Thuc hanh mon hoc cnlm khóa 21

Hình dạng tế bào nấm men rấtđa dạng nên khi quan sát cần chú ý đến các đặc điểm hình dạng và kích thước tế bào.Nguyên tắc: sử dụng tiêu bản giọt để quan sát hình thái tế bào nấm men.

NỘI DUNG THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN 2

1 Chuẩn bị môi trường, dụng cụ, dung dịch pha loãng và các hóa chất cần thiết

2 Thực hành: lên men rượu nho

3 Phân lập nấm men từ mẫu lên men rượu

4 Quan sát hình thái nấm men phân lập được

5 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase/cellulase của vi khuẩn/xạ khuẩn

*** Sinh viên thực hành và viết báo cáo thực hành theo nhóm

Nhó

m

Thành phần môi trường (1 lit)

Số lượng

Ghi chú

1

Hansen

Glucose 50 g/l MgSO4 3 g/l Pepton 10 g/l

KH2PO4 3 g/l Agar 15 g/l

500 mL

2

Môi trường khảo sát enzyme protease (phân giải peotêin)

+ Casein 10g/L + Peptone: 5 g/L + Yeast extract: 1,5g/L + Casein: 10 g/l

+ HM Peptone: 1,5 g/L + Agar 15g/L

3 Nước cất vô trùng 1 lít

- 90 ống (9 mL/ống)

- Còn lại cho vào chai thủy tinh

I LÊN MEN RƯỢU KHÔNG QUA CHƯNG CẤT

1 Giới thiệu

Lên men rượu là quá trình lên men cần có sự tham gia của nấm men và một số vi sinh vật khác Các phản ứng của quá trình lên men rượu phức tạp, nó trải qua 10 phương trình phản ứng khác nhau với sự xúc tác của nhiều hệ enzyme Quá trình lên men rượu, đường được biến đổi thành rượu etylic, CO2 và giải phóng năng lượng Phương trình tổng quát của quá trình có thể

C6H12O6  2C2H5OH + 2 CO2 + 113,4 kJ

Tác nhân chính của quá trình lên men rượu là các loài nấm men Sacharomyces như: S cerevisiae (men rượu), S ellipsoids (nấm men của rượu vang), S carlsbergenis (nấm men để

sản xuất bia) Nấm men là vi sinh vật sống kỵ khí không bắt buộc, có khả năng phân giải kỵ khí các loại đường khác nhau Trong quá trình lên men, ở giai đoạn đầu chúng cần oxy để sinh trưởng, khi đạt sinh khối nhất định và môi trường hết oxy phân tử, chúng mới tiến hành lên men, tức chuyển sang hô hấp kỵ khí Sản xuất rượu không qua chưng cất thường qua 2 giai đoạn:

- Chế biến các loại nguyên liệu thành dịch đường (đường hóa): nhờ tác dụng của enzyme

amylase, thường sử dụng nấm mốc Aspergillus để thực hiện Nguyên liệu chứa tinh bột cần

được nấu chín để chuyển tinh bột sang dạng dễ hòa tan, có như vậy hệ enzyme amylase mới có thể phân giải tinh bột được dễ dàng

- Lên men đường thành rượu (rượu hóa): sử dụng nấm men Sacharomyces.

2 Nội dung thực hành

Lên men rượu vang

Rượu vang bắt đầu từ việc lên men ethylic từ dịch quả nho Rượu vang sản xuất từ nho

theo phương pháp tự nhiên nhờ hệ vi sinh vật trên vỏ và thịt quả nho chín, chủ yếu là S ellipsoids Ngày nay khái niệm rượu vang được hiểu rộng hơn là loại rượu lên men không qua

chưng cất từ dịch các loại trái cây nói chung như táo, lê, thơm, chuối, mơ,…có hương vị thơm ngon của trái cây tự nhiên, nồng độ rượu nhẹ từ 15 – 20% là thức uống giải khát giàu vitamin Các loại vi sinh vật thường làm nhiễm bẩn và phá hoại rượu vang là vi khuẩn lactic Khi

có mặt vi khuẩn lactic trong dịch men, phần lớn axit malic trong dịch trái cây sẽ bị chuyển hóa

thành axit lactic Các loại nấm men dại như Candida sp., Pichia có thể tạo váng trên bề mặt

rượu vang Do đó muốn thu được hiệu suất rượu cao thì phải tạo cho môi trường thật yếm khí, khi đó nấm men lấy năng lượng để tạo sinh khối bằng con đường oxi hóa axit pyruvic (là sản phẩm trung gian trước khi tạo thành rượu) đến CO2 và H2O

