Trong các chơng trình về VKSH vi khuẩn gây bệnh than Bacillus anthracis l à tác nhân sinh học thờng đựơc sử dụng nhiều nhất vì: trực khuẩn B.. Do yêu cầu trong đấu tranh phòng chống kh
Bộ giáo dục đào tạo Trờng đại học bách khoa hà nội Phùng Huyền nhung Nghiên cứu tách dòng vµ biĨu hiƯn gen m· hãa protein BclA cđa vá bào tử vi khuẩn Bacillus anthracis Luận văn thạc sỹ khoa học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giáo viên híng dÉn Tr¬ng Qc Phong HÀ NỘI, 2012 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17061131527691000000 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT aa Amp APS BclA bp BSA CLR CTD DNA dNTP EF EDTA EtBr IPTG kb kDa LB LBA LF OD PA PCR PCKB RNA SDS SDSPAGE TBE amino acid = axit amin Ampicillin Amonium persunphate Bacillus collagen like protein of anthracis Base pairs = cặp bazơ nitơ Bovine serum albumin collagen - like region C-teminal Domain Deoxyribonucleotide acid = axit deoxyribonucleotit 2’-deroxyribonucleotit 5’-triphosphate Edema Factor Ethylen diamin tetra acetic acid Ethedium bromide Isopropylthio-β-D-galactosidase Kilo base Kilo dalton Luria-betani medium Mơi trường LB có bổ sung ampicillin Lethal Factor Optimal density = mật độ quang học Protective Antigen Polymerase chain reaction = phản ứng trùng hợp chuỗi Phòng chống khủng bố Ribonucleotide acid = axit ribonucleotit Sodium dodecyl sulphate Điện di gel polyacrylamit có chứa SDS Tris-Borate- EDTA TEMED N, N, N’, N’-tetramethyl ethylenediamine trx Gen mã hóa thioredoxin A E coli thiết kế sẵn plasmid pET32a(+) TrxBclA Protein tái tổ hợp lai thioredoxin BclA tổng hợp tế bào E coli Thioredoxin mã hóa gen trx, BclA mã hóa gen BclA VKSH Vũ khí sinh học X-Gal 5- bromo- chloro-3- Indol--D-galactopyranoside Luận văn cao học Phùng Huyền Nhung Mở đầu Vũ khí sinh học (VKSH) công cụ hữu hiệu cho bọn khủng bố giới tính nguy hiểm mức độ hủy diệt mạnh chúng Việc sản xuất chế phẩm sinh học không đòi hỏi thiết bị phức tạp, có khả sản xuất số lợng lớn với đầu t dung cụ không nhiều, giá thành rẻ nhiều so với loại vũ khí khác Do vậy, bọn khủng bố dễ dàng sản xuất sử dụng loại vũ khí sinh học Thực tế cho thấy hàng loạt vụ khủng bố đà xảy giới năm gần có liên quan đến sử dụng vũ sinh học Trong chơng trình vỊ VKSH vi khn g©y bƯnh than Bacillus anthracis tác nhân sinh học thờng đựơc sử dụng nhiều vì: trực khuẩn B anthracis tồn tự nhiên dới dạng bào tử thời gian 10 năm, chúng có khả chịu nhiệt lên đến 160oC vµ 100oC 10 Ngêi bị nnhiễm bệnh than qua đờng: qua da, đờng tiêu hoá đờng hô hấp Bào tử B anthracis bị hít vào qua mũi chúng có khả tới phế nang để gây bệnh than thể hô hấp c trú phế bào phế nang, qua hệ thống mạch bạch huyết chuyển tới hạch lympho trung thất Tại đó, vi khuẩn gây bệnh than sinh trởng xâm nhập theo đờng máu gây nhiễm khuẩn huyết nhiễm khuẩn nhiều nơi thể gây tỷ lệ tử vong cao