Nghiên ứu táh dòng và biểu hiện gen mã hóa protein bla ủa vỏ bào tử vi khuẩn baillus anthrais

Trong các chơng trình về VKSH vi khuẩn gây bệnh than Bacillus anthracis l à tác nhân sinh học thờng đựơc sử dụng nhiều nhất vì: trực khuẩn B.. Do yêu cầu trong đấu tranh phòng chống kh

Trờng đại học bách khoa hà nội

Giáo viên hớng dẫn Trơng Quốc Phong

H À NỘI, 2012

aa amino acid = axit amin

Amp Ampicillin

APS Amonium persunphate

BclA Bacillus collagen like protein of anthracis

bp Base pairs = cặp bazơ nitơ

BSA Bovine serum albumin

CLR collagen - like region

CTD C-teminal Domain

DNA Deoxyribonucleotide acid = axit deoxyribonucleotit

dNTP 2’-deroxyribonucleotit 5’-triphosphate

EF Edema Factor

EDTA Ethylen diamin tetra acetic acid

EtBr Ethedium bromide

RNA Ribonucleotide acid = axit ribonucleotit

SDS Sodium dodecyl sulphate

SDS-PAGE Điện di trên gel polyacrylamit có chứa SDS

TBE Tris-Borate- EDTA

TEMED N, N, N’, N’-tetramethyl ethylenediamine

trx Gen mã hóa thioredoxin A của E coli đã được thiết kế sẵn

trong plasmid pET32a(+)

TrxBclA Protein tái tổ hợp lai giữa thioredoxin và BclA được tổng

hợp trong tế bào E coli Thioredoxin được mã hóa bởi gen trx, BclA được mã hóa bởi gen BclA

Mở đầu

Vũ khí sinh học (VKSH) hiện nay đang là công cụ hữu hiệu cho bọn khủng bố trên thế giới bởi vì tính nguy hiểm và mức độ hủy diệt mạnh của chúng Việc sản xuất các chế phẩm sinh học không đòi hỏi thiết bị phức tạp, có khả năng sản xuất số lợng lớn với đầu t dung cụ không nhiều, giá thành rẻ hơn nhiều so với các loại vũ khí khác Do vậy, bọn khủng bố có thể dễ dàng sản xuất

và sử dụng các loại vũ khí sinh học này Thực tế cho thấy hàng loạt các vụ khủng

bố đã xảy ra trên thế giới trong những năm gần đây có liên quan đến sử dụng vũ sinh học

Trong các chơng trình về VKSH vi khuẩn gây bệnh than Bacillus anthracis

l à tác nhân sinh học thờng đựơc sử dụng nhiều nhất vì: trực khuẩn B anthracis

có thể tồn tại trong tự nhiên dới dạng bào tửtrong thời gian hơn 10 năm, chúng

có khả năng chịu nhiệt lên đến 160oC trong 5 phút và 100oC trong 10 phút

Ngời có thể bị nnhiễm bệnh than qua 3 con đờng: qua da, đờng tiêu hoá và đờng hô hấp Bào tử B anthracis khi bị hít vào qua mũi chúng có khả năng tới các phế nang để gây bệnh than thể hô hấp và c trú ở các phế bào của phế nang, qua hệ thống mạch bạch huyết chuyển tới hạch lympho của trung thất Tại đó, các vi khuẩn gây bệnh than này sinh trởng và xâm nhập theo đờng máu gây nhiễm khuẩn huyết và nhiễm khuẩn nhiều nơi trong cơ thể gây tỷ lệ tử vong rất cao

Trớc đây, việc xác định B anthracis trong phòng thí nghiệm chủ yếu dựa vào hình thái học và đặc điểm sinh học Sau đó, B anthracis đợc phát hiện

thông qua DNA bằng kỹ thuật nhân bội PCR, kỹ thuật này có khả năng phát hiện nhanh hơn so với phơng pháp hình thái học và đặc điểm sinh hóa học Kỹ thuật PCR có tính chọn lọc và mức độ chính xác cao Tuy nhiên kỹ thuật PCR đòi hỏi , phải có thiết bị chuyên dụng; thao tác phức tạp và đòi hỏi cán bộ chuyên môn có tay nghề vững vàng

Do yêu cầu trong đấu tranh phòng chống khủng bố bằng vũ khí sinh học, việc phát hiện nhanh trong 10 - 15 phút sự có mặt của các tác nhân gây bệnh

nguy hiểm nh B anthracis là yếu tố rất quan trọng và cần thiết để giúp các cơ

quan chức năng phòng chống khủng bố sinh học ngăn ngừa và ngăn chặn kịp thời

các tác nhân sinh học nguy hiểm đặc biệt là vi khuẩn B anthracis

Do vậy, để đạt tới mục tiêu là chế tạo công cụ, phơng tiện phát hiện

nhanh bào tử của B anthracis chúng tôi đã chọn phơng án chế tạo bộ sinh phẩm

thử nhanh dựa trên nguyên lý sắc ký miễn dịch cho phép phát hiện trực tiếp bào

tử thông qua protein đặc trng trên vỏ của chúng

Kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên đặc hiệu vỏ bào tử B anthracis

là một thành phần quan trọng của bộ sinh phẩm Protein BclA là một protein nằm

ngoài cùng trên bề mặt vỏ bào tử B anthracis và đợc xem nh là một chỉ thị

sinh học, đây sẽ là một kháng nguyên cơ sở để tạo kháng thể đơn, đa dòng kháng

protein vỏ bào tử B anthracis

Do đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tách dòng và biểu

hiện gen mã hóa protein BclA của vỏ bào tử vi khuẩn B anthracis” góp phần tạo

ra các nguyên liệu cần thiết cho phát triển bộ sinh phẩm dựa trên nguyên lý sắc

ký miễn dịch

Nội dung của đề tài:

+ Thiết kế vector tách dòng và vector biểu hiện mang gen mã hóa cho protein

vùng CTD của BclA trên bề mặt bào tử vi khuẩn B anthracis

+ Biểu hiện protein BclA tái tổ hợp trong chủng E coli BL21

+ Tinh sạch và định lợng protein BclA tái tổ hợp thu đợc

Chơng I Tổng quan tài liệu

I Tình hình chung về vấn đề vi sinh vật nguy hiểm

Hiện nay, theo thống kê có trên 200 loại vi khuẩn, virus và độc tố gây hại cho ngời qua con đờng thực phẩm và có khoảng 50 loại có nguồn gốc vi sinh vật đã đợc nghiên cứu, liệt kê trong danh mục vũ khí sinh học dùng để tấn công khủng bố sinh học và chiến tranh sinh học Các tác nhân chủ yếu là các chủng vi sinh vật gây bệnh có độc tố với độc lực mạnh, gây nguy hiểm cho ngời và động vật, có thể gây ra thảm hoạ chết hàng loạt Các tác nhân có thể lây nhiễm qua rất nhiều con đờng: lây nhiễm trực tiếp qua da, vết thơng, hô hấp, tiêu hoá ; phát tán nhanh trên diện rộng và xa thông qua môi trờng nớc, không khí, chứa trong th, bu phẩm gửi qua nhiều quốc gia Các tác nhân đợc sử dụng với nhiều dạng: bột, dịch, dạng phun, dùng động vật mang bệnh, cho vào vũ khí (bom, đạn rocket, tên lửa chứa các mầm bệnh, độc tố )

1.1 Lịch sử

Khủng bố sinh học từ xa xa đã đợc sử dụng trong trong chiến tranh tại

La Mã cổ đại khi chất thải đợc sử dụng để tấn công kẻ thù [3] Đây là trờng hợp khủng bố sinh học đầu tiên trên thế giới và đợc tiếp tục vào thế kỷ 14 khi bệnh dịch hạch đợc sử dụng để tấn công vào thành phố của kẻ thù với hy vọng

họ sẽ sợ hãi mà sẽ sơ tán đến nơi khác và cũng để tiêu diệt lực lợng bảo vệ mà không cần phải tấn công Việc sử dụng bệnh dịch hạch nh là một vũ khí tại thời

điểm đó cho thấy sự thiếu kiểm soát vũ khí sinh học của bên có chứa nguồn vũ khí này Y tế tại thời điểm đó không có khả năng ngăn ngừa dịch bệnh từ những ngời sống sót từ trận chiến trở về có mang mầm bệnh trong ngời, do đó dẫn

