Táh dòng, biểu hiện gene xyna từ baillus subtilis cn2 trên e coli bl21 và nghiên ứu đặ tính ủa xylase tái tổ hợp

β ,4 xylan là các 1 -polysaccharide của đường xylose được tìm thấy trong thành tế bào trong tất cả các loại thực vật trên cạn và trong hầu hết các phần của cây.. Nhưng có 2 h r t ọ ấph b

TRƯỜNG ĐẠ I HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

TÁCH DÒNG, BI U HI Ể Ệ N GENE XYNA T Ừ BACILLUS

TÍNH CỦA XYLANASE TÁI TỔ Ợ H P

LUẬ N VĂN TH C SĨ KHOA H Ạ Ọ C

NGUỜ I HƯ Ớ NG D N KHOA H Ẫ Ọ C: PGS.TS TRẦN LIÊN HÀ

Hà Nội – 2011

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Dương Thị Lương Liên xin cam đoan nội dung trong quy n luể ận văn này với đềtài “Tách dòng, bi u hi n gene ể ệ xynA t ừB subtilis CN2 trên E coli BL21

và nghiên cứu đặc tính c a enzyme xylanaseA tái tủ ổ hợp” là công trình nghiên cứu

và sáng t o do chính tôi th c hiạ ự ện dưới sự hướng d n cẫ ủa PGS.TS Trần Liên Hà -

B mộ ôn Vi sinh Hoá sinh và Sinh học phân tử- - Viện Công nghệ Sinh học và Thực

ph m - ẩ Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội và sự giúp đỡ của TS Ogasawara Wataru Khoa Kỹ thuật Sinh học - Trường Đại học Công ngh Nagaoka, Nh t Bệ ậ ản

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Ogasawara Wataru và TS Takanori Furukawa người đã hướng d n và t n tình chỉ bảo cho tôi trong thời gian tôi học tập ẫ ậ

và nghiên c u t i phòng thí nghi m cứ ạ ệ ủa PGS TS Ogasawara, Khoa Kỹ thuật Sinh

học Trường Đại học Công nghệ Nagaoka, Nhật Bả Nơi mà tôi đã thu đượ ấn c r t nhiều kiến thức và kinh nghiệm thực tế, giúp tôi trưởng thành hơn trong nghiên cứu

và làm chủ được ki n thế ức của mình

Tôi cũng xin gử ờ ải l i c m ơn sâu sắc tới toàn thể các bạn sinh viên và toàn

th ể cán bộ phòng thí nghiệm công nghệ sinh học C4 401 và toàn thể các thầy cô –

và b n bè trong vi n, trong phòng thí nghiạ ệ ệm vi sinh C10, và các thành viên của phòng thí nghi m TS Ogasawaraệ đã giúp đỡ và tạo điều ki n r t nhi cho tôi ệ ấ ều trong quá trình nghiên cứu

Cuối cùng là lòng biết ơn tới bố ẹ, m , anh, chị, em trong gia đình tôi, những người b n c a tôi, nhạ ủ ững người luôn động viên và luôn ng h tôi trong su t th i ủ ộ ố ờgian học

Hà Nội, ngày 29 tháng 11 năm 2011

H c viên ọ

Dương Thị Lương Liên

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

STT Ký hiệu Tên đầy đủ

1 Amax Optical density maximum (mật độquang cực đại)

2 Amp Ampicillin

3 APS Ammonium persulfate

4 B subtilis Bacillus subtilis

13 DMSO Dimethyl sulfoxide

14 DNA Deoxyribonucleic acid

15 dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate

16 DTT Dithiothreitol

17 E coli Escherichia coli

18 EDTA Ethylen diamin tetra acetate

19 EtBr Ethydium bromide

20 EtOH Ethanol

21 IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

22 kDa Kilo Dalton

23 kV Kilo volt

24 LB Luria-Bertani

25 mRNA Messenger RNA (RNA thông tin)

26 MW Molecular weight (khối lượng phân tử)

27 NTA Nitriloacetic acid

28 nu Nucleotide

29 OD Optical density (mật độ quang)

30 PCR Polymerase Chain Reaction

31 PDA Potato Dextrose Agar

32 rpm Revolutions per minute (vòng/phút)

