0782 nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học của polysaccharide từ hạt me (tamarindus indica l) việt nam luận văn tốt nghiệp

MỞĐẦU Tínhcấpthiếtcủađề tài Hiện nay,việc tìm kiếm,phát vàn g h i ê n c ứ u c c h ợ p c h ấ t thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao từ nguồn tài ngun thực vật phongphú nước ta mối quan tâm chung ngành Hoá, Sinh, Y,Dược Việc khai thác, sử dụng nguồn tài ngun ngànhcơngnghiệpthựcphẩm,dượcphẩmvàmỹphẩmcóhiệu quảkinhtếcao TrongvơsốlồithựcvậtởViệtNam,câymethuộcchiTamarinduscủa họ Đậu (Fabaceae) có giá trị sử dụng cao, phậncủa me dùng sống me mà thành phần hóahọc chủ yếu polysaccharide sử dụng nhiều ngành côngnghiệpthực phẩmvàdược phẩm Cho đến thời điểm Việt Nam chưa có cơng trình nghiên cứuvề mặt hóahọc thành phần có quảme,do quảm e l đối tượng nghiên cứu có nhiều triển vọng, có ý nghĩa khoa học vàthựctế Trên sở phân tích trên, tác giả tập thể hướng dẫn lựachọn đề tài nghiên cứu luận án là:"Nghiên cứu thành phần hóa họcvàkhảosáthoạttínhsinhhọccủapolysaccharidetừhạtme(Tamarindu sindicaL.)Việt Nam" Mục tiêu luận án:Xác định thành phần hóa học, cấu trúc đánhgiáhoạttínhsinhhọccủaTamarindSeedPolysaccharide(TSP)cótrongquả me Điều chế dẫn xuất sulfate hóa acetyl hóa có hoạt tínhsinhhọccaohơnTSPtựnhiêntừđó gópphần sángt ỏ ảnh hưởng c ủ a mứcđộsulfatehóavàacetylhóađếnhoạttínhsinhhọc Phương pháp nghiên cứu:Luận án thực sở kếtquả nghiên cứu thực nghiệm hệ thống phương pháp nghiên cứu đãđược công bố Cụ thể, phương pháp sắc ký gel (GPC), phổ hồng ngoại,phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, tán xạ ánh sáng tĩnh động, tánxạ tia X góc nhỏ, kính hiển vi điện tử quét, phương pháp thử hoạt tínhsinhhọc… Ý nghĩa khoa học luận án:Lần cấu trúc TSP từ quảme nghiên cứu hồn chỉnh bao gồm cấu trúc hóah ọ c , c ấ u t r ú c không gian cấu trúc bề mặt cách sử dụng phương pháp hiệnđại giới nghiên cứu cấu trúc polymer bao gồm phổNMR,phổ khốiESI-MS,ESI-MS/MScác phươngphápt n xạá nh sáng tĩnhSLSvàđộngDLS,tánxạtiaXgócnhỏSAXS,xâydựngđượcmơhìnhcấu trúcphântửcủaTSPdựa trêncấutrúchóahọc Ý nghĩa thực tiễn luận án:Đã sulfate hóa acetyl hóa TSP tựnhiên để thu đượcmẫu biến tính TSPS TSPA có hoạtt í n h c a o h n mẫu tự nhiên (Kết nghiên cứu cho thấy dẫn xuất sulfate hóa làm tăngkhả ly giải cục máu đông, khả chống đông tụ máu hoạt tínhkháng vi sinh vật kiểm định cịn dẫn xuất acetyl hóa làm tăng khả năngoxyhóasovớimẫuTSPtựnhiên) Cáckếtquảmớicủaluậnánđạtđược: - Lần cấu trúc TSP từ me nghiên cứu hồnchỉnhbaogồmcấutrúchóahọc,cấu trúckhơnggianvàcấutrúcbềmặt - Đã xây dựng mơ hình cấu trúc phân tử TSP dựa cấutrúchóahọc - Hoạt tính sinh học cấu trúc mẫu TSP TSPS với mứcđộ sulfate hóa khác nghiên cứu để tìm hiểu ảnh hưởng củasự sulfate hóa lên cấu trúc hoạt tính sinh học (Đây điểmmớicủaluậnánsovớicác nghiêncứutrongnước cùnglĩnhvực) Cấutrúccủa luậnán: Luận án gồm 132 trang: Đặt vấn đề trang; Chương – Tổng quan18 trang; Chương – Đối tượng phương pháp nghiên cứu 17 trang;Chương – Thực nghiệm 18 trang; Chương – Kết thảo luận48trang; Kết luận kiến nghị trang; Danh mục công bố luận án 1trang; 122 tài liệu tham khảo 13 trang; có 30 bảng biểu 46 hình ảnh vàđồthị CHƯƠNG1:TỔNG QUAN Phần tổng hợp nghiên cứu giới nước cácnghiêncứuhóahọcvàhoạttínhsinhhọccủapolysaccharide CHƯƠNG2:ĐỐITƯỢNGVÀPHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 2.1 Đốitượngnghiêncứu Đối tượng nghiên cứu luận án Tamarind Seed Polysaccharide(TSP) phân lập từ me Quả me thu hái huyện Thủy Nguyên,Hải Phòng vào tháng năm 2013 huyện Cần Giuộc – Long An vàotháng7năm2014 Cây me có tên khoa học Tamaridus indica.L thuộc họ đậu chiTamaridus,loàiT.indica 2.2 Phươngphápnghiêncứu 2.2.1 Phươngphápchiếttách Chiếttách polysaccharide từquả me phương phápc h i ế t tách thông thường, kết hợp phương pháp tinh chế, làm đồng thờitham khảo công bố giới để đưaram ộ t p h n g p h p c h i ế t tách tối ưu, phù hợp với đối tượng mục đích nghiên cứu luận án[85,86] 2.2.2 Phươngphápxácđịnhcấu trúc 2.2.2.1 Phươngphápsắckýthẩmthấugel(GPC) Gel Permeation Chromatography (GPC) kỹ thuật sắc ký đểphân tách phân tử kích thước lớn dựa rửa giải chúng trêncột GPC xác định vài thơng số cấu trúc quan trọng bao gồmtrọng lượng trung bình Mw,trọng lượng phân tử trung bình số Mn,v đặc trưng polymer phân bố trọng lượng phân tửcủanó 2.2.2.2 PhươngphápphổIR Phổ hồng ngoại xác định dao động nguyên tử phân tử.Khi tia hồng ngoại chiếu qua mẫu, nhóm nguyên tử phântửmẫuhấpthụcáctiaánhsángtạicáctầnsốphùhợpvớisựdaođộngcủ a nguyên tử phân tử Phương pháp mang đến thơng tincấutrúcquantrọngđểxácđịnhvịtrínhómchứctrongphântửpolysaccharide 2.2.2.3 PhươngphápphổNMR Phổ cộng hưởng từhạt nhân proton (1HNMR)củap o l y s a c c h a r i d e khẳng định độ tinh khiết mẫu (khơng có mặt tín hiệucácoligonucleotide,proteinhaylipid).Phổcũngcóthểchobiếtsốmonosaccharide thựctừsốcáccộnghưởngprotonanomer,đánhgiátỷlệphân tử monosaccharide Nhiều nhóm xác địnhhoặc có mặt chúng dự đoán dựa vào phổ1D-1H-NMR Tiếptheo, số lượng xác monosaccharide khẳng địnhchínhxácnhờvàoviệckhảosátvùnganomercủaphổhaichiềudịhạtnhân1H13 C-HSQC 2.2.2.4 PhươngphápphổMS Hiện phương pháp phổ khối lượng với kỹ thuật phổ khối nhiềulần(Tandem– massspectrometers)làcơngcụrấthữuhiệuđểphântích cấu trúc chuỗi polysaccharide Kỹ thuật MALDI-ToF-MS ESI–MS phương pháp hữu hiệu việc xác định trọng lượng phân tửxyloglucan dẫn xuất sau thủy phân enzym hóa, hai kỹthuậtnàyđềuthu đượcdữliệu nhanhchóngvàcácphânmảnh nhỏ 2.2.2.5 Phươngpháptánxạánhsáng(LS)vàtánxạtiaXgóc nhỏ(SAXS) Hiện phương pháp tán xạ (LS) hữu hiệu để nghiên cứucấu trúc không gian phân tử chất tan dung dịch Phương phápnày dựa vào đường cong tán xạ ta biết thơng số cấu trúcnhư trọnglượng,kíchthướcvàhìnhdạngcủaphântửchấttan 2.2.3 Phươngphápthửhoạttínhsinhhọc 2.2.3.1 Hoạttínhgâyđộctế bào Hoạt tính gây độc tế bào tiến hành để đánh giá khả ức chếsự pháttriểntếbàoungthưvàkhôngungthưinvitrocủacácmẫuchiết,cũng để kiểm tra độc tính thuốc với dịng tế bào ung thư vàkhông ung thư Phép thử dựa vào khả nhuộm màu SRB(Sulforhodamine B) bám vào protein tế bào cố định acidtrichloroaxetic (TCA) Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tếbào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo đượckhi thành phần protein tế bào nhuộm Sulforhodamine B(SRB).G i t r ị O D m y đ o đ ợ c t ỉ l ệ t h u ậ n v i l ợ n g S R B g ắ n v i p h â n tử protein, lượng tế bào nhiều (lượng protein nhiều) thìgiátrịODcànglớn 2.2.3.2 Hoạttínhchốngoxyhóa Những phép thử đo hoạt tính chống oxy hóa có liên quan đến chuyểnnguyêntửhydrogenhaychuyểneđộcthân.Cơchếhaiphépthửnàyxảyra đồng thời phụ thuộc vào cấu trúc chất chống oxy hóa pH Phépthử theo chế chuyển nguyên tử hydrogen đựa theo việc đo khả năngcủachấtchốngoxyhóađểquétnhữnggốctựdobởisựchohydrogen Trong phép thử dựa chế chuyển e độc thân, phản ứng đượcxác định sựkhửproton vàkhảnăng ion hóacủan h ó m c h ứ c ( I P ) , phép thử phụ thuộc vào pH, pH cao giá trị IP thấp vàtăng khử proton Những hợp chất có IP45kcal/mol chế phản ứngthường làchuyển e độc thân.P h ả n ứ n g c h u y ể n e đ ộ c t h â n t h n g c h ậ m chịu ảnh hưởng âm tính hợp phần vết, chất nhiễu đặc biệt làkimloại 2.2.3.3 Hoạttínhkhángvisinhvậtkiểmđịnh Hoạttính kháng vi sinh vậtkiểm định thực dựatrênphương pháp khuếch tán đĩa thạch Đây phương pháp thử hoạt tínhkháng vi sinh vật nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh hayyếucủacácmẫuthửthơngquađườngkínhkhuếchtán Các vi sinh vật kiểm định tiến hành hoạt hóat r c k h i t i ế n hành thử nghiệm môi trường dịch thể đặc biệt Sau phalỗng tới nồng độ thích hợp trước tiến hành thử nghiệm Chất khángsinhsosánhlàAmpicilin,Streptomycin,AmphotericinB hoặcmẫutrắng 2.2.3.4 Hoạttínhchốngđơngtụmáu Đơng máu làmột qt r ì n h m u c h u y ể n t t h ể l ỏ n g t h n h t h ể đ ặ c chuyển fibrinogen thành fibrin khơng hịa tan sợi fibrin bịtrùng hợp tạo thành mạng lưới giam giữ thành phần máu làm máuđơnglại.