2.2.1 Nguyên liệu

- Nho chín - Đường kính - Lọ nhựa sạch

2.2.2 Cách tiến hành

- Rửa sạch nho dưới vòi nước, để ráo nước Có thể cắt đôi, bỏ hạt để quá trình lên men được nhanh hơn

- Cân đường kính với tỉ lệ 20% so với khối lượng nho - Cho lần lượt một lớp nho, 1 lớp đường vào lọ nhựa cho đến khi hết nguyên liệu - Lên men hiếu khí 2 ngày, lên men yếm khí 4 ngày ở nhiệt độ phòng

- Đánh giá cảm quan

II NẤM MEN (YEAST)

Nấm men là các loài nấm đơn bào, một số ít các loài thường được sử dụng để lên men bánh mì hay trong sản xuất các loại đồ uống chứa cồn Phần lớn các loài nấm men thuộc về ngành Nấm túi (Ascomycota), mặc dù có một số loài thuộc về ngành Nấm đảm (Basidiomycota) Một

số ít các loài nấm men, chẳng hạn như Candida albicans, có thể gây ra nhiễm độc nấm ở người

(Candidiasis) Trên 1.000 loài nấm men đã được miêu tả Loài nấm men được con người sử

dụng phổ biến nhất là Saccharomyces cerevisiae, được dùng để sản xuất rượu vang, bánh

mì và bia từ hàng nghìn năm trước

1 Phân lập

- Nguồn phân lập: sử dụng sản phẩm rượu nho lên men ở nội dung 1

- Môi trường phân lập: môi trường thạch Hansen

- Cách tiến hành: 1 ml dịch lên men cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng đã khử trùng, tiếp tục pha loãng đến nồng độ thích hợp, lấy 100 µl từ các ống pha loãng cấy trãi vào đĩa petri chứa môi trường phân lập

III QUAN SÁT HÌNH THÁI NẤM MEN

Nấm men có cấu tạo đơn bào, có kích thước tương đối lớn Hình dạng tế bào nấm men rất

đa dạng nên khi quan sát cần chú ý đến các đặc điểm hình dạng và kích thước tế bào

Nguyên tắc: sử dụng tiêu bản giọt để quan sát hình thái tế bào nấm men

Phương pháp tiến hành: Chuẩn bị phiến kính, cho 1 giọt nước cất đã khử trùng lên phiến kính, trải đều một ít sinh khối khuẩn lạc nấm men, đậy lame Tiến hành quan sát dưới kính hiển

vi ở vật kính 40X

Nấm men Saccharomyces cerevisiae

Khuẩn lạc tròn, nhô cao, rìa nguyên,

bề mặt trơn láng, đường kính 2,5 – 3,5 mm

Tế bào hình oval, kích thước lớn 2,5 – 5 x 5,5 – 6,5µm, sinh sản bằng cách tạo chồi.

IV THỰC HÀNH KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH ENZYME PROTEASE CỦA VI KHUẨN

Xác định khả năng phân giải môi trường cơ chất cảm ứng enzyme amylase của nấm men

 Chuẩn bị đĩa petri sạch và vô trùng

 Chuẩn bị môi trường xác định hoạt tính enzyme

 Thuốc thử amido black 0,1%

Chuẩn bị: Môi trường chứa cơ chất casein 0,1% trên đĩa thạch gồm Peptone 5 g, NaCl 5 g, yeast extract 1,5 g, HM peptone 1,5 g, agar 15 g, casein 1 g, nước cất vừa đủ 1 lít, được hấp khử trùng và tiến hành đổ đĩa, các đĩa có đường kính bằng nhau được đổ cùng một thể tích (25 ml/1 đĩa ϕ9) để đảm bảo độ dày của lớp thạch casein là như nhau ở tất cả các đĩa thí nghiệm

Chuẩn bị thuốc nhuộm amido black 0,1%: Pha dung dịch acetic acid 10% làm dung môi cho thuốc nhuộm và dung dịch rửa sau nhuộm Bổ sung 0,1 g amido black vào 100 ml dung dịch actic acid 10%, khuấy đều cho tan hết, lọc qua giấy lọc và bảo quản tránh ánh sáng