đến dịch bệnh lan rộng không chỉ trong khu vực của kẻ thù mà còn ảnh hởng tới ngời dân sống ở các vùng xung quanh Do sử dụng vũ khí sinh học lại không có các biện pháp, phơng tiện kỹ thuật y tế cần thiết để bảo vệ khu vực của mình nên các dịch bệnh phổ biến nh bệnh dịch hạch đã lây lan nhanh chóng ra cả Châu Âu, giết chết một phần lớn dân số ở châu lục này Các nạn nhân của khủng

bố sinh học trên thực tế cũng trở thành nguồn lây truyền bệnh nhng y học thời

đó không đủ kỹ thuật, phơng tiện để ngăn chặn hậu quả do khủng bố sinh học gây ra.[7]

Theo thời gian, chiến tranh sinh học ngày càng trở nên phức tạp hơn Các quốc gia bắt đầu phát triển vũ khí có hiệu quả cao và ít khả năng gây nhiễm khuẩn Một trong những biện pháp tăng cờng vũ khí sinh học đầu tiên là sử dụng bệnh than Hiệu quả ban đầu khi sử dụng bệnh than đã kiểm soát đợc khi cho nạn nhân sử dụng với một lợng lớn Điều này đã khiến cho bệnh than đợc lựa chọn để trở thành một loại vũ khí vì có thể vận chuyển dễ dàng, khả năng sát thơng cao, dễ dàng phát tán Ngoài ra, có nhiều chủng vi khuẩn than đợc tìm thấy trên khắp thế giới nên chúng dễ dàng đợc lựa chọn là vũ khí sinh học từ những năm đầu của thế kỷ 19 Một đặc điểm nữa của bệnh than để nó đợc lựa chọn làm vũ khí sinh học chính là khả năng lây lan nhanh trong cộng đồng Tuy nhiên bệnh than không thể lây nhiễm giữa ngời với ngời

Thế kỷ 20

Khi chiến tranh thế giới thứ nhất nổ ra, bệnh than đợc dùng để gây bệnh cho động vật tuy nhiên hiệu quả không cao Ngay sau khi Chiến tranh thế giới thứ nhất bắt đầu, Đức đã phát động một chiến dịch phá hoại sinh học ở Mỹ, Nga, Rumania và Pháp [ ]4 Mỹ phát triển vũ khí sinh học vào năm 1942 Tổng thống Franklin D Roosevelt đặt George W Merck phụ trách đa ra phơng hớng phát triển cho vũ khí sinh học[8] Các chơng trình này đợc kéo dài cho đến năm

1969 đến khi tổng thống Richard Nixon đóng cửa tất cả các chơng trình liên quan đến sử dụng vũ khí sinh học của quân đội Mỹ [4] Tổng thống Mỹ Richard Nixon tuyên bố chính sách mới của ông về chiến tranh sinh học tại một cuộc họp báo vào ngày 25/11/1969 : Vũ khí sinh học gây ra hậu quả rất lớn, không thể

đoán trớc và có khả năng không thể kiểm soát đợc Chúng có thể tạo ra dịch bệnh toàn cầu và ảnh hởng đến sức khỏe của các thế hệ tơng lai Do đó Mỹ đã quyết định phá hủy toàn bộ kho dự trữ của các tác nhân sinh học và hạn chế các chơng trình nghiên cứu sinh học trong tơng lai, bên cạnh đó chú trọng các biện pháp phòng thủ nh vaccine và các thiết bị dò Ngày 10 tháng 8 năm 1972, tổng thống Nixon đã chính thức đa ra Công uớc Vũ khí sinh học và đợc Thợng viện Mỹ phê chuẩn Vào năm 1972, cảnh sát Chicago đã bắt giữ hai sinh viên đại học là Allen Schwander và Stephan Pera, những ngời này đã lên kế hoạch đầu

độc nguồn nớc của thành phố bằng vi khuẩn thơng hàn Từ đó, các nỗ lực để sử dụng chiến tranh sinh học càng đợc thể hiện rõ ràng hơn trong các tổ chức cực

đoan Năm 1984, tại Dallas, Oregon, Rajneeshe đã kiểm soát cuộc bầu cử ở địa

phơng bằng cách phát tán vi khuẩn Salmonella typhimurium Cuộc tấn công này

làm 751 ngời bị ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng tuy nhiên không có trờng hợp nào bị tử vong Đây là vụ tấn công khủng bố sinh học đầu tiên ở Mỹ trong thế kỷ 20.[26]

Vào tháng 6 năm 1993 nhóm tôn giáo Aum Shinrikyo đã phát tán vi khuẩn gây bệnh than tại một ga tầu điện ngầm ở Tokyo nhng không có trờng hợp nào

bị nhiễm vi khuẩn vì trớ trêu thay nhóm đã sử dụng vaccine ngừa bệnh than để phát tán Tuy nhiên các bào tử thu đợc từ cuộc tấn công này cho thấy chúng giống với một chủng vaccine ngừa bệnh than ở động vật tại thời điểm đó

Thế kỷ 21

Trong tháng 9 và tháng 10 năm 2001, nhóm khủng bố Al-Qaeda đã chuyển những lá th chứa trực khuẩn bệnh than tới bu điện, cơ quan công quyền và truyền thông Mỹ làm chết 5 ngời và gây sự hoảng loạn trong d luận

số tác nhân nhóm A nh:

Vi khuẩn Francisella tularensis: Bệnh sốt tularemia hay “sốt thỏ” do vi khuẩn này gây ra Đây là vi khuẩn Gram âm, hiếu khí Bệnh không lây từ ngời sang ngời mà do tiếp xúc với lông thú, qua hô hấp, hoặc uống nớc nhiễm khuẩn hoặc qua vết côn trùng cắn Vi khuẩn Francisella tularensis rất dễ lây

nhiễm, chỉ với một lợng nhỏ cũng có thể gây bệnh Nếu F tularensis đợc sử

dụng làm vũ khí trong chiến tranh thì chúng sẽ đợc phát tán trong không khí Những ngời hít phải không khí bị nhiễm khuẩn thờng bị viêm đờng hô hấp Vi

khuẩn này đợc sử dụng làm vũ khí sinh học do đặc điểm dễ lây truyền và dễ sử dụng [5]

Vi khuẩn Bacillus anthracis: Bệnh than là bệnh nhiễm khuẩn cấp tính từ

động vật mà chủ yếu là động vật ăn cỏ lây sang ngời do trực khuẩn than

Bacillus anthracis gây ra, biểu hiện lâm sàng ở ngời là hội chứng nhiễm khuẩn, nhiễm độc toàn thân nặng với tỉ lệ tử vong cao Vi khuẩn than thuộc nhóm Gram dơng, hình gậy, sinh bào tử, có sức đề kháng cao với các nhân tố vật lý và hóa học Vi khuẩn than gây bệnh cho động vật hoang dã và động vật nhai lại Con ngời cũng có thể bị nhiễm và mắc bệnh khi tiếp xúc với các gia súc mắc bệnh

hay với một lợng lớn bào tử B anthracis phát huy độc lực rất cao khi xâm nhập

vào cơ thể qua đờng hô hấp Bệnh than không lây từ ngời sang ngời và đã có vaccine Bệnh than khi phát hiện sớm có thể đợc điều trị bằng kháng sinh [5,9,13]

Virus gây bệnh đậu mùa: Bệnh đậu mùa đợc gây ra bởi DNA virus

Variola majora Nó dễ dàng lan truyền trong khí quyển và có tỉ lệ tử vong rất cao (20 – 40%) Bệnh đậu mùa đã đợc diệt trừ từ những năm 1970, nhờ chơng trình vaccine trên toàn thế giới Tuy nhiên, một vài chủng virus vẫn tồn tại trong các phòng thí nghiệm ở Nga và Mỹ Một số tin rằng sau sự sụp đổ của liên bang Soviet, một số chủng của bệnh đậu mùa đợc cất giữ ở một số quốc gia Mặc dù những ngời sinh trớc năm 1970 sẽ đợc tiêm vaccine phòng bệnh đậu mùa theo chơng trình của WHO, vaccine chỉ có hiệu lực trong khoảng từ 3 – 5 năm [5] Bệnh đậu mùa là một vũ khí sinh học nguy hiểm vì có thể lây lan trong tự nhiên cao theo cả con đờng lây nhiễm

