Hình dạng tế bào nấm men rấtđa dạng nên khi quan sát cần chú ý đến các đặc điểm hình dạng và kích thước tế bào.Nguyên tắc: sử dụng tiêu bản giọt để quan sát hình thái tế bào nấm men.
NỘI DUNG THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN Chuẩn bị mơi trường, dụng cụ, dung dịch pha lỗng hóa chất cần thiết Thực hành: lên men rượu nho Phân lập nấm men từ mẫu lên men rượu Quan sát hình thái nấm men phân lập Khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme amylase/cellulase vi khuẩn/xạ khuẩn *** Sinh viên thực hành viết báo cáo thực hành theo nhóm Nhó m Thành phần mơi trường (1 lit) Hansen Glucose 50 g/l MgSO4 g/l Pepton 10 g/l KH2PO4 g/l Agar 15 g/l Môi trường khảo sát enzyme protease (phân giải peotêin) + Casein 10g/L + Peptone: g/L + Yeast extract: 1,5g/L + Casein: 10 g/l + HM Peptone: 1,5 g/L + Agar 15g/L Nước cất vô trùng Số lượng Ghi 500 mL lít - 90 ống (9 mL/ống) - Cịn lại cho vào chai thủy tinh I LÊN MEN RƯỢU KHÔNG QUA CHƯNG CẤT Giới thiệu Lên men rượu trình lên men cần có tham gia nấm men số vi sinh vật khác Các phản ứng trình lên men rượu phức tạp, trải qua 10 phương trình phản ứng khác với xúc tác nhiều hệ enzyme Quá trình lên men rượu, đường biến đổi thành rượu etylic, CO2 giải phóng lượng Phương trình tởng qt trình viết sau: C6H12O6 2C2H5OH + CO2 + 113,4 kJ Tác nhân trình lên men rượu loài nấm men Sacharomyces như: S cerevisiae (men rượu), S ellipsoids (nấm men rượu vang), S carlsbergenis (nấm men để sản xuất bia) Nấm men vi sinh vật sống kỵ khí khơng bắt buộc, có khả phân giải kỵ khí loại đường khác Trong trình lên men, giai đoạn đầu chúng cần oxy để sinh trưởng, đạt sinh khối định môi trường hết oxy phân tử, chúng tiến hành lên men, tức chuyển sang hơ hấp kỵ khí Sản xuất rượu không qua chưng cất thường qua giai đoạn: - Chế biến loại nguyên liệu thành dịch đường (đường hóa): nhờ tác dụng enzyme amylase, thường sử dụng nấm mốc Aspergillus để thực Nguyên liệu chứa tinh bột cần nấu chín để chuyển tinh bột sang dạng dễ hịa tan, có hệ enzyme amylase phân giải tinh bột dễ dàng - Lên men đường thành rượu (rượu hóa): sử dụng nấm men Sacharomyces Nội dung thực hành Lên men rượu vang Rượu vang việc lên men ethylic từ dịch quả nho Rượu vang sản xuất từ nho theo phương pháp tự nhiên nhờ hệ vi sinh vật vỏ thịt quả nho chín, chủ yếu S ellipsoids Ngày khái niệm rượu vang hiểu rộng loại rượu lên men không qua chưng cất từ dịch loại trái nói chung táo, lê, thơm, chuối, mơ,…có hương vị thơm ngon trái tự nhiên, nồng độ rượu nhẹ từ 15 – 20% thức uống giải khát giàu vitamin Các loại vi sinh vật thường làm nhiễm bẩn phá hoại rượu vang vi khuẩn lactic Khi có mặt vi khuẩn lactic dịch men, phần lớn axit malic dịch trái bị chuyển hóa thành axit lactic