0809 nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme dat tham gia tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn (catharanthus roseus (l) g don) luận văn tốt nghiệp

ĐẠIHỌCTHÁINGUYÊN TRƢỜNGĐẠIHỌCSƢPHẠM BÙITHỊHÀ NGHIÊNCỨUTĂNGCƢỜNGBIỂUHIỆNGENMÃH ÓA ENZYME DATTHAM GIA TỔNG HỢPALKALOIDỞCÂYDỪACẠN (Catharanthusroseus(L.)G.Don) Chuyên ngành: Di truyền họcMãsố:9420121 TÓMTẮTLUẬNNTI N SS I N H H Ọ C THÁINGUN-2017 Cơngtrìnhđượchồnthànhtại: TRƢỜNGĐẠIHỌCSƢPHẠM–ĐẠIHỌCTHINGUN Người hướngdẫnkhoahọc:1.PGS.TS.NguyễnThịTâm 2.GS.TS.ChuHoàngMậu Phảnbiện1:…………………………………………………… Phảnbiện2:…………………………………………………… Phảnbiện2:…………………………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp TrườngHọptại:TRƢỜNGĐẠIHỌCSƢPHẠM-ĐẠIHỌCTHINGUYÊN Vào hồi phút,ngày tháng năm2017 Cóthểtìmhiều luậnántại: ThưviệnQuốcgiaViệtNam Trungtâmhọc liệu -ĐạihọcTháiNgun ThưviệnTrườngĐạihọcSư phạm -ĐạihọcTháiNgun CCCƠNGTRÌNHCƠNGBỐLIÊNQUANĐNLUẬNN Cácbài báo BùiThị H ,H M n h T n g , Hoàng Phú H i ệ p , L ê V ă n Sơ n ,Nguyễ nThịTâm,ChuHồngMậu(2015),“Táchdịngphântửvàthiếtkếvectorchuyển genDATphân lập từ dừa cạn (Catharanthus roseus(L.) G.Don),T A P CHISINHHOC37(2), pp.236-243 Bùi Thị Hà, Trần Thị Anh, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2015),“Nghiên cứu hệ thống tái sinh đa chồiin vitroở dừa cạn (Catharanthusroseus(L.).G.Don)”,Tạp chí KHĐHQGHN Khoa học Tự nhiên cơngnghệ,Tập 31, sơ4S , tr56-62 Bùi Thị Hà, Đỗ Huy Hoàng, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hồng Mậu (2016),“Nghiên cứu quytrình chuyển genởcâydừa cạn (Catharanthus roseus(L.) G.Don)”,TạpchíKhoahọcvàCơng nghệ,Tập 157,số12/1 Bui Thi Ha, Nguyen Thi Ngoc Lan, Nguyen Thi Tam , Le Van Son, ChuHoang Mau (2017), “Expression of the gen encoding deacetylvindoline 4O-acetyl transferase (CrDAT) fromCatharanthus roseusin transgenic tobaccoplants” (Gửi tạitạpchíKhoahọcQuốc tếđangđợiđăng) Cáctrìnhtựgen đãđăngký trênNgânhàngGenquốctế [1].Bui,H.T., Hoang,H.P., Nguyen,T.T and Chu,M.H (2015),Catharanthus roseusmRNA for DAT enzyme (DAT gene), isolate TN1(Pink-purpleflower),GenBank:LN809930.1 [2].Bui,H.T.,Hoang,H.P.,Nguyen,T.T.andChu,M.H(2015),Catharanthus roseusmRNA for DAT enzyme (DAT gene), isolate TN2(Whiteflower),GenBank:LN809931.1 MỞĐẦU Đặtvấnđề Hiện nay, loài người giới phải đối mặt với nhiều cănbệnhnguyhiểm,ảnhhưởngnghiêmtrọngtớisứckhỏenhư:Ungthư,AIDS,tiểuđường ,thốihóakhớp,viêmganB,C.Ungthưlàcănbệnhgâytửvonghàngđầutrêntồnthếgiới.Theotổ chứcYtếThếgiới(WHO)tỉlệngườimắc ung thư năm 2012 14 triệu người Đến năm 2015 có 90 triệungườimắcungthưvàhàngnămcóhơn8triệungườichếtvìungthư Cây dừa cạn (Catharanthus roseus(L.) G Don) nhữngloạicây dượcliệuquý.Cây