Đơngmáuvàchốngđơnglàmộtqtrìnhrấtphứctạp,cảhaihiện tượng xảy ra, song song tiến triển, cuối đểnhằm cầm máu, tránh tượng đông máu tràn lan gây tắc nghẽnmạch máu hình thành đủ Kết đánh giá qua quan sát trựcquanvàdùngpipethútkiểmtratrạngtháicủamáu 2.2.3.5 Hoạttínhlygiảicụcmáuđơng Hình thành cục máu đơng làmộtp h ả n ứ n g t ự n h i ê n đ ể c t h ể t ự bảo vệ Tuy nhiên, cục máu đơng trở nên nguy hiểm hìnhthành bên mạch máu Chúng di chuyển tới khắp nơi trongcơ thể, lên não làm tắc mạch máu não gây đột quỵ, đến tim làm hẹpđộng mạch vành gây nhồi máu tim, điều thực nguy hiểm,thậm chí đe dọa tính mạng Kết đánh giá thay đổi khối lượngly giải huyết khối trước sau thí nghiệm Phần trăm ly giải cục máuđơng tính chênh lệch khối lượng trước sau ly giải cục máuđông CHƯƠNG 3:THỰCNGHIỆM 3.1 Thuhái, địnhdanhvàxửlýmẫuquảme 3.1.1 Thuháivàđịnh danh Quả me thu hái vùng Thủy Nguyên, Hải Phòng vào tháng 5năm 2013 Cần Giuộc –Long An vào tháng 12 năm 2014 Cây me(có tên khoa học làTamarindus indicaL chiTamarindusthuộc họĐậu(Fabaceae)) giám định TS Bạch Thị NhưQ u ỳ n h K h o a KỹthuậtYhọc-TrườngĐạihọcY DượcHảiPhòng.Tiêubảnsố56891 vàsố56891Acủamẫu quảmeđượclưugiữtạiKhoaK ỹ thuậtYhọcTrườngĐạihọcYDượcHảiphòng 3.1.2 Xửlýmẫu Quảme sau thu hái rửasạch chấtb ẩ n t h ô d i v ò i n c , sấy 60-700C 48h,sau tách bỏ vỏ,t c h r i ê n g p h ầ n h t m e thịt me Thịt hạt me sấy lại 60 0C đến khối lượng khơng đổi,hạtme tách bỏ vỏ cứng sau nghiền nhỏ vàgiữt r o n g b ì n h hútẩm.Thịtvàhạtmeđược dùngđểchiếttáchTSP 3.2 Xác định thành phần hóa học, chiết tách tính chếTamarindSeedPolysaccharide(TSP) 3.2.1.Xác địnhthànhphầnhóa học Xác định hàm ẩm,protein,chất béo,l ợ n g tro, c a c b o n h y d a r a t e v sợi thô tiến hành theo phương pháp AOAC thực 03 lần lấykếtquảtrungbình Hàmẩmđược xác địnhbằngphươngphápkhốilượng Chất béo thơ phân tích cách chiết mẫu bột hạt me khơ vớietherdầuhỏatrongbìnhchiếtSoxhlet Lượngproteinthơ c ó m ẫ u đ ợ c x c đị nh bằ ng p h n g pháp micro-KjeldahlđượccảitiếnbởiCoconvàDian Phântícht ổ n g c a r b o h y d r a t e đ ợ c x c đ ị n h b ằ n g p h ươngpháp phenol-acidsulfuric Xácđ ị n h l ợ n g t r o , s ợ i t h ô : X c đ ị n h l ợ n g s ợ i t h ô t h e o p h ng phápAOCS-AOAC Xácđ ị n h ợ n g a x i t t ổ n g s ố : L ợ n g a x i t t ổ n g đ ợ c x c đ ị n h b ằ n g phươngpháptrunghịatheoTiêuchuẩnViệtNamTCVN 4589:1988 3.2.2 Chiếttáchvà tinhchế Tiếnhànhkhảosátcácquytrìnhchiếttáchsau: Dùng lượng ethanol phù hợp cho vào lượng bộtm e , k h u ấ y mạnh để loại màu chất hữu có trọng lượng phân tử thấp, quátrìnhnàyđược lậplại3lầnthuđượcbộtme màunâunhạt Quytrình1:TheoquytrìnhcủaRupaliSinghvàcộngsự.Quytrình2: TheoPhaniKumarvàcộngsự Quytrình3:ChiếttáchTSPtheoquytrìnhcủaRaovàcộngsự Mẫusa ukhi chiếtt c h đượcl o i bỏproteintheophươngphápc Oliveir avàcộngsự Sau loại protein lipid mẫu tiến hành tinh chế màngthẩm tách MWCO No 68035 SnakeSkin Dialysis Tubing, 10000K củahãngThermoScientific - USAđểthuđược TSPcóđộsạchcao SơđồchiếttáchđượcđưaraởHình3.1 Hình3.1.SơđồchiếttáchTSPtừhạtquảme 3.3 Điềuchế dẫnxuất 3.3.1 Sulfate hóa Tamarinds e e d p o l y s a c c h r i d e s u l f a t e đ ợ c t ổ n g h ợ p t h e o phương phápcủaLihongFan,XiaolinChenvàcộngsự Bằngcáchthayđổitỷlệtácnhânsulfatehóa( B ả n g 3.2),chúngtơi thuđượccácmẫu TSPScómứcđộsulfatehóa(DS)khácnhau Bảng3.1 Kýhiệumẫuvàtỉlệsốmolcác chấttạotácnhânsulfate hóa STT Mẫu nNaHSO3 nNaNO2 TSPS1 0.050 0.086 TSPS2 0.050 0.059 TSPS3 0.050 0.045 TSPS4 0.051 0.029 TSPS5 0.051 0.016 TSPS6 0.050 0.007 Hình3.2 SơđồtổnghợpTSPS Xácđịnhmứcđộsulfatehóa:XácđịnhhàmlượngsulfatecủaTSPbằng phươngphápphântíchkhốilượng 3.3.2 Acetylhóa Tamarindseedpolysacchride acetylhóađượctổnghợptheophương pháp củaX i a o - x i a o Liuvàcộngsự theosơđồHình3.3 Hình3.3 SơđồtổnghợpTSPA Tiến hành tổng hợp TSPA có mức độ acety hóa( D A ) k h c n h a u cho TSP tác dụng với tác nhân acetyl có nồng độ khác trênBảng3.2 Bảng3.2 Kýhiệumẫuvànồngđộtácnhânacetylhóa STT Mẫu TSPA1 TSPA2 TSPA3 TSPA4 TSPA5 TSPA6 n(CH3CO)2O 0.011 0.021 0.032 0.042 0.053 0.064 Xác định mức độ acetyl hóa:Xác định hàm lượng acetyl TSPbằngphươngphápphântíchthểtíchtheoLuisvàcộngsự 3.4 Xác địnhcấutrúc hóahọc 3.4.1 Xácđịnhthànhphầnđường Để xác định thành phần đường phương pháp HPLC, mẫu TSPđược thủy phân hoàn toàn TFA 4M