Táh dòng và biểu hiện gen mã hoá tyrosinase từ aspergillus oryzae tp01

68 Trang 4 BẢNG VIẾT TẮTADN Deoxyribonucleic axit Amp AmpicilliinAOX Alcohol oxidase ARN Axit ribonucleic cDNA Complementary DNA DEPC Diethylpyrocarbonate DHAS Dihydroxyacetone synthas

bộ giáo dục và đào tạo trờng đại học bách khoa hà nội

-

luận văn thạc sĩ khoa học

Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa

Tyrosinase từ aspergillus oryzae tp01

MỤC LỤC

MỤC LỤC 1

BẢNG VIẾT TẮT 3

DANH MỤC CÁC HÌNH 4

DANH MỤC CÁC BẢNG 5

MỞ ĐẦU 6

Phần I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7

1.1 ENZYM TYROSINASE (EC 1.14.18.1) 7

1.1.1 NGUỒN THU TYROSINASE 7

1.1.2.1 Cấu tạo không gian và khối lượng phân tử của tyrosinase 9

1.1.2.2 Tính chất của Tyrosinase 12

1.1.3 CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA TYROSINASE 15

1.1.4 VAI TRÒ VÀ ỨNG DỤNG CỦA TYROSINASE 18

1.1.4.1 Vai trò của tyrosinase 18

1.1.4.2 Ứng dụng của tyrosinase 19

1.1.4.2.1 Trong ngành công nghiệp thực phẩm 19

1.1.4.2.2 Trong y học và dược phẩm 20

1.1.4.2.3 Trong lĩnh vực hóa mỹ phẩm 20

1.1.4.2.4 Trong lĩnh vực xử lý môi trường 21

1.1.5 TYROSINASE TÁI TỔ HỢP 21

1.2 VECTOR VÀ TẾ BÀO CHỦ 25

1.2.1 Khái niệm vector 25

1.2.2 Vector tách dòng pCR2.1 25

1.2.3 Hệ vector biểu hiện trong Pichia pastoris 27

1.2.4 Tế bào chủ 30

1.2.4.1 Hệ thống các tế bào chủ trong biểu hiện gen 30

1.2.4.2 Tế bào chủ Pichia pastoris 32

Phần II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 35

2.1 Vật liệu 35

2.1.1 Chủng vi sinh vật và plasmid 35

2.1.2 Hóa chất 35

2.1.3 Trang thiết bị 35

2.2 Phương pháp 36

2.2.1 Phương pháp tách chiết ARN tổng số 36

2.2.2 Phương pháp định lượng AND/ARN bằng quang phổ kế 36

2.2.3 Phương pháp phiên mã ngược tạo cADN 37

2.2.4 Phương pháp khuếch đại gen bằng kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) 38

2.2.5 Phương pháp điện di trên gel agarose 39

2.2.6 Phương pháp biến nạp 40

2.2.7 Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ vi khuẩn E.coli 42

2.2.8 Phản ứng cắt ADN bằng enzym giới hạn (Restriction enzym – RE) 43

2.2.9 Phương pháp giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động ABI 3100 44

2.2.10 Phương pháp biến nạp vào Pichia pastoris - X33 45

Phần III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47

3.1 Tách ARN tổng số bằng phương pháp Trizol 47

3.2 Tổng hợp cDNA và khuếch đại gen bằng phản ứng Nested PCR 47

3.3 Kết quả tách dòng gen mã hoá tyrosinase 49

3.3.1 Kết quả gắn vào vector pCR 2.1 và biến nạp 49

3.3.2 Tách ADN plasmid 50

3.3.3 Kiểm tra AND plasmid mang gen bằng enzym giới hạn 51

3.3.4 Kết quả giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động ABI 3100 52

3.4 Biểu hiện gen mã hoá tyrosinase trong Pichia pastoris X33 61

3.4.1 Thiết kế vector biểu hiện tyrosinase ở Pichia pastoris X33 61

3.4.2 Biến nạp pPICZαA-TYR vào E.coli Top 10F’ 63

3.4.3 Biến nạp pPICZαA-TYR vào Pichia pastoris X33 65

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

EtBr Ethidium bromide FLD Formaldehyde dehydrogenase FMLD Formate dehydrogenase kDa Kilo Datol

LB Lauria- bertani medium

MD Minimal dextrose medium

OD Optical density PCR Polymerase chain reaction

RE Restriction enzyme

RT Reverse transcription SCED Sorbitol citrat natri EDTA DTT SDS Sodium dodecyl sulphate

TE Tris - EDTATYR Tyrosinase YPD Yeast pepton dextrose YPDSZ Yeast pepton dextrose sorbitol zeocin

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.1 Phản ứng chuyển hóa dưới sự xúc tác của tyrosinase 10

1.3 Cấu tạo trung tâm hoạt động của Tyrosinase 12 1.4 Phản ứng tạo Hemocyamin từ Deoxy-tyrosinase 12 1.5 Tyrosinase xúc tác chuyển hoá cả hai dạng mono và di-phenol 16 1.6 Cơ chế xúc tác của tyrosinase với sự tham gia của phân tử O2 18 1.7 Phản ứng oxy hóa pirocatechol dưới tác dụng của catecholase 18 1.8 Quá trình tổng hợp melanin trong các tế bào động vật 19 1.9 Vị trí bảo thủ CuA và CuB của tyrosinase ở các loài nấm khác

2.3 Phản ứng gắn ADN vào vector tách dòng pCR 2.1 42 2.4 Gắn pPICZ αA mang gen vào Pichia pastoris 46

3.3 Khuẩn lạc E.coli Top10F mang vector tách dòng 51

3.5 Kiểm tra ADN plasmid mang gen TYR bằng EcoR I 53

3.8 Sản phẩm PCR với mồi biểu hiện trên gel agarose 1% 63 3.9 Sơ đồ vector biểu hiện gen TYR trong Pichia pastoris 64 3.10 Khuẩn lạc Ecoli Top10F’ mang vector biểu hiện 65 3.11 Điện di đồ AND plasmid biểu hiện vào E.coli Top 10F’ 65

MỞ ĐẦU

Tyrosinase là enzym được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu từ nhiều năm qua Tyrosinase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như ngành thực phẩm: tạo màu sắc, hương vị và chất lượng cho chè đen, café, ca cao , ngành y dược: ngăn ngừa sự xâm nhiễm vi khuẩn, điều trị bệnh Parkinson, bệnh tạng, lang ben sản xuất kem làm trắng da và đặc biệt là , khả năng phát hiên các hợp chất thuộc họ polyphenol trong xử lý môi trường Với mục tiêu tạo ra lượng lớn tyrosinase trong thời gian ngắn để ứng dụng, vào các mục đích mong muốn, chúng tôi tiến hành tạo tyrosinase tái tổ hợp Để tạo được tyrosinse tái tổ hợp việc chọn tế bào chủ để biểu hiện là vấn đề rất quan trọng Tyrosinas từ Aspergillus oryzae TP01

(chủng gốc) có hoạt tính tyrosinase nội bào, phải phá vỡ màng tế bào gây khó khăn khi thu nhận và làm tăng giá thành chế phẩm enzym Do vậy chúng tôi chọ tế bào n chủ là chủng nấm men Pichia pastoris với vector biểu hiện pPICZαA có tín hiệu α - factor là yếu tố tạo protein ngoại bào, thuận lợi cho quá trình thu nhận enzyme

Nội dung chính nhằm giải quyết vấn đề này được thực hiện trong luận văn:

- Tách chiết ARN tổng số từ Aspergillus oryzae TP01.

