19 PHỤ LỤC ii Trang 4 DANH MỤC CÁC CHỮ KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT Ký hiệu, chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt 1H-NMR Proton 1 Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của proton 1
TỔ NG QUAN
VÀI NÉT VỀ HỌ CÚC - ASTERACEAE
Họ Cúc (Asteraceae) còn được gọi là họ Hướng dương hay họ Cúc tây, là một họ thực vật có hai lá mầm Họ Cúc là họ lớn nhất trong ngành thực vật có hoa, với khoảng 25.000 loài, gồm 2 phân họ:
- Phân họ hoa ống (Tubuliforae hay Asteroideae): trên cụm hoa chỉ có hoa hình ống, hoặc hoa hình ống ở giữa, hoa hình lưỡi nhỏ ở xung quanh đầu
- Phân họ hoa lưỡi nhỏ (Liguiiflorae hay Cichorioideae): tất cả các hoa trong cụm hoa đầu là hoa lưỡi nhỏ, không bao giờ có hoa ống Cây có nhựa mủ
Họ Cúc phân bố rộng khắp thế giới, nhưng phổ biến nhất là tại các khu vực ôn đới và miền núi nhiệt đới Ở Việt Nam, họ Cúc có khoảng 125 chi, trên 350 loài, chủ yếu là cỏ dại, một số được trồng làm cảnh (các loại hoa cúc), rau ăn (ngải cứu, cải cúc, rau diếp), gia vị (cúc tần)… Họ Cúc là họ có số loài được dùng làm thuốc lớn nhất trong giới thực vật Có khoảng 51 loài của họ Cúc được dùng làm thuốc, trong đó có 18 loài được dùng trong công nghiệp dược như các loài: atisô, bạch truật, cỏ nhọ nồi, cỏ ngọt, cúc hoa, cúc tần, hồng hoa, hy thiêm, ké đầu ngựa, khoản đông hoa, mần tưới, mộc hương, ngải cứu, ngưu bàng, sài đất, thương truật, thanh hao hoa vàng, tử uyển
• Một sốđặc điểm thực vật của họ Cúc:
Thân cỏ hay bụi, sống một năm hay nhiều năm, ít khi là dây leo hay cây gỗ
Rễ có thể phù lên thành củ, nhưng chất dự trữ ở đây không phải là tinh bột mà là inulin (ví dụ như cây thược dược)
Lá có hình dạng biến thiên, không có lá kèm, thường mọc đối hoặc tụ thành hình hoa ở gốc, có những loại lá có gai Thông thường phiến lá nguyên, xẻ sâu, hình dạng lá kép hình lông chim
Cụm hoa: đầu, có thể mang nhiều hoa hay ít hoa Đầu có thể đứng riêng lẻ hay tụ thành chùm, gié, xim, nhưng thông thường nhất là tụ thành ngù
Khóa luận tốt nghiệp đại học
Hoa: lưỡng tính, mẫu năm, bầu dưới, không có lá bắc con Các hoa trên một đầu có thể giống nhau, có cùng cách cấu tạo, cùng chức năng
Bao hoa: lá đài thường giảm vì nhiệm vụ bảo vệ đã được đảm nhiệm bởi các lá bắc của tổng bao Đài có thể biến mất, đôi khi chỉ còn một gờ nhỏ, nguyên hay có thùy, gờ có thể mang những vẩy hoặc một vòng lông tơ Sau khi thụ tinh, đài có thể phát triển thành một mào lông, có thể láng hay có gai, có nhiệm vụ trong sự phát tán của quả
Bộ nhị: năm nhị bằng nhau, đính trên ống tràng và xen kẽ với cánh hoa Bao phấn mở dọc, hướng trong, dính nhau thành một ống bao quanh vòi
Bộ nhụy: hai lá noãn ở vị trí trước và sau, tạo thành bầu dưới một ô, đựng một noãn, đính đáy Đĩa mật ở trên bầu Ở hoa lưỡng tính và hoa cái, vòi xuyên qua đĩa mật và chia thành hai nhánh đầu nhụy Các nhánh đầu nhụy mang ở mặt dưới những lông để quét hạt phấn khi vòi mọc xuyên qua ống cấu tạo bởi các bao phấn Sự thụ phấn nhờ côn trùng
Quả bế, thường mang một mào lông do đài biến đổi, có khi mào lông được mang bởi một cuống dài hay ngắn Đôi khi quả trần hoặc có móc hay có gai Hạt không có nội nhũ, lá mầm to, nhiều khi chứa đầy dầu.