nhiệt độ 80 0C thời gian8h Phân tích hệ thống HPLC Shimazu- Nhật Bản với detector RI, tạiTrungtâmPhântíchvàKiểmđịnh–ViệnCơngnghiệpThựcphẩm 3.4.2 GPC GPC đo máy HPLC Agilent 1100 PTN Phân tích trung tâm,Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia TP HCM Vớiphađộng NaNO30,1N, detectorRI, cột đo TSK G3000-PW,n n g đ ộ mẫu TSP 4,4% (khối lượng) Các liệu xử lý phần mềmJiangshenWorkstation 3.4.2PhổIR PhổhồngngoạiFT-IRđượcghitrênmáyFT-IRAffinity-1SShimadzu Khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đạihọc Quốc gia Hà Nội, vùng số sóng 4000-400 cm-1 Mẫuđược épviênvớiKBr 3.4.3 PhổNMR Phổ NMR ghi máy Bruker Avance III 500MHz Trungtâm phương pháp phổ ứng dụng -Viện Hóa học, Viện Hàn lâm KhoahọcvàC ô n g nghệVi ệtN a m M ẫ u đượcphat r o n g dungm ôi D 2O+ % CD3COODvớinồngđộ 3mg/ml.DSSđượcsửdụnglàmchấtnộichuẩn, đoở nhiệtđộ70oCvớikỹthuậtđokhửtínhiệunước 3.4.4 PhổMS Để tiến hành đo phổ khối, mẫu TSP thủy phân TFA 2Mtạinhiệtđộ800Ctrongthờigian4hđểtạocácoligosaccharide Phổ ESI-MS ghi thiết bị LTQ Orbitrap XL TMcủa hãngThermo SCIENTIFIC Khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học Tựnhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, với nguồn ion hóa phun mù điện tử vàkiểuionhóadương 3.4.5 PhươngphápSEM ẢnhSEMđượcthựchiệntrênhệthiếtbịFE-SEMS4800(Hitachi) trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia HàNội 3.4.6 Phươngpháp LS Thí nghiệm tiến hành đo 5° dải đo từ 30-150trên thiết bịSLS-6500 & EDLS-9000 Đại học Điện- Truyền thơngOsaka,NhậtBản 3.4.7 PhươngpháptánxạtiaXgócnhỏ Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) đo máy BL10CtạiPhotonFactory, Tsukuba,NhậtBản 3.5 Đánhgiáhoạttínhsinhhọc Các hoạttính sinh học thường tiến hành thửn g h i ệ m đ ố i v i polysaccharide tự nhiên biến tính Các phương pháp thử tuântheo qui định chung thử hoạt tính sinh học như: chuẩn bị mẫu thử,mẫu đốichứng,ghi,đọckếtquả,tínhtốnnồngđộgây đápứng 3.5.1 Hoạttínhgâyđộctếbào Hoạttínhgâyđộctếbàođượcxácđịnhtại ViệnCơngnghệSinhhọc – ViệnHànlâmKH&CNViệtNam Cácdịng tế bào đượcni cấy dạng đơn lớptrongm ô i trườngnuôicấyDMEMvớithànhphầnkèmtheogồm2mMLglutamine, 10 mM HEPES, 1,0 mM natri pyruvate, bổ sung10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO) Tế bào cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) nuôi tủ ấm CO 2ở điều kiện 370C, 5% CO2.Chấtthử(20l)phatrongDMSO10%đượcđưavào cácgiếng(khay 96 giếng) để có nồng độ 150g/ml; 75g/ml; 38g/ml; 19g/ml, tế bàođược cố định vào đáy giếng TCA, nhuộm SRB 1giờ 37 0C, sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quảvề hàm lượng màu chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ bước sóng540 nm Xác định khả sống sót tế bào có mặt chất thử từ đóxác địnhkhảnăngức chếtếbàotheocơngthức sau: %ức chếtếbào=100%-% sốngsót 3.5.2 Hoạttínhchốngoxyhóa Hoạt tính chống oxy hóa tổng khả khử sắt tiến hành tạiViệnNghiêncứuvàỨngdụngcôngnghệNhaTrang Xác định khả khử sắt: tiến hành theo phương pháp Zhu cộngsự [120] Lấy 0,2 ml mẫu có nồng độ mg/ml thêm hỗn hợp gồm 0,2 mlđệm phốt phát pH= 7,2 0,2 mL kaliferricyanid 1% Hỗn hợp giữở 50 0C 20 phút Sau đó, thêm tiếp 0,2mL CCl 3COOH 10% Saucùng, lấy 0,125 ml hỗn hợp 0,125ml nước cất đặt vào giếng96 lỗ với 0,02mL FeCl3 Độ hấp thụ củah ỗ n h ợ p t ă n g t i b c sóng655nmchỉrakhảnăngkhửcủahỗnhợp Xác định hoạttính oxy hóat ổ n g s ố t h e o p h n g p h p H u i m i n v cộng [43] Lấy 0,3 ml mẫu có nồng độ mg/ml thêm vào ml chấtphản ứng bao gồm (0,6 M acid sulfuric, 28 mM natri phosphate mMamoni molybdat) Để phản ứng 95 0C giờ, để nguội đo bướcsóng695nm.Hoạttínhoxyhóatổngsốtínhtheoaxidascorbic Xác định hoạt tính ức chế q trình peroxy hóa lipid màng tế bào:Tách não chuột (chuột chủng dòng BALB/c) nghiền đồng thểtrong dung dịch đệm phosphat (pH 7,4), theo tỉ lệ 1:10 nhiệt độ 0-5 0C.Phản ứng bao gồm 1ml dịch đồng thể thêm vào 0.2ml nồng độ mẫuthử 0.8ml đệm phosphat Ủ 37 0C/15 phút (tự oxy hóa) ủ 37 0Ctrong phút với hệ Fenton (FeSO40,1 mM: H2O215 mM theo tỉ lệ 1:1).Kết thúc phản ứng 1ml acid tricloacetic 10% Li tâm lấy dịch trong.Bổ sung 1ml acid thiobarbituric 0.8% 1000C 15 phút.Cuối cùnglàm lạnh ống nghiệm tiến hành đo cường độ mầu máy quangphổ ELISA bước sóng 532 nm Chất đối chứng malonyl dialdehyd(Sigma,USA).Thínghiệmđượclặplại3lần 3.5.3 Hoạttínhkhángvisinhvậtkiểmđịnh Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định tiến hành theo phươngpháp khuyếch tán đĩa thạch Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệNha trang theo phương pháp Vanden; Uchechukwu.U; Nehad.M vàcộng Chất đối chứng Cloramphenicol (10g/đĩa) khuẩnGr(+),T e t r a c y l i n ( g/đĩa)v i k h u ẩ n G r ( - ) v m ẫ u t r ắ n g ( d u ngmôi nước).Các chủng vi sinh vậtkiểm định bao gồm :V i k h u ẩ n Gr( - ) : E coli (vi khuẩn đại tràng), Pseudomonas aeruginosa (trực khuẩn mủ xanh),L.mon.Vi khuẩnGr (+): Bacillus cereus (đường ruột), Streptococcusfaecalis(tiêuhóa),Staphylococcusaureus(tụcầukhuẩn)-Nâm men:Candidaalbicans(nấmsinhdục) 3.5.4 Hoạttínhchốngđơngtụmáu Hoạt tính chống đơng tụ máu tiến hành Phịng Thử nghiệmsinh học, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học CơngnghệViệtNam Hút 10 µl mẫu nghiên cứu dextrose nước cất vào ốngeppendof Hút 50 µl máu chuột (chuột nhắt trắng dịng BALB/c) vào cácống eppendof có mẫu thử aspirin dextrose nước cất.Lắc nhẹ để nhiệt độ phịng Ghi thời giam máu bị đơng tụ Dextrose(Sigma) sử dụng làm đối chứng tham khảo.C c t h í n g h i ệ m đ ợ c lặplại3lần 3.5.5 Hoạttínhlygiảicụcmáuđơng Hoạt tính ly giải cục máu đơngin vitrođược tính hành PhịngThử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa họcvà Công nghệ Việt Nam thực theo phương pháp Dang, Wang vàcộng sự.Lấy 0,5 mlmáu từ hốcmắt chuột cho vàomỗie p p e n d o f v ô trùng (đã cân trước), ủ 37°C 45 phút Sau hình thành cục máuđơng, hút loại bỏ hết huyết (không làm ảnh hưởng đến cục máuđông hình thành) Tiến hành cân ống eppendof có cục máu đôngtrước ly giải để xác định trọng lượng cục máu đông theo công thức: “khốilượngcụcmáuđôngtrước ly giải = khối lượng ống chứa cục máuđộng – khối lượng ống” Với ống eppendof chứa cục máu đôngđã cân trước, thêm vào 100 μl mẫul mẫu TSPS (nồng độ 50 mg/ml) TSP(nồng độ 25 mg/ml) Mẫu đối chứng 100 μl mẫul DMSO 100%; đối chứngtham khảo streptokinase (5 IU) Tất ống đem ủ 37°C 90phút quan sát ly giải cục máu đông Sau ủ, hút loại bỏ chấtlỏng tiến hành cân ống để xác định khối lượng cục máu đơng khơng bịlygiải.Phầntrămlygiảicụcmáuđơngtínhbằngsựchênhlệchvềkhốilượng trước sau ly giải cục máu đơng Tiến hành lặp lại thí nghiệm 3lầnvớimáucủahaichuộtcùngloại CHƯƠNG4:KẾT QUẢVÀTHẢOLUẬN 4.1.Xácđịnhthànhphầnhóahọccủa hạtvà thịtquả me Thành phần hóa học me bào gồm cacbonhydrate, protein,chất béo, lượng tro, sợi thô, axit tổng thành phần bị ảnh hưởngcủa môi trường phát triển Kết nghiên cứu thành phần thịtvàhạtmeđược đưa trênBảng4.1 Bảng4.1Thànhphầnchínhcủaquảme Me Thủy NguyênMetạiCầnGiuộcHảiPhòng LongAn Thành phần Hạtme Thịtme Hạtme Thịtme 11.2 20.6 11.2 22.8 Hàmẩm(%) Protein(%) 13.0 9.2 18.0 8.9 Chất béo(%) 3.9 0.6 3.1 0.4 Sợithô(%) 3.0 3.0 4.6 3.7 Tro(%) 2.5 2.4 2.2 3.2 Carbonhydrate(%) Axit tổng (mg/100g) 66.4 63.7 60.9 60.2 - 9.2 - 11.0 Như vậy, lồi me nghiên cứu có hàm lượng protein hàmlượng lipid thành phần khác tương đương so với công bốtrên.Thành phần polysaccharide chủ yếu hạt thịt me.S o s n h với kết phân tích hàm lượng polysaccharide hạt thịt metrên giới11, 32, 33thì mẫu me thu hái Thủy Ngun - Hải PhịngvàtạiCầnGiuộc –LongAncóhàmlượngpolysaccharidetươngđương 4.2Lựachọnquytrìnhchiếttáchvàmẫu nghiêncứu Kết hiệu suất chiết tách TSP từ hạt thịt me theo 3quy trìnhđã nêu Phần thực nghiệm đưa Bảng 4.2 Kếtquả cho thấy hàm lượng TSP thu tương đối cao, với TSP từ hạt mekhoảng26,2-39,3%wvàtừthịtmelàtừ12,6-17,5%w TSPtừ hạtme TSP từ thịt quảme TSPtừ hạtme TSPtừ thịtquả Bảng4.2:HiệusuấtchiếttáchTSP(%w) Theoquy Theoquy Theoquy trình1 trình2 trình3 28,0 39,3 38,7 14,5 17,5 16,8 26,2 12,6 36,0 16,5 35,7 16,2 Ghi Thu hái tạiThủyNgu yên,Hải Phòng Thuháitại CầnGiuộc, me LongAn Kếtq u ả p h â n t í c h t h n h p h ầ n đ n g c ủ a T S P t r o n g t h ị t v h t m e mẫu thu hái Hải Phòng