dừacạncókhảnăngsảnxuấtc c i n d o l alkaloid có dược tính quan trọng sản xuất loại thuốc chống ungthư, đặc biệt ung thư máu Ngồi ra, dừa cạn cịn dẫn trongđiều trị bệnh bạch cầu lympho cấp số bệnh ung thư khác Trong dângian,d a c n đ ợ c s d ụ n g t r ị c a o h u y ế t p , b ệ n h t i ể u đ n g , đ i ề u h ị a kinhnguyệt,chữatiêuhóakémvàchữalị,lợitiểukhámạnh,chữabệnhđitiểuđỏ ít, tẩygiun, chữa sốtcao Trongcâydừacạncóchứa2loạialkaloidlàvinblastinev vincristine sửd ụ n g r ộ n g r ã i t r o n g đ i ề u t r ị b ệ n h u n g t h V i n b l a s t i n e vincristine chất ức chế mạnh phân chia tế bào vậyngăncản tăng số lượng tếbào Hàm lượng vinblastine vincristine dừa cạn hoang dại rấtthấpchonênđịnhhướngnghiêncứulàmtănghàmlượngalkaloidởcâydừacạn quan tâm với việc sử dụng kỹ thuật đại đó, xác định vàtăngcườngbiểuhiệnenzymechìakhóalàrấtquantrọng.Deacetylvindoline-4-Oacetyltransferase (DAT) enzyme chìa khóa trongchuỗi chuyển hóa tổng hợp alkaloid dừa cạn Biểu mạnh enzymeDATsẽlàmtăngcácsảnphẩmchuyểnhóathứcấpvàhàmlượngvinblastinevàvinc ristinetrongdừacạnsẽđượcnângcao Từ lý thực đề tài luận án:“Nghiên cứu tăngcường biểu gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp alkaloid ởcâydừa cạn(Catharanthusroseus(L.)G.Don)” Mụctiêunghiêncứu Xác định đặc điểm biểu gen mã hóa deacetylvindoline-4O-acetyltransferase (CrDAT) phân lập từ dừa cạn Tạo dừacạnchuyển genCrDATcó hàmlượng alkaloid đượccảithiện Nộidungnghiêncứu 3.1 Nghiên cứu thu thập thông tin genCrDAT, thiết kế cặp mồi PCRnhân genCrDAT, khuếch đại, tách dịng xác định trình tự genCrDAT 3.2 Thiết kế vector chuyển gen thực vật chứa genCrDATvà đánh giá hoạtđộngcủa vectorchuyển gen câythuốc 3.3 Nghiên cứu hệ thống tái sinh xây dựng quy trình chuyển gen thơngquaAgrobacteriumtumafaciensởcâydừa cạn 3.4 Nghiên cứu chuyển genCrDATvào dừa cạn, phân tích chuyển genvàđánhgiásựbiểuhiệnchứcnăngsinhhọccủagenchuyểnCrDATở câydừa cạn Nhữngđónggópmớicủaluậnán Luận án cơng trình Việt Nam nghiên cứu có hệ thốngtừ phân lập, tách dòng phân tử đến thiết kế vector chuyển gen biểu hiệngenCrDATởcâythuốc câydừa cạn,cụ thể là: 1) Đãphânlậpđượcgen CrDATtừ mRNAcủa câydừacạn,genCrDAT (cDNA)có kíchthước 1320bp, mãhóa4 amino acid 2) Xây dựng quy trình tái sinh, quy trình chuyển gen thơng quaA.tumefaciensvà tạo dịng dừa cạn chuyển genCrDATở hệ T1(T1-1; T1-3; T1-6; T1-7) có hàm lượngalkaloidtổng sốtăng từ3 , l ầ n đến15,57 lần sovớiđốichứng không chuyển gen 3) ProteintáitổhợprCrDATđượcbiểuhiệntrêncâythuốclá,câydừacạnchuyểnge n kếtquả đượckiểmchứng Westernblotvà ELISA Ýnghĩakhoa họcvà thựctiễn củađề tàiluậnán Vềmặtkhoa học Kết nghiên cứu luận án góp phần làm sáng tỏ đặc