CÁC CHI TRONG HỌ CÚC – ASTERACEAE
Ở Việt Nam, họ Cúc có khoảng 125 chi, trong đó có một số chi tiêu biểu, thường gặp như chi Gerbera, chi Helianthus L, chi Cynara Cây cỏ the là một loài thuộc chi Centipeda.
ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY CỎ THE
Cây cỏ the thuộc họ Cúc, chi Centipeda
Tên khoa học: Centipeda minima (L)
Tên thông thường: nga bất thực thảo, địa hồ tiêu, cầu tử thảo, cóc mẳn, cúc mẩn, thạch hồ tuy [3]
1.3.1 Mô tả thực vật cây cỏ the
Cỏ the là loại cỏ mềm, mọc bò lan trên mặt đất ẩm, thân rất nhiều cành, ở ngọn có lông mịn trắng, nhưng toàn thân trông nhẵn bóng Lá đơn, mọc so le, hình
Khóa luận tốt nghiệp đại học ba lá cạnh, đầu tù, phía cuống hẹp lại, mép có một, hai hoặc ba răng cưa Lá dài khoảng 10-18 mm, rộng khoảng 6-10 mm, gân chính hơi nổi ở mặt dưới lá, gân phụ không rõ, không có cuống Cụm hoa hình đầu mọc ở nách lá, hoa cái gồm nhiều lớp, cánh hoa hình ống màu trắng, trên có răng cưa Tràng hoa hình chuông, có bốn răng, hình trứng rộng, màu hơi tím Quả bế bốn cạnh, trên cạnh có lông mịn nhỏ Mùa ra hoa khoảng tháng 2 - 5, mùa quả khoảng tháng 4 - 7 Để dùng làm thuốc, thường hái toàn cây, gồm cả rễ, dùng tươi hay phơi hoặc sấy khô Cây mọc hoang khắp nơi ở vùng đồng ruộng ẩm thấp, ruộng bỏ hoang, bờ rãnh, ven đường…
Hình 1.1 Cây cỏ the Hình 1.2 Hoa cỏ the
1.3.2 Công dụngcủa cây cỏ the
Cây cỏ the có vị cay, mùi hắc, tính ấm, có tác dụng tiêu thũng, tiêu viêm, tiêu sưng, giải độc Cỏ the còn được dùng làm thuốc chữa ho, viêm phế quản, mắt đau đỏ sưng, chảy nước dãi, đau màng mộng mắt, viêm mũi dị ứng, hay dùng ngoài để chữa bệnh mẫn ngứa (eczema), trị rắn cắn, đắp bó gãy xương [2]
Phần thân, lá và hoa của cây cỏ the còn được sử dụng phổ biến trong các bài thuốc dân gian Ví dụ như trong các bài thuốc dân gian của Trung Quốc, cây cỏ the được dùng để chữa bệnh đau đầu, cảm lạnh, viêm kết mạc và bệnh sốt rét Ở Đài
Khóa luận tốt nghiệp đại học
Loan, cỏ the được nấu lấy nước để tắm cho trẻ em bị bệnh ghẻ lở, hay uống để trị các bệnh về hệ tiêu hóa [9]
• Một số bài thuốc dân gian sử dụng cây cỏ the:
Chữa mẩn ngứa (eczema): cỏ the hai phần, đậu xanh một phần, muối vài hạt
Cả ba thứ giã nhỏ đắp lên nơi bị mẩn ngứa đã được rửa sạch
Chữa ho: cỏ the khô 20 g hoặc tươi 30 g, nước 500 ml sắc còn 100 ml chia ba lần uống trong ngày
Chữa viêm mũi, nghẹt mũi: dùng cỏ the, hoa mộc lan (mỗi vị 6 g), ké đầu ngựa (10 g), sắc lấy nước uống Nếu dùng ngoài, nghiền cỏ the, tế tân và bạch chỉ rồi đặt mỗi lần một ít vào trong mũi.
THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÓ TRONG CÂY CỎ THE
Năm 1989, Dipti Gupta và J Singh công bố bốn triterpenoid saponin từ cây cỏ the là acid lα,3β,19α,23-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic-28-O-β-d-xylopyranosid (1), acid lβ,2α,3β,19α,23-pentahydroxyurs-12-en-28-oic-28-O-β-d-xylopyranosid (2),
Năm 1990, cũng Dipti Gupta và Singh J đã nghiên cứu và tìm ra một số chất trong cây cỏ the, gồm: tetratriacontanyl nonadecanoat (5), sitosterol (6), 3,3′,5,5′- tetramethoxy stilben (7), 2-isopropyl-5-methylhydroquinon-4-O-β-d-xylopyranosid
(8), acid 2α,3β,23,19α-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic-28-O-β-d-xylopyranosid (9),
Năm 1998, Taylor và Towers đã cô lập được ba sesquiterpen lacton có hoạt tính kháng khuẩn là 6-O-methylacrylylplenolin (12), 6-O-isobutyroylplenolin (13),
Năm 2007, Liang và cộng sự đã cô lập được được các sesquiterpen lacton là 4,5 β-dihydroxy-2β-(isobutyryloxy)-10β H-guai-11(13)-en-12,8β-olid (15), 4- hydroxy-1βH-guaia-9,11(13)-dien-12,8α-olid (16), 2β-(isobutyryloxy)florilenalin
Khóa luận tốt nghiệp đại học
Năm 2012, Peng Wu và các cộng sự đã cô lập được các chất sau: 4-oxo-2β- hydroxy-6α-angeloyloxy-pesudoguaia-8β,12-olid (20), 4-oxo-2β-ethoxy-6α- angeloyloxy-pesudoguaia-8β, 12-olid (21), 4,6α-dihydroxy-2α -angeloyloxy- pesudoguaia-11(13)-en-8α,12-olid (22), 4-hydroxy-2α-angeloyloxy-pesudoguaia- 11(13)-en-8α,12-olid (23), 4,5-epoxy-2α-angeloyloxy-guaia-11(13)-en-8β,12-olid
(24), 4,5-epoxy-2α-isobutyryloxy-guaia-11(13)-en-8β,12-olid (25), plenolin (26), arnicolid D (27), pulchellin-2a-O-isovalerat (28), florilenalin-2a-O-isovalerat (29), florilenalin-2a-O-isobutyrat (30), florilenalin-2a-O-angelat (31) và helenalin (32) [8]
Khóa luận tốt nghiệp đại học
Khóa luận tốt nghiệp đại học
Khóa luận tốt nghiệp đại học
Khóa luận tốt nghiệp đại học
THỰ C NGHI Ệ M VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
NGUYÊN LIỆU VÀ ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO
Cây cỏ the được thu hái ở tỉnh Vĩnh Long vào tháng 07 năm 2013 Cây tươi được rửa sạch và để khô tự nhiên trong mát Sau đó, sấy khô ở 50 – 60 o C và được xay nghiền thành bột mịn thu được 3,2 kg bột thô
Khóa luận tốt nghiệp đại học
2.2.2 Điều chế các loại cao Đun hoàn lưu 3,2 kg bột thô với dung môi methanol (3 lần x 3 giờ), lọc nóng, cô quay ở áp suất thấp, thu hồi dung môi được cao methanol Chiết phân bố lỏng - lỏng cao methanol lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: eter dầu hỏa, ethyl acetate và n-butanol Cô quay các dịch chiết, thu được các loại cao tương ứng: cao eter dầu hỏa (320,2 gam), cao ethyl acetate (36,5 gam), cao butanol (13,6 gam)
Quy trình điều chế các loại cao được trình bày trong sơ đồ 2.1 Hiệu suất điều chế các loại cao được trình bày trong bảng 2.1
Khóa luận tốt nghiệp đại học
Bảng 2.1 Khối lượng của các loại cao và hiệu suất so với bột mẫu nguyên liệu ban đầu
Bột cây cỏ the (3,20 kg)