33 SDS Sodium dodecyl sulphate

34 SDS-PAGE 53TSodium dodecyl sulfate53T polyacrylamide gel ectrophoresis

35 SLS Sample loading solution (dung d ch tra mị ẫu)

41 TE-RNase Tris-EDTA- Ribonuclease

42 Tm Temperature melting (nhiệt độ nóng chảy)

43 X-gal 5-bromo-4-chloro-indolyl-galactopyranoside

DANH MỤC C C BẢNG Á

Bảng 2.1: Thành phần và chu kì nhiệt của phản ứng PCR 25

Bảng 2.2: Thành phần phản ứng cắt enzyme giới han cua pET22b(+) 28

Bảng 2.3: Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn cua san phâm PCR 28

Bảng 2.4: Thành phần phản ứng loại bỏ nhóm phosphat của vector 29

Bảng 2.5: Nồng độ khuôn DNA cho phản ứng giải trình tự 35

Bảng 3.1: Bảng mô tả độ tương đồng gene xynA từ B subtilis CN2 với các trình tự khác từ ngân hàng Genbank 56

Bảng 3.2: Các đặc điểm của xylanase từ các chủng thuộc chi Bacillus khác nhau 67

Bảng 3.3: Kết quả tinh sạch xylanase tái tổ hợp từ E coli BL21 (DE3) 70

Bảng 4.1: Giá trị OD đo được tương ứng với nồng độ xylose 89

Bảng 4.2: Giá trị OD đo được tương ứng với nồng độ BSA 89

Bảng 4.3: Thành phần Gel 15% cho 2 bản gel 89

Bảng 4.4 Đệm sodium phosphate 90

Bảng 4.5: Đệm sử dụng để xác định độ bền pH 90

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Dạng đơn giản của xylan 4

Hình 1.2: D ng ph ạ ứ c tạ ủ p c a xylan 4

Hình 1.3: Đơn vị ấ c u trúc c a xylan t c ủ ừ ỏ [8] 5

Hinh 1.4: C u hình không gian c a G11 xylanase t Bacillus subtilis (XYNA) ấ ủ ừ 8

Hình 1.5: H 11 xylanase t Bacillus circulans (1XNB) và Trichoderma harzianum ọ ừ (1XND) 9

Hình 1.6: Cơ chế ho ạt độ ng c a xylanse d ủ ạng đơn giả n 10

Hình 1.7: V trí t n công c a endo ị ấ ủ -1,4- - β xylanase trên m ch xylan ạ 11

Hình 1.8: Cơ chế ủ th y phân xylan c a 1XNB 12 ủ Hình 1.9: C u trúc c a xylan và v trí c t các enzyme trong quá trình s n xu t gi ấ ủ ị ắ ả ấ ấ y 15

Hình 1.10: Các d ng s n ph m xylanase trên th ạ ả ẩ ị trườ ng 17

Hình 2 : Ph 1 ả ứ n ng n i vector pUC118 và gene xynA ố 29

Hình 2 : Ph 2 ả ứ n ng chèn xynA gene vào pET22b(+) 30

Hình 2 : Vector bi 3 ể u hiệ n pET22b(+) 37

Hình 2 : Nguyên t 4 ắc phương pháp sắ c ký ái l ự ử ụ c s d ng NiP2+ P 42

Hình 3.1: Điệ n di DNA t ng s tách t B subtilis CN2 trên gel agarose 1% 46 ổ ố ừ Hình 3.2: Trình t ự ồ m i xuôi và m ồi ngượ c 47

Hinh 3.3: V trí c t enzyme gi i h n c a xynA mang kí hi u AF027868.1 ị ắ ớ ạ ủ ệ 48

Hình 3.4: K t qu ế ả ch ạ y PCR v i c p m ớ ặ ồi đã thiế ế t k 49

Hinh 3.5: Điện di đồ ế k t qu các thao tác th c hiện trước khi nối 50 ả ự Hình 3.6: Ch n l ọ ọ c khuẩ ạc chứ n l a vector tái t ổ ợ h p pUC118- xynA trên môi trườ ng chứa X-gal-IPTG 51

Hình 3.7: Khu n l c sau khi bi n n p plasmid tái t ẩ ạ ế ạ ổ ợ h p pET xynA vào E coli -DH5α 51

Hình 3.8: Điện di đồ ế k t qu tách plasmid pET22b (+) tái t ả ổ ợ h p và c ắ t bằng enzyme gi i h ớ ạ n 52