điểmcấu trúc genCrDATphân lập từ dừa cạn màu hoa hồng tím màuhoa trắng thu thập Thái Nguyên Cơ sở khoa học hiệu kỹthuật tăng cường biểu gen mã hóa enzyme chìa khóa chuỗichuyển hóa tổng hợp alkaloid nhằm nâng cao hàm lượng alkaloid câydừa cạn Các báo đăng tải tạp chí khoa học với trình tựgen cơng bố Ngân hàng gen quốc tế tư liệu có giá trị thamkhảo trongnghiêncứu giảng dạysinh học cơng nghệ sinhhọc Vềmặtthựctiễn Cáct r ì n h t ự g e n C r D A T đ ợ c p h â n l ậ p , c ấ u t r ú c v e c t o r c h u y ể n gen,cácdịngcâychuyểngengópphầngiảiquyếtnhữngvấnđềcụthểvềviệc sử dụng kỹ thuật chuyển gen để cải thiện hàm lượng alkaloid câydượcliệunóichungvàcâydừa cạn nói riêng Kết nghiên cứu mở ratriển vọng ứng dụng kỹ thuật biểu mạnh gen mã hóa enzyme vào việcnâng cao hàmlượng dượcchấttrong câydược liệu Cấu trúc luận án:Luận án có 120 trang (kể tài liệu tham khảo) đượcchia thành chương, phần: Mở đầu (03 trang), Chương 1: Tổng quan tàiliệu (21 trang), Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu (21 trang);Chương 3: Kết thảo luận (49 trang); Kết luận đề nghị (01 trang);Cácc n g t r ì n h c ô n g b ố l i ê n q u a n đ ế n l u ậ n n ( t r a n g ) ; T i l i ệ u t h a m khảo(16trang).Phụlục(4trang).Luậnáncó20bảng,31hìnhvàthamkhảo121 tàiliệu Chƣơng1.TỔNGQUANTÀILIỆU Luận án tham khảo 22 tài liệu tiếng Việt; 99tài liệu tiếng Anh đểtổngkếtcácnộidungcóliênquan,baogồm:( ) Alkaloidởcâydừacạn,(2)Sinhtổnghợp alkaloid hoạt động DAT dừa cạn, ( 3) Nghiêncứucảithiệnhàmlượngalkaloidởcâydừacạn Alkaloid chất hữu có chứa nitơ, đa số có nhân dị vịng, cóphảnứngkiềm,thườnggặptrongthựcvậtvàđơikhicótrongđộngvật,thường có dược tính mạnh Trong lĩnh vực y học, alkaloid cung cấp nhiềuloạithuốc có giá t r ị chữa bệnhca ov độc đáo.Theo Đỗ TấtLợ i (19 77), câydừacạn(Catharanthusr o s e u s ( L ) G D o n ) h a y hảiđằng, d n g giác, bơngdừa, trườngxnhoalàmộtlồithựcvậttrongc h i Catharanthusthuộc họ La bố ma (Apocynaceae) Dừa cạn địa vàđặchữucủaMadagascar.ỞViệtNam,dừacạnlàcây hoang dại, phân bốkhắp nơi nước Dừa cạn nguồn giàu alkaloid thuộc chủng loạialkaloid terpenoid indole tách chiết từ ba giống, làroseusvới hoamàu hồng tím,albusvới hoa màu trắngvàng vàocellatusvới hoam u trắngđỏ,trongđóhoamàuhồngtímcóhàmlượngvincristinevàvinblas tinecao Trongcâydừacạncókhoảng130loạialkaloid,trongđóvinblastine vàvincristine làhaihợpchấtquantrọng nhất.Alkaloidcónhânindolđượctìm thấy tất cácbộ phận cây, nhiều láv r ễ Alkaloid tồn phần có dừa cạn với hàm lượng 0,37% - 1,15%, thân0,40%, rễ 0,7% - 2,4%, rễ phụ 0,9% - 3,7%, hoa 0,14% - 0,84%, vỏquả 1,14%, hạt 0,18% Trong khoảng 130 loại alkaloid chiết từ câydừa cạn,ngườita đặcbiệtchúý20nhóm