Định tính shighela tiểu luận phân tích vi sinh thực phẩm

Shigella gây ra bệnh lỵ trực khuẩn chiếmmột tỷ lệ đáng kể trong các bệnh đường ruột cấp tính ở trẻ em các nước đang phát triểnvà bệnh nhiễm trùng này là nguyên nhân chính dẫn đến sự tăng

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

MỤC LỤC

MỤC LỤC BẢNG BIỂU ii

LỜI MỞ ĐẦU 1

NỘI DUNG 2

CHƯƠNG I TỔNG QUAN VỀ SHIGELLA 2

1 Đặc điểm sinh học 2

1.1 Sinh thái và tính chất nuôi cấy 2

1.2 Tính chất sinh hóa 2

1.3 Cấu trúc kháng nguyên 2

1.4 Độc tố 3

2 Khả năng và cơ chế gây bệnh 3

2.1 Khả năng gây bệnh 3

2.2 Cơ chế gây bệnh 4

2.3 Tác hại 4

CHƯƠNG II PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SHIGELLA 5

1 Phương pháp truyền thống 5

1.1 Phạm vi áp dụng 5

1.2 Nguyên tắc 5

1.3 Môi trường và hóa chất 5

1.4 Quy trình phân tích 6

1.5 Dụng cụ và thiết bị 6

1.6 Các bước tiến hành 7

1.7 Kết quả 9

2 Phương pháp hiện đại 9

2.1 Phương pháp PCR 9

2.2 Kỹ thuật LA (latex agglutination) 9

KẾT LUẬN 11

TÀI LIỆU THAM KHẢO 12

BẢNG PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC 13

CÂU HỎI TRẮC NGHIỆM 14

Shigella vào biểu mô ruột kết và lớp đệm Kết quả là viêm đại tràng và loét niêm mạc dẫn đến phân có máu, nhầy và tiêu chảy sốt Shigella gây ra bệnh lỵ trực khuẩn chiếm

một tỷ lệ đáng kể trong các bệnh đường ruột cấp tính ở trẻ em các nước đang phát triển

và bệnh nhiễm trùng này là nguyên nhân chính dẫn đến sự tăng trưởng thấp còi củanhững trẻ em này Shigella cũng có nguy cơ đáng kể đối với du khách đến từ các nướcphát triển khi đến thăm các khu vực lưu hành bệnh, và các đợt bùng phát thức ăn hoặcnguồn nước lẻ tẻ xảy ra ở các nước phát triển

Shigella được cho là loại vi khuẩn đứng hàng đầu gây ra bệnh tiêu chảy trên

toàn thế giới Tính đến năm 2006, theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới WHO,

Shigella là nguyên nhân gây ra khoảng 165 triệu trường hợp lỵ nặng, một triệu trong

số đó đã dẫn đến tử vong mỗi năm Ở Việt Nam, số ca nhiễm Shigella rất cao, hơn hẳn bệnh gây ra bởi Salmonella typhi và Vibrio choleraeri Việt Nam có khoảng 39.500 ca

nhiễm Shigella hằng năm, cao nhất là ở vùng cao nguyên Trung Bộ, kế đến là vùng bờbiển Nam Trung Bộ và thấp nhất là vùng đồng bằng sông Hồng Nghiên cứu cho thấy

mưa nhiều và nghèo đói là những nguy cơ trong nhiễm Shigella Loài Shigella gây bệnh phổ biến là S Flexneri và S.sonnei Loại vi khuẩn này liên quan chặt chẽ với Salmonella.

NỘI DUNG

CHƯƠNG I TỔNG QUAN VỀ SHIGELLA

1 Đặc điểm sinh học

1.1 Sinh thái và tính chất nuôi cấy

Theo khoa học Shigella được xếp vào giới Bacteria, ngành Proteobacteria, lớp Gramma Proteobacteria, bộ Enterobacteriales, họ Enterobacteriaceae, giống Shigella

Castellani & Chalmers 1919

Shigella là có dạng hình que dài 1 – 3 μm trực khuẩn gram âm, kỵ khí tùy nghim trực khuẩn gram âm, kỵ khí tùy nghi

nhưng phát triển rất tốt ở điều kiện hiếu khí

Trong môi trường đặc chúng tạo thành

khuẩn lạc tròn, có đường kính khoảng 2 mm

sau 24h Shigella thường bị nhầm lẫn với

Salmonella trong quá trình kiểm tra vi sinh.