- Tách dòng và giải trình tự đoạn gen mã hóa cho tyrosinse từ Aspergillus oryzae

TP01

- Tạo vector biểu hiện cho tyrosinase trong nấm men Pichia pastoris.

- Biểu hiện tyrosinase trong Pichia pastoris X33.

Phần I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ENZYM TYROSINASE (EC 1.14.18.1)

Tyrosinase là enzym hai chức năng (bifunctional enzym), xúc tác phản ứng hydroxyl hóa các monophenol như tyrosine, p-cresol và axít -coumaric thành -p o

diphenol (thể hiện họat tính cresolase hoặc monophenolase) và oxi hóa o-diphenol thành dopaquinone (thể hiện hoạt tính catacholase hoặc diphenolase )

Hình 1.1 Phản ứng chuyển hóa dưới sự xúc tác của tyrosinase

1.1.1 NGUỒN THU TYROSINASE

Tyrosinase được tìm thấy phổ biến trong tự nhiên, trong tất cả các cơ quan, các mô của thực vật, động vật cũng như trong vi sinh vật: vi khuẩn và nấm mốc Đây là những nguồn thu enzym vô cùng phong phú

∗Tyrosinase từ thực vật

Tyrosinase có hầu hết trong giới thực vật, là nguyên nhân hình thành các vết thâm trên rau quả khi bị dập nát Tyrosinase có rất ở cà ít chua và khoai tây, có nhiều trong đậu, rau pina, táo, hoa atiso, lê, dâu, khoai lang, lá chè, cây thuốc lá, vỏ nho, đặc biệt là nấm Nấm trong tự nhiên có rất nhiều chủng loại, chứa khá nhiều tyrosinase, đặc biệt là nấm mỡ Agaricus bispora với hoạt lực rất cao [ ] 12

Một số loài thực vật có hoạt tính yrosinase như :t

• Nấm mỡ : Agaricus bispora

• Nấm sò : Pleurotus spp

• Nấm kim châm :

Flammulia velutipes

• Nấm quả thể : Amanita muscaria

• Cây thuốc lá: Nicotiana tabacum

∗Tyrosinase từ động vật

Tyrosinase trong tất cả các tế bào động vật có chức năng hình thành sắc tố melanin bởi nó xúc tác chuyển hóa L-tyrosine thành L-Dopa và từ L-Dopa chuyển thành dopaquinon và cuối cùng tạo melanin Sắc tố này quyết định màu lông ở động vật và màu tóc, màu mắt hay màu da ở người

Tuy nhiên, nguồn thu này không khả thi do việc thu nhận rất khó khăn mà hiệu quả kinh tế lại không cao Các yếu tố rủi ro về nguồn gốc, bệnh tật…vẫn là mối quan tâm lớn của các nhà khoa học và nhà sản xuất Nhưng cũng có một số nghiên cứu tách và tinh chế tyrosinase ở các động vật thân mềm và chuột bạch, đặc biệt nghiên cứu tyrosinase từ chuột bạch, phục vụ cho y học chủ yếu trong lĩnh vực thần kinh học, điều trị bệnh Parkinson ở người [31]

∗Tyrosinase từ vi sinh vật

Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp một lượng lớn tyrosinase trong một thời gian ngắn với những điều kiện nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền Do đó đây là một nguồn thu có triển vọng

Các vi sinh vật đã được nghiên cứu để tách và thu tyrosinase gồm: vi khuẩn như Rhizobium meliloti Thermomicrobium roseum, , Các loại xạ khuẩn như

Streptomyces glaucescens Streptomyces lavendulae , và đặc biệt là các loại nấm mốc Aspergillus oryzae, Neurospora crassa,

T ùy thuộc vào loài vi sinh vật (nấm mốc, vi khuẩn), điều kiện nuôi cấy, thành phần dinh dưỡng của môi trường tyrosinase thu được , có hoạt lực và tính chất của tyrosinase khác nhau

1.1.2 CẤU TẠO VÀ TÍNH CHẤT CỦA TYROSINASE

1 1.2.1 Cấu tạo không gian và khối lượng phân tử của t yrosinase

Tyrosinase (còn gọi là monophenol, o-diphenol oxygen oxidoreductase

(EC.1.14.18.1)) là một protein kim loại (metal protein) đồng loại III Tyrosinase ở

các loài khác nhau có khối lượng phân tử khác nhau: tyrosinase của Aspergillus oryzae có khối lượng phân tử 180kDa, chia ra làm 4 tiểu phần, mỗi tiểu phần có

khối lượng 67kDa; tyrosinase của Agaricus bisporus có khối lượng phân tử là

110-130kDa, chia làm 4 tiểu phần, hai tiểu phần c khối lượng 43kDa, hai tiểu phần có ó

khối lượng là 13kDa; Illex agentius 140kDa, Ruditapes philippinarum: 80kDa, : người: 66kDa, Streptomyces 30kDa, táo 66kDa, khoai tây 67kDa, cà chua 66-: : : : 71kDa [7 ]

Cấu trúc bậc 3 của tyrosinase cho tới nay chưa được hoàn thiện Tuy nhiên cấu trúc tinh thể đã được xây dựng dựa trên protein ORF378 ( ORF: open reading

frame, gen orf có 378 nucleotid, được đặt ngược chiều với gen tyrosinase tyrC trong

gen tổng hợp melanin từ Streptomyces castaneoglobisrus HUT6202) Tyrosinase có

cấu trúc xoắn ốc α gồm α2, α3,α6,α7, ngoài ra còn có một vào cấu trúc gấp nếp tờ giấy β [51]

