Thế nhưng bệnh tật không vì thế mà giảm đi, tỷ lệ mắc bệnh tăng lên từng ngày xuất phát từ nhiều nguyên nhân do ô nhiễm môi trường, do hóa chất trong thực phẩm, hay cũng có thể do di tru
TỔ NG QUAN
ĐẶC ĐIỂ M TH Ự C V Ậ T
Me rừng còn gọi là chùm ruột núi hay du cam tử, ngưu cam tử, dư cam tử
Tên khoa học: Phyllanthus emblica Linn
Thuộc họ thầu dầu Euphorbiaceae [1]
Hình 1.1 Cây me rừng Hình 1.2 Quả me rừng
Cây me rừng chủ yếu phân bố ở các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới như Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia và Malaysia Tại Việt Nam, cây me rừng thường mọc trên các đồi trọc, bãi hoang và trong các khu rừng thưa.
Me rừng là cây ưa sáng, có khả năng chịu hạn, cao khoảng 3m với nhiều cành nhỏ mềm có lông dài 20cm Hoa nhỏ, mọc thành xim ở nách lá dưới cành, bao gồm nhiều hoa đực và một vài hoa cái, nở từ tháng 3 đến tháng 11 Lá cây xếp thành hai dãy trên các cành nhỏ, giống như lá kép lông chim, với cuống lá rất ngắn và lá kèm nhỏ hình ba cạnh Quả ban đầu hình cầu, sau đó khô lại thành quả nang, hạt có hình ba cạnh và màu hồng nhạt.
CÁC NGHIÊN C Ứ U V Ề DƯỢ C TÍNH
1.2.1 Dược tính theo y học cổ truyền Ở Việt Nam:
Khóa luận tốt nghiệp đại học
Quả có vị chua, ngọt, đắng, tính mát, có tác dụng nhuận phế, hóa đờm, sinh tân, chữa cảm, phát sốt ho, đau cổ họng [1]
Rễ có tác dụng trị viêm ruột, đau bụng đi ngoài, cao huyết áp: ngày dùng 15-20g rễ sắc uống [1]
Lá có tác dụng trị lở loét, mẩn ngứa [1] Ở Ấn Độ:
Cây me rừng, một loại thảo dược phổ biến ở Ấn Độ, được biết đến như một nguồn cung cấp vitamin C dồi dào Quả tươi của cây có tác dụng mát, lợi tiểu và nhuận tràng, trong khi quả khô được sử dụng để điều trị lỵ và tiêu chảy.
Cây có nhiều tác dụng hữu ích như hạ men gan, cải thiện khả năng hấp thụ thức ăn và cân bằng lượng acid trong dạ dày Ngoài ra, cây còn giúp tăng cường
1.2.2 Một số nghiên cứu vềdược tính
+ Hoạt tính kháng herpes simplex virus (HSV) loại 1 và loại 2
Năm 2011, Yangfei Xiang và các cộng sự [16] đã thử nghiệm khả năng kháng viêm nhiễm HSV-1 và HSV-2 của hợp chất 1,2,4,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucose
Nghiên cứu về 1246TGG, được tách chiết từ cây me rừng, cho thấy ở nồng độ 31,70 àM, chất này có khả năng ức chế sự phát triển của virus Herpes, mở ra triển vọng trong việc điều trị HSV.
+ Tác dụng gây độc tế bào ung thư
Năm 2011, Xiaoli Liu và các cộng sự đã nghiên cứu khả năng điều hòa miễn dịch và gây độc tế bào ung thư của một số hợp chất phenol từ quả me rừng Kết quả cho thấy hai hợp chất isocorilagin và geraniin có khả năng gây độc tế bào ung thư vú (MCF-7) với IC50 lần lượt là 13,2 và 80,9 µg/ml Đặc biệt, isocorilagin còn cho thấy tác dụng gây độc tế bào ung thư phổi (HELF) với IC50 là 51,4 µg/ml.