Shigella không sinh bào tử và không có lông

mao, không di động Trên môi trường phân

lập có lactose, khuẩn lạc vẫn không màu

1.2 Tính chất sinh hóa

Khi mới nuôi cấy có dạng cầu trực khuẩn có phản ứng catalase dương tính,oxidase âm tính, H2S âm tính, lactose âm tính trừ S Sonei có khả năng lên men chậm sau từ 2 ngày đến 2 tuần Khả năng lên men monnitol, trừ S Dysenteriae Chủng Shigella đều lên men đường glucose, hầu hết không sinh hơi, một số trường hợp sinh

hơi nhưng rất yếu Trên môi trường phân lập có lactose, khuẩn lạc vẫn không màu

1.3 Cấu trúc kháng nguyên

Shigella có kháng nguyên thân O, một số có kháng nguyên K và không có kháng nguyên H Giống Shigella gồm 4 loài:

- Shigella dysenteriae (kháng huyết thanh nhóm A), không lên men

monnitol, có 10 typ huyết thanh, các typ huyết thanh không có quan hệ vềkháng nguyên với các nhóm khác và không có quan hệ về kháng nguyên vớinhau Nhóm này lây truyền chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Đặc biệt

là nhiễm serotype A (lỵ Shiga Kruse), ngoài độc tố còn sinh ra một ngoại độc tố

mạnh, gây nên các triệu chứng nhiễm độc thần kinh hay gặp ở trẻ em

- Shigella flexneri (kháng huyết thanh nhóm B), có khả năng lên men

monnitol trừ một vài ngoại lệ, có 6 typ huyết thanh, các typ huyết thanh này có

cả thành phần kháng nguyên đặc hiệu typ và thành phần kháng nguyên chungcho cả 6 typ Nhóm được cô lập thường xuyên hầu hết các loài trên toàn thếgiới, và chiếm 60% các trường hợp ở các nước đang phát triển

- Shigella boydii (kháng huyết thanh nhóm C), có khả năng lên men

monnitol, trừ một vài ngoại lệ, được chia thành 15 typ huyết thanh Được tìmthấy chủ yếu trong tiểu lục địa Ấn Độ và Bắc Phi, nhiễm trùng do chúng thường

là rất hiếm và không gây hại

- Shigella sonei (kháng huyết thanh nhóm D), có khả năng lên men

monnitol, là nhóm duy nhất có khả năng lên men lactose nhưng chậm, chỉ có 1typ huyết thanh Gây ra 77% các trường hợp ở các nước phát triển, so với chỉ15% các trường hợp ở các nước đang phát triển; nhóm này hiện nay phổ biếnnhất ở Trung Âu, đặc biệt gây ra bệnh tiêu chảy mùa hè thường vô hại ở trẻ em

Nhóm A – C có tính chất sinh lý tương tự nhau; S sonnei (nhóm D) có thể được

phân biệt trên cơ sở các xét nghiệm sinh hóa chuyển hóa

1.4 Độc tố

Các Shigella đều có nội độc tố và một số Shigella có ngoại độc tố:

- Nội độc tố: nội độc tố có tính độc mạnh, cấu tạo như kháng nguyên thân,

là loại kháng nguyên yếu Tác dụng chủ yếu là gây phản ứng trong ruột

- Ngoại độc tố: độc tố này rất độc, mạnh như độc tố của trực khuẩn uốnván, có tác dụng đặc hiệu vào hệ thần kinh Những độc tố mạnh thì sẽ trung hòabằng kháng thể đặc hiệu

2 Khả năng và cơ chế gây bệnh

2.1 Khả năng gây bệnh

Shigella là tác nhân gây bệnh lỵ trực khuẩn, chỉ có người và khỉ mắc bệnh này Nguồn nhiễm Shigella vào thực phẩm chủ yếu là từ nguyên liệu, từ nước, từ công nhân

chế biến thực phẩm, hoặc tiếp xúc bề mặt trong sản xuất hay từ phân Các loại thực

phẩm thường xuyên phân lập được Shigella là rau quả, xà lách, thịt băm, thủy sản Liều lượng gây ngộ độc thực phẩm do Shigella rất thấp, có thể chỉ ở mức 10g tế bào/g

sản phẩm là có thể gây bệnh

2.2 Cơ chế gây bệnh

Cơ chế gây bệnh của Shigella rất phức tạp, liên quan đến tiền chất tiêu chảy có thể gây độc ruột, độc tế bào và ngoại độc tố, độc tố thần kinh Shigella là căn nguyên

