Coenzyme Q10 có vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp ATP chất dự ữ năng lượng quan trọng của tất cả các loại tế bào và là tr một chất chống oxy hóa mạnh.. Tính chất, vai trò
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - Đinh Văn Minh TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN DPS MÃ HÓA DECAPRENYL DIPHOSPHATE SYNTHASE TỪ AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Chuyên ngành: Công nghệ sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Trương Quốc Phong Hà Nội – 2013 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17061132226581000000 LỜI CẢM ƠN Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Trương Quốc Phong (Trưởng phịng thí nghiệm Proteomics – Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ sinh học - Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Trường đại học Bách Khoa Hà Nội), người tận tình hướng dẫn tạo điều kiện làm việc tốt cho suốt q trình thực hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tới thầy cô giáo cán công tác Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Viện đào tạo sau đại học – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội dạy dỗ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập Và cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, bạn làm việc phịng thí nghiệm nhiệt tình động viên, giúp đỡ tơi q trình học tập hoàn thiện luận văn Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 13 tháng 03 năm 2013 Học viên Đinh Văn Minh ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn TS Trương Quốc Phong giúp đỡ tập thể cán nghiên cứu phòng thí nghiệm Proteomics – Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ sinh học – Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm – Đại học Bách Khoa Hà nội Các số liệu kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm với lời cam đoan Học viên Đinh Văn Minh iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ii LỜI CAM ĐOAN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH ix MỞ ĐẦU .1 Chương TỔNG QUAN 1.1 Tính chất, vai trò ứng dụng CoQ10 1.1.1 Tính chất CoQ10 .3 1.1.2 Vai trò CoQ10 1.1.3 Ứng dụng CoQ10 1.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất CoQ10 1.3 Sinh tổng hợp CoQ10 .8 1.4 Các chiến lược để nâng cao khả sản xuất CoQ10 11 1.5 Nghiên cứu tách dòng gen dps biểu chủng vi sinh vật tái tổ hợp mang plasmid chứa gen dps sinh tổng hợp CoQ10 19 1.6 Nhân nuôi Agrobacterium tumefaciens để thu CoQ10 19 1.7 Tách chiết tinh CoQ10 21 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Vật liệu, hóa chất, thiết bị 23 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu .23 2.1.2 Chủng vi sinh vật 24 iv 2.1.3 Hóa chất thiết bị 24 2.2 Phương pháp nghiên cứu .26 2.2.1 Tách DNA tổng số 27 2.2.2 Tách plasmid 27 2.2.3 Thiết kế mồi 28 2.2.4 PCR 28 2.2.5 Giải trình tự gen .30 2.2.6 Điện di DNA gel agarose .30 2.2.7 Thôi gel 31 2.2.8 Tinh DNA 32 2.2.9 Tạo tế bào khả biến: E coli A tumefaciens 32 2.2.10.Phương pháp xử lý enzyme cắt giới hạn .33 2.2.11.Ligation 34 2.2.12.Biến nạp: Sốc nhiệt, xung điện 35 2.2.12.Phương pháp tách chiết CoQ10 36 2.2.13.Định lượng CoQ10 37 Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 39 3.1 Tách DNA tổng số từ A tumefaciens EHA 39 3.2 Thiết kế mồi sử dụng PCR để thu gen dps từ A tumefaciens EHA 39 3.3 PCR nhân gen dps từ A tumefaciens EHA 40 3.4 Giải trình tự gen dps từ A tumefaciens EHA 42 3.5 Kết cắt nối ghép gen dps vector pCAMBIA1301 44 3.5.1 Xử lý vector pCAMBIA1301 với enzym giới hạn 44 3.5.2 Xử lý enzym giới hạn tinh gen dps 45 v 3.6 Kết chọn dòng E coli mang cấu trúc pCAM-dps tái tổ hợp 46 3.6.1 Biến nạp vector pCAMBIA1301 mang gen dps vào E coli DH10b .46 3.6.2 Kiểm tra plasmid E coli DH10b tái tổ hợp .47 3.6.3 PCR nhân gen dps từ plasmid E coli DH10b tái tổ hợp 48 3.7 Tạo chủng A tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc biểu pCAM-dps 49 3.7.1 Tạo tế bào A tumefaciens EHA khả biến .49 3.7.2 Biến nạp cấu trúc pCAM-dps vào A tumefaciens EHA 51 3.7.3 Kiểm tra gen dps từ plasmid chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp… 51 3.8 Khả sản xuất CoQ10 chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp 52 3.8.1 Đánh giá khả sinh CoQ10 chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp so với chủng