Hình 1.2 Cấu trúc xoắn ốc α của tyrosinase

Màu xanh dương: ORF

Màu đỏ: tyrosinase

Màu xanh: ion Cu

1.1.2.1 Cấu trúc trung tâm hoạt động của tyrosinase

Trung tâm hoạt động của tyrosinase chứa hai nguyên tử Cu: CuA và CuB

Cu A: Trung tâm CuA có chứa 2 hạt

nhân, 2 nguyên tử Cu được nối với nhau bởi

2 nguyên tử S từ 2 Cystein Mỗi nguyên tử

Cu còn nối với nguyên tử N từ His Chức

năng của trung tâm CuA là ở trong chuỗi vận

chuyển electron và có thể tìm thấy trung tâm

này trong cytochrome oxidase và nitrous

oxide reductase Nó có phổ EPR (Electron

paramagnetic resonance) rất điển hình và có

màu tía Ở dạng oxi hoá, mỗi nguyên tử Cu

đều ở trạng thái hoá trị hỗn hợp

Cu(1.5)Cu(1.5) [37]

Cu B: Trung tâm CuB rất giống với

nhóm ngoại Hem chứa Fe trong trung tâm

phản ứng của cytochrome xúc tác phản ứng

khử O2 thành nước Năng lượng giải phóng ra

được sử dụng để chuyển proton qua màng nơi

gắn cytochrome

Tâm CuB được đặt xuyên qua trục của His

trong tâm nhóm ngoại Hem a3 và liên kết với 3

histidin dưới dạng hình chóp tam giác với vị trí

liên kết mở của nhóm Cu hướng tới vị trí liên

kết mở của nguyên tử Fe trong nhóm Hem

Hình 1.3 Cấu tạo trung tâm hoạt động của tyrosinaseMỗi nguyên tử Cu được bao quanh bởi ba histidine, ứng với 3 trạng thái:[37]

• Deoxy-tyrosinase – Ered (Edeoxy) (với trung tâm hoạt động Cu1+ - Cu1+) với khoảng cách giữa 2 nguyên tử Cu là 4,4Ao Đây là vị trí mà khi tương tác với phân tử oxy sẽ tạo hắc tố hemocyanin

Cu1+

HisHis

His

Cu1+

HisHis His

+ O2

Cu 1+

His His

His

Cu 1+

His His His

Cu

His His His

Cu His His His

O O HemocyaninHình 1.4 Phản ứng tạo Hemocyamin từ Deoxy-tyrosinase

• Met-tyrosinase - Emet (với trung tâm hoạt động là Cu2+-OH--Cu2+), khoảng cách giữa Cu-Cu là 2,9Ao

Màu xanh dương: Histidin (His)

Màu xanh : nguyên tử Cu

Màu đỏ: bề mặt ngoài của tyrosinase

Cu 2+

His His

His

Cu 2+

His His His

O H

• Oxy-tyrosinase – Eoxy (với trung tâm hoạt động là Cu2+- O2--Cu2+), khoảng cách giữa Cu-Cu là 3,6Ao

Cu2+

HisHis

His

Cu2+

HisHis His

OO

Ngoài ra còn có dạng Half met tyrosinase (trung tâm hoạt động là Cu- 2+

-Cu1+) Trường hợp này ít xuất hiện trong cấu trúc của tyrosinase

 Tyrosinase từ nấm Amanita muscaria: pH tối ưu 6, không có hoạt tính khi

ở pH < 3, nhưng ở pH=8 enzym vẫn còn 75% hoạt tính Chất kìm hãm là

β-mercaptobenzothiazola (2 MBT) và tropolone Với axit benzoic 1mM

-ức chế 95% hoạt tính enzym ở pH 5 nhưng với pH 7 thì axít này không còn khả năng ức chế Cơ chất đặc hiệu: các monophenol như tyrosine, tyramine, axit 3-(4-hydroxyphenyl) propionic, các diphenol như L-DOPA, D DOPA, 3- -hydroxytyramine và axit 3-hydroxy cafeic Trong đó tyrosine có Km thấp nhất và Vmax cao nhất trong các cơ chất trên [29]

 Tyrosinase từ cây thuốc lá Nicotiana tabacum có pH tối ưu 7, nhiệt độ tối

ưu 40oC, Km = 6.8 mM với cơ chất là catechol ở pH = 6,5 trong đệm

H3PO4- NaOH 0,05M Sử dụng phương pháp đo quang phổ UV/VIS EPR

xác định được tyrosinase từ cây thuốc lá có cấu trúc chứa 3 nguyên tử đồng [10]

 Tyrosinase từ Agaricus bisporus có khối lượng phân tử M = 108kDa, pH

tối ưu 7, pI=5,1-5,2, nhiệt độ tối ưu 300C, Km = 0,44 mM (L DOPA),

-Vmax = 24,5 µmol/phút (L-DOPA) 40] [

∗Tyrosinase từ động vật:

 Tyrosinase từ động vật thân mềm Illex agentius có pH tối ưu 8,0, hoạt tính enzym còn trên 90% ở dải pH=6,5 – 11 sau 24h Hoạt tính ổn định ở 4-40oC, trên 450C enzym mất hoàn toàn hoạt tính, cơ chất đặc hiệu là L-DOPA, chất ức chế là phenylthiourea, tropolone, axit kojic và abutin [ ] 47

 Tyrosinase từ loài trai biển Ruditapes philippinarum có pH tối ưu 7, nhiệt

độ tối ưu 40oC, Km= 2,2 mM/l với cơ chất là L DOPA, bị ức chế mạnh bởi axit benzoic, sodium sulfite, axit citric, 1-phenyl 2 thiourea và - cystein, không bị ảnh hưởng bởi axít ascobic

- Tyrosinase từ người có nhiệt độ tối ưu là 50oC, hoạt độ enzym giảm mạnh khi nhiệt độ trên 55oC, pH tối ưu 7,5 hoạt lực enzym giảm 30% khi

pH dưới 6,5 Cơ chất đặc hiệu là L-DOPA, Km là 0,31mM, chất ức chế là arbutin và ethyl ascorbyl

∗Tyrosinase từ vi sinh vật :

 Tyrosinase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermomicrobium roseum có pI = 4,9,

pH tối ưu 9,5; enzym mất 50% hoạt tính khi pH<7 và pH>10,5, nhiệt độ tối ưu 70oC, bền ở nhiệt độ dưới 750C, trên 900C enzym mất hoạt tính hoàn toàn Cơ chất đặc hiệu là catechol, không có hoạt tính với cơ chất là axít vanillic Chất kìm hãm là mercaptoethanol với nồng độ 0,1 mM và β-sodium diethyldthiocarbamat 1mM, hoạt tính của enzym tăng khi có mặt

của ion Mg2+, K+ và Cu+ 1mM Giá trị Km với cơ chất L-DOPA là 0,18mM.[ ] 28

 Tyrosinase từ vi khuẩn Streptomyces antibioticus có pH tối ưu 7, enzym bền ở pH=6-7, sau 16 giờ ủ ở 300C hoạt độ còn lại trên 72%, nhiệt độ tối

