Táh dòng và biểu hiện gen dps mã hóa deaprenyl diphosphate synthase từ agrobaterium tumefaiens

Coenzyme Q10 có vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp ATP chất dự ữ năng lượng quan trọng của tất cả các loại tế bào và là tr một chất chống oxy hóa mạnh.. Tính chất, vai trò

B GIÁO D Ộ ỤC VÀ ĐÀO TẠ O TRƯỜNG ĐẠ I H C BÁCH KHOA HÀ N I Ọ Ộ

ii

L I C Ờ ẢM ƠN

Trướ c h t, tôi xin bày t lòng bi ế ỏ ết ơn sâu sắ ớ c t i TS Trương Quố c Phong ( Trưở ng phòng thí nghiệm Proteomics Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công – ngh ệ sinh học - Vi n C ệ ông nghệ sinh học và Công nghệ thực p ẩ , Trườ đại họ h m ng c Bách Khoa Hà N ội), người đã tậ n tình hướ ng dẫn và t ạo điề u ki n làm vi ệ ệ c tố t nh ấ t cho tôi trong su t quá trình th c hi ố ự ệ n và hoàn thành lu ận văn.

Tôi cũng xin chân thành cả m ơn t ớ i các th y cô giáo và cán b công tác t i ầ ộ ạ

Vi ệ n Công nghệ inh học và Công nghệ ực phẩm, Viện đào tạo sau đại học s th – Trường Đạ ọ i h c Bách khoa Hà N ội đã dạ y d và t o m ỗ ạ ọi điề u ki n thu n l i cho tôi ệ ậ ợ trong su ố t thờ i gian h ọ c tậ p

Và cu ố i cùng, tôi xin chân thành c ảm ơn gia đình, ngườ i thân, b n bè ạ , và các

b ạ n cùng làm việc tại phòng thí nghiệ đã nhiệt tình động viên, giúp đỡ tôi trong m quá trình h ọ c tậ p và hoàn thi n lu ệ ận văn này.

Xin chân thành c ảm ơn!

Hà N ội, ngày 13 tháng 03 năm 2013

H c viên ọ

Đinh Văn Minh

iii

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứ u c ủa tôi dướ ự i s hư ng d n ớ ẫ

c ủ a TS Trương Quốc Phong và giúp đỡ ủa tập thể cán bộ nghiên cứ ại phòng thí c u t nghi ệ m Proteomics Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học – –

Vi ệ n Công nghệ sinh học và Công nghệ ực phẩ th m – Đạ i học Bách Khoa Hà nộ i Các số ệ li u và k t qu nêu trong lu ế ả ận văn là trung thực và chưa từng đượ c công b ố

Tôi xin hoàn toàn ch u trách nhi ị ệ m vớ i nh ữ ng lời cam đoan trên.

H c viên ọ

Đinh Văn Minh

iv

M C L C Ụ Ụ

LỜI CẢM Ơ N ii

LỜI CAM ĐOAN iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ix

MỞ ĐẦU 1

Ch ương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tính ch t, vai trò và ng d ng c ấ ứ ụ ủ a CoQ10 3

1.1.1 Tính ch t c a CoQ10 3 ấ ủ 1.1.2 Vai trò c ủ a CoQ10 5

1.1.3 ng d ng c a CoQ10 6 Ứ ụ ủ 1.2 Tình hình nghiên c u và s n xu ứ ả ấ t CoQ10 8

1.3 Sinh t ổ ng hợ p CoQ10 8

1.4 Các chiế ược để n l nâng cao kh ả năng sả n xu t CoQ10 11 ấ 1.5 Nghiên c u tách dòng gen ứ dps và biể u hi n ch ng vi sinh v t tái t h p mang ệ ủ ậ ổ ợ plasmid ch ứ a gen dps sinh t ng h p CoQ10 19 ổ ợ 1.6 Nhân nuôi Agrobacterium tumefaciens để thu CoQ10 19

1.7 Tách chi t và tinh s ch CoQ10 21 ế ạ Ch ương 2 VẬT LIỆU VÀ PH ƯƠ NG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 V t li u, hóa ch ậ ệ ấ t, thiế ị t b 23 2.1.1 V t li u nghiên c u 23 ậ ệ ứ 2.1.2 Ch ng vi sinh v t 24 ủ ậ

v

2.1.3 Hóa ch t và thi ấ ế t bị 24

2.2 Ph ng pháp nghiên c u 26 ươ ứ 2.2.1 Tách DNA t ng s 27 ổ ố 2.2.2 Tách plasmid 27

2.2.3 Thi t k m i 28 ế ế ồ 2.2.4 PCR 28

2.2.5 Gi i trình t gen 30 ả ự 2.2.6 Điệ n di DNA trên gel agarose 30

2.2.7 Thôi gel 31

2.2.8 Tinh s ạch DNA 32

2.2.9 T o t bào kh bi n: ạ ế ả ế E coli và A tumefaciens 32

2.2.10 Phương pháp x lý enzyme c t gi i h n 33 ử ắ ớ ạ 2.2.11 Ligation 34

2.2.12 Bi n n ế ạ p: Số c nhi ệt, xung điệ n 35

2.2.12 Phương pháp tách chi t CoQ10 36 ế 2.2.13 Đị nh l ng CoQ10 37 ượ Ch ương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 39

3.1 Tách DNA t ng s t ổ ố ừ A tumefaciens EHA 39

3.2 Thi t k m i s d ế ế ồ ử ụng trong PCR để thu gen dps t ừ A tumefaciens EHA 39

3.3 PCR nhân gen t dps ừ A tumefaciens EHA 40

3.4 Gi i trình t gen ả ự dps ừ A tumefaciens t EHA 42 3.5 K t qu c t và n i ghép gen và vector pCAMBIA1301 44 ế ả ắ ố dps

3.5.1 X lý vector pCAMBIA1301 v i 2 enzym gi i h n 44 ử ớ ớ ạ 3.5.2 X lý enzym gi i h n và tinh s ch gen 45 ử ớ ạ ạ dps

vi

3.6 K t qu ế ả chọ n dòng E coli mang c u trúc pCAM-dps tái t h p 46 ấ ổ ợ 3.6.1 Bi ến nạp vector pCAMBIA1301 mang gen dps vào E coli DH10b 46 3.6.2 Ki m tra plasmid c ể ủ a E coli DH10b tái tổ ợ h p 47 3.6.3 PCR nhân gen dps ừ plasmid của E coli t DH10b tái t h p 48 ổ ợ 3.7 T o ch ng ạ ủ A tumefaciens tái t h p mang c u trúc bi u hi n pCAM-dps 49 ổ ợ ấ ể ệ 3.7.1 T o t bào ạ ế A tumefaciens EHA kh bi n 49 ả ế 3.7.2 Bi ế n nạ ấ p c u trúc pCAM-dps vào A tumefaciens EHA 51 3.7.3 Ki m tra gen ể dps ừ t plasmid c ủ a chủ A tumefaciens ng EHA tái t ổ

h p… 51 ợ 3.8 Kh ả năng sả n xuấ t CoQ10 c ủ a chủ A tumefaciens ng EHA tái t h p 52 ổ ợ 3.8.1 Đánh giá khả năng s inh CoQ10 c a ch ng ủ ủ A tumefaciens EHA tái t ổ

h p so v i ch ng g c 54 ợ ớ ủ ố 3.8.2 Thi ế t lậ p m t s u ki n nuôi ộ ố điề ệ A tumefaciens EHA tái t h p sinh t ng ổ ợ ổ

h p CoQ10 54 ợ KẾT LUẬN 58 KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

DMAPP : Dimethylallyl diphosphate

DNA : Deoxyribonucleic acid

DPS : Decaprenyl diphosphate synthase

DXP : 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate

DXS : 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase FPP : Farnesyl diphosphate

GA3P : Glyceraldehyde-3-phosphate

GPP : Geranyl diphosphate

IPP : Isopentenyl pyrophosphate

LDL cholesterol : Cholesterol có m ật độ lipoprotein thấ p MEP : 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate

RNA : Ribonucleic acid

B ng 3.2 So sánh kh ả ả năng tổ ng hợ p CoQ10 c ủ a chủ A tumefaciens ng EHA tái

t h p ổ ợ ở 2 môi trườ ng khác nhau 55

B ng 3.3 So sánh kh ả ả năng sinh tổ ng h p CoQ10 ợ ở các nhiệt độ khác nhau 56

B ng 3.4 So sánh kh ả ả năng tổ ng hợ p CoQ10 c ủ a chủ A tumefaciens ng EHA tái

t h p ổ ợ ở môi trườ ng có giá tr ị pH ban đầ u khác nhau 56

ix

DANH M C CÁC HÌNH Ụ

Hình 1.1 C ấ u trúc hóa học của coenzyme Q10 3 Hình 1.1 Con đường trao đổ i ch t t ng h p CoQ10 8 ấ ổ ợ Hình 1.2 Các phương pháp điề u khi ển trao đổ i ch ất để tăng sả n xu ấ t CoQ10 12 Hình 2.1 Vector pCAMBIA1301 23 Hình 2.2 Chu trình ph n ng PCR 30 ả ứ Hình 2.3 Ph n ng gi a ethyl cyanoacetate và CoQ10 37 ả ứ ữ Hình 3.1 K t qu n di DNA t ng s ế ả điệ ổ ố thu được từ A tumefaciens EHA 39 Hình 3.2 K t qu nhân gen t ế ả dps ừ A tumefaciens ằ b ng PCR 40 Hình 3.3 X lý pCAMBIA1301 v i ử ớ Nhe I và II 44 Bgl

Hình 3.4 Điện đi sả n ph ẩm thôi gel thu đoạ n 9823 bp 45 Hình 3.5 Gen dps sau khi x lý v ử ớ i Nhe I và II, và tinh s Bgl ạ ch 46 Hình 3.6 Khuẩ ạc tế bào E coli DH10b chứ n l a vector pCAMBIA1301 mang gen

dps trên môi trườ ng th ch LB có kháng sinh kanamycin 47 ạ Hình 3.7 Kế t qu ả điện di plasmid thu đượ c từ các chủ E coli ng DH10b tái t h p 48 ổ ợ Hình 3.8 Di n di s ệ ả n phẩ m PCR v i khuôn là plasmid t 5 dòng ớ ừ E coli DH10b

tái t h p 49 ổ ợ Hình 3.9 Kiể m tra t bào ế A tumefaciens EHA kh bi n 50 ả ế Hình 3.10 Khu n l ẩ ạ c A tumefaciens EHA tái tổ ợp mang ấu trúc h c pCAM- dps

trên môi trườ ng có kháng sinh ch n l c kanamycin 51 ọ ọ Hình 3.11 K t qu ế ả điệ n di s n ph m PCR nhân gen ả ẩ dps t ừ khuôn là plasmid thu