+ Tác dụng phục hồi tổn thương tinh hoàn do tác dụng phụ của thuốc động kinh
Khóa luận tốt nghiệp đại học
Here is a rewritten paragraph:Valproic acid được sử dụng rộng rãi trong điều trị bệnh động kinh, tuy nhiên lại có tác dụng phụ không mong muốn ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của nam giới Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng valproic acid có thể gây ra các vấn đề về sinh sản, bao gồm giảm số lượng và chất lượng tinh trùng, làm tăng nguy cơ vô sinh.
+ Hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxi hóa
Nghiên cứu của Xiaoli Liu (2007) và Wei Luo (2010) đã chỉ ra rằng một số hợp chất phenol như 3-O-galloyl mucic acid 1,4-lactone, kaempferol 3-β-D-glucopyranoside, kaempferol, quercetin, isocorilagin, geraniin, isomallotusinin, chebulagic acid và chebulanin được chiết xuất chủ yếu từ vỏ và quả me rừng, có khả năng kháng khuẩn và kháng oxi hóa hiệu quả.
+ Tác dụng phục hồi chức năng gan và hạ men gan
Nghiên cứu của Sharma Bhawna và các cộng sự năm 2010 cho thấy dịch chiết ethanol từ cây me rừng có khả năng hạ men gan và phục hồi chức năng tế bào gan Liều lượng hiệu quả được xác định là 75mg/kg/ngày khi thử nghiệm trên chuột.
CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC
Research conducted prior to 1998 identified several compounds in the wild tamarind tree, including zeatin, zeatin nucleotide, zeatin riboside, chebulic acid, chebulinic acid, corilagin, 3,6-di-O-galloyl glucose, gallic acid, ethyl gallate, gluco-gallin, ellagic acid, various gibberellins (A1, A3, A4, A7, A9), leucodelphinidin, rutin, and β-sitosterol.
Khóa luận tốt nghiệp đại học
Từ năm 1999 đến 2001, Ying-Jun Zhang và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học từ các bộ phận khác nhau của cây me rừng Kết quả nghiên cứu cho thấy nhóm tác giả đã cô lập và xác định được nhiều hợp chất, bao gồm phyllaemblic acid (20), các phyllaemblicin A-C (21-23), cùng với sáu hợp chất phenolic mới như 2-O-galloyl L-malic acid (24), 2-O-galloyl mucic acid (25) và ba dẫn xuất methyl ester (26-28) Ngoài ra, họ cũng phát hiện 2-O-galloyl mucic acid 1,4-lactone (29) cùng các dẫn xuất methyl ester (30), 5-O-galloyl mucic acid 1,4-lactone (31) và dẫn xuất methyl ester (32), cùng với 3-O-.
The undergraduate thesis focuses on the compounds galloyl mucic acid 1,4-lactone, 3,5-di-O-galloyl mucic acid 1,4-lactone, phyllaemblic acid B, phyllaemblic C, and phyllaemblicin D, along with two novel compounds: 2-carboxylmethylphenol 1-O-β-D-glucopyranoside and 2,6-dimethoxy-4-(2-hydroxyethyl)phenol 1-O-β-D-glucopyranoside, as well as the phyllanemblinin series A-F.
Khóa luận tốt nghiệp đại học
Năm 2007, Xiaoli Lin và các cộng sự đã phát hiện ra năm hợp chất từ cây me rừng, bao gồm kaempferol 3-β-D-glucopyranoside, kaempferol, quercetin, isocorilagin và geraniin Cùng năm đó, họ cũng đã cô lập thành công hợp chất mới phyllanthunin.
(51) cũng đã được cô lập cùng với các hợp chất đã biết: daucosterol (52), stearic acid
Khóa luận tốt nghiệp đại học
In 2008, S K EL-DESOUKY and colleagues isolated a novel compound known as acylated apigenin glucoside (apigenin-7-O-(6”-butyryl-β-glucopyranoside)) along with other compounds such as 1,2,3,4,6-penta-O-galloyglucose Additionally, Xiaoli Liu and his team successfully isolated quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside.