Vi khuẩn Clostridium botulinum: Là vi khuẩn Gram dơng do Emile van

Ermengem phân lập vào năm 1895, sản sinh độc tố botulin (độc tố gây chết do làm suy hô hấp) Độc lực của botulin rất cao, chỉ cần 1 microgam hay 1 phần triệu gam đã có thể làm chết một ngời, một giọt chất độc này có thể làm chết cả trăm ngàn ngời Nếu quy trình chế biến bảo quản không tốt trong chế biến thực phẩm (nhất là đồ hộp), thực phẩm có thể bị nhiễm vi khuẩn này Phơng pháp làm sôi kết hợp với điều áp có thể diệt đợc vi khuẩn Bào tử của vi khuẩn này

không phát triển trong những đồ hộp có hàm lợng đờng cao nh mật ong, siro nhng có khả năng phát triển khi vào đờng tiêu hóa của trẻ sơ sinh

Vi khuẩn Yersinia pestis: Bệnh dịch hạch đợc gây ra bởi trực khuẩn Gram

âm Yersinia pestis Bệnh dịch hạch đã gây ra một đại dịch có sức tàn phá nhất

trong lịch sử, làm 20 – 30 triệu ca tử vong trong thế kỷ 14 Các loài gặm nhấm

là thờng là vật chủ của bệnh này và bệnh này truyền sang ngời qua vết cắn của

bọ chét Bệnh này có lịch sử đợc sử dụng làm chiến tranh sinh học tại rất nhiều quốc gia và nó đợc coi là mối đe dọa vì là chủng có trong tự nhiên và có khả năng tồn tại một thời gian dài trong vật chủ Vũ khí đe dọa đến từ chủ yếu là bệnh truyền nhiễm thể phổi (lây nhiễm qua hô hấp) [25] Đây chính là bệnh dịch gây ra Cái chết đen ở Châu Âu thời trung cổ

Virus sốt xuất huyết Ebola: vius này thuộc giống Ebolavirus, họ

Filoviridea gây bệnh với tỷ lệ tử vong cao do khả năng gây suy nhợc đa cơ quan

và làm mất máu trầm trọng Bệnh lây nhiễm do tiếp xúc với dịch tiết của động vật bị nhiễm hoặc cơ thể ngời bị nhiễm Bệnh cha có thuốc điều trị đặc hiệu, bệnh nhân khi chết cần phải hỏa táng ngay Đây là vũ khí sinh học nguy hiểm nhất vì bệnh xuất hiện nhanh, tỉ lệ tử vong cao.[5]

Nhóm B: là nhóm đợc quan tâm thứ hai vì chúng tơng đối dễ lây lan, dẫn tới tỉ lệ bệnh trung bình và tỉ lệ tử vong thấp Nhóm B bao gồm các tác nhân

nh: vi khuẩn Brucella, sốt Q, Staphylococcal enterotoxin B, viêm não do virus,

mầm bệnh trong thức ăn và nớc uống,…

Nhóm C: là những tác nhân mới đợc nghiên cứu có thể đợc thiết kế để lây lan hàng loạt trong tơng lai bới chúng có sẵn, dễ tạo ra và khi lây lan có khả năng mắc bệnh cao, tỉ lệ tử vong cũng nh mức ảnh hởng tới sức khỏe nghiêm

trọng Nhóm này gồm các tác nhân nh: Nipah virus, Hantavirus, SARS,…

Bảng 1: Đặc tính của một số tác nhân sinh học thờng lựa chọn làm vũ khí sinh học:

(bệnh dịch hạch) Chuột hoặc khí dung Nhanh Cao

7 Smallpox (bệnh đậu

8 Botulin toxin Trong thực phẩm hoặc khí

9 Ricin toxin Trong thực phẩm hoặc khí

10 Dengue fever virus Mosquito bome Nhanh Thấp

Tình hình an ninh thế giới thời gian gần đây có những biến động lớn đặc

dụng một số tác nhân sinh học, hoá học,… với mức độ liều lĩnh nguy hiểm cao

và không loại trừ bất cứ quốc gia nào từ Mỹ (vụ 11/9) tới Châu á (vụ Bali – Indonesia, vụ Sarin – Nhật Bản), Châu Âu (vụ Madrid – Tây Ban Nha).… Mặc dù có những hạn chế bởi các công ớc quốc tế nhng việc nghiên cứu tác nhân Sinh hoá (Biological Chemistry BC) vẫn đang đựơc ng- ấm ngầm đẩy mạnh ở nhiều nớc và rất có thể tác nhân BC sẽ trở thành chất độc Quân sự thế

hệ thứ ba tiêu biểu vào những năm của thế kỷ 21 Nhiều dự đoán rằng chất độc

BC sẽ đợc đa vào trang bị của Quân đội các nớc tiên tiến trong những năm tới

Năm 2001, một loạt cơ quan tại Mỹ đã bị khủng bố bằng bột trắng có mang bào tử vi khuẩn than Các địa điểm bị tấn công là Văn phòng Quốc hội ( thợng viện, hạ viện, một số nghị sỹ), bu điện (các bu cục, nhân viên bu

điện), Toà soạn báo, Hãng truyền hình, Trung tâm Vũ trụ Kenedy và một số cơ

sở khác Các giám định sau này cho thấy các nạn nhân đều chết do nhiễm vi khuẩn than Loại bào tử có trong chất bột trắng là bào tử vi khuẩn than [4]

1.2 Đặc điểm sinh học vi khuẩn B anthracis

B anthracis là vi khuẩn đầu tiên đợc xác định là chủng gây bệnh, vào năm 1877, R Koch đã nuôi cấy vi khuẩn này dới dạng chủng thuần khiết; đã chứng minh đợc khả năng hình thành bào tử và qua thực nghiệm chủng này gây bệnh than bằng cách cấy vào cơ thể động vật

Vi khuẩn than thuộc loài Bacillus, họ Bacillaceae Loài Bacillus là các

trực khuẩn Gram dơng, có bào tử, kỵ khí tuỳ tiện, bào tử của chúng có thể tồn tại trong đất nhiều thập kỷ[6, 16] Các vi khuẩn này gồm nhiều loài, đa số không

gây bệnh Một số gây nhiễm trùng nhiễm độc thức ăn (B cereus), một số có lợi cho con ngời (B subtilis, B thuringiensis, B mycoides B anthracis) có đặc

điểm khác biệt với các loài trực khuẩn hiếu khí có bào tử khác do độc lực của nó

B anthracis mang plasmid pXO1; pXO2 [11] V capsule hình thành trong môi ỏ trờng giàu chất dinh dỡng, hoặc đợc nuôi cấy trong môi trờng dinh dỡng 0,7% Nabica, ở nhiệt độ 37°C trong điều kiện giầu CO2 (20%).[1]

Vi khuẩn B anthracis hình thẳng, hai đầu vuông, có kích thớc từ 1ữ1,5 ì

3ữ10 àm, thờng xếp thành từng chuỗi giống nh cây tre, bắt màu Gram (+) ở ngoại cảnh hoặc trong môi trờng nuôi cấy vi khuẩn hình thành bào tử, bào tử nằm giữa thân và không làm thay đổi hình dạng vi khuẩn Trong môi trờng lỏng

vi khuẩn không di động.[1]

Khuẩn lạc B anthracis có kích thớc lớn, đờng kính 0,3 - 0,5 cm Màu

khuẩn lạc trắng đến trắng ghi Bề mặt khuẩn lạc ớt, hơi dính, không gây tan huyết trên thạch máu cừu (nhng trên thạch máu thỏ có thể gây tan huyết).[1] Độc tố của vi khuẩn có sự tham gia của 3 yếu tố cấu thành: kháng nguyên bảo vệ (Protective Antigen PA), giúp hai cấu tử khác là yếu tố gây phù -

nề (Edema Factor - EF) và yếu tố gây chết (Lethal Factor - LF) xâm nhập đợc vào tế bào của vật chủ và gây độc Về bản chất đây là 3 peptid do bản thân vi khuẩn sinh ra Yếu tố gây phù nề làm bất hoạt tế bào bạch cầu trung tính của vật chủ làm cho các tế bào này không có khả năng thực bào để tiêu diệt vi khuẩn Các nhà nghiên cứu cho rằng yếu tố gây chết kích thích các đại thực bào sản sinh TNF-alpha và interleukin-1-beta (cả hai yếu tố này là cấu phần của hệ miễn dịch

có tác dụng trong phản ứng viêm và sốc phản vệ) và có thể gây chết vật chủ Đây

cũng là yếu tố khác biệt chủ yếu của B anthracis so với các chủng tơng tự nh

B cerius….Các nghiên cứu gần đây cho thấy vi khuẩn bệnh than còn tác động

đến các tế bào nội mạc gây tổn thơng các mạch máu dẫn đến sốc và chết do mất máu (đây không phải là sốc phản vệ) Cơ thể chết do bệnh than thờng có hiện tợng chảy máu từ các lỗ tự nhiên.[18,22]