đượ c c a ch ng ủ ủ A tumefaciens EHA tái t ổ ợ h p 52 Hình 3.12 Đườ ng chu n CoQ10 53 ẩ

1

M Ở ĐẦ U

Coenzyme Q10 (CoQ10) là m t coenzyme quan tr ng trong chu i v ộ ọ ỗ ậ n chuy ển điệ n tử trên màng tế bào sinh vật nhân sơ và trên màng ty thể ủa tế c bào sinh v t nhân th ậ ực được tạ o thành t ừ ự s liên k t c a vòng benzoquinone v i m ế ủ ớ ột chu ỗ i isoprenoid kỵ nước Coenzyme Q10 có vai trò quan trọng trong quá trình sinh

t ổ ng hợp ATP (chất dự ữ năng lượng quan trọng của tất cả các loại tế bào) và là tr

m ộ t chất chống oxy hóa mạnh Do đó, CoQ10 đã được sử ụng nhiều làm thực d

ph ẩ m chức năng; ứng dụng trong y tế ằm ngăn ngừa, điều trị nh nhi ề u bệnh về tim

m ạ ch, tiểu đường, Parkinson, ung thư, tăng hệ ống miễn dịch, giảm huyết áp, và th

b ổ sung vào mỹ ẩm như một chất chống oxy hóa, chống lão hóa Với nhiề ứ ph u ng

d ụ ng có lợi như vậy nên nhu cầu về CoQ10 ngày một tăng lên Để đáp ứng nhu cầu

đó đã có nhiề u gi ải pháp được đưa ra như tổ ng h p hóa h c, bán t ng h p và công ợ ọ ổ ợ ngh ệ sinh họ c

Do CoQ10 có c u trúc ph ấ ứ c tạ p nên hi ện nay CoQ10 đượ c sả n xu t ch ấ ủ ế y u

b ằng con đườ ng sinh học ờ vi khuẩn như A tumefaciens, P denitrificans, nh

Cryptococcus laurentii, Tricosporon sp., Sporobolomyces salmonicolor, Rhodobacter sphaeroides, Để nâng cao hi u qu ệ ả ả s n xuấ t CoQ10, nhi u nghiên ề

c ứ u trên thế ới đã tập trung vào tối ưu hóa quá trình lên men chủng tự nhiên hoặc gi

c ả i biến chủng từ ững năm 1993 Việc cải biến chủng được thực hiện bằng cách nh gây độ t bi n ng u nhiên ho c t o ch ng tái t h p M c dù các ch ế ẫ ặ ạ ủ ổ ợ ặ ủng độ t bi n có ế

kh ả năng tổ ng hợp CoQ10 tăng, tuy nhiên các chủng này rất khó có thể ải biến để c tăng thêm hiệ u su t Hi n nay nhi u nghiên c ấ ệ ề ứu đã và đang tậ p trung vào vi c t o ệ ạ

ch ủ ng E coli tái t h p mang gen mã hóa m t s ổ ợ ộ ố enzy me quan tr ng c ọ ủa con đườ ng sinh t ng h p CoQ10 ổ ợ như dxs, dps Tuy nhiên, kh ả năng tổ ng hợ p CoQ10 còn th ấ p

so v ớ i các chủng độ ế t bi n Ngoài ra, các ch ủ ng E coli tái t ổ ợ h p không ch ng h ỉ ổ t ợ p CoQ10 mà còn t ng h p c ổ ợ ả CoQ8 và CoQ9 Đây là điề u b t l ấ ợi đặ c bi t là khi s ệ ả n

xu t ấ ở quy mô công nghiệp vì cần rất nhiều bước tinh sạch và hoàn thiện sản phẩ m

Vi khu ẩ n Agrobacterium tumefaciens là m t trong nh ng vi khu ộ ữ ẩn đang đượ c sử

d ụng để ả s n xuất CoQ10 hiện nay do chúng có nhiều ưu điểm như có hàm lượ ng

2

CoQ10 tương đố i cao so v i các vi sinh v t khác, ch t ng h ớ ậ ỉ ổ ợp CoQ10, môi trườ ng nuôi đơn giả n, r ti n, phù h p s n xu t quy mô công nghi p ẻ ề ợ ả ấ ở ệ

Chi ến lượ c sử ụ d ng chính ch ng ủ Agrobacterium tumefaciens làm chủ ng ch ủ

để ả c i bi n gen t o ch ng tái t h p có kh ế ạ ủ ổ ợ ả năng tổ ng h ợp CoQ10 tăng lên là mộ t

gi ả i pháp khả thi và đã bướ ầ c đ u thành công bởi nhóm nghiên cứu tại Hàn Quốc năm 2008 Ở Vi t Nam hi n nay các nghiên c u v CoQ10 m i ch là các nghiên ệ ệ ứ ề ớ ỉ

c ứ u về phân lập các chủng nấm men có khả năng sinh tổng hợp CoQ10 (Đ Th Lương và cs, 2009; Tr Th L Quyên và cs, 2010) Do đó, chúng tôi thự c hi ện đề

tài: “Tách dòng và bi ể u hiện gen dps mã hóa Decaprenyl Diphosphate Synthase

t ừ Agrobacterium tumefaciens” ph ụ c vụ phát triển chủ A tumefaciens tái tổ ợp ng h cho s n xu t CoQ10, v ả ấ ớ i các mụ c tiêu sau:

- Tách dòng thành công gen mã hóa Decaprenyl Diphosphate Synthase dps

- T ạ o cấu trúc biểu hiện gen dps tái tổ ợp phù hợp chủng chủ h

Agrobacterium tumefaciens

- T o ch ng ạ ủ Agrobacterium tumefaciens mang c u trúc bi ấ ể u hiệ n tái t h p ổ ợ

N ộ i dung nghiên cứ : u

- Tách DNA t ng s t ổ ố ừ A tumefaciens EHA

- Phân l p gen ậ dps mã hóa decaprenyl diphosphate synthase t ừ A

tumefaciens EHA

- Tách dòng gen vào vector bi dps ể u hiệ n

- T o ch ng ạ ủ A tumefaciens tái t h p mang vector bi u hi n ch ổ ợ ể ệ ứ a gen dps

- Nghiên c u t ng h p CoQ10 t ứ ổ ợ ừ chủ A tumefaciens ng tái t h p ổ ợ

3

Chương 1 Ổ T NG QUAN 1.1 Tính ch ấ t, vai trò và ứ ng d ng c ụ ủ a CoQ10

1.1.1 Tính chấ ủ t c a CoQ10

CoQ10 là m t ch ộ ất dinh dưỡ ng gi ng vitamin có vai trò quan tr ng trong s ố ọ ả n

xu ất năng lượ ng tế bào thường được coi là là một ubiquinone do cấu trúc hóa học ;

và đượ c phân bố ộ r ng rãi trong t nhiên ự

CoQ10 đượ c phát hi n ra b i ti n s Frederick L Crane i h c Wisconsin ệ ở ế ỹ ở đạ ọ vào cu i nh ố ững năm 1950 , trong nghiên c ứ u củ a ông v hóa sinh h ề ọ c củ a chu i vận ỗ chuy ển điệ n tử ty thể, còn gọi là chuỗi hô hấ p H ợ p chất này được gọi là coenzyme Q10 vì có cấ u trúc quinone và chu i bên 10 ti u ph n isoprene Vai trò c a CoQ10 ỗ ể ầ ủ trong chu i v n chuy ỗ ậ ển điệ n t ử đượ c miêu t ả ần đầ l u b i ti n s Peter Mitchell ở ế ỹ , ngườ i Anh – đã đoạ t gi i Nobel cho nghiên c u c a mình ả ứ ủ

Hình 1.1 C ấ u trúc hóa học của coenzyme Q10 (Catarina M Q và cs, 2007)

4

M t s c tính hóa lý c ộ ố đặ ủa CoQ10 đượ c th hi n b ể ệ ở ả ng 1.

B ng 1(a) Tính ch t c a Ubiquinone (CoQ10) ả ấ ủ

Tr ng thái ạ Tinh th u cam ( nhi ể mà ở ệt độ phòng)

Công th c phân t ứ ử C59H90O4

Kh ối lượ ng phân t ử 863,358

Nhi ệt độ nóng ch y ả 49oC

Tính tan Không tan trong nướ c

Tan ít trong d u và ch t béo ầ ấ Tan trong các dung môi không phân c c ự

Tính tan Không tan trong nướ c

Tan ít trong d u và ch t béo ầ ấ Tan trong các dung môi không phân c c ự Các h p ch ợ ấ t CoQ phân b r ng rãi trong t nhiên, t vi sinh v t t i th ố ộ ự ừ ậ ớ ự c v ậ t

và độ ng vật (bao gồm cả con ngườ Ở người và một số loài khác, i) chu ỗ i phụ được

c ấ u tạo từ 10 tiểu phần isoprene và được gọi tên là CoQ10 ịt từ các cơ quan như Th tim và cơ chứ a nhi u CoQ10 nh t Nói chung, các mô v i nhu c ề ấ ớ ầu năng lượ ng cao chứa lượ ng CoQ10 khá l n Trong các th c ph m có ngu n g c th c vật, cây bông ớ ự ẩ ồ ố ự

c ả i xanh (broccoli) và rau bi na (spinach) chứa lượng khá lớn CoQ10 Một số ầu - d

th ự c vật thô như dầu đậ u nành và d u c ầ ọ cũng là nguồ n thu t t CoQ10 ố

CoQ10 đượ ổ c t ng h p ợ trong cơ thể như th nào? ế

CoQ10 t ồ n t i trong h u h ạ ầ ế ế t t bào c a cơ thể ủ và trong h tu n hoàn (trong ệ ầ các lipoprotein) Th ự c tế ọ ế bào đề m i t u có kh ả năng tổ ng h p CoQ10 ợ S t ự ổ ng h ợ p nội sinh CoQ10 là một quá trình rất phức tạp cần nhiều vitamin như vitamin B6,

5

vitamin B12, folic acid , niacinamide, pantothenic acid vitamin C, và m t s , ộ ố khoáng chấ t C u trúc vòng ấ quinone đượ c tạ o ra t amino acid tyrosine, các nhóm methyl ừ trên vòng đượ c cung cấp bởi methionine, và chuỗi phụ isoprene thu được từ con đườ ng mevalonate Do đó, quá trình ổ t ng h p CoQ10 ph thu c vào m t ngu n ợ ụ ộ ộ ồ cung c ấp đầy đủ ấ r t nhiề u ti ề n chấ t và cofactor, và s ự thi u m t ho ế ộ ặ c nhi ề u các thành ph ầ n cầ n thi t này có th ế ể ảnh hưở ng x ấu đế n quá trình sinh t ng h p CoQ10 ổ ợ Gây thi u h ế ụt lượ ng CoQ10 c n thi ầ ết cho cơ thể

CoQ10 đượ c h p th ấ ụ vào cơ thể như th ế nào?