đưa Bảng 4.3 Kết cho thấyTSPtừthịtvàhạt me đềucó thành phần đường giống nhaub a o g m loại đường glucose, galactose xylose với tỷ lệ khác Kết nàycũng thể giống phổ 1H-NMR mẫu (Hình4.1) Bảng4.3.ThànhphầnđườngcủaTSPchiếttừhạtvàthịtme Mẫu TSP (từhạtme) TSP(từthịtme) Glucose 1 Thành phần đường (%mol) Xylose Galactose 0,22 0,33 0,05 0,17 Hình4.1.Phổ1H-NMRcủamẫuTSPchiếttừhạtmea)từhạtme, b)từthịtme Trong nghiên cứu cấu trúc polysaccharide, thông số cầnkiểm tra độ đa phân tán mức độ phân bố trọng lượng phân tử, sắc đồ củaphép đoGPCcủaTSPthuđượctừhạtvàthịtmeđượcđưaratrênHình 4.2 Sắc đồ GPC cho thấy TSP chiết tách từ thịt me có mức độ đaphân tán cao khơng thích hợp cho việc nghiên cứu cấu trúc chúngtôilựachọnTSPchiếttáchtừhạtlàmđốitượngnghiêncứu củaluậnán Hình 4.2.SắcđồGPC mẫu TSPchiếttừa)hạtme,b)thịtquả me Thành phần đường mẫu TSP chiết từ hạt me mẫu thu háitại vị trí đưa Bảng 4.4 Kết cho thấy thành phần đườngcủahai mẫu TSP chiếttách từ hạt me có nguồn gốct i H ả i P h ò n g v Long An gần giống Do cho nghiên cứu chúngtơilựachọnmẫuhạtmethuháitạiHảiPhịng Bảng4.4 ThànhphầnđườngcủaTSP TSP (chiết táchtừ hạt me) MẫumetạiHảiPhòng (%mol) Glucose Xylose Galactose 0,33 0,22 MẫumetạiLong An (%mol) Glucose Xylose Galactose 0,29 0,20 Phổ1H-NMRcủamẫuTSP tách chiếttừhạtme thuh i t i H ả i Phịng quy trình khác đưa Hình 4.3 Kết chomẫuTSP theoquytrìnhthấyquytrình1vàquytrình3cóđộsạchcaohơn, kết hợp với kết hiệu suất chiết tách (Bảng 4.2), quy trình 3đượcchúngtơilựachọnđểchiếttáchTSPchocácnghiêncứutiếptheo 4.3 XácđịnhcấutrúccủaTSP Hiện GPC phương pháp hữu hiệu để xác định trọng lượngphân tử phân bố trọng lượng phân tử polymer Kết đo GPCcùng với kết phân tích thành phần đường mẫu TSP đưa ratrên Bảng 4.5 Thành phần đường TSP từ hạt me thu hái ThủyNguyên – Hải phòng gồm 03 loại đường glucose, xylose galactose,với tỷ lệ mol Glc : Xyl : Gal = : 0,33 : 0,22 Với trọng lượng phân tửmẫu TSP thu 1,16x106 Da, kết tương tự với cơngtrình cơng bố trọng lượng phân tử TSP từ nguồn khác nhaunằmtrongkhoảngtừ115kDađến2500kDa[32,33,50] Bảng4.5 TrọnglượngphântửvàthànhphầnđườngcủaTSP Mẫu TSP KếtquảGPC Mw Mw/Mn 1,16x106Da 4,46 Thành phần đường (%mol) Glucose Xylose Galacstose 0,33 0,22 Phổ IRc ủ a T S P t h t m e ( H ì n h ) t h ể h i ệ n d a o đ ộ n g đ ặ c t r n g nhóm có mặt phân tử TSP, dao động 3325 cm-1 thể hiệnđặctrưngdaođộnghóatrịcủanhóm-OH;tạitầnsố1417cm-1và1396cm1 thể đặc trưng dao động δ CH2 glucose galactose;tại tần số 1078cm-1thể đặc trưngdao động(C-O), (C-C) đặctrưngcủavòngpyranose,tạitầnsố999cm-1thểhiệndaođộng(C-O), (C-C) liên kết C6(H)-O6, tần số 943cm-1 thể dao độngnhóm δ (C-1-H), tần số 895 cm-1 thể dao động vịng □amomeric.KếtquảphântíchphổIRđượcđưaratrênBảng4.6 Bảng4.6.KếtquảphântíchthànhphầnphổIRcủaTSP Tầnsố(cm-1) 3325 1417,1396 1078 999 943 895 Nhómđặctrưng (OH)) δCH)2 (C-O),(C-C) (C-O),(C-C) δ (C-1-H)) Vòng Liênkết Glucose, galactose Vòng C6(H))-O6 -anomeric Vậy phổ IR mẫu thấy xuất nhóm dao động đặctrưng củap o l y s a c c h a r i d e , n h c ó nhóm dao động c ủ a l i ê n k ế t  (OH),δCH CH 2,(C-O),(C-C)củavịng,(C-O),(C-C) củaliênkếtC-6-H2-O-6,δ(C-1-H), dao động củavịng-anomeric,k h n g t h ấ y c ó n h ó m chức acid Vậy phân tử polysaccharide có liên kết glycoside vànhómOHcủacác gốc đường Phổ 1H 13C-NMR TSP đưa Hình 4.6a b Phổ1HNMR cho thấy phổ phức tạp với độ rộng vạch lớn trùng chập,điển hình cho mẫu polymer có cấu trúc phức tạp Tại vùng anomeric củaphổ1HNMR( t δ4 , - 5, 1 ppm)v C - N M R ( t δ 101, 4- 10 6, ppm)đềucó4pic.Cáctínhiệutừδ3.39-4.51ppmtrênphổ1H-NMRvàδ 69,077,7ppmtrênphổ13C-NMRlàthuộcvềprotonvàcarbonvịngpyranose Các pic khoảng δ 62,964,2ppm carbon vị trí C6 củaglucose galactose C5 xylose Các phổ thu khơng có cáctín hiệu tạp chất vàtín hiệu đặc trưng protein vùng 6,0-7,0ppm, điều chứng tỏ protein loại khỏi mẫu nghiên cứu [24,25].PhổCOSYcủaTSPđượcđưaraởHình4.7.Trênphổ1H-NMR chothấycó4tínhiệuởvùnganomerictạiδ5,12;4,93;4,56và4,55ppmđượckýhiệu tương ứng A, B, C D Sự cộng hưởng từ H1 đến H6 nhómC, D H1 đến H5 nhóm A, B gán cho tín hiệu đượcchỉ phổ COSY