Phân tích vi sinh thực phẩm các phương pháp định lượng và định tính clostridium perfringens

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG THƯƠNG TP.HCM KHOA CƠNG NGHIỆP THỰC PHẨM PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VÀ ĐỊNH TÍNH CLOSTRIDIUM PERFRINGENS GVHD: ThS Nguyễn Thành Luân Nhóm: Mã lớp: PHẠM ĐÌNH CHƯƠNG 2005217880 12DHTPTD CAO MINH DANH 2005217881 12DHTPTD LÊ THỊ PHƯƠNG DUNG 2022218200 12DHTPTD NGUYỄN TẤN ĐẠT 2005217899 12DHTPTD ĐỖ HOÀNG ANH KHOA 2005217943 12DHTPTD MỤC LỤC MỤC LỤC .i DANH MỤC HÌNH ẢNH ii DANH MỤC BẢNG BIỂU iii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Clostridium perfingens 1.1.1 Đặc điểm hình thái Clostridium perfingens 1.1.2 Mầm bệnh từ Clostridium perfingens thực phẩm 1.1.3 Ý nghĩa việc xác định Clostridium perfingens thực phẩm nhiều phương pháp định danh định tính CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG CLOSTRIDIUM PERFINGENS 2.1 Các phương pháp truyền thống 2.1.1 Định lượng phương pháp đếm khuẩn lạc .4 2.1.2 Phương pháp màng lọc dùng định lượng Clostridium perfingens 2.1.3 Fung double tube 2.2 Phương pháp đại 2.2.1 Phương pháp PCR việc xác định Clostridium perfingens 2.2.2 Phương pháp xét nghiệm ELISA (Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay) việc phát Clostridium perfingens 10 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 12 3.1 Kết xác định phương pháp định lượng Clostridium perfingens phương pháp đếm khuẩn lạc 12 3.2 Kết phương pháp màng lọc 15 3.3 Kết phương pháp Fung Double Tube định lượng Clostridium perfingens mẫu nước biển 17 3.4 Kết phương pháp PCR để xác định Clostridium perfingens mẫu phân đà điểu 18 3.5 Kết phương pháp ELISA việc xác định netB từ Clostridium perfingens gây bệnh viêm ruột hoại tử 19 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1: Vi khuẩn C perfringens thạch TSC 12 Hình 2: Kết thử Sinh hóa vi khuẩn C perfringens 13 Hình 3: Tỉ lệ mẫu nhiễm C.perfingens mẫu thực phẩm 13 Hình mẫu nước dùng để định lượng Clostridium perfingens phương pháp Fung Double Tube 17 Hình Multiplex polymerase chain reaction for toxins typing of C perfringens M: 100 bp DNA ladder maker, (-) negative control, lane 1: Positive control for type A, lane 2:Positive control for type B, lane 3: Positive control for type C, lane 4: Positive control for type D, lane 11: Samples 18 Hình Nồng độ độc tố NetB huyết (A), chất tiêu hóa đường ruột (B) phân (C) lấy mẫu sau nhiễm C perfringens Mối tương quan độc tố NetB chất tiêu hóa đường ruột điểm tổn thương NE mô tả (D) 21 ii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1: Các loại Clostridium perfingens dựa theo loại toxin mà chúng sản sinh mã gen ứng với loại toxin [4] Bảng Mồi ứng dụng phản ứng chuỗi polymerase phát gen độc tố Clostridium perfingens [14] 10 Bảng Số lượng mẫu từ phòng thí nghiệm với liệu dùng sau đếm từ TCA TCSA để phân tích Clostridium perfingens nước .15 Bảng tỷ lệ gen mã hóa độc tố chủng phân lập Clostridium perfringens 18 Bảng Sự phát toxin NetB gây bệnh viêm ruột hoại tử mẫu sinh học thu nhận từ gà bị viêm ruột hoại tử 20 iii ĐẶT VẤN ĐỀ “Nguồn bệnh từ thực phẩm” thuật ngữ quen thuộc ngành Công nghệ thực phẩm, xem mối nguy quan trọng ảnh hướng trực tiếp đến sức khỏe người, gây ảnh hưởng mạnh đến kinh tế thực phẩm, mối nguy đến từ vi sinh vật có thực phẩm Clostridum perfringens biết đến lịch sử lồi người có liên quan đến việm mạc hoại tử gây chủ yếu alpha – toxin Clostridium perfringens có khả hình bào tử tìm đất ruột nhiều loại động vật