Trớc đây, việc xác định B anthracis phòng thí nghiệm chủ yếu dựa vào hình thái học đặc điểm sinh học Sau đó, B anthracis đợc phát thông qua DNA kỹ thuật nhân bội PCR, kỹ thuật có khả phát nhanh so với phơng pháp hình thái học ®Ỉc ®iĨm sinh hãa häc Kü tht PCR cã tÝnh chọn lọc mức độ xác cao Tuy nhiên, kỹ thuật PCR đòi hỏi phải có thiết bị chuyên dụng; thao tác phức tạp đòi hỏi cán chuyên môn có tay nghề vững vàng Do yêu cầu đấu tranh phòng chống khủng bố vũ khí sinh häc, viƯc ph¸t hiƯn nhanh 10 - 15 phút có mặt tác nhân gây bệnh nguy hiĨm nh B anthracis lµ u tè rÊt quan trọng cần thiết để giúp Luận văn cao học Phùng Huyền Nhung quan chức phòng chống khủng bố sinh học ngăn ngừa ngăn chặn kịp thời tác nhân sinh học nguy hiểm đặc biệt vi khuẩn B anthracis Do vậy, để đạt tới mục tiêu chế tạo công cụ, phơng tiện phát nhanh bào tử B anthracis đà chọn phơng án chế tạo sinh phẩm thử nhanh dựa nguyên lý sắc ký miễn dịch cho phép phát trực tiếp bào tử thông qua protein đặc trng vỏ chúng Kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên đặc hiệu vỏ bào tử B anthracis thành phần quan trọng sinh phẩm Protein BclA protein nằm bề mặt vỏ bào tử B anthracis đợc xem nh thị sinh học, kháng nguyên sở để tạo kháng thể đơn, đa dòng kháng protein vỏ bào tử B anthracis Do tiến hành thực đề tài Nghiên cứu tách dòng biểu gen mà hóa protein BclA vỏ bào tử vi khuẩn B anthracis góp phần tạo nguyên liệu cần thiết cho phát triển sinh phẩm dựa nguyên lý sắc ký miễn dịch Nội dung đề tài: + Thiết kế vector tách dòng vector biểu mang gen mà hóa cho protein vùng CTD BclA bề mặt bào tư vi khn B anthracis + BiĨu hiƯn protein BclA tái tổ hợp chủng E coli BL21 + Tinh định lợng protein BclA tái tổ hợp thu đợc Luận văn cao học Phùng Huyền Nhung Chơng I Tổng quan tài liệu I Tình hình chung vÊn ®Ị vi sinh vËt nguy hiĨm HiƯn nay, theo thống kê có 200 loại vi khuẩn, virus độc tố gây hại cho ngời qua đờng thực phẩm có khoảng 50 loại có nguồn gốc vi sinh vật đà đợc nghiên cứu, liệt kê danh mục vũ khí sinh học dùng để công khủng bố sinh học chiến tranh sinh học Các tác nhân chủ yếu chủng vi sinh vật gây bệnh có độc tố với độc lực mạnh, gây nguy hiểm cho ngời động vật, gây thảm hoạ chết hàng loạt Các tác nhân lây nhiễm qua nhiều đờng: lây nhiễm trực tiếp qua da, vết thơng, hô hấp, tiêu hoá ; phát tán nhanh diện rộng xa thông qua m«i trêng níc, kh«ng khÝ, chøa th, bu phÈm gửi qua nhiều quốc gia Các tác nhân đợc sử dụng với nhiều dạng: bột, dịch, dạng phun, dùng động vật mang bệnh, cho vào vũ khí (bom, đạn rocket, tên lửa chứa mầm bệnh, độc tố ) 1.1 Lịch sử Khủng bố sinh học từ xa xa đà đợc sử dụng trong chiến tranh La Mà cổ đại chất thải đợc sử dụng để công kẻ thù [3] Đây trờng hợp khủng bố sinh học giới đợc tiếp tục vào kỷ 14 bệnh dịch hạch đợc sử dụng để công vào thành phố kẻ thù với hy vọng họ sợ hÃi mà sơ tán đến nơi khác