Hình 3.9: Điện di đồ ế k t qu tách plasmid pUC118 tái t h p và c t b ng enzyme ả ổ ợ ắ ằ gi ớ i hạ 53 n Hình 3.10: Điện di đồ tinh s ch plasmid pET xynA b ng PEG ạ - ằ 54

Hình 3.11: Tinh s ch vector pUC xynA b ng PE và c t b ng enzyme gi ạ - ằ G ắ ằ ớ i hạn 55

Hình 3.12: Trình t nu c a gene xynA t B subtilis CN2 ự ủ ừ 56

Hình 3.13: So sánh trình t ự gene xynA ch ủ ng B subtilis CN2 v ới đoạ n gene mã hoá xylanse đượ c công b ố trên cơ sở ữ ệ d li u NCBI v i s hi u AJ536759.1 57 ớ ố ệ Hình 3.14: Trình t acid amin c a xyla ự ủ nase A củ a B subtilis CN2 58 Hình 3.15: C u trúc domain và phân lo i xylanase t B subtilis CN2 ấ ạ ừ 58 Hình 3.16: So sánh trình t ự tương đồ ng các acid amin c a xylanase t B subtilis ủ ừ CN2 v i trình t ớ ự chu ỗi acid amin đã đượ c công b mã hi u ACP87391.1 ố ệ 59 Hình 3.17: Hình nh khu n l c E coli BL21 sau khi bi n n p v i pET22b(+) ch ả ẩ ạ ế ạ ớ ứ a gene xynA 60 Hình 3.18: Điện di đồ protein tan và không tan 37°C và n ở ồng độ IPTG khác nhau 61 Hình 3.19: Đồ ị th ho t tính xylanase tái t h p đ ạ ổ ợ ạt đượ c v i c m ng IPTG khi thay ớ ả ứ đổi điề u ki n nuôi c y 61 ệ ấ Hình 3.20: Điện di đồ protein tan v i nhi t đ và n ớ ệ ộ ồng độ IPTG khác nhau 62 Hình 3.21: Điện di đồ protein không tan v i nhi ớ ệt độ và n ồng độ IPTG khác nhau 62 Hình 3.22: Điện di đồ enzyme tái t h p bi u hi n các nhi ổ ợ ể ệ ở ệt độ khác nhau khi dùng α -lactose làm ch t c m ng 64 ấ ả ứ Hình 3.23: Đồ ị th ho t tính xylanase tái t h p đ ạ ổ ợ ạt đượ c v i c m ớ ả ứng α - lactose khi thay đổi điề u ki n nuôi c y 65 ệ ấ Hình 3.24: Vòng thu phân c a xylanase tái t ỷ ủ ổ ợp trên môi trường đặ h c chứ a xylan 66 Hình 3.25: Độ ề b n pH c ủa enzyme thô trướ c khi tinh s ch 67 ạ Hình 3.26: Điện di đồ protein tái t h p sau khi tinh s ch b ng Ni ổ ợ ạ ằ P

2+

P 69 Hình 3.27: Điện di đồ protein tái tổ ợp sau khi tinh s ch b h ạ ằ ng nh a ự TALON 69 Hình 3.28: Độ ề b n pH c a enzyme tái t h p sau tinh s ch v i Co2+ ủ ổ ợ ạ ớ 72 Hình 3.29: pH t ối ưu củ a enzyme tái t ổ ợ h p sau tinh s ạ ch vớ i Co 2+P

P

73 Hình 3.30: Nhiệt độ ố t i ưu củ a enzyme tái t h p sau tinh s ch v i Co ổ ợ ạ ớ 2+P P 74 Hình 3.31: Độ ề b n nhi t c a enzyme tái t h p sau tinh s ch v i Co ệ ủ ổ ợ ạ ớ P2+

P

75 Hình 3.32: Độ ề b n nhi t c a enzyme s d ệ ủ ử ụng nướ c đ ề ion ủ trướ c ph n ng 76 ả ứ Hình 4 1: Đườ ng chuẩ n xylose 89 Hình 4 2: Đườ ng chuẩn Bradford 89

MỞ ĐẦU

Ngày nay nhiên liệ như xăng, dầu u, chất đốt, … là m t thu t ngộ ậ ữ quen thuộc và phổ ến trong mọi tầng lớp cư dân, nó vô cùng quan trọng và ần thiết bi ctrong sinh hoạt cũng như các hoạt động công nghiệp, nó tạo ra nguồn năng lượng cung c p cho máy móc hoấ ạt động, tạo ra điện, … N u không có nhiên li u thì nế ệ ền kinh t không th phát triế ể ển, đờ ống con người s i không t nâng cao, cuh ể ộc sống của con ngườ ặi g p nhiều khó khăn T xưa đừ ến nay con người ch y u s d ng ngu n ủ ế ử ụ ồnhiên li u khai thác tệ ừ ự t nhiên hay nguyên li u hoá thệ ạch t ừ lòng đất Nhưng do sựkhai thác quá mức của con ngườ ơn nữi, h a s tự ạo thành nhiên li u hoáệ th này ạch đòi

hỏi sự ắng mặt của oxy, áp suất, nhiệt độ (chu trình và mất từ hàng chục triệu v C) đến hàng trăm triệu năm Theo ướ c tính c a liên h p qu c và các qu c gia giàu tr ủ ợ ố ố ữlượng v d u m ề ầ ỏ thì hàng năm tổng lượng khai thác của con người hàng t t n d u ỷ ấ ầthô, và hàng tỷ ỷ t mP

3

Pkhí gas S chênh l ch quá l n giự ệ ớ ữa sự hình thành và khai thác dẫn đến lượng nhiên li u hoá th ch ngày càng cệ ạ ạn kiệt, giá nhiên liệu tăng cao dẫn

đến r t nhi u v n đ tranh ch p, chi n tranh bùng nấ ề ấ ề ấ ế ổ ả x y ra giữa các nước, đờ ối s ng con người khó khăn, và ấ t t nhiên ng nhiên li u khai thác khó có thểlượ ệ đáp ng đ ứ ủnhu c u cầ ủa con người T ừ đây đòi hỏi ph i có s thay th ngu n nhiên li u hoá ả ự ế ồ ệthạch bằng một nguồn nhiên liệu khác Nhiên liệu sinh học được các nhà khoa học

và các nư c đớ ặc bi t quan tâm nh ngu n sinh kh i sinh v t sệ ờ ồ ố ậ ẵn có trên trái đấ ớt v i

khối lượng lớn, giá thành rẻ có thể ục hồi nhanh chóng, đồng thờ ph i giảm thiểu được ô nhiễm môi trường

Hiện tại có một thách thứ ặc đ t ra là giá thành c a nhiên li u sinh hủ ệ ọc còn cao chưa th c nh tranh v i nhiên li u hoá th ch Do chúng ta vể ạ ớ ệ ạ ẫn đang trong giai đoạn tìm ki m và nghiên c u công nghế ứ ệ ả s n xuấ ối ưu và phù hợt t p với thự ễc ti n Tr ữlượng l n v s ng C c nh trong t nhiên là sinh kh i t bào th c v t, nó g m ớ ề ố lượ ố đị ự ố ế ự ậ ồ

có ba thành p n polymer chính: cellulose chi m 35 50% , hemicellulose chi m 23hầ ế - ế 35%, và lignin chiếm 10 20% sinh khố- i Vì vậ ự ử dụng một cách có hiệy s s u qu ảnguồn sinh khối tự nhiên đóng vai trò hết sức quan trọng nên ệc nghiên cứu hệ vienzyme phân huỷ lignocelluloses là vô cùng c n thiầ ết Cellulase là enzyme phân

-hu ỷ cellulose đã được nghiên cứu từ khá lâu và cũng đã đạt được những thành công

nhất định Enzyme phân huỷ hemicellulose và lignin cũng đang được các nhà nghiên c u quan tâmứ S ph biự ổ ến của xylan trong hemicellulose cho chúng ta thấy

rằng enzyme tổng hợp có hoạt tính phân huỷ xylan đóng vai trò quan trọng trong sự

biến đổi sinh họ Các sản phẩm thủy phân từ gnocellulose tạo thành đường đơn c li

và nh ng m ch polymer ng n tữ ạ ắ ừ đó dễ dàng biến đổi thành nhiên liệ ỏu l ng, protein đơn bào, dung môi và các s n ph m khác b ng viả ẩ ằ ệc sử ụ d ng vi sinh vật lên men đã được ch n l c ọ ọ