máu nóng, bao gồm người Bởi phổ biến vi khuẩn bào tử nó, thường vấn đề lớn ngành công nghệ thực phẩm sở chế biến thực phẩm lượng lớn thực phẩm chuẩn bị Đặc biệt người, C.perfringens gây bệnh liên quan đến thực phẩn ngộ độc thực phẩm viêm ruột gây hoạt tử [1] Loại vi sinh vật kiểm soát việc tuân thủ theo biện pháp an tồn vệ sinh thực phẩm hâm nóng làm nguội thực phẩm trình chuẩn bị, C.perfringens năm loại mầm bệnh thường gây ngộ độc thực phẩm Mỹ, đứng thứ hai tác nhân gây bệnh phát theo CDC (2019) [2] Mặc dù C.perfringens tách từ rau loại gia vị, động quan trọng cho loại vi sinh vật bò gà, loại sản phẩm thịt khác Nguồn lây nhiễm thịt phân, xem nơi cư trú tự nhiên đường tiêu hóa Ở Việt Nam, C.perfringens mối nguy đề hầu hết tiêu chuẩn thực phẩm, quy định an tồn thực phẩm Khơng riêng Việt Nam, Mỹ, theo báo cáo có triệu ca năm 27 – 44% gây tử vong, từ gây tổn thất 10 tỷ la Mỹ, lý cần xác định chủng vi sinh vật loại bỏ chúng khỏi thực phẩm Hiện có nhiều phương pháp để định danh đính tính C.perfringens thực phẩm bao gồm phương pháp đại truyền thống Với đời phương pháp đại giúp cho việc xác định C.perfringens có thực phẩm trở lên đơn giản, tiết kiệm nhiều thời gian chi phí, nhiên tồn phương pháp kiểm nghiệm 10 truyền thống cho phép người nghiên cứu hiểu sâu chế phản ứng vi sinh vật CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Clostridium perfringens Clostridium perfringens tìm năm 1891 bệnh viện Johns Hopkins sau khám nghiệm tử thi cho người đàn ông 38 tuổi bác sĩ Willian H Welch, MD, đặt tên lần viên nang Bacillus aerogenes Sau đổi tên thành Bacillus welchii trước đổi tên thành Clostridium perfringens, Latin có nghĩa “burst through.” Clostridium perfingens phân vào Giới (Regnum): Bacteria Ngành (Phylum): Bacillota Lớp (Class): Clostridia Bộ (Ordo): Clostridiales Họ (Familia): Clostridiaceae Chi (Genus): Clostridium Lồi (Species): C perfringens 1.1.1 Đặc điểm hình thái Clostridium perfringens Clostridium perfringens trực khuẩn gram dương, hô hấp kị khí sinh bào tử Trực khuẩn có khả tồn lâu dài môi trường nới tìm thấy, ví dụ tìm thấy bào tử môi trường nuôi cấy từ tinh bột Trong đó, trực khuẩn có thời gian tồn ngắn môi trường giàu glucose tế bào sinh dưỡng bào tử có khả chịu lạnh tương đối tốt C.perfringens có khả thủy phân gelatin chuyển hóa nitrates thành nitrites; mơi trường sulphite, sulphite có khả bị khử hình thành khuẩn lạc màu đen Phần lớn tiện lợi đẩy lên hàng đầu, ngày nhiều ngành hàng đơng lạnh đời đưa đến mơi trường thuận lợi cho nhiễm khuẩn vào thực phẩm Clostridium perfringens ví dụ điển hình Điều kiện cần xuất 13 axit amin thiết yếu, nhiên với nhiệt độ phát triển tối ưu 43 đến 45 độ C, khoảng pH từ – 8, khoảng hoạt độ nước (a w) từ 0.93 – 0.97, loại vi khuẩn tìm thấy thực phẩm, nước khơng khí 1.1.2 Mầm bệnh từ Clostridium perfingens thực phẩm Trong thực phẩm theo tiêu Việt Nam khơng cho phép có mặt Clostridium perfringens độ tố mà sinh với số lượng lớn (bảng 1) Độc tố C.perfringens gây bệnh khác lên động vật máu nóng kể người, kể đến biểu lâm sàng đến bệnh nghiêm trọng đe dọa đến tính mạng người [3] Bảng 1: Các loại Clostridium perfringens dựa theo loại toxin mà chúng sản sinh mã gen ứng với loại toxin [4] Alpha (α ) (plc o cpa)* A + B + C + D + E + F + G + * Gen cho loại toxin Type Beta ( β ) (cpb)* + + - Toxins Epsilon (ε ) Iota (I) (iap y ibp)* (etx)* + + + - CPE (cpe)* +/+/+/+ - NetB (netB)* + Sự đa dạng độc tố C.perfringens tạo khiến trở thành nguyên nhân gây nhiều bệnh khác người động vật