alkaloid dimeric nhómcóhoạttính chốngung thưbao gồmvincristinevà vinblastine DATl enzyme ứng chìa khóa cuối xúc tác cho phản t r o n g chuỗit ổ n g h ợ p v i n d o l i n e t d e a c e t y l v i n d o l i n e c â y dừacạn.TheoSt- Pierre cs (1998) protein DAT có khối lượng phân tử 51 kDa, gồm 9chuỗi polypeptid GenDATở dừa cạn mã hóa cho enzyme acetyl CoA:deacetylvindoline-4-Oacetyltransferase(DAT)thamgiavàobướccuốicùng trình sinh tổng hợp vindoline GenDATcó kích thước1320bp, gồm 439 amino acid, tham gia xúc tác chuỗi phản ứng cuối cùngtrongquá trình tổnghợp vindoline Đểcảithiệnhàmlượngvinblastinevàvincristine,cáchướngnghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật, kỹ thuật chuyểngenđãđượcđề xuất.Nhiềunghiêncứutheohướngtăngsinhkhốinhưviệcthu nhận huyền phù tế bào nuôi cấy, nuối mô tế bào thực vật, ni cấytạo dịng rễ tơ để làm tăng hàm lượng alkaloid, đặc biệt vinblastine vàvincristine.Trongnhữngnăm gầnđây,ứngdụngkỹ thuật chuyểng e n nhằm tăng hàm lượng alkaloid dừa cạn quan tâm nghiêncứu Nghiên cứu tạo dòng rễ tơ chuyển gen dừa cạn nhờ vi khuẩnAgrobacterium rhizogenscủa Mohsen Zargar cs (2010) cho thấy cácdòng dừa cạn chuyển gen có hàm lượng alkaloid tăng đáng kể so vớicác không chuyển gen Kỹ thuật biểu mạnh gen mã hóaenzyme chìa khóa chuỗi phản ứng tổng hợp vinblastine vincristinetrongcâydừa cạn chuyển gencòn ítđượctập trung nghiên cứu Chƣơng2.VẬTLIỆUVÀPHƢƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 2.1 VẬTLIỆUNGHIÊNCỨU Hạt giống dừa cạn màu hoa hồng tím vàm u h o a t r ắ n g thu t h ậ p tỉnh Thái Nguyên Giống thuốc tabacumK326 láNicotinana có nguồngốctừViệnKinhtếkỹthuậtthuốclá,doPhịngtếbàoThựcvậtViệnCơngnghệSinhhọccungcấp Các chủng vi khuẩn E.Coli(DH5α), chủng A.), chủng A.tumefaciensCV58 doPhịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ Sinh học Việt Nam,ViệnHàn lâmKhoa họcvà CôngnghệViệtNamcung cấp 2.2 HĨACHẤT,THIETBỊVÀĐỊAĐIỂMNGHIÊNCỨU Hóa chất sử dụng nghiên cứu mua từ hãng tiếngtrênthếgiớinhưhãngFermentas,BioNeer,Invitrogen,nhưTrizolReagents,kítMaxima® FirstStrand cDNASynthesis, Các thí nghiệm thực trang thiết bị đại củaPhịng cơng nghệ gen, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại họcThái Ngunvà Phịng thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ gen, Phịng Cơngnghệ ADN ứng dụng Phịng cơng nghệ tế bào thực vật thuộc Viện côngnghệ sinhhọc,ViệnHànlâmKhoahọc CôngnghệViệtNam Luậná n đ ợ c h o n t h n h t i B ộ m ô n S i n h h ọ c h i ệ n đ i & G i o d ụ c sinhhọc,KhoaSinhhọc,TrườngĐạihọcSưphạm–ĐạihọcT h i Nguyên 2.3 PHƢƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Các phương pháp nghiên cứu chia thành nhóm chính: (1) nhómphương