường

Dextrose: cung cấp năng lượng cho vi sinh vật

Khuẩn lạc có màu nâu xám hay màu đen, thỉnh thoảng có xuất hiện ánh kim tím

2.4 Quy trình phân tích

2.5 Các bước tiến hành

Cân một lượng 25g mẫu rắn hoặc đong một thể tích 25ml mẫu lỏng với sai sốcho phép± 5% của phần mẫu thử đại diện cho vào bao PE vô trùng (hoặc bình tamgiác), bổ sung 225ml môi trường BPW và đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu(stomacher) trong 60 giây

Bước 1: Tiền tăng sinh (tăng sinh sơ bộ)

Mẫu được tiền tăng sinh trong môi trường tăng sinh không chọn lọc (BPW) ủ

ở 37oC±3h trong khoảng 18h±3h

Bước 2: Tăng sinh chọn lọc

Trộn đều dịch tiền tăng sinh, chuyển 0,1ml vào ống nghiệm chứa 10ml môitrường RVS, ủ ở 41,5±1oC trong 24±3h; đồng thời chuyển 1ml vào ống nghiệmchứa 10ml môi trường MKTTn, ủ ở 37±1oC trong 24±3h Cẩn thận không được đểquá nhiệt độ ủ tối đa (42,5oC)

Bước 3: Phân lập

Dùng que cấy vòng cấy phân lập từ mỗi canh thang tăng sinh chọn lọc RVS

và MKTTn lên mỗi đĩa thạch chứa môi trường chọn lọc XLD và HE Sau khi cấy,lật ngược các đĩa sao cho đáy hướng lên trên và ủ ở 37oC±1oC trong 24±3h

Sau khi ủ 24±3h, kiểm tra các đĩa về sự có mặt của các khuẩn lạc điển hình và

các khuẩn lạc không điển hình mà có thể nghi ngờ là Salmonella Trên môi trường XLD khuẩn lạc Salmonella điển hình có màu hồng trong suốt, có hoặc không có tâm màu đen Trên môi trường HE khuẩn lạc Salmonella điển hình có màu xanh

lam, có hoặc không có tâm đen Đánh dấu vị trí các khuẩn lạc này dưới đáy đĩa

Bước 4: Phục hồi trên môi trường dinh dưỡng NA/TSA

Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ từ mỗi đĩa trên môi trườngphân lập XLD và HE Nếu mỗi đĩa có ít hơn 5 khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạcnghi ngờ, thì lấy tất cả khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ đó cấy ria trên NA/TSA

Ủ ở 37oC±1oC trong 24±3h

Cân 25g mẫu rắn hoặc 25ml mẫu

lỏng

Ủ / (182)h

Không có khuẩn lạc điển hình hoặc

nghi ngờ từ mỗi môi trường phân

Ủ ở /(243)h

10ml môi trường RVC broth Ủ

ở (/(24)h 10ml môi trường MKTTn broth Ủ ở /(24)h

Cấy lên HE agar Ủ ở /(18-24)h

Không phát hiện

Salmonella trong

25g/25ml

Thử kháng huyết thanh

Thử 1 khuẩn lạc hoặc nghi ngờ

Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ, cấy lên NA/TSA Ủ ở /(243) h

TH1: từ mỗi đĩa thử một khuẩn lạc đặc trưng, nếu cho các kết quả thử nghiệm

sinh hóa hóa phù hợp thì kết luận phát hiện Salmonella trong mẫu.

TH2: nếu khuẩn lạc đầu tiên cho kết quả thử nghiệm sinh hóa không phù hợpthì tiến hành thử bốn khuẩn lạc còn lại đã được đánh dấu, một trong bốn khuẩn lạc

này cho kết quả thử nghiệm sinh hóa phù hợp thì kết luận phát hiện Salmonella trong mẫu và ngược lại thì kết luận không phát hiện Salmonella trong mẫu.