CoQ10 là m t ch t béo tan và vì th ộ ấ ế nó đượ c hấ p th ụ ống như bấ gi t k ỳ ch t ấ béo nào khác trong kh u ph n c a chúng ta Quá trình tiêu hóa giúp gi i phóng ra ẩ ầ ủ ả CoQ10 t ừ ỗ h n h p th ợ ức ăn Vớ i CoQ10 nguyên ch , thì quá trình tiêu hóa d dày là ấ t ạ không c n thi t Trong ru t non, quá trình ti ầ ế ộ ết từ tuy n tụ ế y và m t làm d quá trình ậ ễ chuy ể n thành thể ữa (emulsification) và tạo mixen đây là 2 quá trình cần thiết s – cho s ự ấ h p th ụ ủ c a chấ t béo theo ru ột non Không có cơ chế ậ v n c huyển “chủ độ ng” cho quá trình h p th ấ ụ ch ấ t béo Khi CoQ10 đượ c th m b ấ ở i các tế bào bi u mô ru ể ộ t,

nó đượ c v n chuy n theo h b ch huy ậ ể ệ ạ ết như mộ t ph n c a h ầ ủ ạt nhũ trấ p (chylomicron) và cu ối cùng đượ c hấ p thu b ởi gan để đóng gói vào các hạ t lipoprotein và đượ c gi i phóng vào h tu n hoàn ả ệ ầ

1.1.2 Vai trò c a CoQ10 ủ

Ch ức năng quan trọ ng nhất của CoQ10 trong cơ thể chúng ta là sản xuấ t năng lượ ng t bào H p ch t này là 1 thành ph n quan tr ng c a ty th mà có m t ế ợ ấ ầ ọ ủ ể ặ trong m i t ọ ế bào trong cơ thể chúng ta Ty th có th ể ể đượ c xem như là các t ế bào nhiên li ệu nơi mà năng lượ ng sinh h c (ATP ọ - adenosine triphosphate) được tạ o ra CoQ10 cũng là mộ t ch t ch ng ôxy hóa t t và nó giúp b o v các mô và các thành ấ ố ố ả ệ

ph ần tế bào trong cơ thể không bị ự phá hủy bởi các gốc tự do Ngoài ra, CoQ10 s cũng có nhữ ng ch ức năng quan trọng khác trong cơ thể

6

Ho ạt độ ng c ủa CoQ10 trong cơ thể

CoQ10 là m t thành ph n quan tr ng c ộ ầ ọ ủ a chuỗ ậ i v n chuy ển điệ ử n t (chu i hô ỗ

h ấ p) trong ty thể nơi mà năng lượng thu được từ quá trình phosphoryl hóa ôxy hóa các sản phẩm của quá trình trao đổi chấ t axit béo, protein và carbohydrate đượ c chuy ển thành năng lượ ng sinh học (ATP adenosine triphosphate) điều khiển bộ - máy t bào và t t c các quá trình t ng h p sinh h c CoQ10 ế ấ ả ổ ợ ọ có chức năng như là

m ộ t cofactor quan trọng trong các hoạt động của hệ ống enzyme được gọi là phức th

h ệ I, II và III trong chuỗi vận chuyển điện tử Nó vận chuyển điện tử ừ ức hệ I t ph (nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase) và ph ứ c hệ II (succin ate dehydrogenase) t ớ i phức hệ III (ubiquinone cytochrome c reductase) b ng tác d - ằ ụ ng

c ủ a đ ặ c tính ôxy hóa khử ủa nó Nó tham gia toàn bộ quá trình trên của quá trình c

v ận chuyển điện tử thu ộc chuỗi vận chuyể n đi ệ n tử, mà tại đó năng lượng sinh học

c ầ n cho ự ống như ATP được tạo ra Do đó, CoQ10 có vai trò quan trọng trong s s năng lượ ng sinh h c c a t bào ọ ủ ế

CoQ10 cũng là mộ t ch t ch ng ôxy hóa tan trong ch t béo quan tr ng và nó ấ ố ấ ọ giúp b o v ả ệ các c ấ u trúc s ng kh i s phá h y c ố ỏ ự ủ ủ a gốc tự do t ừ ả c hai ngu n n ồ ộ i sinh và ngoại sinh CoQ10 cũng có nhiều chức năng quan trọng khác trong cơ thể

Nó giúp duy trì độ ổn đị nh c a màng và có m t vai trong trong tín hi u t bào (cell ủ ộ ệ ế signaling)

Vai trò c ủa CoQ10 đố ớ ứ i v i s c khỏe con ngườ i?

Do có vai trò quan tr ọng trong năng lượ ng sinh h ọ c tế bào và là mộ t ch ấ t chố ng ôxy hóa quan tr ng, CoQ10 có vai trò c n thi t cho s s ng B i vì nó tham ọ ầ ế ự ố ờ gia vào sinh lý b nh h ệ ọ c củ a nhi u tr ng thái b ề ạ ệnh, cho nên đả m b o m ả ột lượng đủ CoQ10 là c n thi ầ ết để duy trì s c kh ứ ỏ e tố t và phòng ch ố g cũng như giả n m thi ể u nguy cơ củ a nhi u b ề ệnh do lão hóa và trao đổ i ch t mãn tính ấ

1.1.3 Ứ ng dụng của CoQ10

CoQ10 đượ c s d ử ụng như là mộ t ch t làm gi m s phá h y do ôxy hóa ty ấ ả ự ủ

th S d ể ử ụng CoQ10 đườ ng uống có thể có tác dụng vào ty thể, nhưng chỉ đối với

m ột lượ ng hạn chế Mộ t cách đ vượ ể t qua giới hạn này là hướng CoQ10 vào ty thể

u ố ng thành công ở người MitoQ ngày nay đã được phát triển như một dược phẩ m Các thí nghi m v ệ ới độ ng v t ch ậ ỉ ra r ằ ng MitoQ th ể ệ hi n mộ ố ệ t s hi u qu ả ch ng ôxy ố hóa trong các mô M t khía c nh h p d ộ ạ ấ ẫ n c ủ a vi ệ c sử ụ d ng các chấ t ch ng ôxy ố hướ ng vào ty th là chúng có th ể ể đượ ứ c ng d ng cho r t nhi u b nh và nhi ụ ấ ề ệ ều cơ quan vì s phá h y ty th do ôxy hóa gây ra r t nhi u b nh Ngoài ra, các ch ự ủ ể ấ ề ệ ấ t

ch ố ng ôxy hóa này có th ể đượ c ứ ng d ụng đố i với các tổn thương cấp tính như ổ t n thương mô do thiế u máu c c b trong ph u thu t, ng d ụ ộ ẫ ậ ứ ụng trong trườ ng h p bán ợ cấp tính như tổn hại gan do viêm gan, và ứng dụng cho các bệnh mãn tính do lão hóa như Parkinson Dạ ng kh c a CoQ10 b o v cơ th kh i các stress ôxy hóa và ử ủ ả ệ ể ỏ ngăn cả n s gây ra và ti n trình peroxy hóa lipid CoQ10 làm gi m s ự ế ả ự ôxy hóa cholesterol có m ật độ lipoprotein th ấp (LDL cholesterol) vì nó đượ c chuy n vào ể trong máu v ớ i LDL cholesterol CoQ10 làm hạ h s n c ế ự tích t ụ ủ c a các superoxide anion trong hô h p hi u khí ấ ế Ở Caenorhabditis elegans , CoQ10 làm gi m m ả ứ c superoxide anion và làm kéo dài thờ i gian s ng c a nó ố ủ S cerevisiae độ ế t bi n m ấ t gen COQ3 b ị đáp ứ ng quá m n v i lipid peroxide do thi u quá trình sinh t ng h ẫ ớ ế ổ ợ p CoQ ở chủng Tình trạng này không xảy ra khi đưa vào một plasmid chứa gen COQ3

CoQ10 như mộ t ch t ph gia trong m ph m ấ ụ ỹ ẩ ở kem dưỡ ng da làm lo i b ạ ỏ các g c t ố ự do trên da đố i v ới ngườ i già Vi ệ c s ử ụng CoQ10 cũng d ngày càng gia tăng trong công nghi p m ph ệ ỹ ẩm do các đặ c tính ch ng ôxy hóa c a nó ố ủ

CoQ10 cũng có thể đượ c s d ử ụng như chấ ổ t b sung cùng v i các “statin” (là ớ các chấ t kìm hãm c a HMG CoA reductase, do statin kìm hãm c ủ - ạ nh tranh quá trình sinh t ng h ổ ợp cholesterol và CoQ10 Do đó, bệnh nhân mà s ử ụng statin như d

8

lovastatin và pravastatin thì th y gi m CoQ10 trong huy t thanh và mô ấ ả ế Liệ u pháp

s d ử ụng đồ ng th ời statin và CoQ10 thường đượ c khuyên dùng

S d ử ụ ng CoQ10 với các bệnh nhân đái đường typ 2 cũng làm giảm áp lực máu tâm thu và giảm HbA1c R ấ t nhiều bệnh liên quan đến nồng độ CoQ10 th ấ p, bao g m b nh tim m ch, Parkinson, ch ng lo ồ ệ ạ ứ ạn dưỡng cơ bắ , ung thư vú và các p

lo ại ung thư khác, bệnh đái đườ ng, b ệ nh vô sinh nam, hội chứng suy giảm miễn

d ị ch mắc phải, hen, các bệnh tuyến giáp, và bệnh quanh răng đều có thể được cải thi n nh vi ệ ờ ệ c sử ụng CoQ10 d

