68 Trang 4 BẢNG VIẾT TẮTADN Deoxyribonucleic axit Amp AmpicilliinAOX Alcohol oxidase ARN Axit ribonucleic cDNA Complementary DNA DEPC Diethylpyrocarbonate DHAS Dihydroxyacetone synthas
bộ giáo dục đào tạo trờng đại học bách khoa hµ néi - luận văn thạc sĩ khoa học Tách dòng biểu gen mà hóa Tyrosinase từ aspergillus oryzae tp01 ngành : công nghệ sinh học mà số:23.04.3898 Nguyễn thị hoa Ngời hớng dẫn khoa học: GS.TS đặng thị thu VIệN CNSH&CNTP- đh BáCH KHOA HN Hà Nội 11/ 2008 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17057205017181000000 MỤC LỤC MỤC LỤC BẢNG VIẾT TẮT .3 DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG MỞ ĐẦU .6 Phần I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ENZYM TYROSINASE (EC 1.14.18.1) 1.1.1 NGUỒN THU TYROSINASE .7 1.1.2.1 Cấu tạo không gian khối lượng phân tử tyrosinase .9 1.1.2.2 Tính chất Tyrosinase .12 1.1.3 CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA TYROSINASE 15 1.1.4 VAI TRÒ VÀ ỨNG DỤNG CỦA TYROSINASE 18 1.1.4.1 Vai trò tyrosinase 18 1.1.4.2 Ứng dụng tyrosinase 19 1.1.4.2.1 Trong ngành công nghiệp thực phẩm 19 1.1.4.2.2 Trong y học dược phẩm 20 1.1.4.2.3 Trong lĩnh vực hóa mỹ phẩm 20 1.1.4.2.4 Trong lĩnh vực xử lý môi trường 21 1.1.5 TYROSINASE TÁI TỔ HỢP .21 1.2 VECTOR VÀ TẾ BÀO CHỦ 25 1.2.1 Khái niệm vector 25 1.2.2 Vector tách dòng pCR2.1 .25 1.2.3 Hệ vector biểu Pichia pastoris 27 1.2.4 Tế bào chủ 30 1.2.4.1 Hệ thống tế bào chủ biểu gen 30 1.2.4.2 Tế bào chủ Pichia pastoris 32 Phần II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 35 2.1 Vật liệu .35 2.1.1 Chủng vi sinh vật plasmid 35 2.1.2 Hóa chất 35 2.1.3 Trang thiết bị .35 2.2 Phương pháp .36 2.2.1 Phương pháp tách chiết ARN tổng số 36 2.2.2 Phương pháp định lượng AND/ARN quang phổ kế 36 2.2.3 Phương pháp phiên mã ngược tạo cADN 37 2.2.4 Phương pháp khuếch đại gen kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) 38 2.2.5 Phương pháp điện di gel agarose 39 2.2.6 Phương pháp biến nạp 40 2.2.7 Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ vi khuẩn E.coli .42 2.2.8 Phản ứng cắt ADN enzym giới hạn (Restriction enzym – RE) 43 2.2.9 Phương pháp giải trình tự gen máy giải trình tự gen tự động ABI 3100 .44 2.2.10 Phương pháp biến nạp vào Pichia pastoris - X33 45 Phần III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 3.1 Tách ARN tổng số phương pháp Trizol .47 3.2 Tổng hợp cDNA khuếch đại gen phản ứng Nested PCR 47 3.3 Kết tách dịng gen mã hố tyrosinase 49 3.3.1 Kết gắn vào vector pCR 2.1 biến nạp 49 3.3.2 Tách ADN plasmid .50 3.3.3 Kiểm tra AND plasmid mang gen enzym giới hạn 51 3.3.4 Kết giải trình tự gen máy giải trình tự gen tự động ABI 3100 52 3.4 Biểu gen mã hoá tyrosinase Pichia pastoris X33 61 3.4.1 Thiết kế vector biểu tyrosinase Pichia pastoris X33 61 3.4.2 Biến nạp pPICZαA-TYR vào E.coli Top 10F’ 63 3.4.3 Biến nạp pPICZαA-TYR vào Pichia pastoris X33 65 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 BẢNG VIẾT TẮT ADN Deoxyribonucleic axit Amp Ampicilliin AOX Alcohol oxidase ARN Axit ribonucleic cDNA Complementary DNA DEPC Diethylpyrocarbonate DHAS Dihydroxyacetone synthase dNTP Deoxyribonucleic triphosphate DTT Dithiothreitol (C 4H10O2S2 W = 154,25) EDTA Ethylenediaminetetraacetic EtBr Ethidium bromide FLD Formaldehyde dehydrogenase FMLD Formate dehydrogenase kDa Kilo Datol LB Lauria- bertani medium MD Minimal dextrose medium OD Optical density PCR Polymerase chain reaction RE Restriction enzyme RT