Các quá trình biến đổi sinh h c và loọ ại trừ các phần th a và ph n không sừ ầ ử

dụng sinh ra từ nông nghiệp, lâm nghiệp có sự ấp dẫn đặc biệt giúp tận dụ h ng nguồn thải và ảm ô nhiễm môi trường Không chỉ ậy xylanase cũng có nhiều tính gi vchất đặc bi t hữu ích có th ng d ng nhi u trong các ngành công nghiệ ể ứ ụ ề ệp và thương

m i ạ như công nghiệp giấy, bột giấy, thức ăn gia súc, công nghiệp bánh m Nh ng ỳ ữ

ứng dụng khác trong lĩnh vực bia rượu, nước gi i khát,ả [20] Do vậy trong nh ng ữ

thập niên gần đây các nhà khoa học đi sâu nghiên c u v enzyme này.ứ ề

S d ng ử ụ enzyme vi sinh vật cho quá trình th y phân công nghi p củ ệ ủa lignocellulose có nhiều ưu điể vì tính m ôn hòa của điều kiện phả ứ , tuy nhiên n ng

ho t tính ạ và khả năng xúc tác quá trình phân huỷ cơ ch t thì r t cao Hi n nay ấ ấ ệenzyme nói chung và xylanase nói riêng có giá thành còn rất cao nên đòi hỏi chúng

ta cố ắ g ng khai thác các vi sinh vật khcó ả năng sinh enzyme v i sớ ố lượng l , hoớn ạt tính cao đáp ứng cho quá trình phân h y sinh hủ ọc Hơn nữa ngày nay enzyme ứng

d ng ụ trong các quá trình công nghiệp đòi hỏi thực hiện phả ứ ở các điều kiện ng n

khắc nghiệt hơn về nhiệt độ, pH và thời gian dài Nên việc tìm kiếm những vi sinh

vật có khả năng tạo ra nhữ enzyme có đặng c điểm đáp ứng nhu c u thầ ực tiễn luôn luôn được đặt ra

Một câu hỏi lớn được quan tâm là những vi sinh vật có chứa gene có khả năng sinh enzyme cao, song ch nhỉ ững trường h p thi u chợ ế ất dinh dưỡng thì nó m i ớ

biểu hiện, hoặc nó không chỉ ạo ra một loại enzyme ta c n v i n t ầ ớ ồng độ cao mà còn nhiều loại enzyme khác có thể gây ức chế enzyme ta cần, ho c nh ng vi sinh vặ ữ ật đó gây độc cho nh ng s n phẩm quá trình lên men, Vì v y làm thữ ả ậ ế nào đ ể chúng ta

có th ng d ng chể ứ ụ ủng đó vào sản xu t hay t o ch ng s n xu t enzyme mà ta muấ ạ ủ ả ấ ốn

có nồng độ cao mà v n đẫ ảm b o an toàn cho các s n ph m sả ả ẩ ử ụ d ng cho mục đích tiêu dùng hay nh ng mữ ục đích khác Và chính việc gi i quy t nh ng câu hả ế ữ ỏi tương

t ự như vậy đã khiến cho các nhà khoa học quan tâm đến việc tách dòng và biểu hiện gene xylanase t rừ ất nhiều loài vi sinh v t khác nhau lên các vi sinh vậ ật có sức chịu

đựng t t, phát triố ển nhanh và không gây độc (lo i b ạ ỏcác gene gây độc) ch y u là ủ ế

E coli, B subtilis, P pastoris, S serevisia,

Xuất phát từ ững thách thứ ặt ra, chúng tôi đã tiế nh c đ n hành nghiên cứu đềtài: “Tách dòng, bi u hi n gene ể ệ xynA t ừB subtilis CN2 trên E coli BL21 và nghiên

cứu đặc tính của xylanase tái tổ ợ h p” với những nội dung sau:

1 Tách dòng gene xyn ừ B subtilisA t CN2

2 Giải trình tự gene A t xyn ừ B subtilis CN2

3 Biểu hiện gene xyn ừ B subtilis CN2 lên E coli BL21 (DE3)A t

4 Tinh sạch enzyme xylanaseA bằng sắc ký ái lực

5 Khảo sát một số đặc tính của xylanase tái tổ ợp để đề h xuất phương hướng ng d ng phù hứ ụ ợp đố ới v i enzyme này trong th c tế ự