Hình 1: Vi khuẩn B anthracis Hình 2: Bào tử vi khuẩn B anthracis

Trong chẩn đoán vi khuẩn B anthracis ở thể sinh dỡng, ngời ta có thể

căn cứ vào xác định sự có mặt của 3 protein này hoặc đoạn gen mã hoá cho 3 protein này để nhận biết

Các gen độc lực đợc mã hoá bởi Plasmids pXO1 bao gồm lef, pag, cya và pXO2 có các gen c apA, apB, c C c ap , đây là các dấu ấn quan trọng trong việc

trong việc xác định B anthracis trong mẫu bệnh phẩm lâm sàng và mẫu môi

trờng bằng kỹ thuật PCR

Trên cơ sở phân tích và giải trình tự gen đợc mã hoá bởi hai plasmid pXO1

và pXO2 cũng nh trình tự gen Ba 813 thuộc nhiễm sắc thể ngời ta đã thiết kế các cặp mồi đặc hiệu phát hiện trực khuẩn than thể sinh dỡng và thể sinh bào tử Trong PXO1 là gen pag, đây là gen mã hoá kháng nguyên bảo vệ quyết định cho

sự xâm nhập của B anthracis vào tế bào vật chủ Trong PXO2 là gen c C ap ,

chứng minh có gen mã hoá capsul đây cũng là yếu tố tạo ra độc lực của B

anthracis và là cơ sở khác biệt với các chủng trực khuẩn khác trong nhóm B

cereus

1.3 Cấu tạo bào tử của B Anthracis

Bào tử B anthracis đợc bọc trong một vỏ dầy gồm nhiều lớp, bên ngoài

tiếp tục đợc bao quanh bởi một lớp vỏ bào tử Bào tử trởng thành gồm một khoang trung tâm chứa bộ gen đợc gọi là phần lõi và ba lớp bảo vệ là lớp vỏ bao bên ngoài phần lõi; lớp áo và lớp vỏ bào tử Những lớp này đợc tổng hợp trong những giai đoạn sau của quá trình hình thành bào tử

Lớp áo bao bên ngoài phần lõi là một lớp peptidoglycan dầy trong đó gồm nhiều loại protein khác nhau Lớp áo bào tử thờng chức các protein lắp ráp và các yếu tố hình thái quan trọng Lớp áo này cũng đóng vai trò quan trọng trong

sự nảy mầm của bào tử, có thể nó cung cấp cho quá trình nảy mầm các protein thụ thể nằm trên tế bào chất Hydrolase phân hủy peptidoglycan có mặt trong lớp

áo của bào tử còn tham gia vào quá trình phân hủy vỏ bào tử trong quá trình nảy mầm Các protein trong áo bào tử tạo liên kết ngang với nhiều protein có chứa d lợng cystein

Mặc dù B anthracis và B subtillis đợc dự đoán có nhiều protein tơng tự

nhau ở lớp áo bào tử nhng lớp áo bào tử của 2 chủng này có nhiều khác biệt

đáng kể Nếu nh ở bào tử B subtillislớpáo bào tử là một cấu trúc tơng đối dầy

thì ở lớp áo bào tử B anthracis mỏng và kết cấu chắc chắn hơn Ngoài ra lớp áo

bào tử của B anthraciscòn đợc bao bọc bởi lớp vỏ bào tử

Là lớp ngoài cùng, lớp vỏ bào tử có vai trò nh một lớp rào cản và là nguồn gốc kháng nguyên bề mặt của bào tử Mặt khác lớp vỏ bào tử còn là phần tiếp xúc trực tiếp với môi trờng đất, với các tế bào trong vật chủ và với các yếu

tố bảo vệ trong cơ thể vật chủ Lớp vỏ bào tử này có phản ứng với lectin để tạoliên kết với các olysaccharide nằm trong các sợi trên lớp vỏ bào tử ở bào tử B

anthracis lớp vỏ bào tử chiếm khoảng 2% khối lợng bào tử, trong đó 50% là protein, 20% là lipid, 20% là các polysaccharide và 10% là các thành phần khác [7] Khi phân tích lớp vỏ bào tử của B anthracis thấy rằng nó chứa ít nhất 12 loại protein chính Một trong những protein nổi bật nhất trong số đó đợc đặt tên là

BclA (Bacillus collagen like protein of anthracis) đợc mã hóa bởi gen bclA [3]

BclA có tính glycosyl hóa cao, là kháng nguyên bề mặt của bào tử và đợc biểu hiện là thành phần cấu trúc của các sợi ở lớp vỏ bào tử BclA đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ bào tử vi khuẩn than khỏi tác động của các yếu tố bất lợi

từ môi trờng Chiều dài của gen bclA ở các chủng B anthracis là khác nhau và

mã hóa protein có kích thớc khác nhau Tất cả các protein này có một vùng

Hình 3: Cấu tạo lớp vỏ bào tử B anthracis

Bào tử B anthracis

BclA Lớp vỏ bảo tử Lớp áo bảo tử Lõi bào tử

giống nh collagen là đoạn GXX lặp lại, có độ dài thay đổi từ 17 – 19 đoạn lặp lại Điều đó chỉ ra rằng chiều dài của vùng giống nh collagen là yếu tố quyết

định đến chiều dài của lớp sợi bên ngoài Trình tự giống nh collagen này khá hiếm ở vi sinh vật nhng đã đợc xác định trong một số vi khuẩn và virus

Hiện nay, đã có một số protein đợc phân lập từ lớp vỏ bào tử của vi khuẩn

B anthracis Alanin racemase và nucleotide nuclease đã đợc xác định và phân lập, cũng nh các thành phần của CotY và ExsY Lớp protein S cũng đã đợc tìm thấy trên vỏ bào tử nhng nhiều khả năng lớp protein S này là lớp tạp Protein

BxpB cũng đợc tìm thấy trong lớp vỏ bào tử của B anthracis BxpB/ExsF, ExsY

và BclA đều đợc tìm thấy trong nhóm protein có khối lợng phân tử khoảng 250kDa Một protein khác là ExsK, ExsH cũng đợc tìm thấy trong lớp vỏ bào tử

của B anthracis và protein này không xuất hiện trong lớp vỏ bào tử của B

C ereus B thuringiensis , [14] Vỏ bào tử B anthracis còn chứa arginase có thể

cạnh tranh với các đại thực bào, hạn chế khả năng các đại thực bào có thể tạo thành NO và các gốc tự do tấn công tế bào đang nẩy mầm

Quan sát dới kính hiển vi điện tử thì lớp vỏ bào tử này gồm một lớp cơ bản là paracrystalline với cấu trúc mạng tinh thể hình lục giác [7] BxpB cùng với

BxpA, BxpC và ExsK đều đợc dự đoán là các protein của lớp cơ bản bxpB mã

hóa cho một protein có khối lợng khoảng 17 kDa Protein này hình thành nênliên kết cộng hóa trị bền vững với BclA và lớp cơ bản bao gồm cả ExsY và CotY

Gần đây, một glycoprotein bào tử giống nh một collagen thứ hai đã đợc

xác định ở B anthracis Glycoprotein mới này có tên là BclB (Bacillus collagen

like protein B) [14] Khác với các glycoprotein khác của vỏ bào tử, các yếu tố tạo

ra gen bclB đợc dự đoán là đợc hình thành từ một liên kết chéo độc đáo giữa các gen exsH hoặc gen exsJ có nguồn gốc từ B cereus hoặc B thuringenesis ExsJ và ExsH, đều đợc tìm thấy ở B cereus và B thuringenesis nhng không tìm thấy ở B anthracis ExsJ có chứa rhamnose, galactosamin và một đờng thức

3 cha xác định ExsH có một vùng giống collagen đợc lặp lại, tơng tự nh ExsJ, nhng các thành phần cacbonhydrate cha đợc xác định

BclC có vùng CL duy nhất, đợc đặc trng bởi tần xuất bộ ba GXT lặp lại thấp hơn và bộ ba GXQ đợc lặp lại nhiều, đặc điểm này không tìm thấy trong

các Bcls khác Những khác biệt này cung cấp một cơ sở để bổ sung thêm cho sự khác biệt giữa các Bcls Ví dụ BclD và BclE có sự thống nhất trong chuỗi CTD cao tuy nhiên vùng CL của BclE có chứa các bộ ba GST, GET, GNT,GTT, GGT, GMT, GSA, GSI, GSM, GNM, GPM, GDT, và GVS mà vùng CL của BclD không

có [24]