Khóa luận tốt nghiệp đại học
Từ vỏ quả me rừng, năm 2011, Wei Lou và các cộng sự đã cô lập được isomallotusinin (59), chebulagic acid (60), chebulanin (61) [10]
Hợp chất 1,2,4,6-tetra-O- galloyl-β-D-glucose (62) đã được cô lập từ lá và cành của cây me rừng bởi Yangfei Xiang và các cộng sự vào năm 2011 [16]
Năm 2012, Wei-Yan Qi và cộng sự đã cô lập được β-sitosterol (19), daucosterol
(52), cùng 12 hợp chất sterol khác (63-74), trong đó có 2 hợp chất sterol mới là 5α,6β,7α- trihydroxysitosterol (64) và 7α-acetoxysitosterol (65) từ cành và lá của cây me rừng [12]
Khóa luận tốt nghiệp đại học
Khóa luận tốt nghiệp đại học
Khóa luận tốt nghiệp đại học
THỰC NGHIỆM
NGUYÊN LIỆU
Mẫu được dùng trong nghiên cứu khoá luận là lá cây me rừng được thu hái tại Bình Thuận vào tháng 5/2014
Mẫu cây đã được TS Phạm Văn Ngọt nhận danh tên khoa học là Phyllanthus emblica Linn, họ thầu dầu ( Euphorbiaceae)
2.2.2 Xử lý mẫu nguyên liệu
Nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ sâu bệnh, phơi khô trong bóng râm và xay thành bột mịn Tiếp theo, tiến hành ngâm chiết và phân lập các hợp chất.
ĐIỀ U CH Ế CÁC LO Ạ I CAO
Lá me rừng được phơi khô, cắt nhỏ và nghiền thành bột mịn với khối lượng 7,2 kg Nguyên liệu này sau đó được chiết xuất bằng ethanol 96° thông qua phương pháp ngâm dầm, sau khi lọc và cô quay dưới áp suất thấp, thu được 285,5 g cao ethanol thô.
Cao ethanol thô được chiết xuất bằng phương pháp lỏng – lỏng với hexane và ethyl acetate, cho ra các sản phẩm gồm cao hexane (22,1 g), cao ethyl acetate (143,1 g) và phần cao còn lại (77,1 g) Quá trình chiết xuất này được tóm tắt trong sơ đồ 2.1 của khóa luận tốt nghiệp đại học.
CÔ L Ậ P CÁC H Ợ P CH Ấ T H ỮU CƠ TRONG CAO ET HYL ACETATE
Cao ethyl acetate được SKC silica gel giải ly bằng hệ dung môi H: EA (80% đến 100% EA) và tiếp tục với hệ dung môi EA: Me (5% đến 100% Me) Dịch giải ly được thu thập vào các lọ sau khi qua cột, và quá trình giải ly được theo dõi bằng sắc kí lớp mỏng Các lọ có kết quả sắc kí lớp mỏng giống nhau được gộp lại thành một phân đoạn, với tổng cộng 5 phân đoạn (EA1-EA5) được thu nhận Quá trình thực hiện chi tiết được trình bày trong bảng 2.1.