Bước 5: Khẳng định sinh hóa và kháng huyết thanh

Từ các khuẩn lạc đã chọn cấy ria lên NA/TSA, dùng que cấy cấy vào các môitrường sau:

⮚Thạch TSI

Nguyên tắc: xác định khả năng sử dụng nguồn Carbohydrate cụ thể kết hợp vớimôi trường tăng trưởng căn bản, có hoặc không có sinh hơi và hydrogen sulfide(H2S)

Cách lấy mẫu: cấy ria trên bề mặt nghiêng của thạch và cấy đâm sâu xuống đáy Ủ

ở 37±1oC trong 24±3h Diễn giải những thay đổi trong môi trường như sau:

+ Cấy đâm sâu

● Màu vàng glucose dương tính (sử dụng glucose)

● Màu đỏ hoặc không đổi màu glucose âm tính (không sử dụng glucose)

● Màu đen sinh hydro sunfua Bọt hoặc vết rạn sinh khí từ glucose

+ Cấy bề mặt nghiêng của thạch

● Màu vàng lactose và/hoặc sucrose dương tính (sử dụng lactose và/hoặcsucrose)

● Màu đỏ hoặc không đổi màu lactose và sucrose âm tính (không sử dụng lactosecũng như sucrose)

Các khuẩn lạc Salmonella điển hình thể hiện tính kiềm (màu đỏ) trên bề mặt nghiêng

của thạch và khi cấy đâm sâu mang tính acid (màu vàng) có sinh khí (bọt khí) và (vớikhoảng 90% trường hợp) sinh hydrosunfua (thạch bị đen)

⮚Lysine decarboxylase

Nguyên tắc: sử dụng để phát hiện vi khuẩn sinh các enzyme decarboxylase, cácenzyme này thường tương tác với các amino acid có gốc carboxyl (-COOH) ở cuối,tạo thành amine hay diamine và carbon dioxide (CO2)

Cách lấy mẫu: cấy ngay phía dưới của bề mặt môi trường lỏng, phủ một lớp paraffinhay dầu khoáng lên trên bề mặt môi trường Ủ ở 37±1oC trong 24± 3h Salmonella có

phản ứng lysine decarboxylase dương tính nên sau khi nuôi cấy, môi trường vẫn giữnguyên màu tím Phản ứng âm tính khi môi trường có màu vàng

⮚Thạch ure

Nguyên tắc: sử dụng để phát hiện khả năng phân cắt ure thành amoniac do hoạt tínhcủa enzyme urease từ VSV và kết quả là môi trường bị kiềm hóa do NH3 được tạo ra.Cách lấy mẫu: cấy ria trên bề mặt thạch nghiêng của thạch Ủ ở 37±1oC trong 24±3h.Nếu phản ứng dương tính, môi trường từ màu đỏ chuyển thành màu hồng và sau đóchuyển thành đỏ hồng Ngược lại, nếu phản ứng là âm tính thì môi trường không đổimàu (vàng cam)

⮚Môi trường phản ứng Indol

Nguyên tắc: phát hiện khả năng oxy hóa tryptophan thành các dạng của indol: Indol,Skatol (methyl indol) và indol-acetate

Cách lấy mẫu: cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống chứa 5ml môi trường tryptone water

Ủ ở 37±1oC trong 24±3h Sau khi ủ, thêm 1ml thuốc thử kovac’s, nếu phản ứng dươngtính thì trên bề mặt môi trường xuất hiện một mặt màu đỏ chứng tỏ phản ứng dươngtính, xuất hiện màu khác là phản ứng âm tính

⮚Phát hiện β-galactosidase

Nguyên tắc: xác định khả năng lên men lactose của vi sinh vật

Cách lấy mẫu: cho một vòng đầy các khuẩn lạc nghi ngờ vào ống vô trùng có chứa0,25ml dung dịch muối sinh lý Thêm một giọt Toluen và lắc ống Đặt ống này vàotrong nồi cách thủy ở 37oC và để trong vài phút (khoảng 5 phút) Thêm 0,25ml thuốc

thử để phát hiện β-galactosidase và lắc đều Đặt lại ống vào nồi cách thủy để ở 37oCtrong 24±3h, kiểm tra ống thường xuyên Màu vàng cho thấy phản ứng dương tính.Phản ứng thường xuất hiện trong khoảng 20 phút Nếu sử dụng đĩa giấy bán sẵn, thìtheo các chỉ dẫn của nhà sản xuất.

