Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa protein bcla của vỏ bào tử vi khuẩn bacillus anthracis

Tách dịng biểu gen mã hóa protein BclA vỏ bào tử vi khuẩn Bacillus anthracis BỘ MÔN: KỸ THUẬT GEN GVHD: PSG.TS TRẦN LIÊN HÀ Thành viên nhóm • Nguyễn Thu Ngân 20162893 • Đào Thanh Mai 20162621 • Phan Thị Khánh Linh 20162471 NỘI DUNG Tại phải sản xuất protein BclA? Q trình tách dịng gen mã hóa BclA Biểu gen mã hóa đoạn CTD protein BclA Tại phải sản xuất protein BclA? Tại phải sản xuất protein BclA • Bệnh Than bệnh truyền nhiễm nghiêm trọng vi khuẩn gọi Bacillus anthracis gây Trong chiến coi vũ khí sinh học nhằm sát hại đến người với cách lây lan hàng loạt có khả tử vong cao không phát nhanh Vào tháng tháng 10,năm 2001, nhóm khủng bố Al Qaeda loạt thư chứa bào tử vi khuẩn bệnh than gửi tới bưu điện,cơ quan cơng quyền văn phịng truyền thông , khiến người thiệt mạng gây hoang mang dư luận • Vi khuẩn B.anthracis được Robert Koch phân lập từ năm 1877 vi khuẩn than hình thẳng, hai đầu vng, có kích thước từ 11,5 310m, thường xếp thành chuỗi giống tre, bắt màu Gram (+) Có khả tồn tự nhiên dạng bào tử thời gian 10 năm, có khả chịu nhiệt lên đến 160⁰C phút 100⁰C 10 phút Bào tử B anthracis bao gồm lớp sau: lõi (spore core), vỏ lõi (cortex), vỏ bào tử (exosporium) Lớp vỏ bên ngồi lõi peptidoglucan dày gồm nhiều loại protein khác nhau, thường chứa protein lắp ráp yếu tố quy định hình thái Lớp áo bào tử chứa protein BclA Phương pháp phát B.anthracis xác định chủ yếu dựa vào đặc điểm sinh học hình thái học Sau đó,phương pháp PCR phát nhanh , có tính chọn lọc mức độ xác cao Bộ sinh phẩm thử nhanh chế tạo cho phép xác định trực tiếp bào tử thông qua protein vỏ chúng Trong protein BclA có vùng có tên CTD:có cấu trúc bậc ổn định, nằm thị ngồi bề mặt bào tử B.anthracis, lợi để phát nhanh bào tử mà không cần tách chiết phá vỡ bào tử Q trình tách dịng biểu gen mã hóa protien BclA Biến nạp vào vi khuẩn Kiểm tra biến nạp Kiểm tra ghép nối gen • Lấy ngẫu nhiên khuẩn lạc đĩa có ampicillin, cấy chuyển vào môi trường LB lỏng + amp, nuôi qua đêm tiến hành tách plasmid • Điện di kiểm tra gel agarose thu băng DNA (vòng xoắn), cao so với mẫu đối chứng chứng tỏ có đoạn DNA ngoại lai chèn vào vector • Ủ plasmid tách với enzyme BamH I 37°C thu sản phẩm điện di gel agarose Nếu kết thu vạch vạch cao mẫu đối chúng mẫu khuẩn lạc có gen ngoại lai • Giải trình tự gen để chắn gen mã hóa vùng CTD protein BclA chèn vào trình tự Biểu gen mã hóa đoạn CTD protein BclA CÁC B Ư ỚC CỤ THỂ Vector biểu pET32a(+) • Vị trí khởi đầu chép ori • Vị trí đánh dấu • Vị trí chèn gen lạ • Vùng RBS • Vùng điều hịa E Coli Ưu điểm: dễ ni cấy, phân chia tế bào nhanh chấp nhận nhiều loại vector Nhược điểm: • Khó biểu protein > 50 kD, giàu cysteine, có nhiều S-S hay protein biến đổi cấu trúc sau dịch mã vd: trình glycosyl hóa,… • Tiết tạo protein ngoại bào tương đối thấp • Một số gây bệnh, tạo độc tố biểu gen sinh vật bậc cao • Protease nội bào phân hủy protein ngoại lai Xử lí E Coli Khả gây bệnh : biến đổi di truyền Protease phân hủy protein ngoại lai • Cho protein ngoại lai tiết ngồi cách dùng đồn tín