Sơ đồ 2.1 Qui trình điều chế các loại cao
Bột lá me rừng ( 7,2 Kg)
- Cô quay thu hồi dung môi
Ethanol thu hồi Cao ethanol
- Chiết lỏng – lỏng với hexane, ethyl acetate
- Cô quay thu hồi dung môi
Cao ethyl acetate lá me
Khóa luận tốt nghiệp đại học
Bảng 2.1 Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate lá me (143,1g)
STT Phân đoạn Dung môi giải ly
Sắc kí lớp mỏng Ghi chú
1 EA1 H:EA 2:8 16,50 Vệt dài Khảo sát
2 EA2 EA 13,28 Nhiều vết Chưa khảo sát
3 EA3 EA:Me 95:5 22,25 Nhiều vết kéo vệt Đã khảo sát
4 EA4 EA:Me 8:2 33,40 Nhiều vết Khảo sát
5 EA5 EA:Me 7:3 14,70 Nhiều vết Chưa khảo sát
Ghi chú: H (hexane), EA (ethyl acetate), Me (methanol)
2.4.1 SẮC KÍ CỘT SILICA GEL TRÊN PHÂN ĐOẠN EA1 (16,50 g)
Tiến hành sắc ký cột silica gel trên phân đoạn EA1 (16,50 g) sử dụng hệ dung môi C:Me với tỷ lệ từ 0% đến 20% Me, sau đó chuyển sang hệ dung môi EA:Me với tỷ lệ từ 5% đến 100% Me, thu được tổng cộng 10 phân đoạn được ký hiệu từ EA1.1 đến EA1.10.
Trong phân đoạn EA1.9, sắc kí lớp mỏng cho thấy sự tách biệt rõ ràng của vết màu vàng Sau nhiều lần sắc kí cột pha thường trên phân đoạn này, hợp chất thu được dưới dạng bột màu vàng, được ký hiệu là PAL3 Hợp chất PAL3 có khối lượng 25mg và được chiết xuất bằng hệ dung môi H: Ac: AcOH với tỷ lệ 6:4:0,2, hiện hình màu vàng khi sử dụng thuốc thử H2SO4 20% Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 2.2 và 2.3.
Bảng 2.2 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA1 (16,50 g) của bảng 2.1
STT Phân đoạn Dung môi giải ly
Sắc kí lớp mỏng Ghi chú
1 EA1.1 C 0,39 Nhiều vết Khảo sát
2 EA1.2 C 0,32 Nhiều vết Chưa khảo sát
3 EA1.3 C 0,31 Nhiều vết Chưa khảo sát
4 EA1.4 C : Me 9:1 0,38 Vệt dài Chưa khảo sát
5 EA1.5 C : Me 9:1 0,32 Vệt dài Chưa khảo sát
6 EA1.6 C : Me 9:1 0,22 Vệt dài Chưa khảo sát
7 EA1.7 C : Me 85:15 0,24 Vệt dài Chưa khảo sát
8 EA1.8 C : Me 85:15 0,31 Vệt dài Chưa khảo sát
9 EA1.9 C : Me 8:2 9,73 Vết rõ ràng Khảo sát
10 EA1.10 C : Me 8:2 0,83 Nhiều vết Chưa khảo sát
Khóa luận tốt nghiệp đại học
Bảng 2.3 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA1.9 của bảng 2.2
STT Phân đoạn Dung môi giải ly
Sắc kí lớp mỏng Ghi chú
1 EA1.9.1 DCM:Me 95:5 0,41 Vết mờ Khảo sát
2 EA1.9.2 DCM:Me 95:5 0,65 Nhiều vết Đã khảo sát
3 EA1.9.3 DCM:Me 95:5 0,54 Nhiều vết Đã khảo sát
4 EA1.9.4 DCM:Me 9:1 1,57 Nhiều vết Chưa khảo sát
5 EA1.9.5 DCM:Me 9:1 1,51 Vết rõ ràng Chưa khảo sát
6 EA1.9.6 DCM:Me 9:1 0,40 Vết rõ ràng Khảo sát thu được PAL3
7 EA1.9.7 DCM:Me 9:1 1,62 Nhiều vết Chưa khảo sát
2.4.2 SẮC KÍ CỘT SILICAGEL TRÊN PHÂN ĐOẠN EA4 (33,40 g)
Tiến hành sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4 (33,40 g) sử dụng hệ dung môi H:EA với tỷ lệ từ 75% đến 100% EA, sau đó chuyển sang hệ dung môi EA:Me với tỷ lệ từ 5% đến 40% Me Quá trình này thu được 8 phân đoạn, được kí hiệu từ EA4.1 đến EA4.8.