gốc 54 3.8.2 Thiết lập số điều kiện nuôi A tumefaciens EHA tái tổ hợp sinh tổng hợp CoQ10 54 KẾT LUẬN .58 KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 vi DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT bp : Cặp bazơ (Base pair) CoQ10 : Coenzyme Q10 Cs Da : : Cộng Dalton DMAPP : Dimethylallyl diphosphate DNA : Deoxyribonucleic acid DPS : Decaprenyl diphosphate synthase DXP : 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate DXS : 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase FPP : Farnesyl diphosphate GA3P : Glyceraldehyde-3-phosphate GPP : Geranyl diphosphate IPP : Isopentenyl pyrophosphate LDL cholesterol : Cholesterol có mật độ lipoprotein thấp MEP : 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate MVA : Mevalonate pHBA : 4-hydroxybenzoate RNA : Ribonucleic acid vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1(a) Tính chất Ubiquinone (CoQ10) Bảng 1(b) Tính chất Ubiquinol (CoQ10 H2) Bảng 3.1 So sánh khả tổng hợp CoQ10 chủng A tumefaciens tái tổ hợp so với chủng gốc 54 Bảng 3.2 So sánh khả tổng hợp CoQ10 chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp môi trường khác 55 Bảng 3.3 So sánh khả sinh tổng hợp CoQ10 nhiệt độ khác 56 Bảng 3.4 So sánh khả tổng hợp CoQ10 chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp môi trường có giá trị pH ban đầu khác 56 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học coenzyme Q10 Hình 1.1 Con đường trao đổi chất tổng hợp CoQ10 Hình 1.2 Các phương pháp điều khiển trao đổi chất để tăng sản xuất CoQ10 12 Hình 2.1 Vector pCAMBIA1301 23 Hình 2.2 Chu trình phản ứng PCR 30 Hình 2.3 Phản ứng ethyl cyanoacetate CoQ10 37 Hình 3.1 Kết điện di DNA tổng số thu từ A tumefaciens EHA 39 Hình 3.2 Kết nhân gen dps từ A tumefaciens PCR 40 Hình 3.3 Xử lý pCAMBIA1301 với NheI BglII 44 Hình 3.4 Điện sản phẩm thơi gel thu đoạn 9823 bp 45 Hình 3.5 Gen dps sau xử lý với NheI BglII, tinh 46 Hình 3.6 Khuẩn lạc tế bào E coli DH10b chứa vector pCAMBIA1301 mang gen dps mơi trường thạch LB có kháng sinh kanamycin 47 Hình 3.7 Kết điện di plasmid thu từ chủng E coli DH10b tái tổ hợp 48 Hình 3.8 Diện di sản phẩm PCR với khn plasmid từ dịng E coli DH10b tái tổ hợp 49 Hình 3.9 Kiểm tra tế bào A tumefaciens EHA khả biến 50 Hình 3.10 Khuẩn lạc A tumefaciens EHA tái tổ hợp mang cấu trúc pCAM-dps mơi trường có kháng sinh chọn lọc kanamycin 51 Hình 3.11 Kết điện di sản phẩm PCR nhân gen dps từ khuôn plasmid thu chủng A tumefaciens EHA tái tổ hợp 52 Hình 3.12 Đường chuẩn CoQ10 53 ix MỞ ĐẦU Coenzyme Q10 (CoQ10) coenzyme quan trọng chuỗi vận chuyển điện tử màng tế bào sinh vật nhân sơ màng ty thể tế bào sinh vật nhân thực tạo thành từ liên kết vòng benzoquinone với chuỗi isoprenoid kỵ nước Coenzyme Q10 có vai trị quan trọng q trình sinh tổng hợp ATP (chất dự trữ lượng quan trọng tất loại tế bào) chất chống oxy hóa mạnh Do đó, CoQ10 sử dụng nhiều làm thực phẩm chức năng; ứng dụng y tế nhằm ngăn ngừa, điều trị nhiều bệnh tim mạch, tiểu đường, Parkinson, ung thư, tăng hệ thống miễn dịch, giảm huyết áp, bổ sung vào mỹ phẩm chất chống oxy hóa, chống lão hóa Với nhiều ứng dụng có lợi nên nhu cầu CoQ10 ngày tăng lên Để đáp ứng nhu cầu có nhiều giải pháp đưa tổng hợp hóa học, bán tổng hợp cơng nghệ sinh học Do CoQ10 có cấu trúc phức tạp nên CoQ10 sản xuất chủ yếu đường sinh học nhờ vi khuẩn A tumefaciens, P denitrificans, Cryptococcus laurentii, Tricosporon sp., Sporobolomyces salmonicolor, Rhodobacter sphaeroides, Để nâng cao hiệu sản xuất CoQ10, nhiều nghiên cứu giới tập trung vào tối ưu hóa q trình lên men chủng tự nhiên cải biến chủng từ năm 1993 Việc cải biến chủng thực cách gây đột biến ngẫu nhiên tạo chủng tái tổ hợp Mặc dù chủng đột biến có khả tổng hợp CoQ10 tăng, nhiên chủng khó cải biến để tăng thêm hiệu suất Hiện nhiều nghiên cứu tập trung vào việc tạo chủng E coli tái tổ hợp mang gen mã hóa số enzyme quan trọng đường sinh tổng hợp CoQ10 dxs, dps Tuy nhiên, khả tổng hợp CoQ10 thấp so với chủng đột biến Ngoài ra, chủng E coli tái tổ hợp khơng tổng hợp CoQ10 mà cịn tổng hợp CoQ8 CoQ9 Đây điều bất lợi đặc biệt sản xuất quy mơ cơng nghiệp cần nhiều bước tinh hoàn thiện sản phẩm Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vi khuẩn sử dụng để sản xuất CoQ10 chúng có nhiều ưu điểm có hàm lượng