Reverse transcription SCED Sorbitol citrat natri EDTA DTT SDS Sodium dodecyl sulphate TE Tris - EDTA TYR Tyrosinase YPD Yeast pepton dextrose YPDSZ Yeast pepton dextrose sorbitol zeocin DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Tên hình Phản ứng chuyển hóa xúc tác tyrosinase Trang 10 1.2 1.3 Cấu trúc xoắn ốc α Tyrosinase Cấu tạo trung tâm hoạt động Tyrosinase 10 12 1.4 1.5 Phản ứng tạo Hemocyamin từ Deoxy-tyrosinase Tyrosinase xúc tác chuyển hoá hai dạng mono di-phenol 12 16 1.6 1.7 Cơ chế xúc tác tyrosinase với tham gia phân tử O2 Phản ứng oxy hóa pirocatechol tác dụng catecholase 18 18 1.8 Quá trình tổng hợp melanin tế bào động vật 19 1.9 Vị trí bảo thủ CuA CuB tyrosinase loài nấm khác 24 1.10 So sánh trình tự axit amin gen mel O A.oryzae với Neurospora crassa 25 1.11 1.12 Sơ đồ vector pCR 2.1 (Invitrogen) Sơ đồ vector pPICZα 27 30 2.1 2.2 Sơ đồ tổng hợp cDNA sợi đơn Chu trình nhiệt phản ứng PCR 39 40 2.3 Phản ứng gắn ADN vào vector tách dòng pCR 2.1 42 2.4 3.1 Gắn pPICZ αA mang gen vào Pichia pastoris ARN tổng số từ Aspergillus oryzae TP01 46 48 3.2 3.3 Sản phẩm PCR agarose 1% Khuẩn lạc E.coli Top10F mang vector tách dòng 50 51 3.4 3.5 Điện di đồ tách ADN plasmid tách dòng Kiểm tra ADN plasmid mang gen TYR EcoR I 52 53 3.6 Sơ đồ qui trình hồn chỉnh gen TYR-VN 59 3.7 3.8 3.9 Điện di đồ gel agarose 1% Sản phẩm PCR với mồi biểu gel agarose 1% Sơ đồ vector biểu gen TYR Pichia pastoris 61 63 64 3.10 Khuẩn lạc Ecoli Top10F’ mang vector biểu 65 3.11 3.12 Điện di đồ AND plasmid biểu vào E.coli Top 10F’ Sản phẩm cắt pPICZαA-TYR 65 66 3.13 Sản phẩm cắt mở vòng 67 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Tính chất tyrosinase số loại nấm 15 1.2 Số axit amin mã hoá tyrosinase lồi khác 23 1.3 Trình tự axit amin gen melO 24 1.4 Thành phần vị trí vector tách dịng pCR2.1 28 1.5 Thành phần vector pPICZα 30 1.6 Các loại tế bào chủ chủ yếu 31 3.1 Trình tự mồi TYR5 49 3.2 Trình tự mồi TYR3 49 3.3 Trình tự gen TYR5 54 3.4 Trình tự gen TYR3 55 3.5 Vị trí enzym cắt giới hạn TYR5 56 3.6 Vị trí enzym cắt giới hạn TYR3 57 3.7 Trình tự đoạn gen TYR mã hóa cho tyrosinse từ A.oryzae TP01 60 3.8 Các enzym cắt giới hạn không cắt gen TYR 62 3.9 Mồi biểu cho TYR 63 MỞ ĐẦU Tyrosinase enzym nhiều nhà khoa học giới quan tâm nghiên cứu từ nhiều năm qua Tyrosinase ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực ngành thực phẩm: tạo màu sắc, hương vị chất lượng cho chè đen, café, ca cao , ngành y dược: ngăn ngừa xâm nhiễm vi khuẩn, điều trị bệnh Parkinson, bệnh tạng, lang ben , sản xuất kem làm trắng da đặc biệt khả phát hiên hợp chất thuộc họ polyphenol xử lý môi trường Với mục tiêu tạo lượng lớn tyrosinase thời gian ngắn, để ứng dụng vào mục đích mong muốn, tiến hành tạo tyrosinase tái tổ hợp Để tạo tyrosinse tái tổ hợp việc chọn tế bào chủ để biểu vấn đề quan trọng Tyrosinas từ Aspergillus oryzae TP01 (chủng gốc) có hoạt tính tyrosinase nội bào, phải phá vỡ màng tế bào gây khó khăn thu nhận làm tăng giá thành chế phẩm enzym Do chọn tế bào chủ chủng nấm men Pichia pastoris với vector biểu pPICZαA có tín hiệu αfactor yếu tố tạo protein ngoại bào, thuận lợi cho trình thu nhận enzyme Nội dung nhằm giải vấn đề thực luận văn: - Tách chiết ARN tổng số từ Aspergillus oryzae TP01 - Tách dịng giải trình tự đoạn gen mã hóa cho tyrosinse từ Aspergillus oryzae TP01 - Tạo vector biểu cho tyrosinase nấm men Pichia pastoris - Biểu tyrosinase Pichia pastoris X33 Phần