Trong phân đoạn EA4.7, kết quả sắc kí lớp mỏng cho thấy sự tách vết màu vàng rõ ràng Sau khi thực hiện sắc kí cột pha thường nhiều lần trên phân đoạn EA4.7, chúng tôi thu được hợp chất không màu, được ký hiệu là PAL4, với khối lượng 7mg trong hệ dung môi H: Ac.
AcOH 6:4:0,2 màu vàng khi hiện hình bằng thuốc thử H2SO 4 20%) Kết quả được trình bày trong bảng 2.4, 2.5
Bảng 2.4 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4 (33,40 g) của bảng 2.1
STT Phân đoạn Dung môi giải ly
Sắc kí lớp mỏng Ghi chú
1 EA4.1 H:EA 1:3 4,67 Vệt dài Đã khảo sát
2 EA4.2 H:EA 1:3 3,78 Nhiều vết kéo vệt Chưa khảo sát
3 EA4.3 H:EA 1:9 2,52 Nhiều vết kéo vệt Chưa khảo sát
4 EA4.4 H:EA 1:9 2,75 Vệt dài Chưa khảo sát
5 EA4.5 EA 1,59 Vệt dài Đã khảo sát
6 EA4.6 EA:Me 95:5 1,86 Kéo vệt Chưa khảo sát
7 EA4.7 EA:Me 85:15 3,40 Có vết tách rõ Khảo sát
8 EA4.8 EA:Me 6:4 2,80 Kéo vệt Chưa khảo sát
Khóa luận tốt nghiệp đại học
Bảng 2.5 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.7 (3,40 g) của bảng 2.4
STT Phân đoạn Dung môi giải ly
Sắc kí lớp mỏng Ghichú
1 EA4.7.1 H:Ac 4:1 0,16 Vệt dài Chưa khảo sát
2 EA4.7.2 H:Ac 4:1 0,24 Nhiều vết Chưa khảo sát
3 EA4.7.3 H:Ac 3:2 0,8 Nhiều vết Khảo sát thu được PAL4
4 EA4.7.4 H:Ac 3:2 1,20 Vệt dài Chưa khảo sát
Khóa luận tốt nghiệp đại học
3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT PAL3 (25 mg)
Hợp chất PAL3 thu được sau quá trình sắc kí cột nhiều lần phân đoạn EA1.9.6 của bảng 2.3 có những đặc điểm quan trọng sau:
• Hợp chất ở dạng bột màu vàng
Kết quả sắc ký lớp mỏng với hệ môi hexane : acetone : acetic acid theo tỷ lệ 6: 4: 0,2, được hiện hình bằng thuốc thử H2SO4 20% và đun nóng bảng mỏng, cho thấy một vết tròn màu vàng nhạt.