để tiêu diệt lực lợng bảo vệ mà không cần phải công Việc sử dụng bệnh dịch hạch nh vũ khí thời điểm cho thấy thiếu kiểm soát vũ khí sinh học bên có chứa nguồn vũ khí Y tế thời điểm khả ngăn ngừa dịch bệnh từ ngời sèng sãt tõ trËn chiÕn trë vỊ cã mang mÇm bệnh ngời, dẫn đến dịch bệnh lan rộng không khu vực kẻ thù mà ảnh hởng tới ngời dân sống vùng xung quanh Do sư dơng vị khÝ sinh häc l¹i biện pháp, phơng tiện kỹ thuật y tế cần thiết để bảo vệ khu vực nên dịch bệnh phổ biến nh bệnh dịch hạch đà lây lan nhanh chóng Châu Âu, giết chết phần lớn dân số châu lục Các nạn nhân khủng bố sinh học thực tế trở thành nguồn lây truyền bệnh nhng y học thời không đủ kỹ thuật, phơng tiện để ngăn chặn hậu khủng bố sinh học gây ra.[7] Luận văn cao học Phùng Huyền Nhung Theo thời gian, chiến tranh sinh học ngày trở nên phức tạp Các quốc gia bắt đầu phát triển vũ khí có hiệu cao khả gây nhiễm khuẩn Một biện pháp tăng cờng vũ khí sinh học sử dụng bệnh than Hiệu ban đầu sử dụng bệnh than đà kiểm soát đợc cho nạn nhân sử dụng với lợng lớn Điều đà khiến cho bệnh than đợc lựa chọn để trở thành loại vũ khí vận chuyển dễ dàng, khả sát thơng cao, dễ dàng phát tán Ngoài ra, có nhiều chủng vi khuẩn than đợc tìm thấy khắp giới nên chúng dễ dàng đợc lựa chọn vũ khí sinh học từ năm đầu kỷ 19 Một đặc điểm bệnh than để đợc lựa chọn làm vũ khí sinh học khả lây lan nhanh cộng đồng Tuy nhiên bệnh than lây nhiễm ngời với ngêi ThÕ kû 20 Khi chiÕn tranh thÕ giíi thø nổ ra, bệnh than đợc dùng để gây bệnh cho động vật nhiên hiệu không cao Ngay sau Chiến tranh giới thứ bắt đầu, Đức đà phát động chiến dịch phá hoại sinh học Mỹ, Nga, Rumania Pháp [4] Mỹ phát triển vũ khí sinh học vào năm 1942 Tổng thống Franklin D Roosevelt đặt George W Merck phụ trách đa phơng hớng phát triển cho vũ khí sinh học[8] Các chơng trình đợc kéo dài năm 1969 ®Õn tỉng thèng Richard Nixon ®ãng cưa tÊt chơng trình liên quan đến sử dụng vũ khí sinh học quân đội Mỹ [4] Tổng thống Mỹ Richard Nixon tuyên bố sách ông chiến tranh sinh học họp báo vào ngày 25/11/1969 : Vũ khí sinh học gây hậu lớn, đoán trớc có khả kiểm soát đợc Chúng tạo dịch bệnh toàn cầu ảnh hởng đến sức khỏe hệ tơng lai Do Mỹ đà định phá hủy toàn kho dự trữ tác nhân sinh học hạn chế chơng trình nghiên cứu sinh học tơng lai, bên cạnh trọng biện pháp phòng thủ nh vaccine thiết bị dò Ngày 10 tháng năm 1972, tổng thống Nixon đà thức đa Công uớc Vũ khí sinh học đợc Thợng viện Mỹ phê chuẩn Vào năm 1972, cảnh sát Chicago đà bắt giữ hai sinh viên đại học Allen Schwander Stephan Pera, ngời đà lên kế hoạch đầu độc nguồn nớc thành phố vi khuẩn thơng hàn Từ đó, nỗ lực để sử dụng chiến tranh sinh học đợc thể rõ ràng tổ chức cực Luận văn cao học Phùng Huyền Nhung đoan Năm 1984, Dallas, Oregon, Rajneeshe đà kiểm soát bầu cử địa phơng cách phát tán vi khuẩn Salmonella typhimurium Cuộc công làm 751 ngời bị ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng nhiên trờng hợp bị tử vong Đây vụ công khủng bố sinh học Mỹ kỷ 20.