Kết hợpvới kếtq u ả t p h â n t í c h t h n h p h ầ n đường TSP gồm loại đường làglucose,galactose xylose,c ó t h ể kết luận C D thuộc glucose galactose; A B thuộc vềxylose.Trên sở độ dịch chuyển hóa học proton, độ dịch chuyểnhóa học tất cacbon đường A, B, C D gán dựatrênphổHSQC(Hình4.8).TrênphổHSQC,cáctín hiệu C1/H1 tại(106,96/4,56ppm); (105,05/4,55ppm)vàC6/H6tại(64,50/3.75–3,95 ppm) thuộc C D (-glucose và-galactose) C6 D tồn ởcả2 dạngthamgiavàkhơngthamgialiênkếtglycosidenhưđượcchỉracó tín hiệu 69.00/3.95ppm và65.50/3.75ppm Tín hiệu củaC / H (64.50/3.60 ppm) gán cho-xylose.Tín hiệucủaC4( 0 ppm) vàcủaC6 (69.50 ppm) củaglucose hoặc-galactose, nhưtínhi ệut ại 82.00ppmcủaC xyloseđềubịdịchchuyểnvềphía trường thấp so với carbon không tham gia liên kết glycoside, điềuđó chứngtỏxylosethamgialiênkếtglycosidetạivịtríC2cịnglucosevà/hoặc galactose tham gia liên kết vị trí C4 C6 Khi so sánh vềđộ chuyển dịch hóahọcvùng anomeric củaglucose vàgalactose thìgalactose nằm trường thấp hơn, kết luận D glucose,điều phù hợp TSP thuộc lớp chất xyloglucan nên glucoselà mạch tồn nhiều trạng thái khơng tham gia liên kếtglycosidevàthamgialiênkếtở vịtríkhácnhau Liên kết glycoside xác định dựa phổ HMBC (Hình 4.9).Trên phổ HMBC thể mối tương quan H1 nhóm B (xylose)và C6 nhóm D (glucose), H6 nhóm D (glucose) C1 nhómA (xylose) B (xylose) H1 nhóm D (glucose) C4 nhóm D(glucose), H1 nhóm C (galactose) C2 nhóm A (xylose) Nhưvậy, qua phân tích phổ NMR kết hợp với phân tích thành phần đường ởtrên kết luận TSP có mạch (14)--Glucose vớimạchnhánhlàXylosevà-Galactose(12)--Xylosecóliênkết(16) vớiglucoseởmạchchính Bảng4.7.Độdịchchuyểnhóahọc trênphổ1Hvà1 CNMRcủaTSP (125/500MHz, D2O,δppm) Đặctrưng C-1/H)1 A nhóm -xylose 101.50/ 5,12 B nhómcuốikhơng khử -xylose C -Galactose D -Glucose C-2/H)2 82.00/ 3.65 C-3/H)-3 C-4/H)-4 72.00/ 3,92 74.50/ 3.65 C-5/H)5 C-6/H)-6 64.50/ 3.60 101.50/ 4.93 74-75/ 3.55 75.50/ 3.72 72.50/ 3.60 64.50/ 3.60 106.96/ 4.56 72.50/ 3.60 75.50/ 3.70 71-72/ 3.90 72-73/ 3.60 64.50/ 3.75 105.05/ 4.55 76.00/ 3.40 75.50/ 3.67 81.00/ 3.60 76.00/ 3,80 64.50;69.00/ 3.75;3,95 Đểnghiên cứuchuỗi trúccủaTSP chiếttừhạtm e c h ú n g t i t i ế n hành phân tích phổ khối ESI-MS TSP-oligosacharide thu bằngphương pháp thủy phân TSP nêu phần thực nghiệm Phổ ESI-MSc ủ a TSPol i gos ac c ri de đư ợc đ a rat r ê n H ì n h 1 Pic c s t i m/z413là của[Glc-Glc-Glc-5H2O+H]+1.P i c mảnhm/z457đươc g n cho[Glc[Xyl]-Glc+H]+1hay nhóm[Glc[Xyl-Gal]+H]+1, pic mảnhm/ z615 của[Glc-Glc-Glc-Glc+H]+1 Pic mảnhm/z1011 gán cho[Glc[Xyl]Glc[Xyl]-Glc[Xyl]] - G l c + H ] +1.T í n h i ệ u m / z 7 l c ủ a [ G l c [ X y l ] Glc[Xyl- Gal]-Glc-Glc]+H]+1và Glc[Xyl-Gal]+H]+1 pic mảnhm/z1224 của:[Glc[Xyl]-Glc[Xyl-Gal]- Phổ ESI-MS/MS mảnhm/z1224 pic mảnhm/z525 đặctrưng cho nhóm ion[Glc-Glc-Glc-Glc-5H2O+H]+1, pic mảnhm/z631 đặctrưngcho nhóm[Glc-Glc-Glc-Glc-H2O+H]+1,pictại mảnhm/z661 đặctrưng cho nhóm[Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc -3H2O+H]+1, pic mảnhm/z833đặc trưng cho nhóm[Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc-Glc+2H2O+H]+1, pic mảnhm/z935 đặc trưng cho nhóm[Glc[Xyl]-Glc[Xyl-Gal]-Glc[Xyl-Gal]+H]+1, pictại mảnhm/ z1025 đặc trưng cho nhóm[Glc[Xyl]-Glc[Xyl-Gal]-Glc-Glc -3H2O+H]+1, pic mảnhm/z1157 đặc trưng cho nhóm[Glc[Xyl-Gal]-Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc3H2O+H]+1 Phổ ESI-MS/MS mảnh tạim/z1077 đưa Hình 4.13, pictại mảnhm/z401 thể củamảnh[Glc[Xyl-Gal] -3H2O+H]+1h o ặ c c ủ a pic mảnh[Glc[Xyl]-Glc] -3H2O+H]+1, pic mảnhm/z479 thể củamảnh[Glc-Glc-Glc-Glc -H2O+H]+1, pic mảnhm/z773 thể đặc trưngcủa mảnh[Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc-Glc -5H2O+H]+1, pic mảnhm/z879 thểhiện mảnh[Glc[Xyl]-Glc[Xyl-Gal]-Glc] -H2O+H]+1,p i c t i m ả n h m/ z945thể mảnh[Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc-Glc[Xyl] -3H2O+H]+1và pic mảnhm/z1011 thể mảnh[Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc+H]+1 Phổ ESI-MS/MS mảnhm/z1011 thu Hình 4.14, hình pic mảnhm/z545 gán cho nhóm[Glc[-Xyl-Gal]-4H2O+H]+1, pic