gây bệnh lỵ trực trùng, viêm ruột kết qua trung gian cytokine và hoại tử biểu mô ruột

kết Vi khuẩn Shigella nhân lên trong các tế bào biểu mô ruột kết, vi khuẩn chết giải

phóng ra nội độc tố

2.3 Tác hại

Gây xung huyết, xuất tiết, gây chết tế bào và lây lan sang các bên để lây nhiễm

và giết chết các tế bào biểu mô lân cận gây loét, viêm và chảy máu niêm mạc, viêmkhớp mãn tính, thủng ruột, xuất huyết tiêu hóa, viêm loét đại tràng

Nội độc tố còn tác động lên thần kinh giao cảm gây co thắt và tăng nhu độngruột Những tác động đó làm bệnh nhân đau bụng quằn, buồn đi ngoài và đi ngoàinhiều lần, phân có chất nhầy lẫn máu

Ngoại độc tố có thể gây viêm màng não và hôn mê Tuy nhiên, vi khuẩn chỉsinh ra ngoại độc tố sau khi xâm nhập vào niêm mạc đại tràng

Bệnh lỵ trực khuẩn thường ở thể cấp tính Một tỷ lệ nhỏ có thể trở thành mãntính, những bệnh nhân này thỉnh thoảng lại đi ngoài lỏng và thường xuyên thải vikhuẩn ra ngoài theo phân

Ở nước ta, đa số trường hợp bị lỵ trực khuẩn do S Dysenteriae và S Flexneri, chỉ có một tỷ lệ nhỏ do S Boydi và S Sonnei Shigella có thể được phát hiện bằng cách

nuôi cấy một lượng mẫu xác định vào môi trường lỏng không chọn lọc, sau đó đượcchuyển vào môi trường tăng sinh chọn lọc Dịch khuẩn sau khi tăng sinh chọn đượccấy phân lập trên ít nhất 2 loại môi trường thạch đĩa và mức độ chọn lọc khác nhau.Khuẩn lạc nghi ngờ được kiểm tra bằng thử nghiệm hóa và kháng huyết thanh

CHƯƠNG II PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SHIGELLA

1. Phương pháp truyền thống

1.1 Phạm vi áp dụng

Phương pháp này được tham chiếu theo ISO 21567:2014 được áp dụng để phát

hiện Shigella trong tất cả loại thực phẩm.

1.2 Nguyên tắc

Cấy một lượng mẫu xác định vào môi trường chọn lọc Từ môi trường này cấyphân lập lên môi trường rắn chọn lọc, sau thời gian ủ, những khuẩn lạc nghi ngờ sẽđược kiểm tra khẳng định bằng thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh

1.3 Môi trường và hóa chất

Bảng 1 Môi trường và hóa chất

Môi trường và hóa chất Mục đích

Shigella Broth Tăng sinh chọn lọc

MacConkey

Phân lậpXLD

Hektoen Enteric Agar

TSI

Thử nghiệm sinh hóa khẳng định Shigella

UreaLDC

Que trang, qua cấy vòng Máy dập mẫu (Stomacher)

Đầu tip Pipetman (1000, 5000 µl) Pipetman (1000, 5000 µl)

1.6 Các bước tiến hành

❖ Bước 1 Tăng sinh chọn lọc

Cần một lượng 25g mẫu rắn hoặc đong một thể tích 25ml mẫu lỏng với sai sốcho phép ± 5% của phần thử đại diện cho vào bao PE vô trùng (hoặc bình tam giác),

bổ sung 225ml môi trường tăng sinh chọn lọc Shigella và đồng nhất mẫu bằng máy

dập mẫu (stomacher) trong 60 giây, ủ ở 37oC trong khoảng 18h ± 3h

❖ Bước 2 Phân lập

Dùng que cấy vòng cấy phân lập từ canh thang tăng sinh chọn lọc Shigella lên

mỗi đĩa thạch chứa môi trường chọn lọc MacConkey, XLD và HE Sau khi cấy, lậtngược các dĩa sao cho đấy hướng lên trên và ủ ở 37oC ± 1oC trong khoảng 24h ± 3h

Sau khi ủ 24h ± 3h, kiểm tra các đĩa về sự có mặt của các khuẩn lạc điển hình

và các khuẩn lạc không điển hình mà có thể nghi ngờ là Shigella.