Loại cao Khối lượng (g) Hiệu suất (%)
2.2.3 Cô lập các chất trong cao Ethyl acetate
Thực hiện sắc ký cột silica gel trên cao ethyl acetate, hệ dung môi giải ly n- hexane – ethyl acetate với độ phân cực tăng dần từ hệ hexane – ethyl acetate 9:1; 8:2 (tỷ lệ thể tích) đến ethyl acetate – methanol 1:1 Sau khi cô quay thu hồi dung môi thu được năm phân đoạn tương ứng, được ký hiệu từ A1 đến A9 Toàn bộ quá trình được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng, với thuốc thử hiện hình là Vanilin, dung dịch acid sulfuric 20% (phun đều lên bản mỏng silica gel và sấy nóng), hoặc phát hiện vết bằng đèn UV Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate được trình bày trong bảng 2.2
Bảng 2.2 Kết quả sắc ký cột trên cao ethyl acetate (36,5 g) của cây cỏ the
STT Hệ dung môi giải ly Ký hiệu phân doạn Khối lượng (g)
Khóa luận tốt nghiệp đại học
Thực hiện sắc ký cột phân đoạn A1 (8,60 g) trên silica gel pha thường, hệ dung môi giải ly chloroform-methanol, với độ phân cực tăng dần, dựa trên kết quả sắc ký bản mỏng, gộp được năm phân đoạn và kí hiệu: CT-I, CT-II, CT-III, CT-IV và CT-V
Phân đoạn CT-IV (1,38 g) được chạy sắc ký cột trên silica gel pha thường với hệ dung môi chloroform-methanol có độ phân cực tăng dần (sơ đồ 2.3) thu được
5 phân đoạn phụ Dựa trên kết quả sắc ký lớp mỏng, phân đoạn CT-IV được chọn để tách chất
Thực hiện sắc ký cột nhiều lần phân đoạn CT-IV (1,38 g) với hệ dung môi giải ly thích hợp, kết hợp với sắc ký lớp mỏng pha đảo điều chế (MeOH-H2O 1:1), đã cô lập được hai hợp chất, ký hiệu 1A; 1B
Sơ đồ 2.3 Quy trình sắc ký cột silica gel phân đoạn A1
SKC silica gel, CHCl3:MeOH
Khóa luận tốt nghiệp đại học
KẾ T QU Ả VÀ TH Ả O LU Ậ N
KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT 1A
Hợp chất 1A thu được được từ phân đoạn A1 của cao ethyl acetate với các đặc điểm như sau:
Chất bột vô định hình màu vàng nhạt
Hiện hình vết màu vàng khi soi UV, vết màu vàng với dung dịch H2SO4
Phổ 1 H-NMR (DMSO- d 6 ): Phụ lục 1
Phổ 13 C-NMR (DMSO-d 6 ): Phụ lục 2
Phổ HMBC (DMSO-d 6 ): Phụ lục 3
Phổ 1 H-NMR của hợp chất 1A cho thấy có sự hiện diện của năm proton nhân thơm trong khoảng 6-8 ppm, trong đó proton nhân thơm ở δH 6,18 (1H; d; J 2,0; H-
6) ghép cặp meta với proton ở δH 6,39 (1H; d; J 2,0; H-8) xác nhận hợp chất có vòng benzene với bốn nhóm thế; proton nhân thơm ở δH 7,44 (1H; dd; J 8,0; 2,5; H-
6′) ghép cặp ortho với proton nhân thơm ở δH 6,90 (1H; d; J 8,5; H-5′) và ghép cặp meta với proton nhân thơm ở δH 7,54 (1H; d; J 2,0; H-2′) chứng tỏ ba proton này ở các vị trí 1,2,4 trên nhân thơm B Ngoài ra, phổ 1 H-NMR còn cho thấy sự hiện diện của một proton nhóm hydroxyl kiềm nối tại δH 12,7 và proton của nhóm methoxyl tại δH 3,77
Phổ 13 C-NMR của hợp chất 1A cho thấy có sự hiện diện của mười sáu carbon, trong đó carbon carbonyl cộng hưởng tại δC 177,4 (C-4), năm carbon methine thơm cộng hưởng tại δC 115,3 (C-2’); δC 115,7 (C-5’); 120,5 (C-6’); 98,6 (C-6); 93,6 (C-