ưu 350C, enzym bền ở nhiệt độ < 550C Cơ chất đặc hiệu là L-DOPA, chất kìm hãm là axit kojic, L-cystein, DL- dithiothreitiol và N,N-diethylithiocarbamate trihydrate Không bị kìm hãm bởi arbutin, sodiumazide, EDTA với nồng độ 1mM hoặc các ion Cu2+, Fe3+, Zn2+,

Mg2+, Mn2+ và Ca2+.[12,22]

 Tyrosinase từ Neurospora crassa có nhiệt độ tối ưu : 25oC, pI =6,0 -8,0,

pH 5,0 -8,0, cơ chất đặc hiệu là L-Dopa.[40]

 Tyrosinase từ Aspergillus oryzae có nhiệt độ tối ưu 30oC, pH 5-6, cơ chất đặc hiệu: L-DOPA, catechol

 Một vài tính chất của tyrosinase từ một số loại nấm:

Bảng 1.1 Tính chất của tyrosinase của một số loại nấm[40]

Loại nấm

M dạng hoạt động (kDa)

pH tối

(µM/phút)

Hoạt độ riêng (u/mg protein)

A.bisporus 47 Kxđ 5,1-5,2

0,44 DOPA) và 0,76 (catechol)

288 DOPA) và 24,5 (catechol)

DOPA) DOPA)

P.sanguineus 45 6,5-7,0 4,5-5,0

1.0 tyrosine)

và 0,9 DOPA)

30 tyrosine) và

84 DOPA)

54 tyrosine)

(L-và 112 (L- DOPA)

TS * : thermostable isozyme: đồng phân bền nhiệt

TL * : Thermolabile isozyme: đồng phân không bền nhiệt

Hầu hết tyrosinase từ các nguồn khác nhau đều bị ức chế bởi EDTA, SDS, muối ăn, sodium azid và mạnh nhất là axit kojic, glutathione, 2 -mercaptoethanol [ ] 12

1 1.3 CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA TYROSINASE

Tyrosinase có cả hoạt tính cresolase và catecholoxidase, vì vậy cơ chất đặc hiệu của tyrosinase bao gồm monophenol (thể hiện hoạt tính cresolase) và o-

diphenol (thể hiện hoạt tính catecholoxidase)

Hình 1.5 Tyrosinase xúc tác chuyển hoá cả hai dạng monovà di phenol + Phản ứng hydroxyl hoá monophenol (L-tyrosine) thành o diphenol (L- -DOPA):

-+ Oxy hoá o-diphenol thành o quinone:

-Trong nhiều tài liệu nghiên cứu về cơ chế hoạt động của tyrosinase đã chứng minh quá trình oxy hóa các monophenol và di- phenol xảy ra khi có mặt của O2

Đa số các nhà nghiên cứu cho rằng cơ sở tác dụng của tyrosinase là sự oxy hóa thuận nghịch nguyên tử đồng hóa trị một (Cu+) thành đồng hóa trị hai (Cu2+)

4Cu+ + 4H+ + O2 4Cu2+ + 2 H2OCác nhà khoa học đã chứng minh rằng catechol không thể liên kết trực tiếp với trung tâm hoạt động, để liên kết được trước đó enzym phải phản ứng với phân

tử O2 tạo thành 2 nguyên tử oxy liên kết với 2 ion đồng Điều đó được chứng minh

do ái lực liên kết của catechol với trung tâm hoạt động Cu-Cu :

4Cu2+ +2 catechol 4Cu1+ + 2 o-quinon +4H+

Hình 1.6 Cơ chế xúc tác của tyrosinase với sự tham gia của phân tử O2

Ngược với quan điểm trên, một số nhà khoa học lại cho rằng ion đồng liên kết bền vững với protein của enzym và không thay đổi hóa trị phản ứng Theo quan điểm này, phản ứng oxy hóa pirocatechol có thể minh họa bằng phương trình sau :

OH OH

Hình 1.7 Phản ứng oxy hóa pirocatechol dưới tác dụng của catecholase

t

Ở động vật, yrosinase còn có vai trò quan trọng trong việc hình thành sắc tố màu melanin Quá trình hình thành melanine được thể hiện như sau:[ ] 23

Hình 1.8 Quá trình tổng hợp melanin trong các tế bào động vật

1 4 1 VAI TRÒ VÀ ỨNG DỤNG CỦA TYROSINASE

1 4 1 .1 Vai trò của tyrosinase

Tyrosinase là enzym giới hạn trong quá trình sinh tổng hợp tạo nên hắc tố melanin với cơ chất khởi đầu là tyrosine Melanin là một polime dị thể của phenol,

có màu nằm trong dải từ vàng tới đen Những hợp chất này được phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thể tìm thấy trong nhiều loài sinh vật từ vi khuẩn cho đến con người Sự hình thành sắc tố đóng những vai trò sinh lí học khác nhau trong sinh vật: [ ] 37

- Trong rau quả và nấm: melanin có vai trò trong sự nâu hóa các mô bị thương với sự có mặt của oxy không khí trong suốt quá trình bảo quản sau thu hoạch Trong nông nghiệp đây là một vấn đề lớn gây ảnh hưởng tới hiệu quả kinh ,

tế Trong một số trường hợp khác như trong công nghiệp chè, làm nho khô, cacao, hoạt tính tyrosinase rất cần thiết để tạo ra tính chất cảm quan đặc trưng của sản phẩm Đối với nấm, melanin có liên quan tới sự hình thành của cơ quan sinh sản và

sự hình thành bào tử, liên quan tới cơ chế gây độc và cơ chế tự bảo vệ vết thương

- Ở động vật không xương sống: ngoài chức năng cung cấp chất màu, melanin còn liên quan tới 3 quá trình sinh lí quan trọng là phản ứng tự bảo vệ (miễn dịch); làm lành vết thương và làm cứng lớp biểu bì

- Ở động vật có vú: Màu sắc của da, lông, tóc ở động vật có vú được xác định bởi 1 số các nhân tố, trong đó quan trọng nhất là số lượng và sự phân bố các hắc tố melanin ắc tố melanin đóng các vai trò quan trọng khác nhau, trong đó bao Hgồm các chức năng như điều hòa nhiệt, ngụy trang kẻ thù và tạo sự hấp dẫn giới tính

- Ở người: chức năng chính của melanin là bảo vệ làn da khỏi tác hại phá hủy của tia cực tím, tránh gây ảnh hưởng tới bộ gen và tránh sự hình thành của các dạng oxy hoạt động Sư thiếu hụt melanin ở người gây ra những sự xáo trộn nghiêm trọng như chứng bạch tạng, bệnh lang trắng Còn có sự liên quan lớn đáng chú ý giữa melanin và các u ác tính trong căn bệnh ung thư da, mối liên hệ giữa hắc tố não

và sự tổn hại của các neuron thần kinh và các nơi dễ bị tổn thương trong bệnh Parkinson Sự sản xuất melanin không bình thường của cơ thể còn gây ra hàng loạt các ảnh hưởng đến thẩm mĩ như chứng tàn nhang, rám, sạm da