pháp sinh học phân tử, (2) nhóm phương pháp thiết kế vectorchuyển gen thực vật, (3) nhóm phương pháp tạo chuyển gen, (4) nhómphương phápphântích chuyểngen Các thínghiệm tiếnh n h theo sơđồ tổngqtmơ tả ởhình 2.1 Phânlập,nghiêncứuđặcđiểmge Khảo sát điều kiện tối ưu táisinhin vitrocây dừa cạn nCrDATc ủ a câydừacạn từđoạnthânvànáchlámầm Thiếtkếvector chuyểngenthựcvậtmangg enCrDAT Xâydựngquytrìnhc huyểng enquanáchlámầmnhờA.tu mefaciensthôngquachuyể ngengus Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT vào thuốc Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT vào dừa cạn Phân tích thuốc chuyển gen T0 PCR, Southern blot, Western blot Phân tích dừa cạn chuyển gen CrDAT T0, T1 Đánhgiáchứcnăngsinhh ọccủagenchuyểnở T1 Hình 2.1.Sơđồthínghiệmtổng qt 2.3.1 Cácphƣơngphápsinhhọcphântử Phân lập genCrDATbằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu đãthiết kế DAT-NcoI-F/DAT-NotI-R RNA tổng số tách chiết bằngTrizol Reagent Kit cDNA tổng hợp theo quy trình nhà sản xuất.Táchdịngvàgiảitrìnhtựgenquacácbước:i)TinhsạchsảnphẩmPC R, ii)GhépnốiđoạngenvàovectortáchdịngpBT;iii)Biếnnạpplasmidtáitổ hợpvàotếbàokhảbiếnE.coliDH5α), chủng A.; iv) Chọn dịng khuẩn lạc bằngcolony PCR; v) Tách chiết plasmid cắt kiểm tra bằngBamHI; vi) Xácđịnh phân tích trình tự nucleotide Kết nghiên cứu trình tựgen,amino acid đượcxử lýbằng phần mềmBioEdit, 2.3.2 Phƣơngphápthiếtkếvectorchuyểngenmangcấutrúcchứagen CrDAT Vector chuyển gen mang genCrDATđược thiết kế theo hai bước cơbản (1) Thiết kế cấu trúc độc lậpmanggen chuyểnCrDAT; (2) Gắnc ấ u trúcchứagenCrDATvào vectorchuyển genthực vậtpBI121 (Hình2.2) NcoI NotI NcoI 2SP,antiABA 35S CrDAT pBT – CrDAT HindIII CrDAT cmycKDEL polyA pRTRA7/3-CrDAT RB nptII cmyc KDEL polyA pRTRA7/3 HindIII 35S NotI MSC pBI121 GUS LB HindIII Xcị n h trìnhtựgenCrDAT KếtquảgiảitrìnhtựnucleotidecủagenCrDAT(cDNA)phânlậptừhaimẫu dừa cạn TN1 (hoa hồng tím) TN2 (hoa trắng) cho thấy genCrDATcó kích thước 1320 bp GenCrDATphân lập từ hai mẫu dừa cạn TN1 vàTN2 có độ tương đồng so với trình tự genDATmang mã số AF053307 là99,5% 99% tl ệ t n g đ n g c ủ a t r ì n h t ự g e n CrDATgiữa hai mẫuTN1 TN2 Như kết luận rằng, genCrDATphân lập từ mẫudừa cạn TN1 vàT N đ ã đ ợ c t c h d ò n g t h n h c ô n g T r ì n h t ự n u c l e o i t d e genCrDATphân lập từ hai mẫu dừa cạn TN1, TN2 đăng kýtrênNgân hàngGenquốctếvớimã sốLN809930 LN809931 Kết so sánh trình tự amino acid suy diễn DAT hai mẫu dừacạn TN1, TN2 DAT mang mã số AAC99311 Ngân hàngGen(proteinsuydiễntừgenDATmangmãsốAF053307)chothấyproteinDATg ồm439aminoacidvàcóđộtươngđồngcaosovớiproteinmangmãsốAAC99311 Ngân hàng gen (99,3% 99,4%); cịn trình tự