I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ENZYM TYROSINASE (EC 1.14.18.1) Tyrosinase enzym hai chức (bifunctional enzym), xúc tác phản ứng hydroxyl hóa monophenol tyrosine, p-cresol axít p-coumaric thành odiphenol (thể họat tính cresolase monophenolase) oxi hóa o-diphenol thành dopaquinone (thể hoạt tính catacholase diphenolase ) Hình 1.1 Phản ứng chuyển hóa xúc tác tyrosinase 1.1.1 NGUỒN THU TYROSINASE Tyrosinase tìm thấy phổ biến tự nhiên, tất quan, mô thực vật, động vật vi sinh vật: vi khuẩn nấm mốc Đây nguồn thu enzym vô phong phú ∗ Tyrosinase từ thực vật Tyrosinase có hầu hết giới thực vật, nguyên nhân hình thành vết thâm rau bị dập nát Tyrosinase có cà chua khoai tây, có nhiều đậu, rau pina, táo, hoa atiso, lê, dâu, khoai lang, chè, thuốc lá, vỏ nho, đặc biệt nấm Nấm tự nhiên có nhiều chủng loại, chứa nhiều tyrosinase, đặc biệt nấm mỡ Agaricus bispora với hoạt lực cao [12] Một số lồi thực vật có hoạt tính tyrosinase : • Nấm mỡ : Agaricus bispora • Nấm sị : Pleurotus spp • Nấm kim châm Flammulia velutipes : • Nấm thể : Amanita muscaria • Cây thuốc lá: Nicotiana tabacum ∗ Tyrosinase từ động vật Tyrosinase tất tế bào động vật có chức hình thành sắc tố melanin xúc tác chuyển hóa L-tyrosine thành L-Dopa từ L-Dopa chuyển thành dopaquinon cuối tạo melanin Sắc tố định màu lơng động vật màu tóc, màu mắt hay màu da người Tuy nhiên, nguồn thu khơng khả thi việc thu nhận khó khăn mà hiệu kinh tế lại không cao Các yếu tố rủi ro nguồn gốc, bệnh tật…vẫn mối quan tâm lớn nhà khoa học nhà sản xuất Nhưng có số nghiên cứu tách tinh chế tyrosinase động vật thân mềm chuột bạch, đặc biệt nghiên cứu tyrosinase từ chuột bạch, phục vụ cho y học chủ yếu lĩnh vực thần kinh học, điều trị bệnh Parkinson người [31] ∗ Tyrosinase từ vi sinh vật Vi sinh vật có khả sinh tổng hợp lượng lớn tyrosinase thời gian ngắn với điều kiện ni cấy đơn giản, rẻ tiền Do nguồn thu có triển vọng Các vi sinh vật nghiên cứu để tách thu tyrosinase gồm: vi khuẩn Rhizobium meliloti, Thermomicrobium roseum, Các loại xạ khuẩn Streptomyces glaucescens , Streptomyces lavendulae đặc biệt loại nấm mốc Aspergillus oryzae, Neurospora crassa, Tùy thuộc vào loài vi sinh vật (nấm mốc, vi khuẩn), điều kiện nuôi cấy, thành phần dinh dưỡng mơi trường, tyrosinase thu có hoạt lực tính chất tyrosinase khác 1.1.2 CẤU TẠO VÀ TÍNH CHẤT CỦA TYROSINASE 1.1.2.1 Cấu tạo khơng gian khối lượng phân tử tyrosinase Tyrosinase (còn gọi monophenol, o-diphenol oxygen oxidoreductase (EC.1.14.18.1)) protein kim loại (metal protein) đồng loại III Tyrosinase loài khác có khối lượng phân tử khác nhau: tyrosinase Aspergillus oryzae có khối lượng phân tử 180kDa, chia làm tiểu phần, tiểu phần có khối lượng 67kDa; tyrosinase Agaricus bisporus có khối lượng phân tử 110130kDa, chia làm tiểu phần, hai tiểu phần có khối lượng 43kDa, hai tiểu phần có khối lượng 13kDa; Illex agentius: 140kDa, Ruditapes philippinarum: 80kDa, người: 66kDa, Streptomyces:30kDa, táo: 66kDa, khoai tây: 67kDa, cà chua: 6671kDa [7] Cấu trúc bậc tyrosinase chưa hoàn thiện Tuy nhiên cấu trúc tinh thể xây dựng dựa protein ORF378 ( ORF: open reading frame, gen orf có 378 nucleotid, đặt ngược chiều với gen tyrosinase tyrC gen tổng hợp melanin từ Streptomyces castaneoglobisrus HUT6202) Tyrosinase có cấu trúc xoắn ốc α gồm α 2, α3,α6,α7, ngồi cịn có vào cấu trúc gấp nếp tờ giấy β [51] Màu xanh dương: ORF Màu đỏ: tyrosinase Hình 1.2 Cấu trúc xoắn ốc α tyrosinase Màu xanh: ion Cu