Các loại nấm men dại Candida sp., Pichia tạo váng bề mặt rượu vang Do muốn thu hiệu suất rượu cao thì phải tạo cho mơi trường thật yếm khí, nấm men lấy lượng để tạo sinh khối đường oxi hóa axit pyruvic (là sản phẩm trung gian trước tạo thành rượu) đến CO2 H2O 2.2.1 Nguyên liệu - Nho chín - Đường kính 2.2.2 Cách tiến hành - Lọ nhựa - Rửa nho vịi nước, để nước Có thể cắt đôi, bỏ hạt để trình lên men nhanh - Cân đường kính với tỉ lệ 20% so với khối lượng nho - Cho lớp nho, lớp đường vào lọ nhựa hết nguyên liệu - Lên men hiếu khí ngày, lên men yếm khí ngày nhiệt độ phòng - Đánh giá cảm quan II NẤM MEN (YEAST) Nấm men loài nấm đơn bào, số loài thường sử dụng để lên men bánh mì hay sản xuất loại đồ uống chứa cồn Phần lớn loài nấm men thuộc ngành Nấm túi (Ascomycota), có số lồi thuộc ngành Nấm đảm (Basidiomycota) Một số lồi nấm men, chẳng hạn Candida albicans, gây nhiễm độc nấm người (Candidiasis) Trên 1.000 loài nấm men miêu tả Loài nấm men người sử dụng phổ biến Saccharomyces cerevisiae, dùng để sản xuất rượu vang, bánh mì bia từ hàng nghìn năm trước Phân lập - Nguồn phân lập: sử dụng sản phẩm rượu nho lên men nội dung - Môi trường phân lập: môi trường thạch Hansen - Cách tiến hành: ml dịch lên men cho vào ống nghiệm chứa ml dung dịch pha loãng khử trùng, tiếp tục pha lỗng đến nồng độ thích hợp, lấy 100 µl từ ống pha loãng cấy trãi vào đĩa petri chứa mơi trường phân lập III QUAN SÁT HÌNH THÁI NẤM MEN Nấm men có cấu tạo đơn bào, có kích thước tương đối lớn Hình dạng tế bào nấm men đa dạng nên quan sát cần ý đến đặc điểm hình dạng kích thước tế bào Nguyên tắc: sử dụng tiêu bản giọt để quan sát hình thái tế bào nấm men Phương pháp tiến hành: Chuẩn bị phiến kính, cho giọt nước cất khử trùng lên phiến kính, trải sinh khối khuẩn lạc nấm men, đậy lame Tiến hành quan sát kính hiển vi vật kính 40X Nấm men Saccharomyces cerevisiae Khuẩn lạc trịn, nhơ cao, rìa nguyên, Tế bào hình oval, kích thước lớn 2,5 – x 5,5 – 6,5µm, sinh sản cách tạo chồi bề mặt trơn láng, đường kính 2,5 – 3,5 mm IV THỰC HÀNH KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH ENZYME PROTEASE CỦA VI KHUẨN Xác định khả phân giải môi trường chất cảm ứng enzyme amylase nấm men Chuẩn bị đĩa petri vô trùng Chuẩn bị môi trường xác định hoạt tính enzyme Thuốc thử amido black 0,1% Chuẩn bị: Môi trường chứa chất casein 0,1% đĩa thạch gồm Peptone g, NaCl g, yeast extract 1,5 g, HM peptone 1,5 g, agar 15 g, casein g, nước cất vừa đủ lít, hấp khử trùng tiến hành đở đĩa, đĩa có đường kính đở thể tích (25 ml/1 đĩa ϕ9) để đảm bảo độ dày lớp thạch casein tất cả đĩa thí nghiệm Chuẩn bị thuốc nhuộm amido black 0,1%: Pha dung dịch acetic acid 10% làm dung môi cho thuốc nhuộm dung dịch rửa sau nhuộm Bổ sung 0,1 g