Ngoài ra, phổ 13 C-NMR còn cho thấy sự hiện diện của tín hiệu Csp 3 gắn oxygen cộng hưởng tại δC 59,6
Khóa luận tốt nghiệp đại học
Các dữ liệu phổ trên xác nhận hợp chất 1A có khung sườn flavonol
Phổ HMBC cho thấy proton của nhóm methoxyl (OCH3) tương quan với carbon δC 137,6 xác nhận nhóm OCH3 gắn với carbon tại δC 137,6 (C-3)
Khi so sánh dữ liệu phổ hợp chất 1A với 3-methoxyquercetin đã công bố nhận thấy có sự tương đồng, vì vậy hợp chất 1A có cấu trúc của hợp chất 3- methoxyquercetin Hợp chất 1A lần đầu tiên được tìm thấy trong cây cỏ the
Hình 3.1 Cấu trúc hợp chất 1A
Hình 3.2 Tương quan HMBC của hợp chất 1A
Bảng 3.1 So sánh phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của hợp chất 1A và
Khóa luận tốt nghiệp đại học
KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT 1B
Hợp chất 1B thu được được từ phân đoạn A1 của cao ethyl acetate với các đặc điểm như sau:
Chất bột vô định hình màu vàng nhạt
Hiện hình vết màu vàng khi soi UV
Khối phổ phân giải cao: Phụ lục 4
Phổ 13 C-NMR (CD 3 OD): Phụ lục 5
Phổ 1 H-NMR (CD 3 OD): Phụ lục 6
Phổ 1 H-NMR của hợp chất 1B cho thấy có sự hiện diện của năm proton nhân thơm trong khoảng 6-8 ppm, trong đó proton nhân thơm ở δH 6,23 (1H; d; J 2,0; H-
6) ghép cặp meta với proton ở δH 6,43 (1H; d; J 2,0; H-8) xác nhận hợp chất có vòng benzene với bốn nhóm thế; proton nhân thơm ởδH 7,68 (1H; dd; J 8,5; 2,5; H-
6′) ghép cặp ortho với proton nhân thơm ở δH 6,93 (1H; d; J 8,5; H-5′) và ghép cặp meta với proton nhân thơm ở δH 7,78 (1H; d; J 2,0; H-2′) chứng tỏ ba proton này ở các vị trí 1,2,4 trên nhân thơm B
Phổ 13 C-NMR cho thấy tín hiệu cộng hưởng của mười lăm carbon, trong đó carbon carbonyl cộng hưởng tại δC 177,4 (C-4), có năm carbon methine thơm cộng hưởng tại δC 116,2 (C-2’); δC 116,4 (C-5’); 121,8 (C-6’); 99,4 (C-6); 4,6 (C-8) Khi so sánh dữ liệu phổ hợp chất 1B với quercetin đã công bố nhận thấy có sự tương đồng, vì vậy hợp chất 1B có cấu trúc của hợp chất quercetin
Hình 3.3: Cấu trúc hợp chất 1B
Khóa luận tốt nghiệp đại học
Bảng 3.2 So sánh phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của hợp chất 1B và quercetin
Hợp chất 1B Quercetin Hợp chất 1B Quercetin
Khóa luận tốt nghiệp đại học
KẾ T LU Ậ N VÀ KI Ế N NGH Ị
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Từ mẫu cây cỏ the thu hái được ở huyện Long Hồ, tỉnh Vĩnh Long, chúng tôi đã khảo sát thành phần hoá học trong cao etyl acetate của cây cỏ the Bằng kỹ thuật sắc ký cột trên silica gel pha thường, sắc ký bản mỏng, chúng tôi đã cô lập được 2 hợp chất: 1A (3-methoxyquercetin) và 1B (quercetin)
Cấu trúc của các hợp chất trên được xác định dựa vào các phương pháp phổ nghiệm hiện đại như 1 H-NMR, 13 C-NMR, HMBC
Hướng nghiên cứu tiếp theo của chúng tôi là tiến hành thăm dò hoạt tính sinh học các hợp chất đã cô lập được và tiếp tục khảo sát các phân đoạn cao còn lại, góp phần làm sáng tỏ thành phần hóa học và nâng cao giá trị sử dụng của cây cỏ the
Khóa luận tốt nghiệp đại học