mảnhm/z879đượcgánchonhóm[Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc-Glc-H2O+H] +1 ,pict i mảnhm/z929đ ợ c g n c h o n h ó m [Glc[Xyl]-Glc[Xyl]Glc-Glc+H]+1,p i c mảnhm/z945 gán cho nhóm [Glc-Glc[Xyl]Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-3H2O+4H]+1, pic mảnhm/z992 gán cho nhóm[Glc-Glc[-Xyl]-Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-H2O+H]+1.P h ổ E S I - M S / M S m ả n h m / z đ ợ c đ a ratrênHình4.15,vớipictạim ả n h m / z 0 t h ể h i ệ n đ ặ c t r n g c ủ a nhóm[Glc-Glc -6H2O+H]+1,pictạimảnhm/ z309thểh i ệ n đ ặ c t r n g nhóm[Glc-Glc -H2O+H]+1,pic mảnhm/z337 đặc trưng chonhóm[Glc-Glc-Glc-6H2O+3H]+1,pictạimảnhm/ z3 t h ể h i ệ n đ ặ c t r n g nhóm[Glc-Glc-Glc-4H2O+H]+1, tạim/z439 thể đặc trưng nhóm [Glc-Glc-Glc+3H+]+1 Phổ ESI-MS/MS mảnhm/ z413 đưa Hình4.16, với pic mảnhm/z181 thể đặc trưng nhóm[Glc+2H] +1 ,pictạimảnhm/z254thểhiệnđặctrưngcủanhóm [ Glc[Xyl]- 3H2O+3H] +1 ,pi ctạimảnhm/z309thểhiệnđặctrưngcủanhóm [Glc-Glc -H2O+H]+1,pictạimảnhm/z311thểhiệnđặctrưngcủanhóm [Glc[Xyl]+H]+1, pic mảnhm/z386 thể đặc trưng nhóm[Glc-Glc-Glc-3H2O+3H]+1 CáckếtquảtừphổESI-MSchophépxácđịnhTSPlàmộtgalactoxyloglucan có tập hợp mảnh -Glc-Glc-Glc-, -Glc-Xyl-Glc,-Gl c-Xyl Gal- Kếthợpvớikếtq u ả phân tíchNMR,cấutrúc hóah ọ c c ủ a m o n o m e r c ủ a T S P đ ợ c đ a r a t r ê n Hì nh , t h e o d a n h phápcủalớpchấtxyloglucan,cấutrúcchuỗicủaTSPcódạngGXL Xyl GlcGlcGlc GalXyl Hình 4.16.CấutrúchóahọccủamonomercủaTSP Theo ảnh SEM TSP thấy cấu trúc bề mặt hợp chất cao phân tửcó dạngvơdịnhhình,kếtquảnàyphùhợpvớicáccơngbốtrướcđâycủaJongilChoi[48] KếtquảphépđoLSđượctổnghợp trênBảng4.14 Bảng4.14.Kết quảtừphépđoLScủaTSP Mẫu dn/dc(ml/g) Mwx10-5 Mw/Mn Rg(nm) Rh(nm) (=Rg/Rh) TSP 0.137 11.55 4.36 211.7 229.4 0.92 Giá trịcủa TSP 0,92 điều cho thấy phân tử TSP có dạng hìnhcầu, đặcđiểmhìnhdạngnàytươngtựnhưpolysaccharidetừhạtđậutương từ hạt lanh [92,122] Mơ hình dạng TSP đưa ratrênHình4.19 Hình4.19 MơphỏnghìnhdạngcủaphântửTSP Vậy TSPchiết tách từhạtm e l p o l y s a c c h a r i d e phân nhánh c ó trọnglượng phân tửlà1.15x106Da.T r o n g d u n g d ị c h n c p h â n t TSPcódạnghìnhcầu Cấu trúc khơng gian TSP kích thước cỡ nano xác địnhbằng phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) Kết đo SAXS củadung dịch TSP 0,5% nước biểu diễn qua đường tán xạ 2biểu đồ Kratky Guinier (Hình 4.21 a, b,c) Các dạng biểu đồ điểnhìnhcủapolysaccharide trungtính Qua biểu đồ Guinier, bán kính từ hồi chuyển Rgc=1,3nm Đối vớicác polysaccharide mạch thẳng không phân nhánh carrageenan hayheparin giá trị Rgc khoảng 0,4-0,53nm [106,107], điều cho thấyTSP có mạch nhánh tương đối dài, kếtquản y c ũ n g p h ù h ợ p v i c ấ u trúc hóa học xác định theo phương pháp phổ IR, NMR ESI-MS Kết cho thấy đường tán xạ thu từ thực nghiệm vàtính tốn dựa mơ hình cấu trúc phân tửl t r ù n g n h a u Đ i ề u đ ó m ộ t lần khẳng định cấu trúc hóa học TSP đưa trênHình4.16 Vậycó thểđưa nhậnđịnhsauvềTSPchiếttáchtừhạtme Về cấu trúc hóa học: TSP chiết tách từ me thu thập huyệnThủy Nguyên – Hải Phòng polysaccharide mạch nhánh với cấutrúcchuỗidạng GXL, cấu trúchóahọccủap h â n t T S P đ ợ c đ a r a trênHình4.22 Xyl GlcGlcGlc GalXyl n Hình 4.22 Cấu trúc phân tử TSPVềcấutrúcbềmặt:TSPlàchấtvơđịnhhìnhVề cấutrúckhơnggian:TSPcódạnghìnhcầu 4.4 DẫnxuấtTSPS Tiếnhànhtạocác dẫnxuấtTSPScóDS từ3,3-26,2% Phổ IR TSPS4 (Hình 4.24) thể dao động đặc trưng cácnhóm có mặttrong phân tử TSP,d a o đ ộ n g t i 3 c m -1thể daođộng đặc trưng nhóm -OH liên kết hydro; dao động 1213 cm-1thểhiện dao động đặc trưng nhóm S=O; dao động 824 cm -1thể hiệndaođộngđặc trưngnhómsulfatetạiC2và/hoặc C3 Trên phổ13C-NMR TSPS4 xuất pic δ 69.7ppm,chứng tỏ vị trí C6 galactose hoặc/và glucose bị sulfate, độ chuyểndichhóahọc bịchuyểndịchvềphíatrườngyếu56ppm.Xuấthiệnpictạivùngδ80-84ppmthểhiệnthếsulfatetạivịtríC4,trongkhiđóvớimẫu khơng sulfate vùng δ 74-78 ppm Kết phổ 13C NMR khẳngđịnhnhóm hydroxyl củaglucose vàgalactose ởvịtrí C6 vàxylosevà/hoặcgalactoseở vịtríC4củaTSPđãđượcthếbằngnhómsulfate Kếtquảđotánxạánhsángcủa2mẫuTSPvàTSPS4đượcđưara trênbảng4.17