amido black vào 100 ml dung dịch actic acid 10%, khuấy cho tan hết, lọc qua giấy lọc bảo quản tránh ánh sáng Tiến hành thử hoạt tính enzyme: Các chủng Bacillus cung cấp nuôi cấy riêng rẽ môi trường NB cấy ria đĩa thạch chứa môi trường NA Sau đó, dùng que cấy lấy khuẩn lạc riêng rẽ đưa vào đĩa thạch - casein, đĩa cấy điểm Ủ 48 37ºC Sau ủ tiến hành nhuộm đĩa thạch amido black 0,1% 30 phút, rửa nhuộm quan sát vòng phân giải casein Các chủng có vịng phân giải casein lớn chủng có khả sinh protease cao Kích thước vịng phân giải casein tính theo cơng thức: A=D–d Trong đó: A: kích thước vịng phân giải (mm) D: đường kính vịng phân giải (mm) d: đường kính khuẩn lạc (mm)Tiến hành đổ đĩa môi trường cảm ứng enzyme: Đun tan thạch môi trường chất casein tiến hành đổ đĩa Sau đĩa thạch đông lại thì ta tiến hành gói lại túi nylon vơ trùng bảo quản nhiệt độ phịng 48 Sau 24 48 lấy ra, quan sát loại bỏ đĩa nhiễm vi sinh vật, hỏng Cấy mẫu Chuẩn bị tủ cấy vô trùng, dụng cụ cấy, đĩa môi trường, mẫu giống vi khuẩn Ta tiến hành cấy tủ cấy vô trùng lửa đèn cồn ngâm que cấy móc ống nghiệm chứa cồn 96o đốt que cấy đến đỏ lửa đèn cồn Sau tách lấy giống chạm cấy vào đĩa mơi trường chất Sau lần cấy nhớ đốt kĩ que cấy, tránh nhiễm đĩa ống giống Sau cấy, kí hiệu mẫu gói lại với túi nilon bảo quản nhiệt độ phòng 2-3 ngày sau lấy nhộm amido black 0,1% quan sát Quan sát, đo đường kính ghi nhận Sau ủ tiến hành nhuộm đĩa thạch amido black 0,1% 15- 30 phút, rửa nhuộm quan sát vịng phân giải casein Các chủng có vịng phân giải casein lớn chủng có khả sinh protease cao Hình : Đường kính vịng phân giải chất casein sau 48 nuôi cấy V THỰC HÀNH KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG ENZYME CELLULASE CỦA XẠ KHUẨN/VI KHUẨN Tiến hành đổ đĩa môi trường cảm ứng enzyme: Đun tan thạch môi trường chất CMC tiến hành đổ đĩa Sau đĩa thạch đơng lại thì ta tiến hành gói lại túi nylon vô trùng bảo quản nhiệt độ phòng 48 Sau 24 48 lấy ra, quan sát loại bỏ đĩa nhiễm vi sinh vật, hỏng Cấy mẫu Chuẩn bị tủ cấy vô trùng,dụng cụ cấy, đĩa môi trường, mẫu giống phân lập trước Ta tiến hành cấy tủ cấy vô trùng lửa đèn cồn ngâm que cấy móc ống nghiệm chứa cồn 96o đốt que cấy đến đỏ lửa đèn cồn Sau tách lấy giống chạm cấy vào đĩa môi trường chất Lặp lại lần mẫu giống Sau lần cấy nhớ đốt kĩ que cấy, tránh nhiễm đĩa ống giống Sau cấy, kí hiệu mẫu gói lại với túi nilon bảo quản nhiệt độ phòng 3-5 ngày sau lấy nhộm Lugol/Congo red quan sát Quan sát, đo đường kính ghi nhận Pha dung dịch thuốc nhộm Lugol/Congo red sau đở tráng lớp mỏng thuốc nhộm lugol lên bề mặt đĩa cấy để yên khoảng 15 phút Cuối lấy quan sát, đo đường kính vịng phân giải ghi nhận kết quả DB Hình : Đường kính vịng phân giải chất CMC đo sau 48 nuôi cấy