1 4 1 .2 Ứng dụng của tyrosinase

Tyrosinase có ý nghĩa quan trọng trong rất nhiều lĩnh vực như trong công nghiệp thực phẩm, y học, dược phẩm, trong lĩnh vực hóa mỹ phẩm và trong lĩnh vực môi trường

1 4 1 .2.1 Trong ngành công nghiệp thực phẩm

Tyrosinase được ứng dụng một cách rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm như hợp chất polyphenol bị oxi hóa bởi tyrosinase có sẵn trong lá chè, tạo nên màu sắc, độ đậm và hương vị, đảm bảo chất lượng của sản phẩm chè đen, ảnh hưởng tới màu và vị của thuốc lá và một số sản phẩm khác như cacao, cafe… [12,10]

Bên cạnh đó, tyrosinase là một enzym không mong muốn và giữ một vai trò quan trọng trong việc quyết định chất lượng sản phẩm Nhiều loại trái cây như đào,

mơ, táo, nho, chuối, dâu tây và các loại rau như khoai tây, rau diếp, nấm ăn…bị hỏng do quá trình oxy hóa của tyrosinase khi có mặt của O2, hình thành các sản phẩm có màu do octoquinolcó thể trùng hợp với các chất không có bản chất phenol như axít amin, các amin và nguyên nhân này làm mất chất dinh dưỡng trong sản phẩm Vì vậy việc hạn chế hoạt tính của tyrosinase là quan trọng trong việc hình thành chất lượng sản phẩm.[ ] 13

1.1 .2.3 4 Trong lĩnh vực hóa mỹ phẩm

Sự chuyển hoá không kiểm soát của melanin là nguyên nhân gây ra những vết tàn nhang, sạm da hay nguy hiểm hơn nữa là khối u ác tính Vì vậy việc nghiên cứu các chất ức chế tyrosinase để sản xuất các chế phẩm thương mại như kem làm trắng

da … là một hướng hiện nay rất được quan tâm trên thế giới Trong các sản phẩm làm trắng da có tên thương mại như Melanostat không chỉ tác động lên tyrosinase

mà còn tác động trực tiếp lên melanin và khử hoạt tính của chúng làm trắng rất hiệu quả Arbutin được sử dụng dùng để tiêu diệt các mầm bệnh do vi khuẩn gây ra và

ức chế tyrosinase ngăn ngừa các đốm đen, tàn nhang, xử lý các vùng rám nắng và điều chỉnh sự hình thành sắc tố da [26] Ngoài ra còn nhiều chất ức chế tyrosinase

đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi như vitamin C, licorice, axít Kojic hay chất ức chế chiết suất từ cây dâu tằm

1.1 .2.4 4 Trong lĩnh vực xử lý môi trường

Các hợp chất phenol là một nhóm hóa chất ô nhiễm, dễ bị hấp thụ vào động vật và con người qua da và màng nhầy, ảnh hưởng rất lớn tới các cơ quan và các

mô, gây các bệnh về phổi, gan, thận Hiện nay có nhiều phương pháp phân tích dư lượng các hợp chất phenol như phương pháp phân tích hóa học, phương pháp sắc

kí, phương pháp phun chảy, phương pháp điện hóa học, phương pháp dùng quang phổ kế v.v Song các phương pháp này thường đắt tiền và thời gian dài

Điện cực sinh học và thiết bị cảm ứng sinh học thường được sử dụng để xác định và loại bỏ các chất ô nhiễm trong nước thải và sự có mặt của các hợp chất phenol trong thực phẩm Điện cực sinh học tyrosinase cố định được sử dụng như là công cụ để giải quyết các vấn đề có liên quan đến các hợp chất phenol Dựa vào hoạt tính phenolase, tyrosinase (tyrosinase xúc tác chuyển hóa các hợp chất phenol thành các hợp chất ít độc hơn hoặc không độc) được ứng dụng tạo ra các điện cực sinh học nhờ cố định enzym này lên màng sinh học Người ta nghiên cứu sử dụng màng graphite carbodiimide đã hoạt hóa để cố định nhằm tạo ra điện cực tyrosinase graphite, phát hiện hàng loạt các hợp chất phenol với những khả năng chuyển hóa khác nhau, giới hạn phát hiện từ 0,001- 0,003 mM, có thể đo được 110 mẫu/giờ [34]

1.1.5 TYROSINASE TÁI TỔ HỢP

Enzym có bản chất là protein nên enzym tái tổ hợp hay protein tái tổ hợp là protein được thu nhận từ chủng tái tổ hợp (chủng có gen ngoại lai) Tyrosinsae tái tổ hợp được nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau như vi khuẩn, nấm mốc, người Theo các nghiên cứu, cho tới nay có khoảng 20 trình tự gen mã hóa cho tyrosinase từ người tới procaryot [7]

Bảng1.2 ố axit amin m ho yrosinase ác loài S ã á t ở c khác nhau.

Số axit amin

Homo sapiens (người) 529 Malus domestica (táo) 593

Mus musculus (chuột) 533 Vitis vinifera (nho ) 607

Oryzias latipes (medaka cá) 540 Agaricus bisporus 569

Manduca sexta (cây thuốc lá) 695 Neurospora crassa 620

Malus domestica (táo) 593 Streptomyces glaucescens 273

Bombyx mori (giun tơ) 696 Z hirobium meliloti 494

Drosophila melanogaster

Spinacia oleracea (rau spinach) 639 Rana nigromaculata

(khoai tây) 583 588Pacifastacus leniusculus

Hình 9 1 Vị trí bảo thủ CuA và CuB của tyrosinase ở các loài nấm khác nhau Gen mã hoá cho tyrosinase từ nấm mốc Aspergillus oryzae (melO) dài

1671bp gồm 2 đoạn exon 1203bp, 414bp và 1 đoạn intron 54bp Điểm nối giữa đoạn exon và intron là GT….AG cDNA của melO dài 1617bp mã hóa 539 axit , amin [ ] 50

Bảng 1.3 Trình t ựaxit amin của gen melO

Masvepiktfeirqkgpvetkaerksirdlneeeldklieawrwiqdpartgedsffylaglhgepfrgagynnshwwggychhgnilfptwhraylmavekalrkacpdvslpywdesddetakkgipliftqkeykgkpnplysytfserivdrlakfpdadyskpqgyktcrypysglcgqddiaiaqqhnnfldanfnqeqitgllnsnvtswlnlgqftdiegkqvkadtrwkirqcllteeytvfsnttsaqrwndeqfhplesggketeakatslavplesphndmhlaiggvqipgfnvdqyagangdmgendtasfdpifyfhhcfidylfwtwqtmhkktdasqitilpeypgtnsvdsqgptpgisgntwltldtpldpfrengdkvtsnklltlkdlpytykaptsgtgsvfndvprlnyplsppilrvsginrasiagsfalaisqtdhtgkaqvkgiesvlsrwhvqgcancqthlsttafvplfelneddakrkhannelavhlhtrgnpggqrvrnvtvgtmr