1.2 Tình hình nghiên cứ u và s ả n xuấ t CoQ10

1.3 S inh tổ ng h ợ p CoQ10

CoQ10 có con đườ ng sinh t ng h p gi ng v i c ổ ợ ố ớ holesterol Con đườ ng sinh

t ổng hợp CoQ10 đượ ề c đ xu ất từ các kết quả ủa phân tích di truyền các biến chủ c ng

E coli và S cerevisiae Sinh t ổ ng hợp CoQ10 thườ ng bao g m 3 ph n (Hình ồ ầ 1.1): tổng hợp vòng quinonoid, tổng hợp decaprenyl diphosphate, và biến đổi vòng quinonoid M c dù có s khác nhau trong vi c cung c ặ ự ệ ấ p ti ề n ch t cho prokaryotes ấ

và eukaryotes

Hình 1.1 Con đường trao đổ i ch ấ t tổ ng h p CoQ10 (Marimuthu và cs, 2010) ợ

9

 T ổ ng hợ p vòng quinonoid

S t ự ạ o thành 4 hydroxybenzoate (p - HBA) t ừ chorismate là bướ c đ ầ u tiên trong sinh t ng h p CoQ Ph ổ ợ ả ứng này đượ n c xúc tác bở i enzym chorismate pyruvate lyase đượ c mã hóa b i gen ubiC ở ở E coli pHBA, ti n ch t c a vòng ề ấ ủ quinonoid thu đượ ừ con đườ c t ng shikimate , đây là con đườ ng quan tr ọng để ổ t ng

h ợp các axit amin thơm thông qua chorismate HBA đượ p c sử ụng cho quá trình d prenyl hóa và bi ế n đ ổ i vòng Ở độ ng v t có vú, ậ pHBA được tạ o thành t axit amin ừ cần thiết tyrosine do thiếu con đường shikimate Nấm men dường như sản xuất

pHBA bằ ng cách s d ng 2 cách khác nhau, tr c ti p t chorismate s d ng ph n ử ụ ự ế ừ ử ụ ả

ứ ng chorismate pyruvate lyase gi ng v i ố ớ E coli ho ặ c thay th t tyrosine gi ng v i ế ừ ố ớ các eukaryotes b ậ c cao hơn.

 T ổ ng hợ p decaprenyl diphosphate

T ấ t cả isoprenoid được tổng hợp từ các đơn vị chung, các tiền chất trao đổi chất chung, IPP và đồ ng phân c a nó dimethylallyl diphosphate (DMAPP) Hai con ủ đườ ng riêng bi ệt, con đườ ng mevalonate (MVA) n i ti ổ ếng và con đườ ng 2-C- methyl- D- erythritol 4 phosphate (MEP) khá mới hoặc con đường n MVA, tạo ra - on- IPP Ở E coli có th là h u h t các vi khu n khác và t , ể ầ ế ẩ ả o xanh, t ng h p IPP sử ổ ợ

d ụng con đườ ng MEP bắt đầu theo một phả ứng tổng hợp khở ầ n i đ u giữa pyruvate

và glyceraldehyde -3- phosphate (GA3P) để ạ t o ra IPP và DMAPP Th ự c vậ t và

Streptomycetes s d ử ụ ng cả 2 con đường Phả ứng đầu tiên của tổng hợp IPP ở E n

coli là hình thành 1 -deoxy-D-xylulose-5- phosphate (DXP), đượ c xúc tác bởi DXP synthase (DXS) DXP tr ả i qua quá trình x p x p l i và s ắ ế ạ au đó đượ c khử thành MEP

b ở i EXP reductoisomerase (DXR) được mã hóa bở ispC (dxr) Một loạt các enzym i

c ủa con đường MEP đượ c mã hóa bở ispD (ygbP), ispE (ychB), ispF (ygbB), ispG i

(gcpE), và ispH (lytB) sau đó đượ ử ụ c s d ng trong các ph n ng ti ả ứ ếp theo để chuy n ể MEP thành IPP và DMAPP, mà đượ c đ ồng phân hóa theo enzym đượ c mã hóa b i ở

idi

Các vi sinh v ật Eukaryote như nấ m m ố c và nấ m men thi ếu con đườ ng MEP

và d ựa vào con đườ ng MVA v i m ớ ột số ngo ệ ạ i l Sinh tổng hợ p IPP s ử ụ d ng con

Ở bướ c ti p theo c ế ủa con đườ ng này, farnesyl diphosphate (FPP) synthase xúc tác s ự ắ b t c p 1’ 4 c ặ - ủa IPP vớ i DMAPP và geranyl diphosphate (GPP) d ẫn đế n

s ự hình thành lần lượt GPP và FPP Sản phẩm này được kéo dài bởi decaprenyl

diphosphate synthase (DPS) Nhiều DPS đã đượ c tách dòng t ừ nhi ề u lo i sinh v ạ ậ t như S pombe, Gluconnobacter suboxydans, Paracoccus denitrificans, và Agrobacterium tumefaciens

 Bi ế n đ ổ i vòng

Prenyl hóa là bướ c đ ầ u tiên trong bi ến đổi vòng và đượ c xúc tác b i m t ở ộ enzym liên k t màng, HBA:decaprenyl transferase, ế p chuyể n decaprenyl diphosphate Các ph ả ứ n ng bi ến đổ i vòng khác, bao g m 1 decarboxyl hóa, 3 ồ hydroxyl hóa và 3 ph n ng methyl hóa x ả ứ ả y ra vớ ứ ự i th t khác nhau prokaryote và ở eukaryote CoQ cu ối cùng đượ c tổ ng h ợp như là mộ t kế t qu ả ủ c a các phả ứ n ng biến

đổ i vòng n m men, tiề Ở ấ n ch t chu i ph đư c sử ụ ấ ỗ ụ ợ d ng cho prenyltransferase là

h exaprenyl diphosphate Sản phẩm của phả ứng này, hexa prenyl p n 3- HBA, tr ả i qua các phả ứ n ng bi ến đổ i vòng ti p theo trong m t th t khác so v i E coli ế ộ ứ ự ớ ở Do đó, 3- hexa prenyl pHBA t ải qua hydroxyl hóa, methyl hóa, và decarboxyl hóa thành 2 r - polprenyl-6-methoxyphenol - O methylase được mã hóa bởi gen COQ3 như UbiG

chuy ể n 2 -polyprenyl-3-methyl-5-hydroxy-6-methoxy-1,4- benzoquinol thành ubiquinol Ở con đường sinh tổng hợp CoQ này, pHBA:polyprenyl diphosphate transferase, chuy n chu i ph isoprenoid thành khung quinone ể ỗ ụ pHBA đượ c cho là

m ộ t enzym hạn chế ố ộ t c đ pHBA:polyprenyl diphosphate transferase có tính đặc

hiệ u cơ ch ấ t rộng, và chiều dài củ a cơ ch ất isoprenoid không làm thay đổ i hoạt tính chuy ển đổ i của nó Chiều dài của chuỗi phụ không đượ c xác đ ị nh bởi tính đặc hiệu

11

cơ ch ấ t c a pHBA:polyprenyl diphosph ủ ate transferase, nhưng đượ c xác đ ị nh b i ở tính ch t c a isoprenoids ấ ủ Ở E coli, quá trình prenyl hóa c ủ a p HBA thành 3-

octaprenyl pHBA được xảy ra bởi enzym liên kết màng

pHBA:octaprenyltransferase Enzym này là không đặ c hi u và có th s d ng nhi u ệ ể ử ụ ề prenyl diphosphate như là các tiề n chất chuỗi phụ Enzym này cũng không có tính

đặ c hi u i v i cơ chất thơm này Chiề ệ đố ớ u dài c a chu i ph prenyl là m t h ng s ủ ỗ ụ ộ ằ ố

đố ớ i v i m i sinh v ỗ ật, điều này đượ c quy ết đị nh b i s s n có c a prenyl diphosphate ở ự ẵ ủ trong t bào 3 ế -octaprenyl pHBA đượ c decarboxyl hóa thành 2-octaprenylphenol

b ở i 3 -octaprenyl pHBA decarboxylase 2 octaprenylphenol này trải qua 3 phả ứ - n ng hydroxyl hóa và 3 ph ả ứ n ng methyl hóa d ẫn đế n s ự ạo thành ubiquinol và sau đó là t CoQ

1.4 Các chi ế n lư ợc để nâng cao kh ả năng sả n xuấ t CoQ10

Nhi ề u nỗ ực đã được thực hiện để ản xuất CoQ10 sử ụng vi khuẩn, đây là l s d phương pháp được ưa thích hơn so vớ ổ i t ng h p hóa h c do c u trúc ph c t p c a ợ ọ ấ ứ ạ ủ CoQ10 Các vi khuẩn chứa CoQ10 bao gồ A tumefaciens, P denitrificans, m

Cryptococcus laurentii, Tricosporon sp., Sporobolomces salmonicolor, và Rhodobacter sphaeroides đã đượ ử ụng trong các quá trình lên men để ả c s d s n xuất CoQ10 b ng cách t ằ ối ưu hóa môi trường và điề u ki n nuôi c ệ ấ y Tuy ể n ch ọ n chủng thông qua độ t bi n hóa h ế ọc đã đượ ử ụng để thu đượ c s d c nh ng bi n ch ng th hi n ữ ế ủ ể ệ năng suất sinh CoQ10 tăng (Yoshida và cs, 1998) Ngoài ra, E coli ch s n xu t ỉ ả ấ CoQ8, đã đượ c bi n n p ế ạ gen dps t ừ A tumefaciens (Lee và cs, 2004) ho c P ặ

denitrificans (Takahashi và cs, 2003) Để chuy ển CoQ8 thành CoQ10 Các phương pháp khác nhau để tăng cườ ng s n xu ả ất CoQ10 đượ c th hiệ ể n tóm t t trong Hình ắ 1.2

12

Hình 1.2 Các phương pháp điề u khi ển trao đổ i ch ất để tăng sả n xu ấ t CoQ10

(Marimuthu và cs, 2010)