[26] Vào tháng năm 1993 nhóm tôn giáo Aum Shinrikyo đà phát tán vi khuẩn gây bệnh than ga tầu điện ngầm Tokyo nhng trờng hợp bị nhiễm vi khuẩn trớ trêu thay nhóm đà sử dụng vaccine ngừa bệnh than để phát tán Tuy nhiên bào tử thu đợc từ công cho thấy chúng giống với chủng vaccine ngừa bệnh than động vật thời điểm Thế kỷ 21 Trong tháng tháng 10 năm 2001, nhóm khủng bố Al-Qaeda đà chuyển th chứa trực khuẩn bệnh than tới bu điện, quan công quyền truyền thông Mỹ làm chết ngời gây hoảng loạn d luận Tác nhân sinh học Căn vào mức độ ảnh hởng , nhân tố dùng khủng bố sinh học đợc chia làm ba nhóm A, B, C Nhóm A: Bao gồm vi sinh vật độc tố có nguy cao an ninh công cộng quốc gia Chúng dễ dàng lây lan lây truyền từ ngời sang ngời dẫn đến tỉ lệ tử vong cao khả tác động đến sức khỏe cộng đồng Nó gây nên hoảng loạn cộng đồng, phá vỡ ổn định xà hội yêu cầu biện pháp đặc biệt cho bảo vệ sức khỏe cộng đồng Một số tác nhân nhóm A nh: Vi khuẩn Francisella tularensis: Bệnh sốt tularemia hay sốt thỏ vi khuẩn gây Đây vi khuẩn Gram âm, hiếu khí Bệnh không lây từ ngời sang ngời mà tiếp xúc với lông thú, qua hô hấp, uống nớc nhiễm khuẩn qua vết côn trùng cắn Vi khuẩn Francisella tularensis dễ lây nhiễm, với lợng nhỏ gây bệnh Nếu F tularensis đợc sử dụng làm vũ khí chiến tranh chúng đợc phát tán không khí Những ngời hít phải không khí bị nhiễm khuẩn thờng bị viêm đờng hô hấp Vi Luận văn cao học Phùng Huyền Nhung khuẩn đợc sử dụng làm vũ khí sinh học đặc điểm dễ lây truyền dễ sử dụng [5] Vi khn Bacillus anthracis: BƯnh than lµ bƯnh nhiƠm khuẩn cấp tính từ động vật mà chủ yếu động vật ăn cỏ lây sang ngời trực khuẩn than Bacillus anthracis gây ra, biểu lâm sàng ngời hội chứng nhiễm khuẩn, nhiễm độc toàn thân nỈng víi tØ lƯ tư vong cao Vi khn than thuộc nhóm Gram dơng, hình gậy, sinh bào tử, có sức đề kháng cao với nhân tố vật lý hóa học Vi khuẩn than gây bệnh cho động vật hoang dà động vật nhai lại Con ngời bị nhiễm mắc bệnh tiếp xúc với gia súc mắc bệnh hay với lợng lớn bào tử B anthracis phát huy độc lực cao xâm nhập vào thể qua đờng hô hấp Bệnh than không lây từ ngời sang ngời đà có vaccine Bệnh than phát sớm đợc điều trị kháng sinh [5,9,13] Virus gây bệnh đậu mùa: Bệnh đậu mùa đợc gây bëi DNA virus Variola majora Nã dƠ dµng lan trun khÝ qun vµ cã tØ lƯ tư vong rÊt cao (20 40%) Bệnh đậu mùa đà đợc diệt trừ từ năm 1970, nhờ chơng trình vaccine toàn giới Tuy nhiên, vài chủng virus tồn phòng thí nghiệm Nga Mü Mét sè tin r»ng sau sù sơp ®ỉ cđa liên bang Soviet, số chủng bệnh đậu mùa đợc cất giữ số quốc gia Mặc dù ngời sinh trớc năm 1970 đợc tiêm vaccine phòng bệnh đậu mùa theo chơng trình WHO, vaccine chØ cã hiƯu lùc kho¶ng tõ – năm [5] Bệnh đậu mùa vũ khí sinh học nguy hiểm lây lan tự