Ở người, loại toxin liên quan đến bệnh tiêu hóa thực phẩm chế biến bảo quản điều kiện không đạt yêu cầu Loại bệnh thường có đặc điểm tiêu chảy, đau bụng, khơng sốt nôn mửa triệu chúng biến sau 12 đến 24 1.1.3 Ý nghĩa việc xác định Clostridium perfringens thực phẩm nhiều phương pháp định danh định tính Sau phân tích chủng khác Clostridium perfringens từ ta thấy việc kiểm sốt có mặt C.perfringens cho vơ quan trọng loại gen mã hóa cho loại C.perfringens khác nên khó xác định loại để tìm biện pháp đối phó Clostridium perfringens ứng với phương pháp phân tích phục vụ cho mục đích khác nhau, bên cạnh việc phát , định danh định lượng loại vi khuẩn thực phẩm mà việc phân tích loại trực khuẩn theo phản ứng sinh hóa Khi nhắc tới phản ứng sinh hóa, đặc trưng cho phương pháp truyền thống phương pháp đếm khuẩn lạc, phương pháp màng lọc, … Tuy nhiên phương pháp truyền thống có có chức xác định chủng lồi gây bênh khơng thể xác định xác gen thời gian khả xác định hàng loạt từ đời phương pháp đại tiện ích việc xác định nhanh diện C.perfringnes thực phẩm Mặc dù lợi ích mà phương pháp đại mang lại tiềm tàng số khuyết điểm mà có phương pháp truyền thống làm Từ ta phải thực lúc phương pháp truyền thống phuong pháp tối ưu hóa khả xác định xác định tính định lượng Clostridium perfringens CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG CLOSTRIDIUM PERFRINGENS 2.1 Các phương pháp truyền thống 2.1.1 Định lượng phương pháp đếm khuẩn lạc Phương pháp phương pháp truyền thống quen thuộc sử dụng nhiều nghiên cứu không Việt Nam mà nước ngồi Trong số nhóm lựa chọn nghiên cứu “Sự lưu hành vi khuẩn Clostridium perfringens Clostridium difficile mang gen sinh độc tố cpa, tcdA thịt rau ăn “ [5] Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm – tập 6, số 1, 2023 a) Vật liệu nghiên cứu 150 mẫu thịt (bò, lợn, gà) 220 mẫu rau ăn (rau xà lách, rau cải, rau thơm bắp cải) thu thập chợ địa bàn quận nội thành Hà Nội, gồm Đống Đa, Hồng Mai, Hà Đơng năm 2022, từ 6h sáng đến 8h sáng Các mẫu bảo quản mẫu nhiệt độ - 8°C, vận chuyển phịng thí nghiệm phân tích ngày b) Hóa chất dụng cụ thiết bị Đệm peptone (BD, Mỹ) Thạch TSC (Merck, Đức) Kháng sinh (D-cycloserin, cefoxitin, taurocholate) (Sigma, Đức) Đĩa petri vô trùng (Corning, Mỹ) Que cấy vô trùng (Biologix, Mỹ) Nồi hấp Tủ ấm Tủ an toàn sinh học cấp Máy đồng mẫu c) Phương pháp nghiên cứu Cấy ủ (kỹ thuật rót đĩa) Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh truyền thống theo TCVN 4991:2005 [6]: Cân 10g mẫu 90mL đệm peptone huyền phù 10 -1 , tạo huyền phù pha loãng 10-2 ,10-3 , 10-4 Hút mL dịch huyền phù cho vào đĩa petri, tiến hành độ pha loãng liên tiếp Đổ 15mL thạch TSC (có kháng sinh D-cycloserin) vào đĩa Để đơng, ủ 37°C/18 – 22h Đếm chọn khuẩn lạc Sau giai đoạn ủ qui định, chọn tất đĩa chứa 150 khuẩn lạc Từ đĩa này, chọn đĩa đại diện cho độ pha lỗng liên tiếp, Đếm khuẩn lạc điển hình C.perfringens đĩa Chọn năm khuẩn lạc điển hình thử khẳng định sinh hóa sử dụng mơi trường nitrat để thử tính di động mơi trường lactose-gelatin [5] Khẳng định sinh hóa Các phép thử khẳng định sinh hóa bao gồm: tính di động, chuyển hóa nitrat thành nitrit, lên men đường lactose, hóa lỏng gelatin Tính di động chuyển hóa nitrate thành nitrite Cấy đâm sâu khuẩn lạc chọn sang mơi trường nitrat để thử tính di động.