 Gây độ t biến hóa họ ể c đ tăng sả n xuấ t CoQ10

S c ự ải thiện năng suất sinh CoQ10 đạ được thông qua gây đột biến hóa học t

Rhodopseudomonas sphaeroides làm tăng năng suất sinh CoQ10 lên 770 mg/L

(Sakato và cs, 1992) Các bi n ch ng kh ế ủ ả năng sinh CoQ10 cao đượ c lựa chọ ựa n d

trên m ộ t số ể ki u hình gián ti p M ế ục đích là để tìm ra các bi n ch ế ủ ng có con đườ ng

t o ạ CoQ10 điều hòa ngược bằng cách lựa chọn các biến chủng với khả năng sinh

trưở ng cùng v i các ch t kìm hãm ớ ấ con đườ ng ho c quá trình hô h ặ ấ p Ví d , bi n ụ ế

chủ ng A tumefaciens i kh v ớ ả năng sinh CoQ10 cao hơn chủng ban đầu đượ c xác

đị nh d a trên kh ự ả năng sinh trưở ng trong s có m t c a các đ ng phân c u trúc c a ự ặ ủ ồ ấ ủ

CoQ10, daunomycin và menadione Các biến chủng do chất hóa học cho đến nay đã

đượ ự c l a ch n d a trên kh ọ ự ả năng sinh trưở ng trong s có m t c a L-ethionine, m t ự ặ ủ ộ

13

đồ ng phân c a methionine, là ti n ch t cung c ủ ề ấ ấp cho 3 nhóm methyl làm thay đổ i vòng benzoic CoQ10 (Yoshida và cs, 1998) Các đồ ng phân c a ủ axit amin thơm và các chấ t kìm hãm hô h ấp cũng có thể đượ c sử ụ g để ả d n c i thi ện năng suấ t sinh CoQ10 trong các bi ế n chủng A tumefaciens này Các biế n ch ủ ng Rhodobacter

sphaeroides được lựa chọn dựa trên kiểu hình sản xuất sắc tố ủ c a chúng nơi mà sự

có m ặ t của các khuẩ ạc màu xanh được sử ụng như là sự ỉ ị ủ n l d ch th c a thành ph ầ n carotenoid gi m b t (Yoshida và cs, 1998) S ả ớ ự tăng mứ c đ ộ CoQ10 trong các bi ế n chủng Protomonas extorquens và Rhodopseudomonas sphaeroides KY8598 cũng liên quan t i thành ph n carotenoid th p (Sakato và cs, 1992; Urakami và Hori ớ ầ ấ - Okubo, 1988) S liên quan gi a thành ph n carotenoid th p và s ự ữ ầ ấ ản lượ ng CoQ10 tăng có thể do các t ế bào này đang bù đắ p s m ự ất đi carotenoids là chấ t ch ng ôxy ố hóa bằng cách tăng lên ồng độ ủ n c a một ch t ch ấ ống ôxy hóa khác là CoQ10 để ả b o

v ệ chúng khỏi sự phá hủy do ôxy hóa hiếu xạ ion năng lượ C ng th p v i ion ni ấ ớ tơ đượ ử ụ c s d ng b ổ sung cho độ t bi n hóa h ế ọc để ả c i thi n ch ng (Gu và cs, 2006) ệ ủ

 Điề u khi n ể trao đổ i ch ất để tăng sả n lư ợ ng CoQ10 ở E coli

Phân l ậ p các chủ ng s n xu t t nhiên và các bi n ch ng hóa h ả ấ ự ế ủ ọ c của chúng

là chi ến lượ c thành công nh t trong phát tri ấ ể n các chủ ng vi sinh v ật để ả s n xuất thương mạ i CoQ10 Tuy nhiên, do hi u bi t v các enzym sinh t ng h p và các cơ ể ế ề ổ ợ chế điề u hòa trong s n xu ả ất CoQ10 tăng lên, nên các cơ hộ i cho đi u khi n ề ể trao đổ i chấ ủ t c a s ả n xu t CoQ10 phát tri n vi sinh v t H u h ấ ể ở ậ ầ ế t các n ỗ ự l c để điề u khi n ể con đường sinh CoQ10 đượ ậ c t p trung vào E coli vì vi khu ẩ n này r t phù h p cho ấ ợ các biến đổ i di truy n và lên men quy mô l ề ớn Các enzym DXS và DXR đượ c xem

là các enzym quan tr ọng để sinh t ng h ổ ợp CoQ10 thông qua con đườ ng MEP S ự

bi ể u hiện tăng DXS ạo ra nhiều kết quả dương tính, đặc biệt trong sản xuất t carotenoid I PP synthase và FPP synthase thúc đẩy sinh tổng hợp tấ ả FPP, là cơ t c E- chấ t allylic c ủa DPS, enzym điề u khi n chi u dài chu i và cung c ể ề ỗ ấp đuôi kỵ nướ c dài pHBA:polyprenyltransferase kết hợp vớ các nhóm đầu và đuôi và chuyển sản i

ph ẩ m phả ứng tớ màng Sự cùng biểu hiện hoạt tính của các enzym này, sự n i phân tích các ch ất trao đổ i, và các chi ều hướng trao đổ i ch t s ấ ẽ là điề u ki n thu n l i cho ệ ậ ợ

14

các phương pháp sinh họ c h th ng trong sinh t ng h p CoQ10 M t s thao tác di ệ ố ổ ợ ộ ố truy ề n có thể được thực hiệ để ản xuất CoQ10 trong E coli tái tổ ợp: Biểu hiệ n s h n tăng lên DPS từ các vi sinh s n xu t CoQ10, ng ng bi u hi n octaprenyl ả ấ ừ ể ệ diphosphate synthase (IspB) và bi u hi ể ện tăng các gen của con đườ ng MEP ho ặ c MVA

 Bi ể u hiệ n DPS ở E coli

DPS xúc tác ph ả ứ n ng t g h p IPP v i allylic diphosphate và là m ổ n ợ ớ ộ t enzym quan tr ng trong sinh t ng h ọ ổ ợp đuôi decaprenyl ở CoQ10 Gen mã hóa cho DPS đượ c xác đ ị nh g ần đây ở m t s vi khu ộ ố ẩn, như S pombe, G suboxydans, Aspergillus clavatus, Leucosporidium scotti, P denitrificans và A tumefaciens (Lee

và cs, 2004; Matsuda và cs, 2003; Okada và cs 1998; Suzuki và cs, 1997; , Takahashi và cs, 2003 H ). ầu hết các enzym DPS có sự tương đồng 30 50% với các - polyprenyl diphosphate synthase khác Việc đưa gen mã hóa cho DPS được tách dòng t m ừ ộ t vi sinh sản xuất CoQ10 là chiến lược chính được sử ụng để ạo biến d t chủ ng E coli n xu t CoQ10 Chi u dài c s ả ấ ề ủa đuôi isoprenoid của CoQ10 xác đị nh

b ở i polyprenyl diphosphate synthase có mặt trong sinh vật chủ này (Okada và cs, 1996) Ở E coli, enzym octaprenyl diphosphate synthase, IspB, xúc tác sự hình thành c a octaprenyl diphosphat ủ e và lượ ng nhỏ hơn các prenyl diphosphate ngắ n hơn Theo đó, dạ ng CoQ chính có m t ặ ở E coli là CoQ8, và m ộ ố ạ t s d ng nh ỏ hơn từ CoQ1 đế n CoQ7 (Daves và cs, 1967) E coli bi u hi n DPS c a P denitrificans ể ệ ủ (PdDPS) s ả n xu t CoQ10, bên c nh s n xu ấ ạ ả ất CoQ8 Hơ n n ữ a, t ỷ ệ ả l s n xuất CoQ10:CoQ8 ph thu ụ ộ c vào mứ ộ c đ bi ể u hiện của PdDPS (Takahashi và cs, 2003)

Do đó, các chủ ng E coli bi ể u hi n DPS ngo i lai s n sinh CoQ10, bên c nh vi c ệ ạ ả ạ ệ

s ả n xuấ ở t nhi ề u mứ ộ c đ khác nhau CoQ8 và CoQ9, phụ thu ộ c vào mứ ộ c đ bi ể u

hi n c ệ ủa DPS Tuy nhiên, DPS của những vi khuẩn nhất định cho thấy sự đặc hiệ u hơn hướ ng t i decaprenyl diphosphate Ví d , khi DPS t ớ ụ ừ Rhodobacter sphaeroides

đượ c bi u hi n ể ệ ở E coli nó th hi , ể ện tính đặ c hi ệu cao hơn hướ ng t i decaprenyl ớ diphosphate so v ớ i DPS từ A tumefaciens (Zahiri và cs, 2006) Vì th ế , vi c tách ệ dòng các enzym DPS v ới tính đặ c hi ệ u sản phẩ m tuy ệt đố i, v i m ớ ục tiêu thu đượ c

15

các chủ ng E coli tái t h p có kh ổ ợ ả năng sinh CoQ10 cao, có thể là phương pháp tố t

để tăng sản lượ ng CoQ10 G ần đây, các nghiên cứ u quá trình lên men trong s n ả

xu ất CoQ10 đượ c thực hiện vớ E coli tái tổ ợp chứa dps ừ G suboxydans i h t (Park

và cs, 2005) Lên men gián đoạ n v ới lượ ng glucose h n ch ạ ế thu đượ c n ồng độ cu i ố cùng : 103 g/L tế bào, 255 mg/L CoQ10, và 0,29 mg CoQ10/g sinh khối Lượng ít thành ph ần CoQ10 đặ c hi u này có th ệ ể đượ c cả i thi n b ng vi ệ ằ ệ c sử ụ d ng k ỹ thu t ậ điề u khi n ể trao đổ i ch t c a các con đư ng t ng h p ti n ch ấ ủ ờ ổ ợ ề ất Hai phương pháp đượ c nghiên c u: ứ Tăng chiề u t o thành các ti n ch t isoprenoi ạ ề ấ d và tăng biể u hi n ệ các gen ubi đượ ự c l a ch ọn tham gia vào con đườ ng sinh t ng h p CoQ (Zahiri và ổ ợ

cs, 2006; Zhu và cs, 1995) S n xu ả ất CoQ10 cũng đượ c báo cáo ở E coli tái t ổ ợ h p mang gen t dps ừ A tumefaciens (Zahiri và cs, 2006)