Tiến hành thử hoạt tính của enzyme: Các chủng Bacillus được cung cấp sẽ được nuôi cấy riêng rẽ trong môi trường NB và cấy ria trên đĩa thạch chứa môi trường NA Sau đó, dùng que cấy lấy các khuẩn lạc riêng rẽ đưa vào đĩa thạch - casein, mỗi đĩa cấy 1 điểm Ủ trong 48 giờ ở 37ºC Sau khi ủ tiến hành nhuộm các đĩa thạch bằng amido black 0,1% trong

30 phút, rửa nhuộm và quan sát vòng phân giải casein Các chủng có vòng phân giải casein lớn là chủng có khả năng sinh protease cao

Kích thước vòng phân giải casein được tính theo công thức:

A = D – d

Trong đó: A: kích thước vòng phân giải (mm)

D: đường kính vòng phân giải (mm)

d: đường kính khuẩn lạc (mm)Tiến hành đổ đĩa môi trường cảm ứng enzyme:

Đun tan thạch môi trường cơ chất casein và tiến hành đổ đĩa Sau khi đĩa thạch đông lại thì ta tiến hành gói lại trong túi nylon vô trùng và bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ Sau

24 giờ và 48 giờ lấy ra, quan sát và loại bỏ đĩa nhiễm vi sinh vật, hỏng

 Cấy mẫu

Chuẩn bị tủ cấy vô trùng, dụng cụ cấy, đĩa môi trường, mẫu giống vi khuẩn Ta tiến hành cấy trong tủ cấy vô trùng và trên ngọn lửa đèn cồn ngâm que cấy móc trong ống nghiệm chứa cồn 96o và đốt que cấy đến đỏ trên ngọn lửa đèn cồn Sau đó tách lấy một ít giống và chạm cấy vào giữa đĩa môi trường cơ chất Sau mỗi lần cấy nhớ đốt kĩ que cấy, tránh nhiễm đĩa và ống giống Sau khi cấy, kí hiệu mẫu và gói lại với túi nilon và bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 2-3 ngày sau đó lấy ra nhộm amido black 0,1% và quan sát

 Quan sát, đo đường kính và ghi nhận

Sau khi ủ tiến hành nhuộm các đĩa thạch bằng amido black 0,1% trong 15- 30 phút, rửa nhuộm và quan sát vòng phân giải casein Các chủng có vòng phân giải casein lớn là chủng có khả năng sinh protease cao

Hình : Đường kính vòng phân giải đối với các cơ chất casein sau 48 giờ nuôi cấy

V THỰC HÀNH KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG ENZYME

CELLULASE CỦA XẠ KHUẨN/VI KHUẨN

 Tiến hành đổ đĩa môi trường cảm ứng enzyme:

Đun tan thạch môi trường cơ chất CMC và tiến hành đổ đĩa Sau khi đĩa thạch đông lại thì

ta tiến hành gói lại trong túi nylon vô trùng và bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ Sau 24 giờ và 48 giờ lấy ra, quan sát và loại bỏ đĩa nhiễm vi sinh vật, hỏng

 Cấy mẫu

Chuẩn bị tủ cấy vô trùng,dụng cụ cấy, đĩa môi trường, mẫu giống đã phân lập trước đó Ta tiến hành cấy trong tủ cấy vô trùng và trên ngọn lửa đèn cồn ngâm que cấy móc trong ống nghiệm chứa cồn 96o và đốt que cấy đến đỏ trên ngọn lửa đèn cồn Sau đó tách lấy một ít giống

và chạm cấy vào giữa đĩa môi trường cơ chất Lặp lại 3 lần mỗi mẫu giống Sau mỗi lần cấy nhớ đốt kĩ que cấy, tránh nhiễm đĩa và ống giống Sau khi cấy, kí hiệu mẫu và gói lại với túi nilon và bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 3-5 ngày sau đó lấy ra nhộm Lugol/Congo red và quan sát

 Quan sát, đo đường kính và ghi nhận

Pha dung dịch thuốc nhộm Lugol/Congo red sau đó đổ tráng một lớp mỏng đều thuốc nhộm lugol lên trên bề mặt đĩa cấy và để yên khoảng 15 phút Cuối cùng lấy ra quan sát, đo đường kính vòng phân giải và ghi nhận kết quả

Hình : Đường kính vòng phân giải đối với các cơ chất CMC đo được sau 48 giờ nuôi cấy

DB