• Phổ 1 H-NMR (acetone – d 6 , phụ lục 1), δH ppm: 7,69 (1H, dd, H-6’), 6,99 (1H, d, H-5’), 7,82 (1H, d, H-2’), 6,51 (1H, d, H-8), 6,26 (1H, d, H-6),
• Phổ 13 C-NMR (acetone – d 6 , phụ lục 2), δC ppm: 176,36 (>C=O) và độ chuyển dịch của các cacbon khác được trình bày trong bảng 3.1
Phổ 1 H-NMR của PAL3 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 5 proton vòng thơm trong vùng δ H 7,82-6,26 Trong đó ở δH 7,82 (J=2,0 Hz) xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của proton bị tách meta, ở δH 7,69 (J=8,5 Hz) xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của proton bị tách ortho và meta Ngoài ra trên phổ còn xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của hai proton khác bị tách meta ở δH 7,82 (J=2,0 Hz) và 7,69 (J=2,5 Hz)
Phổ 13 C-NMR của PAL3 thể hiện tín hiệu cộng hưởng của 15 C trong vùng δC
176,4 -94,3, cho phép dự đoán PAL3 là hợp chất flavon Trong đó có carbon >C=O cộng hưởng ở δC 176,4 ppm Như vậy có thể dự đoán PAL3 là một flavonol
Từ những dữ liệu trên kết hợp so sánh với dữ liệu phổ của quercetin cho thấy sự tương đồng, nên hợp chất PAL3 được đề nghị là quercetin
Khóa luận tốt nghiệp đại học
Bảng 3.1 Dữ liệu phổ của hợp chất PAL3
3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT PAL4 (7 mg)
Hợp chất PAL4 thu được sau quá trình sắc kí cột nhiều lần phân đoạn EA4.7.3 của bảng 2.5 có những đặc điểm quan trọng sau:
• Hợp chất ở dạng vô định hình, không màu
Kết quả của sắc ký lớp mỏng trong hệ môi hexane : acetone : acetic acid với tỷ lệ 6: 4: 0,2 cho thấy sự xuất hiện của một vết tròn màu vàng nhạt khi được hiện hình bằng thuốc thử H2SO4 20% và đun nóng bảng mỏng.
• Phổ 1 H-NMR (MeOD, phụ lục 3), δH ppm: 4,55 (1H, d, H-1), 1,27 (3H, d, -
CH3), 3,35 (3H, s, -OCH3), và độ chuyển dịch của các proton khác được trình bày trong bảng 3.2
• Phổ 13 C-NMR (MeOD, phụ lục 4), δC ppm: 102,8 (C1), 55,1 (-OCH 3 ), 17,9 (-
CH 3 ) và độ chuyển dịch của các cacbon khác được trình bày trong bảng 3.2
Phổ 1 H-NMR của PAL4 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của proton anomer ở δH
4,55 (1H, d, J=1,5 Hz) và tín hiệu cộng hưởng của các proton gắn trên carbon mang oxygen >CH-O trong vùng δ H 3,78-3,34 Ngoài ra phổ 1 H-NMR còn xuất hiện tín hiệu
Hợp chất PAL3 ( Acetone-d 6) Quercetin (Acetone-d 6 ) [5] δH ppm (J, Hz) δC ppm δC ppm
Khóa luận tốt nghiệp đại học cộng hưởng của nhóm –CH 3 ở δH 1,27 (3H, d, J =6,5 Hz), tín hiệu cộng hưởng của nhóm
Phổ 13C-NMR của PAL4 thể hiện tín hiệu cộng hưởng của sáu carbon trong vùng δ C 69,61-102,79
Here is the rewritten paragraph:Phổ HSQC của PAL4 cho thấy tín hiệu cộng hưởng của proton anomer tại δH 4,55 tương quan với carbon tại δC 102,79, qua đó giúp xác định vị trí carbon anomer Ngoài ra, tín hiệu proton cộng hưởng tại δH 1,27 cũng được quan sát thấy tương quan với carbon tại δC 17,98, tương ứng với nhóm -CH3.
Phổ HMBC cho thấy sự tương quan giữa proton cộng hưởng ở δH 3,35 (-OCH3) với carbon anomer δC 102,79 (C1) Như vậy nhóm –OCH3 gắn vào C1
Dữ liệu phổ NMR cho thấy cấu trúc của PAL4 có thể là một đường rhamnose gắn nhóm –OCH3 So sánh với dữ liệu phổ của 1-O-methyl-α-L-rhamnopyranoside cho thấy sự tương đồng rõ rệt, do đó cấu trúc hợp chất PAL4 được đề xuất là 1-O-methyl-α-L-rhamnopyranoside.
1-O-methyl-α-L-rhamnopyranside Hình 3.1 Một số tương quan HMBC của PAL4
Bảng 3.2 Dữ liệu phổ của hợp chất PAL4
Hợp chất PAL4 ( MeOD) 1-O-methyl-α-L-rhamnopyranoside
Khóa luận tốt nghiệp đại học