 Tăng biể u hi n các gen c ệ ủa con đườ ng MEP

M ột phương pháp khác để tăng sả n xuất CoQ10 trong E coli tái tổ ợp là h

đồ ng bi u hi n enzym DXS, xúc tác cho ph n ng t ng h p gi a GA3P và ể ệ ả ứ ổ ợ ữ pyruvate Ph ả ứng này là bướ n c đ ầ u tiên c ủa con đườ ng MEP ở E coli DXS th ự c

hi ệ n một vai trò điều hòa quan trọng trong con đường MEP để ổng hợp IPP Do có t nhi ề u nghiên cứu đã báo cáo sự tăng lên đáng kể ản xuất lycopene bằng cách tăng s biểu hiện DXS, nên việc tăng lượng IPP thông qua đồng biểu hiện DXS được mong đợi làm tăng quá trình s n xu t CoQ10, mà s d ả ấ ử ụng IPP như là mộ t ti n ch t gi ng ề ấ ố lycopene M ộ t số nghiên cứu đã cho thấ điều khiể trao đổi chất của sinh tổng hợp y n IPP thông qua vi ệc tăng biể u hi n c ệ ủ a các gen hạ n ch ế ố t c đ c ộ ủa con đườ ng MEP

ho ặ c thông qua việc sử ụng một con đường MVA ngoại lai bổ sung mang lại sự d tăng đáng kể ệ vi c sinh t ng h p isoprenoid E coli Các t bào ổ ợ ở ế E coli ch có m t ỉ ộ ngu ồ n cung cấp hạn chế các tiền chất isoprenoid mà có thể được sử ụng để ổ d t ng

h ợp các chất trao đổi, như CoQ, mà chỉ ần thiết cho tế bào này với lượng nhỏ c

Đồ ng th i, ngu n cung c p ti n ch ờ ồ ấ ề ất isoprenoid này đượ c ki m soát b i s phân b ể ở ự ố

gi ữ a pyruvate và GA3P Sản xuất CoQ ở E coli được tăng cường thông qua việc

tăng biể u hi ện DXS (Matthews và Wurtzel, 2000) Để tăng sả n xu t CoQ10, DXS ấ

c ủ a Pseudomonas aeruginosa đượ ồ c đ ng biểu hiện trong một chủ E coli tái tổ ng

16

h p ợ , đồ ng thời mang gen dps ừ G suboxydans Sự ểu hiện gen dps này làm hết t bi lượ ng IPP E coli S ở ự tăng lên của lượ ng DXS thông qua bi u hi n DXS c a P ể ệ ủ

aeruginosa tạo lại lượng IPP mất đi và tạ o ra x p x 2 l n thành phân liên quan và ấ ỉ ầ

s ản lượ ng CoQ10 N ồng độ CoQ10 l n nh t (4 ớ ấ 6,1 mg/L) đạt đượ c từ nhân nuôi gián đoạ n v ới lượ ng h n ch glucose c a ch ng ạ ế ủ ủ E coli tái t h p bi u hi ổ ợ ể ện đồ ng th i 2 ờ gen và (Kim và cs, 2006) dps dxs

 Thêm vào con đườ ng MVA ngo i lai ạ

Như mộ ự t s thay th cho vi c s d ế ệ ử ụng con đườ ng MEP, m ột con đườ ng MVA ngo i l i có th ạ ạ ể được đưa vào E coli MVA là m t ch t trung gian quan tr ộ ấ ọ ng trong con đường MVA và nó không đượ c s n xu t hay s d ng b i ả ấ ử ụ ở E coli ch ng ủ hoang dã Vi ệc thêm vào con đườ ng MVA có l i th ợ ế làm tăng nguồ n cung c ấ p IPP trong các ch ủng E coli sả n xu t CoQ10 này Toàn b ấ ộ con đường MVA đượ c phân chia thành con đường MVA trên và dướ Con đường MVA dướ i i chuy n MVA ể thành IPP và DMAPP thông qua 4 bướ c xúc tác enzym v i MVA kinase, phospho- ớ MVA kinase, MVA diphosphate decarboxylase, và IPP isomerase Con đườ ng MVA trên bi ến đổ i 3 phân t ử acetyl - CoA thành MVA trong 3 bướ c xúc tác enzym

v i acetyl-CoA thiolase, HMG-CoA synthase, và HMG-CoA reductase Yoon và cs, ớ

2006 đã báo cáo rằ ng s n xu t lycopene ả ấ ở E coli tăng vài lầ n khi s d ng con ử ụ đường MVA dướ i c a Streptococcus pneumoniae v i ngu n b sung bên ngoài ủ ớ ồ ổ MVA G ần đây, ngườ i ta chỉ ra r ng s s ằ ự ả n xuất β carotene cao nhấ - t có th ể đạt đượ c

ở E coli d s ử ụng con đường MVA dướ ở i S pneumoniae v ớ ử ổ i s b sung thêm MVA (Yoon và cs, 2007) Tương tự , Zahiri và cs (2006) ch ra r ng vi c thêm vào ỉ ằ ệ

m ột con đườ ng MVA ngoại lai làm tăng nguồn cung IPP ở các chủ E coli ản ng s

xuất CoQ10 Nửa dưới con đường MVA của Staphylococcus aureus, Streptococcus

pyogenes, S pneumoniae, Enterococcus faecalis, S cerevisiae và đã được kiểm tra Con đườ ng này c a S pneumoniae t o ra s ủ ạ ản lượ ng CoQ10 là 2,70 mg/g sinh kh i ố khô khi đượ c b sung 3 mM MVA ngo i lai N ổ ạ ửa con đườ ng trên c a vi khu n này ủ ẩ đượ c s d ử ụng để ạo nên con đườ r ng MVA hoàn ch nh ỉ Con đườ ng MVA ngo i lai ạ này có th ể chuy n acetyl-CoA nộ ể i sinh thành IPP, d ẫn đế n sự ả s n xu t CoQ10 v ấ ớ i

17

s ản lượ ng lên tới 2,43 mg/g sinh khối khô, không cần bổ sung MVA ở E coli DH5 α tái t ổ ợ h p chứ a 3 plasmid mã hóa cho các enzym c ủa con đườ ng MVA trên ( phbA, mvaS mvaA và ) và dướ i ( mvaK1, mvaK2, và mvaD cùng v i ớ idi ) và DPS Ngượ ạ c l i,

m ột con đường MVA đầy đủ đượ c cấu trúc trong một operon đơn kém hiệu quả hơn

v ớ i sản lượng CoQ10 lên tới 1,71 mg/g sinh khối khô, cao hơn 1,9 lần so với khi sử

d ng ụ dps ột mình Chủ E coli tái tổ ợp này sản xuất CoQ10 và lượng nhỏ m ng h CoQ9, bên c ạnh lượ ng CoQ8 xu t hi ấ ệ n tự nhiên CoQ9 đượ c sả n xu t có th là k ấ ể ế t

qu c ả ủ a sự ải phóng chưa hoàn toàn một đoạn của các chuỗi polyprenyl đang kéo gi dài t ừ DPS của A tumefaciens

G ần đây, Choi và cs (2009) đã báo cáo rằ ng knock out gen ispB và bi u hi n ể ệ

dps t ừ A t umefaciens làm cản trở ặc giảm thiểu sự ản xuất các CoQ khác và do ho s

đó cả i thi n s ệ ản lượ ng CoQ10 c a E coli tái t h ủ ổ ợp Hơn nữa, đồ ng bi u hi n gen ể ệ

dxs làm tăng thành phần đặ c hi ệ u củ a CoQ10 t 0,55- ừ 0,89 mg/g sinh khố i khô thành 1,40 mg/g sinh kh ối khô Liên men gián đoạ n E coli BL21(DE3)_ ispB/ pAP 1 + pDXS đượ c th c hi n m ự ệ ở ột môi trường xác định để ả s n xu ất lượ ng l n CoQ10 ớ pAP1 là m ộ t vector biể u hi ệ n gen dps Cu ố i cùng, n ồng độ CoQ10 là 99,4 mg/L, thành ph ần CoQ10 đặ c hi u là 1,41 mg/g sinh kh i khô, và s ệ ố ản lượ ng là 3,11 mg/L.h thu đượ c sau lên men 33 gi (Choi và cs, 2009) ờ

 Tăng biể u hi n các gen c ệ ủa con đườ ng chorismate

Zhu và cs (1995) đã thự c hi n m t n l c đ ệ ộ ỗ ự ể tăng sả n xu t CoQ ấ ở E coli

b ằng cách tăng biể u hiệ ubiA n và ispB E coli mang các plasmid chứa ubiAC và

ispB hoặc chứa COQ2 và ispB sản xuất CoQ nhiều hơn so với chủng hoang dã Barker và Frost (2001) đã báo cáo rằ ng m t s ộ ản lượ ng cao pHBA ở E coli tái t ổ

h ợ p bằng cách tăng cường lượng carbon thành pHBA thông qua sự tăng biểu hiệ n

c ủ a các enzym con đư ờ ng chorismate, trong khi loại bỏ ự ản xuất các axit amin s s thơm, mà cạ nh tranh các ti n ch t gi ng h t Chi ề ấ ố ệ ến lượ c này t ạo ra lượ ng pHBA cao

hơn so vớ i m ức bình thườ ng c a E coli ủ

18

 Tri ể n vọng sử ụng d A tumefaciens là vi sinh v ậ t chủ ản xuấ CoQ10 s t trong công nghi p ệ

M ặ c dù các gen isoprenoid ngoại lai bao gồ dxs đã được đưa vào E coli, m

S ản lượ ng CoQ10 ở các chủ E coli tái tổ ợ thường thấp (0,3 mg/g sinh khối ng h p khô) so v ới lượng đượ c sả n xu t b ấ ở i các chủng vi sinh khác như P denitrificans

(0,86 mg/g sinh kh ố i khô), Rhodobacter sphaeroides (2,6 mg/g sinh khố i khô) và A radiobacter (2,6 mg/g sinh khối khô) Sự tăng biểu hiện trực t ếp của các enzym i quan tr ọ ng này trong chủ ng công nghi p này là c n thi ệ ầ ết để ả s n xuất lượ ng l ớ n CoQ10 S ự tăng biể u hi n DXS ệ ở A tumefaciens có th ể ả c i thi n quá trình s n xu ệ ả ấ t CoQ10 do IPP là m t ch t quan tr ng trong s n xu ộ ấ ọ ả ất CoQ10 và DXS là enzym bướ c đầu tiên để ổ t ng h p IPP vi khu ợ ở ẩn Lee và cs (2007) đã ỉ ch r ra ng s ằ ự tăng biể u

hi ện của gen dxs ở A tumefaciens KCCM 10413 mang lại sản lượng CoQ10 (502,4 mg/L) và thành ph n CoQ10 là 8,3 mg/g sinh kh ầ ối khô, cao hơn 21,9% và 23,9% tương ứ ng so v i A tumefaciens ớ hoang dã DXS dường như tạ o thành m ột bướ c có ảnh hưở ng trong sinh t ng h p CoQ10 c a A tumefaciens, v i s s n xu t CoQ10 ổ ợ ủ ớ ự ả ấ

hi u qu y ti ệ ả đầ ềm năng bở ỹ i k thu t ậ điề u khiể trao đổ n i ch t ấ ở A tumefaciens