amino acidsuydiễn haimẫu TN1 TN2 tươngđồng 97,7% 3.2 THIETKEV E C T O R C H U Y Ể N G E N V À B I Ể U H I Ệ N GEN CrDATTRÊN CÂYTHUỐCLÁ 3.2.1 Thiếtkếvector chuyển gen mangcấu trúcchứagenCrDAT Trình tự nucleotid genCrDATmàu hoa hồng tím sử dụng để thiếtkế vector chuyển gen thực vật thông quaA tumefaciens Sử dụng enzymegiới hạnHindIII xử lý vector pRTRA7/3-CrDATđể thu nhận cấu trúc35SCrDAT-cmyc-KDEL-polyA.Gắn cấu trúc35S-CrDAT-cmyc-KDEL- polyAvào vector chuyển gen pBI121 DNA T4 ligase tạo vector chuyển genmangcấu trúc chứa genchuyểnCrDAT(pBI121-CrDAT Plasmidt i t ổ h ợ p p B I - S - D A T c m y c đ ợ c t c h ch iết , k i ể m t r a vàbiếnnạpvàoA tumefaciens.Cấu trúc vector chuyển gen pBI121 –CrDATbao gồmcác thành phần chínhđược thểhiệnởhình 3.8A M RB nptII 35S CrDAT cmyc KDEL polyAGUS LB 10 1,5 kb  1,0 kb pBI121-CrDAT B A Hình 3.8.Sơđ c ấ u t r ú c v e c t o r c h u y ể n g e n p B I CrDATvà kết quảđiện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR A: Cấu trúc vector chuyển genpBI121-CrDAT LB: bờ trái T-DNA; RB: bờ phải T-DNA;nptII:gen kháng kanamycin; 35S: promoter CaMV35S B: Kết kiểm tra sảnphẩmcolony- PCRcácdòngA.tumefacienschứavectorchuyểngenpBI121-DAT Các dòngA tumefacienstái tổ hợp chứa vector chuyển gen pBI12135S-DAT-cmyc kiểm tra colony-PCR kết phân tích ngẫunhiên1 d ò n g k h u ẩ n l c t h u đ ợ c d ò n g d n g t í n h v i c o l o n y - P C R (Hình 3.8B).Các dòngA.tumefacienstái tổ hợp chứa vector chuyển genpBI121-CrDATđược lưu giữ sử dụng cho thí nghiệm chuyển gentiếptheo 3.2.2 PhântíchbiểuhiệngenCrDATtrên câythuốcláchuyểngen Bien nạp cấu trúc chứa gen CrDAT tạo thuốc chuyển gen nhờA.tumefacinens CácmảnhlácâythuốclágiốngK326c ó k í c h t h c k h o ả n g 1c m đượcsửdụnglàmvậtliệunhậngen.T h í n g h i ệ m c h u y ể n g e n CrDAT vàothuốcláđượctrìnhbàyởhình3.9 A B D C E G Hình3.9.Hìnhảnhmơtảqtrìnhbiếnnạp,chọnlọcvàtáisinhtạocâythuốcláchuyển gen A: Mảnh sau rửa khuẩn cấy môi trường chọnlọc;B,C:Tái sinhđachồi;D:Kéodàichồi;E:Tạorễ;G:Racâytrongbầuởđiềukiện nhàlưới Bảng 3.3 cho thấy, sau lần biến nạp cấu trúc mang genCrDATvàocácm ả n h t h u ố c l , kết quảcó 235/ m ả n h l s ố n g s ó t s a u t u ầ n , phát sinh 205 chồi thu 186 conin vitrosống sót mơitrường MS có bổ sung kháng sinh Số bầu đất là1 c â y v c ó câytrồng tạinhà lướicóbiểu xanh tốt, mập mạp Bảng3.3.KếtquảbiếnnạpcấutrúcmanggenCrDATvàomảnhláthuốclá Đối chứng vàthínghiệm ĐC0* ĐC1* Thíngh iệm Tổng Lần1 Lần2 Lần3 Tổng sốmả nhlá 30 30 82 90 77 249 Sốmản hlá sốngsót sau4tu ần Số mảnhlá cảmứng tạochồi 30 79 86 70 235 40 68 74 63 205 Số câyra rễtrên môitrƣờn gchọnlọ c 25 55 61 52 186 Số rab ầu Số câytrồn gtron gnhàl ƣới 