Một thành phần chính của lớp vỏ bào tử là lớp tóc mà thành phần chủ yếu

là BclA Nếu cắt bỏ vùng CLR (collagen like region) của BclA dẫn đến sự giảm - kích thớc của lớp sợi bên ngoài vỏ bào tử Các protein của lớp tóc này là thành phần đầu tiên của bào tử tơng tác trực tiếp với hệ thống miễn dịch trong cơ thể vật chủ Chiều dài của lớp tóc này khác nhau giữa các các loài thậm chí giữa chủng này với chủng khác.[6]

1.4 Protein BclA

Cấu trúc Protein BclA bao gồm 3 vùng:

Vùng tận cùng N (NTD: N-terminal domain) chứa 35 amino acid vùng này

đợc nằm bên trong lớp cơ bản của vỏ bào tử [11]

Vùng colagen like (CLR) giống nh colagen bên trong là vùng kỵ nớc gồm 70 bộ 3 lặp lại (GXX) và 54 GPT (glycin, proline và threonine) và với

khoảng 41 đến 232 amino acid đợc lặp lại của bộ ((GPT)5GDTGTT)2 đây là

đoạn lặp đặc trng của BclA, đoạn lặp này có thể dài ngắn khác nhau giữa các

nòi của chủng B anthracis.[16]

Vùng đầu tận cùng C (CTD: C-Teminal Domain gồm 134 amino acid ) hình thành cấu trúc xoắn bậc 3 tơng đối bền vững với điều kiện nhiệt độ, vùng này nằm ngoài bề mặt bào tử là một phần quan trọng của BclA Protein BclA chiếm phần lớn bên ngoài vỏ bào tử, nh là lá chắn vững chắc bao bọc xung quanh bào tử Vùng CTD là vùng có khả năng kháng nhiều loại protease và dễ dàng hình thành các tấm tinh thể lớn Cấu trúc vùng CTD bao gồm nhiều sợi beta xếp lại với nhau.[11]

Hai liên kết O – oligosaccharides, một tetrasaccharide 715 kDa và một disaccharide 324kDa giữa bào tử và vỏ bào tử có liên quan tới BclA sau khi đợc

xử lý bằng hydrazynolysis Mỗi oligosaccharide có thể đợc gắn với BclA bằng liên kết GalNAc Tetraccharide đợc tìm thấy trong nhiều dạng của vùng giống collagen ở BclA và disaccharide có thể đợc gắn bên ngoài vùng này Disaccharide bao gồm một lợng rhamnose và một thành phần đợc xác định 3 – O – methyl – rhamnose Tetrasaccharide là 2-O-methyl- - -4 (3 hydroxy-3-methyl-butamido)-4,6 dideoxy β D- - - -glucopyranosyl-(1→ - -L-3) α

rhamnopyransol-(1→ - -L-3) α rhamnopyranosyl-(1→ -L-rhamnopyranose 2)

Đờng tận cùng này đợc gọi là anthrose Một nửa đờng anthrose của BclA

không tìm thấy trong các thành viên khác của chủng B cereus mặc dù chúng đều

có chứa protein BclA.[10,12]

1.5 Phân lập và biểu hiện gen

Kỹ thuật di truyền bao gồm rất nhiều thao tác trên vật liệu di truyền nh: phân lập gen, tạo chủng tái tổ hợp, biểu hiện dòng gen,… Muốn biểu hiện một gen nào đó trớc hết gen này phải đợc tách dòng (phân lập)

I.5.1.1 Tách dòng gen bằng phơng pháp thiết lập ngân hàng gen

Đặc trng trong cấu trúc genome của vi sinh vật nhân sơ gồm các gen mã hóa liên tục không phân đoạn, còn ở sinh vật nhân chuẩn gen cấu trúc là những vùng mã hóa (exon) nằm xen kẽ với vùng không mã hóa (intron) Do đó để phân lập gen từ vi sinh vật nhân sơ hay sinh vật nhân chuẩn ngời ta phải sử dụng các phơng pháp khác nhau để tạo ngân hàng gen

Với sinh vật nhân sơ thì nguyên tắc chung của lập ngân hàng gen là DNA genome đợc cắt bằng enzyme hạn chế để tạo ra các đoạn có kích thớc nhỏ và sau đó các đoạn nhỏ này đợc đa vào vector Các vector mang đoạn DNA đích

đợc nhận biết, tách chiết và xác định đặc điểm Còn với sinh vật nhân chuẩn: Nếu gen phân lập là gen điều khiển sự biểu hiện thì quá trình tạo ngân hàng gen

đợc tiến hành tơng tự nh đối với sinh vật nhân sơ Nếu gen quan tâm là gen cấu trúc thì quá trình tạo ngân hàng gen bắt buộc phải thông qua mRNA

Sau khi có ngân hàng gen, quá trình phân lập có thể đợc tiến hành theo nhiều cách khác nhau nh: lai DNA, phân tích miễn dịch, phân tích dựa vào hoạt tính của enzyme,…

1.5.1.2 Phân lập gen bằng kỹ thuật PCR

Phơng pháp phân lập gen thông qua kỹ thuật PCR tuy ra đời sau nhng tiện lợi, dễ thực hiện dựa trên cơ sở thông tin về gen đã đợc công bố trên các ngân hàng dữ liệu Đối với gen có nguồn gốc từ sinh vật nhân sơ thì việc phân lập bắt đầu từ DNA genome, còn đối với sinh vật nhân chuẩn việc phân lập bắt đầu

từ ngân hàng cDNA

PCR là một phản ứng sinh hóa phụ thuộc vào nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của quá trình sao chép DNA với sự tham gia của một loại DNA polymerase chịu nhiệt, có hai đoạn ngắn nucleotid, một sợi làm mồi và dùng các đoạn DNA mạch

đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi mới bổ sung với nó Muốn khởi đầu quá trình tổng hợp DNA cần cung cấp các đoạn mồi nucleotid Đoạn này gắn với DNA khuôn tại điểm khởi đầu sao chép và đợc DNA polymerase điều khiển để tổng hợp nên một sợi DNA đặc thù Các sợi DNA mạch đơn làm khuôn đợc tạo theo cách đơn giản là nâng nhiệt độ lên đến 90oC để chuỗi xoắn kép tách nhau ra Cả

2 sợi DNA đều đợc dùng làm khuôn cho quá trình tổng hợp Trong kỹ thuật

này, các đoạn mồi đợc chọn nằm ở 2 đầu đoạn DNA cần nhân lên, sao cho các sợi DNA tổng hợp mới đợc bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia Kết quả cho sản phẩm có độ dài nằm giữa hai đoạn mồi này Độ dài của sản phẩm PCR có thể từ vài trăm cho đến hàng ngàn, thậm chí hàng chục ngàn cặp nucleotide Nh vậy sau mỗi chu kỳ, các điểm bám cho các

đoạn mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi DNA mới đợc tổng hợp Hỗn hợp phản ứng lại đợc nâng nhiệt độ lên thích hợp sao cho các sợi ban đầu tách khỏi sợi mới tổng hợp Các sợi này sau đó đợc dùng làm khuôn cho chu kỳ tiếp theo, bao gồm các bớc: gắn mồi, tổng hợp DNA và tách rời các đoạn Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ, tính theo lý thuyết ta sẽ có 2n bản sao các phân tử DNA mạch kép nằm giữa hai đoạn mồi

Hiện nay do những u điểm trong nghiên cứu sinh học phân tử, nên kỹ thuật PCR đang đợc ứng dụng khá rộng rãi ở các phòng thí nghiệm trên thế giới

Do đó chúng tôi sử dụng kỹ thuật này để phân lập gen bclA từ DNA hệ gen của

B anthracis Sau khi thu đợc sản phẩm PCR, chúng tôi sử dụng vector pUC18

để tách dòng gen

1.5.2 Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp

Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp thực hiện bằng 2 phơng pháp: chọn lọc theo phản ứng cơ chất (X-gal) nhằm loại trừ những vi khuẩn biến nạp chứa vector không mang gen ngoại lai với vector tái tổ hợp mang gen và chọn lọc theo áp lực kháng sinh chọn lọc (ampicillin hoặc kanamycin) nhằm loại trừ những vi khuẩn nhiễm tạp không mang plasmid