Cùng với sự nghiên c u không mứ ệt mỏi của các nhà khoa học, sự trao đổi kinh nghi m và k t quệ ế ả, cùng nhau gi i quyả ết những khó khăn Chúng ta đều có thể

khẳng định chắc chắn rằng trong tương lai gần thì nhiên liệu sinh học sẽ là nguồn nhiên li u phệ ổ ế bi n, hữ ụu d ng và thay thế được ngu n nhiên li u hoá th ch chúng ta ồ ệ ạđang sử ụ d ng và l thuộc vào nó Góp ph n xây d ng thệ ầ ự ế giới hoà bình, trong lành

và giàu mạnh

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN1.1 Xylan

Xylan là thành phần chính của hemicellulose β ,4 xylan là các 1 polysaccharide của đường xylose được tìm thấy trong thành tế bào trong tất cả các

-loại thực vật trên cạn và trong hầu hết các phần của cây Để ủy phân các thành th

phần khung xương của chúng đ i hỏi sự ợp t c của nhiều loại enzyme kh c nhau ò h á áchủ ế y u là -1,4-xylanase (1,4- -D-xylan xylanohydrolase; EC3.2.1.1) và β βxylosidase (1,4- -D-β xylan xylohydrolase; (EC3.2.1.37) [32,59]

Cấu trúc của xylan

Hình 1.1: Dạng đơn gi ả n của xylan

Xylan là m t ví dộ ụ ủ c a một pentosan bao gồm các đơn vị D-xylose liên kết

với nhau bởi liên kết β 1→4

Trong thành tế bào xylan được cấu thành từ các liên k t 1,4- -D-xylosyl ế β

ngắn thành mộ khung xương ới các α glucosyluronic acid (GlcA), 4t v -D-

-methyl-O-α-D-glucosyluronic acid (MeGlcA), α-L-arabinosyl, O acetyl, feruloyl, ho c các - ặchuỗi bên coumaroyl Mức độpolymer hoá của xylan trong gỗ ứng là 150 200 gốc c -

β-xylopyranose, gỗ ềm là 70 đến 130 gốc -xylopyranose m β

84T

Hình 1 2: Dạ ng ph ứ c tạ ủ p c a xylan

Hình 1.3 : Đơn vị ấ c u trúc củ xylan từ c [8] a ỏ

Trong mô hình m ch cạ ủa tế bào thực vậ βt -1,4-xylan chủ ế y u tìm th y trong ấ

lớp thành tế bào thứ hai, là thành phần chính của tế bào trưởng thành trong mô gỗ, trong hemicellulose ở các l p tếớ bào đầu tiên của cây một lá m m, xylan là mầ ột thành phần thứ ếu của lớp thành tế bào đầu tiên cây hai lá mầm Điều quan trọ y ng xylan được coi như một ngu n cung c p C chính trong brichwood v i 35% khồ ấ ớ ối lượng khô Nhìn chung, xylan là m t hemicellulose quan tr ng trong g c a cây h t ộ ọ ỗ ủ ạkín 15 30% và ít ph- ổ ế bi n trong cây h t tr n tạ ầ ừ 7-12% trong lượng khô [1]

1 Xylanase .2

1.2 1 Tên gọi và đặc tính của xylanase

Xylanase được mô t b i hi p h i qu c t hóa sinh và công ngh sinh học ả ở ệ ộ ố ế ệphân tử (IUBMB)) như sau:

- S ố đăng ký: EC 3.2.1.8

- S ố đăng ký sởlý thuyế hóa học của xt ylanase: 9025-57-4

- Tên hệ ố th ng: 1,4-D-xylanohidrolase

- Tên thường : Endo-1,4- xylanase

Các Tên khác: β xylanase; β- - -1,4 xylanase; β- -1,4 xylan xylanohidrolase;

β-D-xylanase; endo-1,4-xylanase; endo-β-1,4-xylanase; endo- -1,4-D-βxylanase; do - -xylan-D-xylanohidrolase; (t en β 1,4 ừ vi khuẩn) endo xylanase; β- -

xylanase, pentosanase, xynA protein, xylanase, xylanase j, xylanase y, xylanase z, xylanase III

Thuộc loạ : Hydrolasei (enzyme thủy phân)