15 34 44 35 113 15 22 25 18 65 Phân tích có mặt hợp gen chuyển CrDAT hệ gencâythuốclá chuyển gen Các dòng thuốcláchuyểngen T0saukhi trồngtrongnhàl i được4tuần thìtiếnhànhthuláđểthựchiệnphảnứngPCRvớicặpmồiCrDATF -Xba/CrDATR-Sacđể kiểm tra có mặt gen chuyểnCrDAT(Hình3.10)  10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 M wt 1,5kb 1,0kb Hình 3.10.Kết điện di sản phẩm PCR xác định có mặt genDATtrong thuốc chuyển gen đốichứng Từ đến 19:cácdòng thuốc chuyển gen; M: thang DNA kb; wt: thuốc khơngchuyểngen Hình 3.10 cho thấy, 19 dòng thuốc chuyển gen có 12dịng thuốc chuyển gen dương tính với phản ứng PCR dòngT0-1,T - , T - , T - , T - , T - , T - , T - , T - , T 16,T0-17, T0-19 (các dòng điện di số 1, 2, 4, 5, 6, 8, 12, 13, 15, 16, 17, 19) Đểkhẳng định gen chuyểnCrDATđã hợp vào hệ gen thuốc lá,DNA thuốc chuyển gen (T0-1, T0-2, T0-4, T0-5, T0-6, T08,T0-12, T0-13, T0-15) cho kết PCR dương tính lựa chọn ngẫunhiên để sử dụng phân tích Southern blot Hình 3.11 cho thấy tất 9dòng thuốc chuyển gen cho kết lai Southern (T0-1, T0-2, T0-4, T0-5,T0-6, T0-8, T0-12, T0-13, T0-15), hai dịng T0-5 T0-15 cho 2băngD N A ( b ả n c o p y ) , b ả y dòng c ò n l i đ ề u c ó m ộ t b ă n g D N A c c kích thước khác Bảy dịng thuốc chuyển gen (T0-1, T0-2, T0-4,T06, T0-8, T0-12, T0-13) cho kết lai Southern có copy đượcsửdụng phân tích Westernblot 2456 ( + ) M W T 20 10 7,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,5 Hình 3.11 Kết phân tích Southern blot mẫu thuốc chuyển genCrDAT.M:Marker1kbplus,(+)PlasmidpBI121-CrDATcắtbởiSacI,115:cáccâychuyểngenT0(1:T0-1;2:T0-2;4:T0-4;5:T0-5;6:T0-6;8:T0-8; 12:T0-12;13:T0-13;15:T0-15),wt:câyđốichứngkhơngchuyểngen PhântíchsựbiểuhiệnproteintáitổhợpCrDATtrêncâythuốcláchuyểngen Protein tổng số dịng thuốc chuyển gen T0-1, T0-2, T0-4, T06, T0-8, T0-12, T0-13 xuất băng DNA từ kết lai Southern đượcphân tích điện di SDS-PAGE chuyển phân đoạn protein lên màngnitrocellulosevà thực phản ứng laiWestern KếtquảphântíchPCR,SouthernblotvàWesternblotcácdịngcâythuốcláchuyển genCrDATở hệ T0 chứng minh gen chuyểnCrDATđã hợp nhấtvàohệgencủacâythuốclávàgenchuyểnCrDATđãhoạtđộngphiênmãvàdịchmãc hokếtquảbiểuhiệnproteintáitổhợpCrDAT KDaM (+)T0-1T0-2T0-4T0-6T0-8T0-12T0-13WT 130 100 70 55 40 35 51,5k D a Hình 3.12.Kết phân tích western blot dịng thuốc chuyểngenCrDAT.M: thang protein chuẩn ; (+) đối chứng dương ; T0-1, T0-2,T0-4, T0-6, T0-8, T0-12, T0-13: chuyển gen; WT: đối chứngkhôngchuyểngen 3.3 NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ XÂY DỰNG QUYTRÌNHCHUYỂNGENỞCÂYDỪACẠN 3.3.1 Nicấyinvitrocâydừa cạn Kết nghiên cứu nuôi cấy in vitro dừa cạn cho nhận xét khửtrùnghạt dừa cạn cồn 