Các nghiên c u v ứ ề ổ t ng h ợ p CoQ10 các bi ở ế n ch ủ ng E coli biể u hi n DPS ệ

t ừ các vi khuẩn khác cho thấy rằ lượ CoQ8 hoặc CoQ9 khác nhau cũng được ng ng

t ổ ng hợ cùng với CoQ10 phụ p thu ộ c vào sự ể bi u hi n ệ DPS (Par và cs, k 2005; Takahashi và cs, 2003; Zahiri và cs, 2006), điều này làm cho việc sản xuất và các quá trình tinh s ạ ch CoQ10 t E coli ừ tái t ổ ợ h p g ặ p nhi ều khăn, tốn kém do đó ệ hi u

qu ả kinh tế ị ảm đi Vì vậ , một chiến lược tốt hơn là tăng biểu hiện đồng thời b gi y

c ủ a các gen dxs và m dps ở ột chủ ng sinh CoQ10 Vector bi u hi n pGPRX ch ể ệ ứ a các gen dps và dxs ủa A tumefaciens được thiết kế và biến nạp và A tumefaciens ả c s n

xu ất CoQ10 Các điều kiện nhân nuôi của A tumefaciens pGPRX như nhiệt độ, pH, thông khí, và t ố c đ ộ khu ấy đượ c tối ưu hóa để ả s n xu t CoQ10 nhi u nh ấ ề ấ t V i ớ

n ồng độ ố t i ưu c ủ a bột cao ngô, ammonium sulfate, và oxy hòa tan, nồng độ CoQ10 cao nh ất 744,2 mg/L đạt đượ c vớ i thành ph ần CoQ10 đặ c hi u là 11,4 mg/g sinh ệ

kh i khô ố

19

1.5 Nghiên c ứ u tách dòng gen dps và biểu hiện chủng vi sinh v ậ t tái tổ ợ h p

mang plasmid ch ứ a gen dps sinh tổ ng h ợ p CoQ10

Gen dps đã được tách dòng thành công ừ A tumefaciens mã hóa cho t decaprenyl diphosphate synthase vào E coli (Jung- Kul Lee và cs, 2004) Trình t ự nucleotit đã đượ c xác đ ị nh ch ứa khung đọ c m 1077 bp, có kh ở ả năng mã hóa cho

m ộ t protein ồ 358 axit amin với điểm đẳng điện 5,16 và khối lượng phân tử g m

38960 Da E coli JM109 mang gen dps này t o ra ubiquinone 10 bên c ạ - ạ nh ubiquinone- 8, trong khi E coli JM109 chứa gen dps đột biến vùng DDxxD mất khả

năng sả n xu t ubiquinone- ấ 10 Điề u này cho th y r ng gen dps t ấ ằ ừ A tumefaciens đã

th hi n ch ể ệ ức năng trong E coli và nó mã hóa cho decaprenyl diphosphate synthase Gen dps đã được tách dòng từ Rhodobacter capsulatus B10 bằng cách xây

d ự ng và sàng lọc thư viện hệ gen (Xinyi Liu và cs, 2006) Một khung đọc mở 1002

bp đượ c xác đ ị nh khi phân tích trình t Polypeptide suy ra bao g m 333 axit amin ự ồ

v i kh ớ ối lượ ng phân t kho ng 37 kDa ử ả

Gen dps mã hóa cho decaprenyl diphosphate synthase từ A tumefaciens đã

đượ c tách dòng và bi u hi n thành công E coli Và nh n th y E coli có thêm kh ể ệ ở ậ ấ ả năng sả n xu t UQ 10 bên c ấ - ạ nh kh ả năng sinh UB -8 v n có và kh ố ả năng sinh UB -10

th ậm chí còn cao hơn so vớ i UB-8 (Dawei Zhang và cs, 2007)

Ch ủ ng tái tổ ợ A tumefaciens chứa 2 gen mã hóa cho decaprenyl h p diphosphate synthase ( dps ) và 1 -deoxy-D- xylulose 5 phosphate synthase ( ) làm - dxs

tăng khả năng sả n xu t coQ10 S ấ ản lượ ng CoQ10 c a các ch ng A tumefaciens ủ ủ

BNQ-pGA748 (bình thường), pGX22 (mang vector chứa gen dxs), pGP85 (mang

vector ch a gen ứ dps ), pGPRX11 (mang vector ch ứ a cả 2 gen dxs và dps ) lần lượ t là

445, 561, 585, 909 µg/g sinh kh i khô ố (Soo -Ryun Cheong và cs, 2008)

1.6 Nhân nuôi Agrobacterium tumefaciens để thu CoQ10

Ch ng ủ Agrobacterium tumefaciens (ATCC4452) sau khi gây đột biến và

chọ ọ n l c trong phòng thí nghi ệm, thu đượ c chủng độ t bi n SBL0715 Ch ng này ế ủ đượ c nuôi v ới điề u ki ện như sau: Mộ t khu n l c sau khi nuôi 48 gi 30 ẩ ạ ờ ở oC trên

20

môi trườ ng th ch ch a 0,5% cao th t, 0,5% peptone, 0,5% NaCl và 2% agar (pH ạ ứ ị 7.2), được đưa vào lọ nuôi dung tích 300 mL ch ứa 40 mL môi trườ ng ho t hóa (2% ạ glucose, 1% peptone, 1% cao nấm men và 0,5% NaCl (pH 7,2)) Sau đó, nuôi 24

gi 30 ờ ở oC, l ắc 220 vòng/phút 4 mL canh trườ ng ho ạt hóa sau đó đượ c chuy n vào ể

50 mL môi trường lên men (9% đườ ng, 2% (NH4)2SO4, 0.05% K2HPO4, 0.05%

KH2PO4, 0.025% MgSO4, 4% d ị ch chiế t ngô, 2% CaCO3 và 1 mL/L dung dịch vi lượ ng (pH 7.2) (ch a trong bình dung tích 500 mL) Nuôi 144 gi , 30 ứ ờ oC, 220 vòng/phút (Xue-Li Cao và Cs, 2006)

Agrobacterium tumefaciens KCCM 10413 đượ c hoạt hóa trong môi trườ ng chứ a thành ph n (g/L): glucose 60, cao n m men 15, peptone 15 và NaCl 7,5 Môi ầ ấ trườ ng nuôi thu CoQ10 bao gồm các thành phần (g/L): sucrose 50, cao ngô 40, (NH4)2SO4 10, K2HPO4 0.5, KH2PO4 0.5 và MgSO4 7H2O 0.25 Điề u ki n nuôi: ệ hoạt hóa: 32oC, 200 vòng/phút trong 12 gi ờ; nuôi lượ ng l ớn: 5 mL canh trườ ng ho ạ t hóa đượ c chuy ển vào 100 mL môi trườ ng nuôi thu CoQ10, 32 ở oC, lắc 200 vòng/phút trong 96 gi (Suk-Jin Ha và Cs, 2009) ờ

A tumefaciens 1.2554 (CGMCC, Beijing, Trung Qu ốc) được cấ y vào bình Erlenmeyer 500mL ch a 100 mL môi ứ trườ ng ho t hóa bao g m: 1% glucose, 0,5% ạ ồ peptone, 0,5% cao n m men và 0,5% NaCl (pH 7,2), và nuôi 24 gi , 28 ấ ờ oC, lắc 200 vòng/phút Canh trườ ng ho ạt hóa này sau đó đượ c chuy n vào m t tank lên men ể ộ khu ấ y (BioFlo 110, New Brunswick, NJ, USA) có thể tích làm việc 2L môi trườ ng nuôi bao g m: 5% sucrose, 4% CSP (corn steep powder t cao ngô), 1% ồ -bộ (NH4)2SO4, 0.05% K2HPO4, 0.05% KH2PO4, 0.025% MgSO4.7H2O và 2% CaCO3 Nhi ệt độ , tố ộ c đ khu ấ y và tố ộ c đ dòng khí trong canh trườ ng nuôi là 28oC, 450 vòng/phút, 0,6 L/phút pH đượ c ki m soát 7,2±0,1 b ng cách b sung 3M NaOH ể ở ằ ổ

ho ặc 2M HCl Sau 56 giờ nuôi, các tế bào được thu bằng ly tâm lạnh 4oC, 10 000 vòng/phút (21 000 x g) trong 10 phút, đượ ử c r a v ới đệ m 0,1 M K3PO4 (pH 7,2), ly tâm, sau đó làm khô bằ ng máy l ạnh đông chân không và giữ ở -18oC để ử ụ s d ng sau (Yuting Tian và cs, 2010)

21

Các tế bào A tumefaciens l ần lượ t ch a plasmid pBIV dps, pBIV ứ - -dpsca, pBIV- dpsq và pBIV dpsp, được giữ - trong glycerol -20 ở oC 125 µL dịch tế bào được đưa vào 25 mL môi trườ ng YEB b sung 50 µg/mL Kanamycin (trong bình ổ

250 mL), đượ c nuôi l c 160 vòng/phút, 28 ắ oC 250 µL canh trường này đượ c chuy n ể vào 50 mL môi trườ ng YEB b sung 50 µg/mL kanamycin (trong bình 250 mL), ổ nuôi l c 200 vòng/phút, 28 ắ ở oC (Dawei Zhang và cs, 2007)

1.7 Tách chiế t và tinh s ch CoQ10 ạ

0,5 mL canh trườ ng nuôi Agrobacterium tumefaciens được ly tâm thu sinh

kh ối, bổ sung 0,5 mL dung dịch ly giải tế bào (Cellytic B, B7435, Sigma); ủ 30 phút; b ổ su ng h ỗ n h ợ p dung môi propanol và hexane (3:5) vào d ch ly gi i t bào và ị ả ế mix m ạnh Pha dung môi đượ c làm khô và ph ần thu được đưa vào hệ ố th ng HPLC với Capcell Pak C18 column (Shodex, Showa, Japan) kết hợp với UV detector (275nm), r a gi ử ả i với 1 hỗ ợ n h p dung d ch methanol và ethanol (13:7) t ị ở ốc độ y chả 1,0 mL/phút (Suk -Jin Ha và Cs, 2009)