Vị trí của trung tâm hoạt động của tyrosinase mel O được xây dựng dựa trên

sự tương đồng với lysin từ Panulirus nt I errupus Trung tâm hoạt động CuA được

bao quanh bởi 3 histidine là His63, His84, His93 và trung tâm CuB được bao quanh bởi His290, His294 và His333 Vùng liên kết Cu (II) của tyrosinase được bảo tồn ở các nguồn khác nhau như vi khuẩn, động vật Tuy nhiên vị trí CuA trong molluscan hemocyanin và tyrosinase có thể không gồm 3 His này Giống như Cys82-Xaa His- 84

hoạt tính enzym thể hiện ở cầu disulfua, Cys94-Xaa His- 96 của tyrosinase từ

N.crassa Trình tự axit amin dự đoán của tyrosinase từ A.oryaze có sự tương đồng

17% với Neurospore crassa (nấm túi) và 15% so với Homo sapiens (động vật có vú) [ ] 50

H 0 ình 1.1 So sánh trình tự axit amin của gen m O el c ủaA.oryzae với Neurospora

crassa

Gen tyrosinase được biểu hiện ở các tế bào chủ khác nhau như E.coli, Saccharomyces cerevisia, A.oryzae, Pichia pastoris… , phụ thuộc vào cấu tạo của

gen Theo nghiên cứu của Hiroshi obata và các cộng sự, melB mã hóa cho

tyrosinase từ A.oryzae có sự tương đồng 24 33% với - mel O của A.oryzae và các nguồn khác Mel B có 6 exon xen kẽ với 5 intron, mã hóa cho 616 axit amin Tuy nhiên melB được biểu hiện cao trong solid state culture, còn mel O được biểu hiện cao trong submerged culture [ ]21 Do đó khi biểu hiện cần dựa vào mục đích thu nhận tyrosinase, cấu trúc của gen để lựa chọn tế bào chủ

1.2 VECTOR VÀ TẾ BÀO CHỦ

1.2 1 Khái niệm vector

Vector là một ADN, thường có dạng vòng, mang nhiều đặc tính trong đó có khả năng xâm nhập vào tế bào và mượn bộ máy tế bào để tạo ra nhiều sản sao khác giống hệt vector ban đầu.[1]

1.2 2 Vector tách dòng pCR2.1

Vector tách dòng (cloning vector) còn gọi là phương tiện vận chuyển gen, được sử dụng để khuếch đại số lượng bản sao của một gen hay trình tự ADN nhất định, chuyển các gen ngoại lai vào tế bào hoặc sản xuất protein với số lượng lớn từ các gen tách dòng [1,2,3]

Vector tách dòng: - Là các phân tử ADN có kích thước nhỏ, cho phép cài (gắn) các

gen cần thiết và có khả năng sao chép độclập không phụ thuộc vào sự phân chia của tế bào

- Có khả năng tồn tại trong tế bào vật chủ qua nhiều thế hệ, ít gây biến đổi bộ gen của tế bào chủ

- Phải mang gen “ tín hiệu“ để dễ dàng nhận biết các tế bào mang vector tái tổ hợp

- Vector phải mang những vị trí nhận biết duy nhất của một số lượng tối đa enzym giới hạn

Vector tách dòng gồm nhiều loại như plasmid (plasmid giới tính (F), plasmid kháng chất kháng sinh (R), plasmid col (có gen mã hoá colicin giết các vi khuẩn khác) ), phage, cosmid, phagemid, nhiễm sắc thể nhân tạo của tế bào nấm men, Vector tách dòng là virus của tế bào eukaryote các loại virus SV40 ( ( Simian virus), adenovirus, retrovirus, baculovirus, virus herpes ),có những ưu, nhược điểm nhất

định Tuỳ thuộc kích thước của gen cần tách dòng và đặc điểm của loại tế bào chủ

để chọn loại vector tách dòng thích hợp

Vector pCR 2.1 (Invitrogen) là vector tách dòng đang được sử dụng phổ biến, có hiệu quả cao, có ưu điểm nổi bật là có thể gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vector đã được cắt mở vòng do có sẵn hai đầu dính, mỗi đầu có một base Timin

Vector pCR 2.1 có kích thước 3,9 kb [46]

Hình 1.11 Sơ đồ vector pCR 2.1 (Invitrogen)

Cấu tạo và vị trí của từng thành phần trong plasmid được thể hiện trong bảng sau:

I, PaeR 71, Xho Xba Apa I Trong đó EcoR I, BstX I, Nsi I có hai vị trí cắt, các I, I, enzym còn lại chỉ có một vị trí cắt

Ngoài ra, vector pCR2.1 có chứa gen kháng Ampicillin và Kanamycin cho

phép lựa chọn các tế bào mang plasmid sinh trưởng bình thường trên môi trường có chứa Ampicillin hoặc Kanamycin với nồng độ ức chế tối thiểu 100μg/ml

1.2.3 Hệ vector biểu hiện trong Pichia pastoris

Các vector biể hiện là vector có thể mang các gen ngoại lai mong muốn cho u phép thực hiện sự phiên mã c a các b n ủ ả sao được t o dòạ ng v ự ịch mà s d ã các mRNA của chúng trong tế bào chủ

Vector biểu hiện phải có đủ các cấu trúc cần thiết:

- Các trình tự mã hóa gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker) để đảm bảo duy trì vector trong tế bào

- Một promoter kiểm soát phiên mã (ví dụ: lac, trp hoặc ) cho phép sản tac

xuất một lượng lớn mRNA từ các gen được tạo dòng

- Các trình tự kiểm soát dịch mã như vùng liên kết ribosome được bố trí thích hợp và codon khởi đầu ATG

- Một polylinker để đưa gen ngoại lai vào trong một hướng chính xác với promoter

Hệ biểu hiện P pastoris cũng như các hệ thống khác, được xây dựng dựa

trên hệ thống vector biểu hiện trong Escherichia coli Qua nhiều năm nghiên cứu

các nhà khoa học đã tạo ra nhiều loại vector biểu hiện cũng như chủng P pastoris

khác nhau: vector pPICZ, pPICZα, pGAPZ, pGAPZα, pPIC6, pPIC6α, pPIC9K, pPIC3.5K, pAO815; chủng P pastoris GS115, X 33, SMD1168, SMD1168H, -KM71, KM71H