1.5.2.1 Chọn lọc theo cơ chế X- gal

Chủng vi khuẩn E coli DH5α sử dụng trong tách dòng gen, đây là một

chủng đã đợc cải biến di truyền bằng cách gây đột biến mất đoạn trong vùng mã hóa tiểu phần α trong gen LacZ mã hóa cho β-galactosidase Vì thế chủng này không có khả năng tổng hợp đợc galactosidase hoàn chỉnh Trong vector tách β-dòng pUC18 đợc thiết kế mang đoạn gen mã hóa tiểu phần α của β-galactosidase Cho nên khi không có gen ngoại lai chèn vào vùng đa nối trong

đoạn gen LacZ trên plasmid thì tiểu phần sẽ đợc plasmid tổng hợp, tiểu phần α này kết hợp với 3 tiểu phần đợc tổng hợp sẵn trong tế bào chủ tạo thành β-

galactosidase hoàn chỉnh Enzyme phân hủy cơ chất X gal có trong môi trờng tạo nên dẫn xuất indol, dẫn uất bị oxy hóa chuyển sang mầu xanh Nếu có đoạn xDNA ngoại lai chèn vào giữa gen LacZ thì gen này bị bất hoạt, galactosidase β-

-sẽ không hoàn chỉnh, vì thế mặc dù trong môi trờng có X gal nhng không bị phân hủy, không tạo dẫn xuất indol và khuẩn lạc có mầu trắng hoặc trắng ngà

-1.5.2.2 Theo cơ chế kháng sinh

Trên các plasmid đợc thiết kế các gen kháng sinh vì thế khi xâm nhập vào

tế bào vi khuẩn, giúp vi khuẩn chủ có khả năng sinh trởng trên môi trờng kháng sinh Còn các tế bào vi khuẩn không chứa plasmid sẽ không có khả năng kháng kháng sinh nên không sinh trởng trên môi trờng có bổ sung ampicillin Dựa trên nguyên lý đó, ta có thể dễ dàng loại trừ các dòng tế bào sau biến nạp không chứa plasmid trên môi trờng bổ sung ampicillin

1.5.3 Biểu hiện gen

Để biểu hiện bất cứ một gen nào cũng đòi hỏi phải giải quyết hàng loạt các vấn đề nhằm đạt đợc mức độ biểu hiện tối u Cho đến nay vấn đề biểu hiện gen ngoại lai vẫn còn mang tính chất thực nghiệm đối với từng gen mà cha có quy luật chung cho phép biểu hiện tối u với tất cả các loại protein khác nhau trong

một hệ biểu hiện Các nhóm tế bào có thể sử dụng cho biểu hiện gen là E coli,

Bacillus, nấm men và tế bào động vật Đồng thời khi nghiên cứu ngời ta cũng chia protein thành các nhóm tơng ứng có thể biểu hiện tối u trong từng hệ biểu hiện

Hầu hết các protein đều có thể biểu hiện ở trong tế bào E coli nếu protein không quá nhỏ hoặc quá lớn, hoặc quá kị nớc, hoặc chứa quá nhiều gốc cystein

Các đoạn peptid nhỏ muốn biểu hiện tốt trong E coli thì nên gắn thêm một đoạn

peptid khác, đoạn peptid này có thể dùng cho việc tinh sạch hoặc biểu hiện protein ban đầu ở dạng protein dung hợp

1.5.3.1 Đại cơng về hệ biểu hiện trong E coli

E coli là vi khuẩn Gram âm có một nhiễm sắc thể nằm trong vùng nhân có chiều dài khoảng 46000 kb mã hóa cho khoảng 3000 loại protein khác nhau ở

điều kiện tối u, trung bình 22 phút E coli phân chia một lần và sau 24 giờ, từ

nghiệm tách dòng và biểu hiện gen vì chúng dễ nuôi cấy, phân chia tế bào nhanh

và chấp nhận nhiều loại vector E coli đợc các nhà di truyền vi sinh vật nghiên cứu rất kỹ về các đặc điểm di truyền của nó làm cơ sở khoa học cho ứng dụng kỹ

thuật di truyền hiện đại trong công tác tạo chủng Các chủng E coli này có đặc

điểm chung là đã bị biến đổi về mặt di truyền nên hầu nh không có khả năng gây bệnh cho ngời và động vật

Vector dùng để biểu hiện ở E coli đợc thiết kế đầy đủ gồm tập hợp các nhân tố di truyền đợc sắp xếp hợp lý nhằm điều khiển tối u cho cả quá trình phiên mã, dịch mã tổng hợp nên protein từ gen ngoại lai Ngoài ra vector còn chứa gen mã hóa cho protein có chức năng làm dấu chuẩn chọn lọc Các gen chọn lọc thờng đợc sử dụng trong vector biểu hiện là gen kháng kháng sinh Các gen này cho phép nhận biết các dòng tế bào mang plasmid Đối với plasmid

tự sao chép thì một trình tự không thể thiếu đợc là điểm khởi đầu sao chép

Điểm khởi đầu sao chép quyết định số lợng bản copy của plasmid trong một tế bào Để tạo điều kiện cho việc đa đoạn gen ngoại lai vào vector biểu hiện, trên vector biểu hiện còn đợc thiết kế vùng đa nối mang trình tự nhận biết của các enzyme cắt hạn chế Cấu trúc cụ thể của vector nh sau:

- Promoter: có nhiều loại promoter khác nhau đợc sử dụng để biểu hiện trong E

coli Hầu hết những promoter có khả năng biểu hiện gen cao có những đặc điểm chung sau:

+ Là promoter mạnh, có khả năng tạo ra lợng protein ngoại lai lớn hơn 10 – 30% protein tổng số của tế bào

+ Chỉ hoạt động phiên mã gen ở mức độ cơ sở (phiên mã khi không cảm ứng) với mức độ nhỏ Promoter bị ức chế cao khi không đợc cảm ứng là điều kiện quan trọng để biểu hiện các protein độc hoặc có hại đối với sự sinh trởng của tế bào + Đợc cảm ứng theo cách đơn giản nhng hiệu quả cao Việc cảm ứng bằng nhiệt hoặc bằng hóa chất thờng đợc sử dụng rộng rãi để tạo ra lợng lớn protein mong muốn Chất cảm ứng đợc sử dụng rộng rãi để cảm ứng hiệu quả cho promoter là Isopropyl – – α D thiogalacpiranoside (IPTG)

Những thập kỷ trớc đây, các nghiên cứu đã sử dụng promoter từ operon

lac hoặc tryptophan, nhng có một số trở ngại nh: hiếm khi tạo đợc ra lợng

lớn protein ngoại lai và gặp khó khăn khi biểu hiện một số protein độc đối với tế bào,… Hiện nay promoter đợc sử dụng chủ yếu để biểu hiện gen mã hóa cho

các protein không gây độc cho tế bào E coli là T7 – promoter Đây là promoter

có nguồn gốc từ bacteriophage T7 xâm nhập vào tế bào vi khuẩn polymerase của bacteriophage T7 rất đặc hiệu đối với các promoter trên phân tử DNA của T7, T7 RNA polymerase có khả năng sao chép hoàn toàn trên bất kỳ một trình tự DNA đặt dới sự kiểm soát của promoter này Là một enzyme hoạt

RNA-động rất mạnh, T7 – RNA polymerase có khả năng kéo dài sợi nhanh gấp 5 lần

enzyme RNA – polymerase khác ở E coli.