20 mL canh trườ ng nuôi Sporidiobolus johnsonii ATCC 20490 đượ c ly tâm

1000 vòng/phút trong 20 phút để thu pellet sinh kh ối, sau đó đượ c chi t v i 20 mL ế ớ ethanol b ng các ằ h đung nóng và lắ c ở 60oC trong 3 gi ờ Tế bào đượ c lo i b b ng ly ạ ỏ ằ tâm và lớp ethanol được chiết lạ ớ i v i 20 mL hexane L ớp hexane đượ c tách ra, cô

đặ ới 1 mL và đưa vào sắc ký để định lượ c t ng (Prafull Ranadive và cs, 2011)

CoQ10 đượ c tách t các t bào ừ ế E coli v ới hexane 500 µl canh trường đượ c

li tâm 1400 vòng/phút Pellet đượ ử c r a 1 l n v ầ ới 1 ml nướ c c ất và sau đó vớ i 1 ml Tris- HCl 20 mM, pH 7,6 Tế bào được li giải bằng cách bổ sung 450 µl dung dịch Cell Lytic B (sigma) và 50µl c a dung d ủ ị ch gố c lysozyme lòng tr ng tr ắ ứ ng (egg white lysozyme stock solution 10 mg/ml, Amresco) Sau khi – ủ 37oC trong 30 phút, CoQ10 đượ c chi t kh i d ch chi t t bào v i 900 µl h n h p hexane/propanol ế ỏ ị ế ế ớ ỗ ợ (5:3) và sau đó vớ i 500 µl hexane M i l n chi t, pha h u cơ hexane ch a CoQ10 ỗ ầ ế ữ ứ đượ c tách kh ỏi pha nướ c b ằng ly tâm 14000 vòng/phút và đượ c đ ự ng vào ng m i ố ớ Phầ n chi ết hexane được bay hơi đế n khô b ng cách ằ ủ qua đêm trong mộ t bu ng ồ

22

chân không ở nhi ệt độ phòng Ph n c n còn l ầ ặ ại đượ c hòa tan trong 500 µl c ồ n tuyệt

đố i (Fisher Scientific, HPLC grade) (Hossein Shahbani Zahiri và cs, 2006)

Tách và tinh s ch CoQ10 t máu: M t m ạ ừ ộ ẫu máu người tươi (10,0 ml) đưa vào bình th ủy tinh đáy tròn, 2 l và đượ c pha loãng v ới 100 ml nướ c Dung d ị ch của 0,5 g pyrogallol trong 20 ml nước đượ c b sung ổ vào, sau đó bổ sung 350 ml c n ồ 95% vào 20 ml dung d ch NaOH 5% H n h ị ỗ ợp đượ c làm n ng trong 15 phút và b ố ả o

v ệ tránh ánh sáng Bình thủy tinh sau đó được nhấn chìm trong bể băng đá và 200 g

đá đượ c b sung H n h p l ổ ỗ ợ ạnh đượ c chi t 3 l n v i hexane (400, 300 và 300 ml), ế ầ ớ sau đó đượ c gom l i và r a 2 l n v ạ ử ầ ới nướ c (m i l n 250 ml) L ỗ ầ ớp dung môi sau đó đượ c làm khô trong chân không (Elliot Redalieu và cs, 1968)

CoQ10 đượ c chi t t chủng độ ế ế ừ t bi n S pombe: Các t ế bào đượ c x lý v i 3 ử ớ

M HCl, khuấ ở y 90oC trong 80 phút Sau khi b sung dung d ổ ịch NaOH để duy trì

pH 7, pellet t ế bào đượ c chiế ở t nhi ệt độ phòng trong 2,5 gi ờ ớ v i acetone H n h ỗ ợ p này được ly tâm và pha trên đượ c thu và làm khô b ằng bay hơi chân không ở 30oC (Bing Cheng và cs, 2008)

23

Chương 2 Ậ V T LI U Ệ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

2.1 V t li ậ ệ u, hóa chấ t, thi t b ế ị

2.1.1 Vật liệu nghiên cứ u

2.1.1.1 Vector tách dòng và vector bi ể u hiệ n

pCAMBIA1301 là vector đượ c sử ụ ở nghiên cứu này vào 2 mục đích: d ng tách dòng gen dps của A tumefaciens EHA vào E coli DH10b và bi u hi n gen ể ệ dps

này ở A tumefaciens EHA

Hình 2.1 Vector pCAMBIA 1301 pCAMBIA 1301 có thể được sử ụng thường xuyên để tách dòng các casset d gen quan tâm bao g m 1 promoter, trình t mang mã c a gen này và 1 terminator ồ ự ủ

Nó có gen gusA có vai trò ch ỉ ị th mà có th ể đượ c sử ụng để đánh giá hiệ d u qu ả ế bi n

n p Vùng ạ đa tách dòng (MCS - Multiple cloning site) ở ữa gusA (gầ ề gi n l T-DNA

ph ả i) và hygromycin (gần lề DNA trái) Vector này chứa gen kháng kanamycin,

T-24

có vai trò ch ỉ th ị vì nó đượ c bi u hi ể ệ n ở vi khu ẩn Do đó, khi chuyể n thành công vector mang gen quan tâm vào vi khu n ( ẩ E coli và A tumefaciens), vi khu n có ẩ thêm kh ả năng kháng kháng sinh kanamycin.

2.1.1.2 Môi trườ ng nuôi vi sinh v t ậ

LB lỏng Cao n m men: 0,5; Peptone: 1; NaCl: 1 ấ

LB c đặ Cao n m men: 0,5; Peptone: 1; NaCl: 1; Agarose: 2 ấ

YEB Sucrose: 0, 5 ; Peptone: 1; Cao n m men: 1; NaCl: 0,5; ấ

• Các thi t b ế ị ử ụ s d ng t i TT nghiên c u và phát tri n Công ngh sinh h ạ ứ ể ệ ọ c,

Vi ệ n công nghệ sinh học và công nghệ ực phẩm, Trường đại học Bách Khoa Hà th

25

N ộ i: Cân kỹ thu ật TE 612 (Satorius, CHLB Đứ c), Cân phân tích CPA 324S (Sartorius, CHLB Đứ c), N i kh trùng (Harayama, Nh t B n), T c y vô trùng ồ ử ậ ả ủ ấ Class II Type A2 (ESCO), Máy Vortex Delta Mixer (Taitec, Nhật Bản), Máy Spin Down C1301B -230V (Labnet, Đứ c), Micropipet các lo ại (Biohit), Máy đo pH (Mettler Toledo), Máy n nhi t DTU-2C (Taitec, Nh t B n), ổ ệ ậ ả Máy lắc ổn nhiệt eppendorf (Torrey pines scientificinc, M ), Máy li tâm Eppendorf Legend X1R ỹ (Thermo Fisher, M ), Máy li tâm Facol Sorval Legend X1R (Thermo Fisher, M ỹ ỹ ),

H th ệ ống điệ n di (BioRad, Mỹ), Bộ điện di DNA (Advance Tech), Máy soi chụp

ả nh gel, Máy PCR (Biorad, M ỹ), Máy cô đặ c SPD 1010 (Thermo Fisher, M ), Máy ỹ siêu âm (Misonix, M ), T ỹ ủ ạ l nh sâu -20oC (Sanyo, Nh t B n), T ậ ả ủ ạ l nh -80oC (Thermo Fisher, M ỹ ), Tủ ạ l nh Heracus +4oC (Thermo Fisher, M ), ỹ Lò vi sóng (Goldsun, Việt Nam)

26

2.2 Phương pháp nghiên cứ u

Sơ đồ tóm t ắt phương pháp nghiên c u: ứ

k ế t hợp với ly tâm cho phép thu nhận DNA dướ i dạng cặn tủa dễ ảo quản và khi b

c n có th hòa l ầ ể ại trong nướ c theo n ồng độ mong mu n ố

- B sung isopropanol (t l 1:1), 15 phút nhi ổ ỷ ệ để ở ệt độ phòng

- Ly tâm 10 000 vòng/phút trong 10 phút; thu t a ủ

- R ử a tủ a 3 l n b ng ethanol 70% ầ ằ

- Làm khô t a ủ

- Hòa tan t a DNA b ủ ằng nước ạ lo i ion

2.2.2 Tách plasmid

- Ly tâm 1 ml d ch nuôi 5000 vòng/phút trong 5 phút, thu c n t bào ị ặ ế

- B sung 100 µL Sol I, tr ổ ộn đều, để ở nhi ệt độ phòng 5 phút

28

- B sung 200 µL Sol II, tr ổ ộn đề u b ng cách l ằ ộn ngượ c ố ng 5-8 l n ầ

- B sung ngay 150 µL Sol III, tr ổ ộn đề ủ đá 5 phút u,

- B sung 5µL RNAse, 65 ổ ủ oC trong 15 phút.

- B ổ sung 50 µL nướ c PCR hòa tan t ủ a.

Các hóa chấ ử ụ t s d ng: Sol I: 25 mM Tris HCl, pH 8,0; 10 mM EDTA; 50mM glucose Sol II: 0,2 M NaOH; 1% SDS Sol III: 14,73 g CH3COOK + 5,75

-mL CH3COOH trong 50 mL H2O (pH 4,8-5,2)

2.2.3 Thiế ế ồ t k m i

- Tìm ki m trình t ế ự gen dps mã hóa decapreny diphosphate synthase c ủ a A

tumefaciens trên ngân hàng NCBI

- So sánh trình t ự các đo ạn gen này, để xác đị nh trình t ự đặc trưng ử ụ S d ng phần mền của MultAlin (Multiple sequence alignment của Florence Corpet) (F Corpet, 1988)

- Thi ế t kế ồi dựa vào phần mềm FastPCR: Tính toán T m m, Ta t ối ưu, và mồ i không t ạ o dimer.

2.2.4 PCR

Nguyên lý:

Kỹ thuật tổng hợp DNA nhân tạo cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của sao chép DNA trong tế bào vi sinh vật như: đoạn DNA cần được mở xoắn thành 2 mạch đơn, cần có các cặp mồi xuôi, ngược, cần nguyên liệu và điều kiện môi trường thích hợp và DNA polymerase Tuy nhiên kỹ thuật PCR có khác là dùng nhiệt độ cao (94oC) để biến tính chuỗi DNA sợi kép, kết hợp với Taq DNA polymerase chịu