Hầu hết các vector biểu hiện trong Pichia pastoris có chứa đoạn trình tự AOX1 promoter (0,9 kb) gồm trình tự 5’ promoter và trình tự nhỏ khác cần thiết

khác cho quá trình kết thúc quá trình phiên mã (AOX1 transcription terminator)

Xen giữa promoter và terminator là vùng đa ểmđi (multiple cloning site, MCS) dùng để chèn thêm gen mong muốn thông thường thì kết quả biểu hiện gen ngoại lai tốt nhất khi trình tự ATG của gen ngoại lai nằm gần trình tự ATG của gen

AOX1 Vị trí này thường trùng với điểm cắt ở đầu 5’ ở vùng MCS Khi vector được

gắn thêm các yếu tố tiết thì có thể tạo ra protein dung hợp.[11,20]

Tùy vào mục đích thu nhận protein, chúng ta có thể chọn các loại vector khác nhau Trong luận văn này chúng tôi sử dụng vector pPICZα (Invitrogen) Đây

là vector được sử dụng khá rộng rãi Vì trong vector có vùng α factor, là tín hiệu giúp protein khi tổng hợp có thể tiết ra ngoài môi trường, thuận lợi cho việc thu nhận chế phẩm protein.[11]

-Hình 1.12 Sơ đồ vector pPICZα pPICZα gồm 3loại vector pPICZ A(3593bp), pPICα Z α B(3597bp) và pPICZ Cα (3598bp) Các đặc tính của pPICZα thể hiện trong bảng sau:

Bảng 1 Thành phần của vector pPICZ5 α

khả năng điều khiển sự tiêu thụ methanol, được biểu hiện cao trong P.pastoris

Tín hiệu tiết protein ngoại bào

(α-factor)

Đây là đặc điểm nổi bật nhất khi dùng vector này biểu hiện trong P.pastoris

Vị trí đa điểm (multiple cloning

site)(với 10 vị trí của enzym cắt

giới hạn)

Cho phép cài gen cần biểu hiện vào vector biểu hiện

Myc epitope (biểu vị) tag đầu C

(Glu-Gln Lys- -Leu Ile Ser Glu- - -

-Glu-Asp Leu Asn)-

-Có thể xác định protein hòa tan (fusion protein) bởi kháng thể kháng myc hoặc kháng thể kháng myc HRP

Polyhistidine tag đầu C Có thể tinh sạch protein hòa tan tái tổ hợp dựa

trên sự liên kết với kim loại

AOX1 để có thể gắn với genom của Pichia

1.2.4 Tế bào chủ

1.2.4.1 Hệ thống các tế bào chủ trong biểu hiện gen

Hiện nay có 4 hệ tế bào chủ thường được sử dụng để biểu hiện gen như

E.coli, B.subtilis, nấm men (S Cerevisiae, P Pastoris) và tế bào động vật [3,4]

Bảng 6 1 Các loại tế bào chủ chủ yếuCác nhóm

chính Kiểu loại nhân Kiểu loại tế bào Thí dụ

Gram đương

Escherichia coli Bacillus subtilis Streptomyces spp

Có khuẩn ty

Sacchromyces cerevisiae Pichia pastoris

E.coli là vi khuẩn gram âm, có một nhiễm sắc thể riêng lẻ nằm trong cấu trúc

gọi là vùng nhân, hệ gen có kích thước khoảng 4.106 cặp bazơ, là một vật chủ đơn giản nhất được sử dụng rộng rãi Các quá trình biểu hiện gen (phiên mã và dịch mã)

đi đôi với nhau, sinh ra sợi mARN được tổng hợp mới và được sử dụng ngay cho quá trình dịch mã Không có hiện tượng sửa đổi sau phiên mã đối với sản phẩm phiên mã ban dầu như thường xảy ra trong các tế bào nhân chuẩn [4]

B.subtilis và nấm men không phải là hệ biểu hiện được sử dụng rộng như E.coli nhưng hệ này có nhiều ưu điểm đáng chú ý B.subtilis có khả năng biểu hiện

và tiết rất tốt protein có nguồn gốc từ procaryot ra ngoài môi trường nuôi cấy, còn nấm men lại có những ưu điểm quan trọng của cả procaryot và eucaryot Nấm men sinh trưởng nhanh và có khả năng chế biến protein sau khi dịch mã tốt để trở thành dạng hoạt động mà hệ biểu hiện ở vi khuẩn không có Hơn nữa nấm men có mức độ

an toàn sinh học cao, được sử dụng nhiều trong công nghệ dược liệu và thực phẩm

Vì vậy, nấm men rất được ưa chuộng để biểu hiện các gen của eucaryot và gen mã hoá cho protein sử dụng trong thực phẩm và chữa bệnh.[4]

Hệ biểu hiện trong tế bào động vật có khả năng biểu hiện được tất cả các protein của 4 nhóm nhưng tốn thời gian và quá trình chọn lọc, nhân dòng và nuôi cấy dòng tế bào phức tạp hơn nên hệ biểu hiện này thường không được sử dụng rộng rãi.[4]

Nấm men Sacchromyces cerevisiae là một vi sinh vật nhân chuẩn được ưa

thích để nghiên cứu kĩ thuật di truyền Hệ gen của Sacchromyces cerevisiae có

khoảng 1,35.107 bazơ nitơ S.cerevisiae được sử dụng rộng rãi trong các ngành

công nghiệp, đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm và y học Bởi vì S.cerevisiae

có độ an toàn sinh học cao, bản thân tế bào S.cerevisiae có hàm lượng protein,

vitamin rất lơn, có giá trị dinh dưỡng cao thường được bổ sung trực tiếp vào thức ăn cho người và động vật Hireman là người đầu tiên thành công trong việc sử dụng

S.cerevisiae làm vật chủ sản xuất interleukin của người Các sản phẩm tiếp đó như

interferon, insulin, albumin huyết thanh người, chất hoạt hoá plasminogen mô, lysozym [4]

Tuy nhiên protein ngoại lai được tiết ra từ S.cerevisiae đạt 0,1-0,5mg/l (Svensson B và cs, 1991) Nguyên nhân chủ yếu là do:

• Plasmid dùng để biểu hiện gen trong S.cerevisiae dạng đa phiên bản rất dễ bị

mất dần qua một số thế hệ

• Promotor dùng để khởi đầu phiên mã gen ngoại lai như promotor của hệ gen đường hoá dễ bị thay đổi, ảnh hưởng tới việc biểu hiện gen

• Môi trường nuôi cấy thường đắt tiền

Bên cạnh đó, S.cerevisiae chưa có hệ vector biểu hiện hữu hiệu, chưa có hệ promotor mạnh được điều khiển chặt chẽ bởi chất cảm ứng [4]