Ủ điều kiện kỵ khí 37°C 24 h Kiểm tra ống mơi trường nitrate để thử tính di động loại mọc dọc theo đường cấy đâm sâu Tính di động chứng phát triển lan rộng vào môi trường cách xa đường cấy đâm sâu Kiểm tra có mặt nitrit cách bổ sung 0.2 – 0.5 mL thuốc thử phát nitrite cho vào ống mơi trường nitrat để thử tính di động [5] Hình 1: Vi khuẩn C perfringens thạch TSC A) Vi khuẩn C perfringens phân lập từ mẫu thịt gà, nồng độ pha loãng 10-3 môi trường TSC B) Vi khuẩn C perfringens ATCC 13124 [5] Hình 2: Kết thử Sinh hóa vi khuẩn C perfringens A) Đối chứng âm: A1, môi trường di động; A2: môi trường lactose – gelatin B) B1: C perfringens ATCC 13124; B2, C perfringens ATCC 13124 lên men đường lactose chuyển môi trường sang màu vàng hóa lỏng gelatin C D) Vi khuẩn Clostridium perfringens phân lập từ mẫu C1, D1: di động chuyển hóa Nitrate thành Nitrite tạo thành màu đỏ; C2, D2: lên men đường lactose chuyển môi trường sang màu vàng hóa lỏng gelatin [5] 14 Hình 3: Tỉ lệ mẫu nhiễm C.perfringens mẫu thực phẩm Qua hình 3, mẫu thịt bao gồm gà, lợn, bị mẫu rau bao gồm xà lách, rau cải, rau thơm Kết từ sơ đồ cho thấy tỉ lệ nhiễm C.perfringens quận Hồng Mai có tỷ lệ nhiễm cao mẫu thực phẩm Tuy nhiên tỉ lệ nhiễm quận khác cao, kể đến mẫu rau thơm (rau mùi, rau diếp cá, húng, mùi tàu) cho thấy tỉ lệ nhiễm C.perrfingens cao với 43.64% cao so với mẫu khác tiếp đến rau cải 36.36% xà lách 27.27% Nhưng nguồn nhiễm C.perfringens lên rau chứng minh rõ qua nghiên cứu Hashimoto cộn tỷ lệ dương tính C.perfringens đất lên khoai tây thương mại tầm quan trọng việc phát chúng tránh gây ngộ độc thực phẩm năm 2023 [18] Nghiên cứu đưa mẫu khoai tây thu thập từ vùng 14 tỉnh Nhật Bản, có đất bám bề mặt củ khoai tây, kết cho thấy 25/30 mẫu có chứa C.perfringens Thơng qua nghiên cứu lý giải ảnh hưởng đất nhiễn C.perfringens lên loại thực phẩm nông sản Ngồi đất đánh giá nguồn nước tưới tiêu dành cho sản phẩm Nghiên cứu Oluwadara Alegbeleye tiêu vi sinh nguồn nước tưới tiêu thu thập từ trang trại nông sản Sao Paulo, Brazil hàm lượng vi sinh nước tưới tiêu sau định lượng thấy hàm lượng Clostridium perfringens Enterococci phát mẫu nước tưới – 6.0 – 6.5log CFU/100ml, – 5.8 log CFU/100ml [19] 15 Đặc biệt mẫu thực phẩm thịt sản phẩm thịt, có nhiều nghiên cứu xuất lưu hành C.perfringens nhiều quốc gia khu vực khác Theo thống kê từ (hình 3) cho thấy tỉ lệ nhiễm C.perfringens tương đồng loại thịt gà, thịt bị thịt lợn từ 24 – 28% Nhưng thơng qua báo cáo nghiên cứu ghi nhận tiến hành so sánh thấy tỉ lệ có chênh lệch với số báo cáo thực số nước giới Viện Môi trường Y tế công cộng năm 2011 Hà Lan công bố tỉ lệ mẫu nhiễm thịt 7% sản phẩm thịt (n=167) [20] Cũng nghiên cứu Zaki Aras cộng đối tượng thịt bò, thịt gà thịt gà tây cho thấy tỉ lệ dương tính 31.7% [21] Trong nghiên cứu khác Osman cộng năm 2012 Ai Cập thịt gà thương phẩm cho thấy tỉ lệ dương tính C.perfringens 41.7% [22] Nghiên cứu thịt bò cắt thành miếng lò mổ thực Jiang cộng năm 2019 tỉnh Thiểm Tây Trung Quốc, cho thấy tỉ lệ nhiễm C.perfringnes 38.2% (n=165) [23] Có nhiều lý để thịt bị nhiễm Clostridium perfringens đường tiêu hóa động vật hay người hay thịt sau giết mổ bị nhiễm Qua phương pháp đếm khuẩn lạc bước đầu định tính Clostridium perfringens mẫu rau thịt Đưa kết xác mật độ từ xác định hạn chế thực phẩm gây ảnh hưởng sức khỏe người 3.2 Kết phương pháp màng lọc Sau mẫu thu từ 10 phóng thí nghiệm từ tháng 4, 2013 đén tháng 1, 2014 bao gồm mẫu nước ngọt, số mẫu nước nước biển Sau thời gian kiểm nghiệm phịng thí nghiệm đưa 219 cặp C.perfingens phân lập TSCA TCA Bảng Số lượng mẫu từ phịng thí nghiệm với liệu dùng sau đếm từ TCA TCSA để phân tích Clostridium perfringens nước Phịng thí nghiệm n 20 21 23 30 16