Cơ chất: Xylan

Sản phẩm: Xylose

Ngu ồ n gố [59]: c

- Vi khuẩn: B polymyxa, Cryptococcus albidus, Cellulomonas fimi,

- N m: ấ Aspergillus spp (nudulans, ochraceus, fumigatus Penicillium, ),

Fuarium, Chaetomium, Aureo bacidium, Rhizomucor, A Ozyrae, Clostridium stercorarium,

- Nấm men: S thermomonospora, S Lividans¸ S Exfoliatus,

Kh ối lượ ng phân tử

- Vi khuẩn (chi Bacillus) : 9,5 56 kDa-

- Nấm (Aspergillus spp, Trichoderma spp) - : 8 53 kDa

- Nấm men Streptomyces ( spp) : 24 50 kDa -

- X khuạ ẩn (Trichoderma spp): 8,5 53 kDa -

1.2.2 Phân loại xylanase

Enzyme xylanase thường được tìm th y th c v t và vi sinh v t Chúng ấ ở ự ậ ậđược phân chia thành r t nhi u h d a vào ngu n g c, cơ ch t, hoấ ề ọ ự ồ ố ấ ạt động, trình t , ự

c u ấ trúc domain, đặc điểm hoá lý và chức năng của chúng, sự quan trọng trong công nghiệp, sự thích nghi với các điều kiện môi trường khác nhau Nhưng có 2 h r t ọ ấ

ph bi n ổ ế và được quan tâm đặc biệt là:

- Endo-xylanase họ 10 gồm các enzyme có nguồn gốc từ ự th c v t, n m mậ ấ ốc

và vi khu n có khẩ ối lượng phân tử cao v i giá trị ớ pI th p (hấ ọ F)

- Endo-xylanse họ 11 gồm các enzyme có nguồn gốc từ ấm mốc và vi nkhuẩn có khối lượng phân tử ấp với giá trị pI cao (h th ọG)

S ựkhác biệt về đặc tính xúc tác của họ 10 là có khả năng thủy phân các liên

kết glycoside cạnh các điểm nhánh và hướng về đầu không khử Trong khi đó họ 11 không có khả năng đó [5] Endo xylanase h 10 c n hai g c xylopyranosyl không - ọ ầ ốthay thế giữa các nhánh thì endo-xylanase của họ 11 c n có ba g c xylopyầ ố ranosyl liên ti p không thay thế ế Do đó, các endo-xylanase của họ 10 hoạt động linh động hơn họ 11 Điều này cũng có nghĩa là họ 11 hoạt tính xúc tác ch n lọ ọc hơn

Ngoài vi c phân lo i xylanase làm 2 nhóm l n, nhi u nhà khoa hệ ạ ớ ề ọc cũng đã tiến hành nghiên cứu, phân chia xylanase thành nh ng nhóm nhữ ỏ hơn Sapag [50] chia xylanase h 11 thành 6 nhóm chính Nhóm I, II và III chọ ứa chủ ế y u các enzyme của nấm mốc Trong khi đó, các xylanase của vi khuẩn được chia thành ba nhóm là A, B và C Nhóm A là các xylanase được sinh t ng h p b i h ổ ợ ở ọActinomycetaceae và Acillaceae, hoàn toàn là nh ng vi khu n hi u khí gram ữ ẩ ếdương Nhóm B và C thì chứa các enzyme chủ ế ừ y u t các vi khu n y m khí gram ẩ ếdương, những loài thường s ng trong d c ố ạ ỏ

1.2.3 Cấu trúc không gian 3 chiề của xylanase u

Có m t sộ ự ến đố bi i khá lớn giữa các enzyme phân h y xylan sinh t ng hủ ổ ợp

t nừ ấm và vi khuẩn, enzym được tiết ra trong môi trường chứe a cơ chất xylan và phân h y nó thành nh ng oligosaccharide ngủ ữ ắn hơn và những ph n này có thầ ể ử s

dụng như một ng ồn năng lượng cho vi sinh vật Xylanu ase được phân thành hai họF10 và G11 a trên s dự ự tương đồng trình tự chuỗi amino acid và s phân tích cự ấu trúc không gian 3 chiều

a b

Hinh 1 4: Cấ u hình không gian c a G11 xylanase t ủ ừ Bacillus subtilis (XYNA)

Phầ ấu trúc điển c n hình nh t c a G11 xylanase là chứấ ủ a 2 vòng xo n g p n p ắ ấ ế