Để khắc phục những nhược điểm của hệ biểu hiện gen trong S.cerevisiae , nấm

men Pichia pastoris đã được sử dụng như một hệ biểu hiện thay thế

1.2.4.2 Tế bào chủ Pichia pastoris

Hệ biểu hiện Pichia pastors khắc phục được những nhược điểm của hệ biểu

hiện S.cerevisiae, trở thành hệ thống biểu hiện gen ngoại lai cực kỳ hữu hiệu với các đặc điểm nổi trội:[4,

• Có promoter AOX I (alcohol oxidase I) đặc hiệu cho việc kiểm soát việc biểu

hiện các gen ngoại lai bằng nguồn C có trong môi trường,

• Plasmid được sử dụng để biểu hiện gen thường được trao đổi chéo với hệ gen của nấm men nên làm tăng tính ổn định của plasmid trong tế bào

• Là sinh vật hiếu khí, thu được sinh khối có mật độ cao, môi trường nuôi cấy đơn giản

• Có khả năng tiết mạnh protein ngoại lai ra môi trường nuôi cấy

• Kit biểu hiện đã được công ty Invitrogen thương mại hóa

P pastoris là chủng nấm men có khả năng sử dụng methanol như nguồn cacbon, nguồn năng lượng độc lập Để sinh trưởng trong môi trường chứa methanol đòi hỏi P pastoris phải có các enzym thiết yếu như alcohol oxidase (AOX), dihydroxyacetone synthase (DHAS) và một số enzym khác trong con đường trao đổi

methanol Trong đó alcohol oxidase là enzym quan trọng nhất, được mã hóa bởi gen

AOX1 và AOX2, không đặc hiệu cho methanol, nó có thể oxy hóa nhiều loại rượu

khác [20]

Các chủng P.pastoris được phân lập từ tự nhiên sinh trưởng trong môi

trường có bổ sung methanol với tốc độ không ổn định (kiểu hình Mut+) Chủng

P.pastoris bị đột biến gen AOX có khả năng sản xuất protein ngoại lai tốt hơn so với chủng phân lập từ tự nhiên [8] Hơn nữa các chủng này đòi hỏi một lượng rất nhỏ methanol dùng cho cảm ứng nên giảm thiểu nguy cơ ngộ độc methanol khi tiến

hành lên men Chủng đột biến KM71 (his4 arg4 aox1∆::SARG4) là một chủng mà gen AOX1 bị xóa, thay vào đó là gen S cerevisiase ARG4 (kiểu hình MutS), sinh trưởng rất chậm trong môi trường có bổ sung methanol Chủng đột biến MC100-3

(his4 arg4 aox1∆::SARG4 aox2∆::Phis4) bị xóa cả hai gen AOX và không thể sinh

trưởng trong môi trường methanol (kiểu hình Mut-) Tất cả các chủng này, kể cả chủng Mut-đều duy trì khả năng biểu hiện protein ngoại lai ở mức độ cao bởi AOX1

Trong quá trình lên men, Pichia pastoris là một vật chủ có năng suất cao,

đây là một ưu điểm nổi trội so với Saccharomyces cerevisiae Hiện nay đã có các

công trình nghiên cứu mô hình hóa quá trình lên men đối với nấm men P pastoris

Việc nghiên cứu kỹ lưỡng con đường chuyển hóa methanol, các giai đoạn sinh trưởng phát triển của nấm men giúp chúng ta có thể kiểm soát quá trình lên men, tạo điều kiện thu được lượng sản phẩm mong muốn lớn nhất có thể

Phần II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG P HÁP 2.1 Vật liệu

- Vector biểu hiện pPICZαA

- Chủng biểu hiện Pichia pastoris X33

2.1.2 Hóa chất

Cao nấm men, Trypton, Agar, Glucose, Agar bacter, Ampicilin, X-gal, EDTA, SDS, Chloroform, Iso amylalcohol, Phenol, Ethanol, Tris-HCl, Agarose, EtBr, Glycerol, ethidium bromide, các loại enzym giới hạn, vector tách dòng pCR2.1, vector biểu hiện pPICZαA, các bộ kit dùng cho sinh học phân tử của các hãng như Invitrogen, Fermentas, Merk, Applies Biosystem

Máy Speed Vac Sc 110-Savant

Máy quang phổ (Shimadzu, Nhật Bản)

Máy soi chụp ảnh gel (Bio-Rad)

Cân điện tử (Mettler Toledo)

Bộ điện di (Bio-Rad)

Tủ cấy vô trùng (Sanyo, Nhật) Pipettman các loại (Gilson)Thiết bị thanh trùng (Nhật Bản)Máy ly tâm lạnh (Sorvall Biofuge Fresco, UK)

Máy xác định trình tự ADN tự động (ABI 3100, Applied Biosystems, Mỹ)

2.2 Phương pháp

2.2.1 Phương pháp tách chiết ARN tổng số

ARN tổng số từ Aspergillus oryzae TP01 được tách chiết theo phương pháp

Trizol, là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm cho nhiều loại nấm mốc và các loại thực vật khác nhau [5,9,38,39] Phương pháp tách chiết ARN bằng Trizol bao gồm các bước sau:

- Tiến hành lên men A.oryzae TP01 ở 30oC, lắc 200vòng/phút, 48 giờ

- Ly tâm 8000 vòng/phút, 5 phút, 4oC thu sinh khối và nghiền trong Nitơ lỏng

- Bổ sung Trizol reagent, nghiền nhẹ và dùng xilanh hút lên hút xuống 3 4 lần

Hút mẫu vào ống eppendorf 1,5ml và bổ sung cloroform : isoamylalcohol (24:1) theo tỉ lệ 1:1, lắc 200-300 vòng/phút bằng máy vortex trong 5 phút ở nhiệt độ phòng và ly tâm 12000 vòng/phút, 4oC, 5 phút

- Hút dịch ở phatrên cùng sang 1 eppendorf 1,5ml mới, bổ sung opropanol (tỉ lệ is1:1), đảo nhẹ, để ở nhiệt độ phòng 5 10 phút Sau đó l- y tâm 12000 vòng/phút, 30 phút, 4oC, loại dịch, thu cặn

- Bổ sung ethanol 70% và ly tâm 12000 vòng/phút, 10 phút, 4oC, loại dịch thu cặn

và làm khô bằng máy Speedvac

- Hoà cặn trong nước khử ion đã xử lý DEPC

- Tiến hành loại ADN bằng DNAase

- Bổ sung Trizol theo tỉ lệ 1:1 và lặp lại các bước như trên

- Điện di kiểm tra trên gel agarose 1%

2.2.2 Phương pháp định lượng AND/ARN bằng quang phổ kế

Phương pháp quang phổ kế cho phép xác định một cách tương đối nồng độ ADN, đồng thời kiểm tra được độ tinh sạch của mẫu [1]

Nguyên tắc: phương pháp này dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các bazơ purin và primidin Giá trị mật độ quang ở bước