nhiên cao theo đờng lây nhiễm Vi khuẩn Clostridium botulinum: Là vi khuẩn Gram dơng Emile van Ermengem phân lập vào năm 1895, sản sinh độc tố botulin (độc tố gây chết làm suy hô hấp) §éc lùc cđa botulin rÊt cao, chØ cÇn microgam hay phần triệu gam đà làm chết ngời, giọt chất độc làm chết trăm ngàn ngời Nếu quy trình chế biến bảo quản không tốt chế biến thực phẩm (nhất đồ hộp), thực phẩm bị nhiễm vi khuẩn Phơng pháp làm sôi kết hợp với điều áp diệt đợc vi khuẩn Bào tử vi khuẩn Luận văn cao học Phùng Huyền Nhung không phát triển đồ hộp có hàm lợng đờng cao nh mật ong, siro nhng có khả phát triển vào đờng tiêu hóa trẻ sơ sinh Vi khuẩn Yersinia pestis: Bệnh dịch hạch đợc g©y bëi trùc khn Gram ©m Yersinia pestis BƯnh dịch hạch đà gây đại dịch có sức tàn phá lịch sử, làm 20 30 triƯu ca tư vong thÕ kû 14 C¸c loài gặm nhấm thờng vật chủ bệnh bệnh truyền sang ngời qua vết cắn bọ chét Bệnh có lịch sử đợc sử dụng làm chiến tranh sinh học nhiều quốc gia đợc coi mối đe dọa chủng có tự nhiên có khả tồn thời gian dài vật chủ Vũ khí đe dọa đến từ chủ yếu bệnh truyền nhiễm thể phổi (lây nhiễm qua hô hấp) [25] Đây bệnh dịch gây Cái chết đen Châu Âu thời trung cổ Virus sốt xuất huyết Ebola: vius thuộc giống Ebolavirus, họ Filoviridea gây bệnh với tỷ lệ tử vong cao khả gây suy nhợc đa quan làm máu trầm trọng Bệnh lây nhiễm tiếp xúc với dịch tiết động vật bị nhiễm thể ngời bị nhiễm Bệnh cha có thuốc điều trị đặc hiệu, bệnh nhân chết cần phải hỏa táng Đây vũ khÝ sinh häc nguy hiĨm nhÊt v× bƯnh xt hiƯn nhanh, tØ lƯ tư vong cao.[5] Nhãm B: lµ nhãm đợc quan tâm thứ hai chúng tơng đối dễ lây lan, dẫn tới tỉ lệ bệnh trung bình tØ lƯ tư vong thÊp Nhãm B bao gåm c¸c tác nhân nh: vi khuẩn Brucella, sốt Q, Staphylococcal enterotoxin B, viêm nÃo virus, mầm bệnh thức ăn nớc uống, Nhóm C: tác nhân đợc nghiên cứu đợc thiết kế để lây lan hàng loạt tơng lai bới chúng có sẵn, dễ tạo lây lan có khả m¾c bƯnh cao, tØ lƯ tư vong cịng nh møc ảnh hởng tới sức khỏe nghiêm trọng Nhóm gồm tác nhân nh: Nipah virus, Hantavirus, SARS, Luận văn cao học Phùng Huyền Nhung Bảng 1: Đặc tính số tác nhân sinh học thờng lựa chọn làm vũ khí sinh học: Stt Tác nhân Phơng thức phát tán Khả Mức lây truyền độ độc Chỉ lây Bào tử dạng bột khí Anthrax (bƯnh than) trun thĨ Cao dung qua da Cholera (bƯnh tả) Trong thực phẩm khí Nhanh dung Cao Pneumonic Plague Chuột khí dung (bệnh dịch hạch) Nhanh Cao Tularemia khí dung Không Trung bình Q fever (Bệnh sốt Q) Trong thực phẩm khí Không dung Thấp Tấn công trực tiếp Có khí dung Cao ®èi víi mét sè tip Ebola virus Smallpox (bƯnh ®Ëu KhÝ dung mïa) Nhanh Cao Botulin toxin Trong thực phẩm khí Không dung Cao Ricin toxin Trong thực phẩm khí Không dung Cao 10 Dengue fever virus Mosquito bome ThÊp Nhanh T×nh h×nh an ninh giới thời gian gần có biến động lớn đặc biệt xảy vụ khủng bố quốc tế có quy mô toàn cầu ®ã cã sư