hiệu tiết=> khơng phải lúc làm • Tạo chủng biểu mang gen đột biến mã hóa protease Chủng biểu E.coli BL21 • Là chủng đột biến gen mã hóa cho ion protease (một protein nội bào) ompT protease (một protease định khu màng ngồi) =>khơng cịn khả thủy phân protein • DNA genome chứa gen mã hóa T7-RNA polymerase-gen có nguồn gốc từ bacteriophage T7 điều khiển promotor lac Tiến hành biểu gen Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli BL21 phương pháp sốc nhiệt ( tương tự tách dòng gen) Ni cấy mơi trường LB lỏng có Ampicillin 37°C=> tăng sinh khối vi khuẩn, chọn lọc E.coli chứa plasmid Bổ sung IPTG, tiếp tục nuôi cấy điều kiện 25°C Sau ly tâm thu lấy tế bào Bố trí Tiêu đề Nội dung với Biểu đồ Chuỗi Chuỗi Chuỗi Danh mục Danh mục Danh mục Danh mục 4 Kiểm tra việc biểu hiện: Ly tâm dịch thu được, thêm nước khử ion vô trùng đệm phá mẫu protein Xử lý mẫu 100°C Điện di gel polyacrylamide Kiểm tra dạng protein: dịch thu để -72°C, sau sốc nhiệt 65°C vài phút, ly tâm thu dịch cặn tế bào cho riêng rẽ vào ống có nước khử ion vô trùng đệm phá mẫu protein, xử lý 100°C đem điện di gel polyacrylamide Tinh protein tái tổ hợp theo phương pháp sắc ký lực cột HisTrap Kiểm tra sản phẩm tinh điện di Định lượng protein tái tổ hợp phương pháp Bradford Phương pháp sắc ký lực  1 Các ion liên kết với hạt Sepharose để nhồi vào cột Protein tái tổ hợp liên kết đặc hiệu với phần tử khác rửa trôi theo dịch đệm Rửa protein tái tổ hợp tách khỏi cột nhờ dung dịch đệm có pH thích hợp Lợi ích His-tag •  giúp dễ dàng tinh • Vì kích thước nhỏ, trình tự axit amin khơng gây đáp úng miễn dịch đưa protein tái tổ hợp vào thể=> khơng cần loại His-tag sau tinh • Tương tác đuôi His-tag với không phụ thuộc cấu trúc bậc bốn protein=> trình tinh dễ dàng protein bị biến tính TÀI LIỆU THAM KHẢO German L.Rosano(4/2014), Eduardo A Ceccarelli; “Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges”; Frontiers in microbiology Khuất Hữu Thanh,(2006),” Kỹ thuật gen –Nguyên lý ứng dụng”,Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội Phùng Huyền Nhung(2012), Nghiên cứu tách dòng biểu gen mã hóa protein BclA vỏ bào tử vi khuẩn Bacillus anthracis.Luận văn thạc sỹ khoa học chuyên ngành công nghệ sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Thu Hiền1 , Hoàng Thị Thu Hiền1 , Khuất Hữu Thanh2 , Nguyễn Huy Hoàng1* 1Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam,(2013),Chọn dòng biểu gen keratinase Escheriochia coli BL21(DH3) từ vi khuẩn Bacillus , Tạp chí sinh học 2013 ... cần tách chiết phá vỡ bào tử Q trình tách dịng biểu gen mã hóa protien BclA Nghiên cứu tách dịng gen mã hóa protein BclA CÁC B Ư ỚC CỤ THỂ Tách chiết DNA genome vk Bacillus anthracis • Nuôi cấy... xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội Phùng Huyền Nhung(2012), Nghiên cứu tách dòng biểu gen mã hóa protein BclA vỏ bào tử vi khuẩn Bacillus anthracis. Luận văn thạc sỹ khoa học chuyên ngành công nghệ sinh...Thành vi? ?n nhóm • Nguyễn Thu Ngân 20162893 • Đào Thanh Mai 20162621 • Phan Thị Khánh Linh 20162471 NỘI DUNG Tại phải sản xuất protein BclA? Quá trình tách dịng gen mã hóa BclA Biểu gen mã hóa đoạn