- Vùng kết thúc phiên mã (Terminator): Quá trình phiên mã đợc bắt đầu

từ promoter, sau đó sợi mRNA đợc kéo dài cho đến khi gặp một trình tự đặc hiệu, tại đó quá trình phiên mã dừng lại Trình tự đặc hiệu đó là vùng kết thúc phiên mã Có hai cơ chế ngừng phiên mã là: cơ chế làm giảm tốc độ phiên mã và cơ chế dừng không đặc hiệu Vị trí giảm phiên mã (attenuator) mang đặc điểm của một vùng kêt thúc phiên mã đơn giản, đợc gắn giữa promoter và gen cấu trúc đầu tiên trong một operon Vì vị trí giảm phiên mã là yếu tố điều khiển âm nên thờng không sử dụng trong hệ biểu hiện Quá trình dừng phiên mã không

đặc hiệu có thể xuất hiện bất kỳ trong một quá trình phiên mã nào do có chứa trình tự trên mRNA giống với trình tự của vùng kết thúc phiên mã một cách ngẫu nhiên Các yếu tố chống lại sự dừng phiên mã cũng đợc đa vào vector biểu hiện để chắc chắn đoạn mRNA có độ dài đầy đủ Nhìn chung, để quá trình này diễn ra thì cần phải có nhân tố khác của chủng chủ (ví dụ protein Q, N của Bacteriophage, protein NusA của E coli) và một vị trí đặc hiệu tại đó polymerase

bị thay đổi Quá trình dừng phiên mã có sự tham gia của nhiều yếu tố nh: trình

tự DNA, cấu trúc bậc hai của RNA vừa đợc tổng hợp hoặc một số nhân tố trong

tế bào chủ nh P, NusA, NusB

- Trình tự peptid tín hiệu: để protein ngoại lai đợc tiết ra khoang chu chất của tế bào, chuỗi polypeptide phải có trình tự peptid tín hiệu nằm ở tận cùng đầu N trên phân tử protein Thông thờng trình tự peptid tín hiệu đợc cấu tạo gồm ba vùng là: vùng tận cùng đầu N, vùng tận cùng đầu C và vùng kị nớc Mỗi vùng có tối

đa 20 acid amine và tối thiểu 2 acid amin đối với vùng N, 8 acid amine đối với

Trên vector biểu hiện, ngời ta thờng thiết kế chuỗi peptid tín hiệu nằm ngay sau vùng RBS (Ribosome binding site) và tiếp đó là trình tự vùng cắt gắn đa

vị để đa gen quan tâm vào vector Một số đoạn trình tự peptid đợc sử dụng rộng rãi để có thể vận chuyển hiệu quả chuỗi polypeptide ngoại lai qua màng trong tế bào là OmpT, OmpA, pelB, β-lactamaza, alkalinphosphatase Các peptid tín hiệu thờng đợc thiết kế sẵn trong vector biểu hiện nhằm đảm bảo cho nó gắn đợc với đầu N của protein quan tâm Tuy nhiên, một số trờng hợp vẫn xảy

ra hiện tợng chuỗi peptid bị mắc trong khi vận chuyển qua màng và bị protease phân hủy

- Vị trí khởi đầu sao chép (Ori): số lợng bản sao của plasmid trong tế bào phụ thuộc vào nhân tố khởi đầu của sự sao chép DNA tại một vị trí đặc hiệu gọi là tâm sao chép Đối với các plasmid sao chép tự do trong tế bào chủ thì số lợng bản sao ít cũng bị ảnh hởng tới tốc độ sinh trởng của tế bào Những plasmid đa phiên bản thờng bị mất đi qua các thế hệ tế bào ( 10-5 – 10-6 trên một thế hệ) khi tế bào mang plasmid nuôi cấy trong môi trờng không có áp lực chọn lọc hoặc gen trên plasmid mã hóa cho protein gây độc cho tế bào

- Dấu chuẩn chọn lọc: để dễ dàng nhận ra các tế bào có mang plasmid, thông thờng ngời ta sử dụng môi trờng nuôi cấy ở đó chỉ có tế bào mang các tính trạng nhất định mới có thể sinh trởng đợc Trong thực tế đã sử dụng bốn cách phân biệt các tế bào, đó là: cách thông thờng nhất là đa các đoạn gen kháng chất kháng sinh vào plasmid, hoặc sử dụng cơ chế “tự sát” đối với tế bào không chứa plasmid, hoặc đa vào plasmid các locus phân chia, hoặc làm bất động tế bào

- Vùng cắt gắn đa vị (Multicloning site): vùng đa nối bao gồm các trình tự của các enzyme hạn chế thông thờng giúp cho quá trình đa đoạn gen ngoại lai vào vector biểu hiện trở nên dễ dàng Hầu hết các trình tự của enzyme hạn chế đều

đợc đặt theo đúng khung đọc và nằm đoạn sau đoạn peptid tín hiệu (signal peptid) Muốn thuận lợi cho việc ghép nối các đoạn gen cần biểu hiện, các điểm nhận biết của các enzyme hạn chế trong vùng đa nối đợc thiết kế sao cho chúng chỉ tồn tại nh những vị trí duy nhất trên toàn bộ phân tử plasmid

1.5 3.2 Vector biểu hiện pET32a

pET 32 đợc thiết kế cho việc tách dòng và biểu hiện bậc cao của chuỗi peptid kết hợp với đuôi Trx.Tag gồm 109 acid amin thioredoxin protein Vector này có một số đặc điểm:

- Vùng đa nối của vector này chứa nhiều điểm nhận biết duy nhất của các enzyme hạn chế thích hợp

- Gen ngoại lai đợc điều khiển bởi promoter T7, là một promoter mạnh và

có tính đặc hiệu cao

- Quá trình phiên mã đợc điều hòa bởi lac operator có cơ chế cảm ứng đơn

giản nhng hiệu quả

- Trớc vùng đa nối có chứa trình tự mã hóa cho protein Thioredoxin nên protein tái tổ hợp tạo ra đợc dung hợp với Thioredoxin nhằm tăng cờng tính tan, đảm bảo sự hình thành cấu trúc không gian đúng của protein đích

- Sau vùng đa nối có chứa trình tự mã hóa cho 6 acid amin Histidine tích

điện âm gọi là đuôi His-tag Vì vậy, protein tái tổ hợp tạo ra đợc tinh sạch

dễ dàng nhờ đoạn His-tag dung hợp với protein đích

Hình 5: Sơ đồ vector pET32a(+)

1.5 4 Chủng biểu hiện E coli BL21

Một vấn đề khó khăn khi biểu hiện những protein ngoại lai ở E coli là các

protein này sau khi đợc tạo ra bị cắt bởi một số loại protease nội bào Hiện nay

có nhiều biện pháp để giải quyết vấn đề này nh: để protein có thể tiết ra ngoài bằng cách dùng đoạn tín hiệu tiết Tuy nhiên không phải lúc nào cũng thực hiện

đợc biện pháp đó Do vậy hiện nay ngời ta sử dụng biện pháp phổ biến là tạo ra các chủng biểu hiện mang các gen đột biến mã hóa cho các protease Chủng biểu

hiện E coli BL21 là một chủng đột biến nh vậy Tế bào E coli BL21 chứa lon

protease (một protein nội bào) và ompT protease (một protease định khu ở màng ngoài) đã bị đột biến không còn khả năng thủy phân protein

Ngoài các đặc điểm trên thì DNA genome của E coli BL21 còn chứa gen mã hóa cho T7-RNA polymerase Đây là gen có nguồn gốc từ bacteriophage T7

đợc đa vào genome của E coli BL21 đặt dới sự điều khiển của promoter lac

Chính trên cơ sở những cải biến này mà E coli BL21 đã trở thành vật chủ hữu

hiệu trong việc biểu hiện gen ngoại lai, đặc biệt là những gen đợc đa vào hệ vector pET đã đợc trình bày ở phần trên

Chơng II Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu

2.1.1 Các chủng vi sinh vật và plasmid

Vi sinh vật:

Chủng Bacillus anthracis do iện H57 cung cấp V

Chủng E coli DH5α end AI rec AI hsd R17 sup E44 gyp A96 thi-I relAI [ ∆

lac U196 (φ80 lac ZM15)] đợc sử dụng làm chủng chủ cho tách dòng gen

Chủng E coli BL21 [F- ompT hsd SB (rBmB) gel dmc (DE3) plysS (Caml)]

đợc sử dụng làm chủng biểu hiện gen

Plasmid:

pET32a(+) sử dụng làm vector tách dòng và biểu hiện trong tế bào E coli DH5α, và E coli BL21

2.1.2 Hóa chất và enzyme

Hóa chất: SDS (Pharmacia, Mỹ), Tris (Merck, Đức),EDTA (Pharmacia, Mỹ), X – gal (Sigma, Mỹ), phenol (Sigma, Mỹ), isoamyalchohol (Merck, Đức), EtBr, glycerol, IPTG (Sigma, Mỹ), ethanol (Merck, Đức), chloroform (Merck,

Đức), agar (Merck, Đức), ampicillin (Pháp), agarose (Gibco, Mỹ), bộ tinh sạch DNA từ gel agarose

Enzyme: Các enzyme hạn chế (BioLabs, Mỹ), Taq DNA – polymerase (Rorch, Mỹ), ribonuclease (MBI, Đức), T4 DNA – ligase (BioLabs, Mỹ)