70% phút dung dịch javen 60% trong15phútchohiệuquảcaonhất.MôitrườngMSbổsungsucrose30g/l;agar8,5g/l; BAP 1,0mg/l IBA 0,6mg/l; nước dừa 100ml/l; pH5,8 thích hợpcho phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồibên Môi trường MS bổ sung sucrose 30g/l; agar 8,5g/l; BAP 0,5mg/l vàIBA 0,4mg/l; nước dừa1 0 m l / l ; p H 5,8,thích hợp chosự phát s i n h chồi sinh trưởng chồi từ nách mầm.G â y t ổ n t h n g b ằ n g c c h c h ẻ dọc dùng mũi dao châm vào đoạn thân mang mắt chồi bên chohiệu đa chồi cao Môi trường tối ưu tạo đa chồi sở cho thínghiệmtiếp theo nghiên cứuchuyển genởcâydừa cạn 3.3.2 Xâydựngquy trìnhchuyểngen thôngquagenchuyểngus Tiến hành biến nạp gengusvào dừa cạn thông quaA.tumefaciens.Các mẫu biến nạp sau nhiễm khuẩn nuôi tối ngày vànhuộm X-gluc để xác định hiệu suất chuyển gengus(Hình 3.16).Kết quảchọn lọc sau tuần thu 84 mẫu tạo chồi (đạt 23,3 %), sau tuần sốchồi sống sót 34 mẫu (đạt 9,45%), có 21 chồi rễ Khi đưa câyra mơi trường thu 15 sống sót Lấy ngẫu nhiên rễ 15 câyđemnhuộmX-glucđểkiểmtrabiểuhiệncủagengus Tất 15 nàyđều chokếtquảdương tính khixuất màu xanhchàmđặc trưng C A B B Hình A D 3.16.Kết biểu Hình 3.17.Kết C biểu tạmthờigengus.A:Lámầmchuyểngen; gengusởcây dừa cạn chuyểng e n B:Đ o n A : Lá chuyển gengus; B:Rễ thân chuyển D gen; câychuyển gengus; C: Lá C : Lámầmkhôngchuyểngen;D : Đo khôngchuyểngen;D:Rễcâykhông chuyểngen ạnthân khôngchuyển gen Nhưvậy thông qua chuyển geng u s , trìnhc h u y ể n g e n v o câydừacạnđượctốiưulà( i ) V ậ t l i ệ u c h u y ể n g e n l l m ầ m ; ( i i ) NồngđộvikhuẩnOD600nm=0 , ; ( i i i ) N n g đ ộ a c e t o s y r i n g o n e l 100µM; (iv)Thờigiann h i ễ m k h u ẩ n l p h ú t ; ( v ) N n g đ ộ kanamycinđểchọnlọcchồi chuyểngenl m g / l Q u y t r ì n h c h u y ể n geng u s v o c â y d a c n t h ô n g q u a v i k h u ẩ n A t u Chuẩn bị vật liệu chuyển gen m e f a c i e n s đ ợ c t ó m tắtởhình3.18 Chuẩn bị vi khuẩn A.tumefaciens Gieo hạt tạo in vitro Thu mầm 10 ngày tuổimật độ OD600nm = 0,8 Chuyển gen - Lá mầm nhiễm khuẩn thời gian 30 phút + AS 100 µM Đồng ni cấy ngày môi trường: MS + sucrose 30g/l + agar 8g/l + MES 3,9g/l + muối B5 0,3g/l + AS 100µM Chọn lọc chồi chuyển gen Chọn lọc chồi môi trường: MS + sucrose 30g/l + agar 8g/l + MES 0,59g/l + muối B5 3g/l + BAP 0,5mg/l + cefotaxim 500 mg/l + kanamycin 50 mg/l Tái sinh chồi chuyển gen Chồi sống sót tái sinh mơi trường: MS + sucrose 30g/l + agar 8g/l + MES 0,59g/l + muối B5 3g/l + BAP 0,5mg/l + cefotaxim 500 mg/l + kanamycin 50 mg/l Tạo hoàn chỉnh Chồi tái sinh chuyển sang môi trường rễ: MS + sucrose 30g/l + agar 8g/l + BAP 0,5mg/l + IBA 0,4mg/l + kanamycin 50 mg/l Đưa môi trường