- Trên môi trường XLD khuẩn lạc Shigella điển hình có màu hồng trong

suốt, có hoặc không có tâm màu đen

- Trên môi trường HE khuẩn lạc Shigella điển hình có màu xanh lam, có

hoặc không có tâm đen

- Trên môi trường MacConkey khuẩn lạc Shigella điển hình có màu đỏ

nhạt (môi trường có màu đỏ cam, hơi đục) Đánh dấu vị trí các khuẩn lạc nàytrên đáy đĩa

❖ Bước 3 Phục hồi trên môi trường dinh dưỡng NA/TSA

Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ từ mỗi đĩa trên môi trường phânlập MacConkey, XLD và HE Nếu trên một đĩa có ít nhất hơn năm khuẩn lạc điển hìnhhoặc khuẩn lạc nghi ngờ, thì lấy tất cả các khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ đó cấyria lên NA/TSA Ủ ở 37oC ± 1oC trong khoảng 24h ± 3h

- Trường hợp 1: Từ mỗi đĩa thử một khuẩn lạc đặc trưng, nếu cho các kết

quả thử nghiệm sinh hóa phù hợp thì kết luận phát hiện Shigella trong mẫu.

- Trường hợp 2: Nếu khuẩn lạc đầu tiên cho kết quả từ thử nghiệm sinhhóa không phù hợp thì tiến hành thử bốn khuẩn lạc còn lại đã được đánh dấu,một trong bốn khuẩn lạc này cho kết quả thử nghiệm sinh hóa phù hợp thì kết

luận phát hiện Shigella trong mẫu và ngược lại thì kết luận không phát hiện Shigella trong mẫu.

❖ Bước 4 Khẳng định sinh hóa

Từ các khuẩn lạc đã chọn cấy ria lên NA/TSA, dùng que cấy cấy vào các môitrường sau:

- Môi trường thạch TSI/KIA:

+ Mục đích: Được sử dụng để thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồncarbon khác nhau (glucose, lactose) và khả năng sinh H2S

+ Cấy đâm sâu và cấy vạch trên bề mặt thạch nghiêng Ủ các đĩa trong tủ ở

37oC trong 24h Shigella cho phản ứng kiềm trên mặt nghiêng và acid ở phần

đâm sâu Không sinh hơi và không sinh H2S trong môi trường

- Môi trường Urea agar:

+ Mục đích: Phát hiện vi sinh vật có mang enzyme urease hay không.+ Cấy ria trên bề mặt thạch Ủ trong tủ ở 37oC - 1oC trong 24h - 3h Nếuurea bị thủy phân, thì sẽ có màu hồng đến hồng đậm do giải phóng amoniac từviệc phân hủy urea với sự đổi màu của chất chỉ thị pH Khi không có sự đổi

màu của thạch chứng tỏ phản ứng âm tính Các loài Shigella không thủy phân

urea

- Môi trường VP:

+ Mục đích: Phát hiện vi sinh vật tạo sản phẩm trung tính trong quá trìnhlên men glucose

+ Ủ ở 37oC trong 24h Shigella cho phản ứng âm tính với thử nghiệm VP,

không đổi màu trên bề mặt môi trường Thử nghiệm VP (+) khi có màu đỏ trên

bề mặt môi trường

1.7 Kết quả

Phát hiện (hay không phát hiện) Shigella trong 25g mẫu rắn hoặc 25ml mẫu

Bộ công cụ dùng trong xét nghiệm “bộ Kít PCR” với độ nhạy rất cao với các vikhuẩn, cứ trong 25g mẫu thực phẩm có một con vi khuẩn cần tìm thì PCR sẽ phát hiện

ra chúng Điều đặc biệt là các bộ kít không chỉ gọi tên một loại vi sinh vật gây ngộ độc

thực phẩm mà chúng có thể phát hiện ra 12 loại vi khuẩn khác nhau như: E.coli, E coli 0157:h7, Salmonella spp, Shigella spp, nấm mốc

Tùy thuộc vào loại thực phẩm và số loại chỉ tiêu vi khuẩn gây bệnh cần kiểmsoát đối với mỗi loại thực phẩm, các quy trình và bộ Kit PCR cho phép xét nghiệm và

gọi tên tất cả các vi khuẩn nêu trên trong vòng 24 giờ (trừ Clostridium botulinum, cần

thời gian nuôi cấy tăng sinh dài) Chúng được thiết kế cho 50 phản ứng PCR với 50ống phản ứng, chứa đầy đủ thành phần dung dịch đệm PCR, mồi, nước để giúp kiểmtra chính xác mức độ nhiễm vi sinh vật trầm trọng hay không