2.1.3 Thiết bị nghiên cứu

- Bộ điện di (Bio-Rad Mỹ và Pharmacia Biotech - Thụy Điển); Đèn soi -

UV (Bio-Rad Mỹ); Máy li tâm lạnh (Sorvall - Mỹ); Lò vi sóng (Nhật); -

Tủ lạnh (Nhật); Tủ hốt hoá chất (Đức); Tủ hốt vô trùng (Đức); Máy khuấy từ (Bio-Rad Mỹ); Máy định lợng DNA (GeneQuant Pro - Anh); máy lắc (Nhật); Máy ổn nhiệt (Grant - Anh); Máy PCR (Đức, Mỹ)

- Bộ pipetman 1000 l, 200 à àl, 100 àl, 20 l, 10 à àl

- Các thiết bị trong phòng thí nghiệm khác nh: ống eppendorf, bình tam giác, đầu côn các loại, găng tay, ống đong, cốc thuỷ tinh (Đức)

2.1.4 Các môi trờng và dung dịch

Môi trờng nuôi cấy:

Môi trờng LB : Cao nấm men 0,5%; bacto trypton 1%; NaCl 1%

Môi trờng chọn lọc LB + ampi: Môi trờng LB có bổ sung 100 gà /ml ampiciline

Môi trờng LB đặc: môi trờng LB có bổ sung 1,5% agar

Môi trờng chọn lọc: môi trờng LB + ampi đặc

Tris – base : 24,2%

Acetic acid: 5,71ml EDTA 0,5M, pH= 8: 10ml

- Đệm tra mẫu (5 X ):

Bromophenol blue: 0,25%

Xylen cyanol FF: 0,25%

Glycerol: 30%

- Dung dịch ethidium bromide (EtBr): 0,5àg/ml

- Chuẩn bị đệm điện di protein

+ Mono solution:

Acrylamid/Bis acrylamid (29:1) Acrylamid 29g + 1g Bis-acrylamid pha trong

100 ml H2O khử ion

* Hóa chất tách chiết DNA

- PBS (Phosphate buffer saline) 137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 10 mM

- Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol (25:24:1) (Sigma - Mỹ)

- Chloroform : Isoamylalcohol (24:1) (Sigma - Mỹ)

- SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) (Sigma - Mỹ)

- Proteinase K (Sigma - Mỹ)

Pha trong 800 ml nớc cất, chỉnh

pH 7,4 với HCl, thêm nớc cất tới 1 lít

- Sodium acetate 3 M (Sigma - Mỹ)

dGTP) Pha từ dung dịch gốc 100 mM (Pharmacia - Thuỵ Điển)

* Taq - DNA polymerase

* Mồi của 2 locus gen D5S818 và D7S820

* Nớc cất khử ion và vô trùng

- Hóa chất dùng cho điện di

* Đệm dùng cho điện di 5X TBE : 450 mM Tris – Borate; 1 mM EDTA+ Cách pha:

- Tris base (MW 121,1): 54 g

Boric acid (MW82,04): 27,5 g

- EDTA 0,5 M ( pH 8,0): 20 ml

+ Agarose 2% ( Pha trong 1X TBE ) (Promega - Mỹ)

+ Acrylamide (Pharmacia - Thuỵ Điển)

+ N'-N methylene bis acrylamide (Pharmacia - Thuỵ Điển)

-+ APS (Sigma - Mỹ)

+ TEMED (Bio-Rad - Mỹ)

2 2 Phơng pháp nghiên cứu

2.2.1 Tách chiết DNA genome của vi khuẩn

Màng tế bào vi khuẩn B anthracis đợc phá vỡ bằng lysozym Proteinase

K có vai trò thủy phân protein bám DNA và protein nội bào Mảnh vỡ tế bào và protein biến tính đợc loại bỏ bằng phenol:chloroform:isoamyalcohol (25:24:1) sau đó ly tâm 13000 v/phút DNA hệ gen ở pha trên đợc hút chuyển sang ống

 Thêm nớc cất tới 1000 ml Khi dùng pha thành 1X TBE để chuẩn bị gel và chạy điện di

eppendorf mới và đợc tủa bằng 2 lần thể tích cồn tuyệt đối DNA đợc hoà và bảo quản trong đệm TE

- Chọn khuẩn lạc đơn tế bào B anthracis cấy vào 5 ml môi trờng LB lỏng, nuôi ở 37oC trên máy lắc 200 vòng/phút qua đêm

- Hút 2ml dịch tế bào vào ống eppendorf 2 ml, ly tâm tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút, thu tế bào

- Hòa tế bào vào 1ml đệm Tris 100 mM; EDTA 50 mM có bổ sung 100àg/ml RNase và 2 mg/ml lysozyme để phá vỡ cấu trúc peptidoglycane ở màng tế bào vi khuẩn Hỗn hợp đợc ủ ở 37oC trong 1 giờ

- Bổ sung 100 àg proteinase K vào hỗn hợp và đợc ủ tiếp ở 65oC trong 2 giờ

- Bổ sung 1ml phenol:chloroform:isoamylalchohol, vortex 30 giây Sau đó

ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút

- Dùng pipet hút chuyển dịch pha trên sang ống eppendorf 2ml mới Quá trình này đợc lặp đi lặp lại 2 lần để loại bỏ hoàn toàn protein có trong mẫu

- DNA hệ gen ở pha trên đợc tủa bằng 2 lần thể tích cồn tuyệt đối trong lạnh và đợc thu lại bằng cách ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút DNA đợc làm khô và hòa lại vào trong 100 l TE Lấy 3ml mẫu để chạy à

điện di kiểm tra, phần còn lại đợc giữ ở -20oC

Mồi xuôi 10 pM: 1 àl Từ bớc 2 đến bớc 4 lặp lại 30

chu kỳ

Mồi ngợc 10 pM: 1 àl Bớc 5: 72oC trong 5 phút

DNA khuôn (10 ng/àl): 1 àl Bớc 6: 4oC trong 1 giờ

Taq DNA polymerase

- Cấy chuyển 1 khuẩn lạc tế bào E coli DH5α tái tổ hợp vào 5ml môi trờng

LB trong ống nghiệm có bổ sung amp (100 àg/ml), nuôi lắc qua đêm ở

điều kiện 37oC và 200 vòng/phút

- Hút 1,5ml dịch nuôi cấy vào ống eppendorf 1,5 ml, ly tâm 6000 vòng/phút,

5 phút Loại bỏ dịch nổi, thu tế bào

- Hòa tế bào thu đợc với 100 àl dung dịch I, vortex, để ở nhiệt độ phòng 5 phút

- Bổ sung 200 àl dung dịch II, đảo nhẹ nhàng để tránh đứt gẫy DNA Hỗn dịch trở nên trong suốt và quánh, ủ trên đá 10 phút

- Bổ sung tiếp 150 l dung dịch III và đảo nhẹ, hỗn dịch xuất hiện kết tủa àtrắng, ủ trong đá 15 phút

- Bổ sung 450 àl dung dịch phenol/chloroform/isoamyalcohol, trộn bằng máy vortex

- Ly tâm 15 phút, tốc độ 13000 vòng/phút để loại protein và DNA hệ gen

- Hút pha trên chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới DNA đợc kết tủa trong hai lần thể tích ethanol 100%; ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút Làm khô tủa ở ống eppendorf bằng máy Speed – Vac, hòa tan DNA

DNA plasmid sau khi tách đợc kiểm tra điện di trên gel agarose 0,8%

2 4 2 Phản ứng nối ghép gen

Thành phẩn phản ứng:

Đoạn DNA cần nối vào vector đợc trộn với DNA vector theo tỉ lệ 3:1 Thờng phản ứng nối ghép đợc tiến hành với thể tích 15 l có thành phần nh àsau:

• Tạo tế bào khả biến

• Cấy chuyển một khuẩn lạc E coli DH5α vào 5 ml môi trờng LB lỏng, nuôi ở 37oC trên máy lắc 200 vòng/phút qua đêm đến pha ổn

định

• Hút 2 ml dịch tế bào huyền phù sang 200 ml môi trờng LB mới, tiếp tục nuôi cấy ở 37oC, trên máy lắc 200 vòng/phút khoảng 2 giờ, cho tới khi OD600 đạt 0,6 Sau đó lấy mẫu ra và đặt lên đá lạnh khoảng 1 giờ Từ bớc này tất cả các thao tác đều tiến hành ở 4oC

• Ly tâm 5000 vòng/phút ở 4oC trong 5 phút