⮚Thử phản ứng kháng huyết thanh

+ Loại trừ chủng tự ngưng kết: nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý lên phiến kính thủy tinh

đã được làm sạch một cách cẩn thận, dùng que cấy vòng trộn đều dung dịch với khuẩnlạc cần thử, để thu được huyền phù đục và đồng nhất Lắc nhẹ phiến kính 30-60 giây.Quan sát kết quả trên nền tối, tốt nhất là dùng kính lúp Nếu có một sự vón cục, khôngrời nhau (ít hoặc nhiều) của vi khuẩn thì chúng xem như tự ngưng kết, không cần thửphản ứng huyết thanh tiếp theo Nếu không có sự vón cục và vi khuẩn rời nhau, thìchúng xem như không tự ngưng kết, cần tiếp tục thử phản ứng huyết thanh

+ Kiểm tra O, H,…

Nhỏ một giọt anti-O hoặc H lên lam kính sạch, dùng que cấy lấy một ít sinh khối của

vi khuẩn từ môi trường Nutrient Agar để phân tán vào giọt huyết thanh, chờ 30-60giây, quan sát trên nền đen Phản ứng dương tính khi có hiện tượng ngưng kết xảy ra.Đôi khi cần quan sát hiện tượng ngưng kết trên kính lúp hoặc kính hiển vi với độphóng đại thấp Ngược lại, nếu vi khuẩn phân bố đều trong huyết thanh, làm cho dungdịch đục đều được xem là kết quả âm tính

Mẫu được kết luận dương tính với Salmonella khi có khuẩn lạc đặc trưng trên

các môi trường phân lập và cho kết quả sinh hóa sau: TSI/KIA: đỏ/vàng; có/không có

H2S và sinh hơi; Ure (-); Indol (-); VP (-); ONPG (-); LDC (+)

Phát hiện (hay không phát hiện) Salmonella trong 25g mẫu rắn hoặc 25ml mẫu lỏng.

KẾT LUẬN

Trong thực phẩm không được phép có sự hiện diện của Salmonella bởi

Salmonella vô cùng nguy hiểm, là tác nhân gây bệnh chủ yếu trong thực phẩm Sau

khi hoàn thành bài tiểu luận này, chúng em có thêm nhiều kiến thức chuyên sâu về

trực khuẩn Salmonella cũng như phương pháp định tính Salmonella (bao gồm phạm vi

áp dụng, nguyên tắc, môi trường hóa chất, quy trình phân tích, các bước tiến hành)

Trong đó quy trình phát hiện Salmonella bắt buộc phải trải qua 5 giai đoạn và phải sử

dụng chủng đối chứng trong toàn bộ quá trình phân tích

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Giáo trình phân tích vi sinh, Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm thành phố

Hồ Chí Minh, năm 2016

CÂU HỎI TRẮC NGHIỆM

ĐỀ TÀI: ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

1 Chọn câu đúng:

A. Salmonella trực khuẩn gram âm (-), hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ

ý, có khả năng di động, sinh acid từ glucose và manitol nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh phân giải ure

B Salmonella trực khuẩn gram âm (+), hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ ý,

có khả năng di động, sinh acid từ glucose và manitol nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh phân giải ure

C Salmonella trực khuẩn gram âm (-), hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ ý,

không có khả năng di động, sinh acid từ glucose và manitol nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh phân giải ure

D Salmonella trực khuẩn gram âm (-), hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ ý,

có khả năng di động, sinh acid từ glucose và manitol nhưng lên men saccharose

và lactose, không sinh phân giải ure

2 Chủng Salmonella nào không sinh H 2 S?

A S gallinarum

B S pullorum

C. S typhi

D Cả 3 đáp án trên

3 Mục đích của bước tăng sinh sơ bộ là gì?

A. Tăng số lượng Salmonella

D Cấy ria hoặc cấy đâm sâu

5 Quy trình phát hiện Salmonella bắt buộc phải trải qua mấy giai đoạn?

10 Vai trò của môi trường XLD và HE là gì?

A Tăng sinh sơ bộ

12 Mục đích của kháng huyết thanh là gì?

A Tăng sinh sơ bộ

14 Trên môi trường XLD, khuẩn lạc Salmonella có màu gì?

A Màu xanh lam, có hoặc không có tâm đen

B Màu vàng nhạt, có hoặc không có tâm đen