Kỹ thuật PCR dùng phát hiện Shigella được tiến hành trên cặp mồi SHIG khuếch đại cho trình tự 320bp trên plasmid xâm nhiễm đặc hiệu cho Shigella và cặp

mồi 16S khuếch đại cho trình tự có kích thước 1007bp nằm trong vùng bảo tồn cùa16S rRNA hiện diện trong mọi loài vi khuẩn

So với phương pháp nuôi cấy truyền thống, phương pháp này cho hiệu quảchính xác và hay hơn ở chỗ, nó phát hiện nhiều vi khuẩn gây bệnh hơn và tốn rất ít

thời gian Riêng đối với Shigella thì cho phép phát hiện Shigella ở mức 10 CFU/25g

mẫu sau 12→14h tăng sinh, cho kết quả sau 24h

2.2 Kỹ thuật LA (latex agglutination)

Ngoài ra dựa trên kỹ thuật phân tích kháng thể dùng trong phát hiện Shigella

còn có bộ Kit Wellcolex, bộ kít Bactigen dựa trên kiểu phân tích LA

Được sử dụng từ những năm 1956, xét nghiệm LA rất phổ biến tại các phòngthí nghiệm lâm sàng, áp dụng để phát hiện hơn 100 bệnh truyền nhiễm Thử nghiệmnày dựa trên sự ngưng kết giữa các hạt cao su với các kháng thể huyết thanh.Chẩn

đoán xác định Shigella từ các mẫu lâm sàng trong 24h với độ đặc hiệu (> 98%) và độ

nhạy (100%), hơn nữa thao tác rất đơn giản và dễ sử dụng

Ví dụ: cơ chế của thử nghiệm LA: Các mẫu thực phẩm cần kiểm tra sau khiđược xử lý được pha trộn với hạt cao su đã được phủ một kháng thể hoặc kháng

nguyên cụ thể Nếu mẫu bị nghi ngờ có sự hiện diện của Shigella, các hạt cao su sẽ

cụm lại với nhau (tựu lại)

KẾT LUẬN

Do vậy Shigella được kiểm soát rất nghiêm ngặt trong thực phẩm, đòi hỏi các

phương pháp kiểm nghiệm phải rất nhạy, các quy trình kiểm soát phải chặt chẽ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 8131:2009 (ISO 21567:2004) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi Phương pháp phát hiện Shigella Spp.

[2] Shigella - Medical Microbiology (n.d.) NCBI Retrieved October 12, 2022,from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK8038/

[3] Shigellosis -Journal of Microbiology (n.d.) Korea Science Retrieved October

12, 2022, from https://koreascience.kr/article/JAKO200502636831192.page

BẢNG PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC

ST

T Họ và tên MSSV Công việc

Mức độ hoàn thành

1 Phạm Thị Xuân

Đào

2005200438

Dụng cụ và thiết bịMục đích của các môi trường Tổng hợp và chỉnh sửa WordChỉnh sửa PowerPoint

100%

2 Huỳnh Tấn Lộc 2005208212

Phạm vi và nguyên tắcMôi trường và hóa chấtQuy trình phân tích

100%

5 Dương Thị Ánh

CÂU HỎI TRẮC NGHIỆM

Câu 1 Chọn câu đúng về Shigella

A Trực khuẩm gram âm, không sinh bào tử

B Trực khuẩn gram dương, không sinh bào tử

C Trực khuẩn gram âm, sinh bào tử

D Trực khuẩn gram dương sinh bào tử

Câu 2 Trong cơ chế của thử nghiệm LA nếu nghi ngờ phát hiện Shigella?

A Cao su vẫn mịn và giữ lại các màu sắc ban đầu của nó

B Thay đổi màu sắc so với các hạt xung quanh

C Cao su thay đổi màu sắc khác và không còn mịn

D Hạt cao su cụm lại với nhau và thay đổi màu sắc khác biệt với cao su xung quanh

Câu 3 Định tính Shigella gồm mấy bước

A 1

B 2

C 3

D 4

Câu 4 Phát biểu đúng về Shigella

A Nội độc tố độc như trực khuẩn uốn ván

B Ngoại độc tố gây tác dụng trong hệ thần kinh

C Cả hai độc tố này là độc tố yếu

D Ngoại độc tố chủ yếu gây phản ứng trong ruột