β được g i là g p “jellyroll” (th ch tròn) ọ ấ ạ giống như một bàn tay phải hình 1.4a Trong ó nhđ ững mạch β riêng biệt đan v o v ra tạo th h c c v ng ng n tay và à à àn á ù ó

lòng b n tay như trong hình 1.4b vùng P và F ph n khe n i c c phà ầ ố á ần cò ại được n l

tạo th nh giữ 2 v ng n y tạo th nh trung tâm hoạt động v ắà a ù à à à g n cơ chất của protein

Vòng tr n mở ộng tạo th nh v ng dạò r à ù ng ngó án c i (vùng T , c i n y c) á à ó thể i u đ ềkhiển vị trí đóng mở ủa trung c tâm hoạt động (chứa glutamic ở ị trí 75 và 78) đóng v vai trò điều hòa s g n c a cơ ch t v i vùng xúc tác c a enzyme [44] ự ắ ủ ấ ớ ủ

Các amino acid cấu th nh xylanase họà 11:

Hình 1 5: H ọ 11 xylanase t ừ Bacillus circulans (1XNB) và Trichoderma harzianum

(1XND)

T hìừ nh 1.5 ta thấy cấu tr c không gian ú và các amino acid cấu th nh hà ình

dáng của ủa họ 11 xylanase từ c Bacillus circulans và Trichoderma harzianum ấ r t

giống nhau mặc dù nó có khoảng cách di truyền rất lớn một enzyme từ vi khuẩn c n òmột enzyme từ nấm mốc Vị trí của nhi u amino acid bề ảo vệ thì được giữ ấ r t gần nhau Màu xám thể hiện tờ ấp nế β hình thành vùng lõm 2 lớ g p p xung quanh v trí ị

hoạt động Màu xám đen thể ệ hi n một vòng xoắ và nén αn [56]

1.2 4 Chức năng và cơ chế thủy phân của xylanase

a ) Chứ c năng c ủ a xylanase

Xylanase là m t enộ zyme xúc tác th y phân liên k t 1,4ủ ế -beta-D-xylose trong xylan thành ph n c a hemicellulose, là m t trong nh ng thành ph n c u trúc lên ầ ủ ộ ữ ầ ấthành t bào thế ực vật, làm phá vỡ ấ c u trúc của thành tế bào giải phóng đường xylose

và giúp các enzym khác hoe ạt động thuậ ợn l i và hi u quệ ả hơn trong quá trình sản xuất Arabinoxylan cũng được biết đến như một pentonsan là những xylan phân nhánh cao trong b t lúa m và b t lúa mộ ỳ ộ ạnh đen có hàm lượng xylan cao Xylanase thuộc nhóm pentosanase, một nhóm của enzym phá hủy các thành phần của thành e

t ếbào chất nền của thực vật (sợi), bẻ gãy hợp chất đặc biệt trong thành tế bào thực

v t ậ

Tạo đ ềi u kiện để các enzym tiêu hóa phía sau làm vi c hie ệ ệu quả do h n ạchế ở b i tính nh y c a dịầ ủ ch vùng d dày và kích thích tiêu hóa giúp h p thu ch t dinh ạ ấ ấdưỡng tốt hơn Chống l i s ạ ự tăng số lượng của vi khuẩn kị khí và giảm tỷ ệ ắc l m

Hình 1 6: Cơ chế ho ạt độ ng c a xylanse ủ d ạng đơn giả n

Do c u trúc c a xylan ấ ủ ở ạ d ng liên k t trong thành tế ế bào r t phức tạấ p nên đểphân hu hoàn toàn m ch xylan thành các mỷ ạ ạch ngắn đơn giản hơn thì xylanase không thể hoạt động m t mình mà ph i hoộ ả ạt động cùng v i nhi enzyme khác ớ ều (hình 1.7) Endo-1,4- -D-β xylanase phân cắt ngẫu nhiên khung xylan, β-D-xylosidase (EC 3.3.1.37) phân c t các xylose m t c u t thành các xyloắ ộ ấ ử -oligosaccharide đầu không kh Trong khi lo i b các nhóm bên c a xylobiose thì ử ạ ỏ ủđược xúc tác b i -L-arabinofuranosidase ở α (EC 3.2.1.55) α glucuronidase (EC , -D-

3.2.1.139), acetylxylan esterase (EC 3.1.1.72), ferulic acid esterase (EC 3.1.1.73) và p-coumaric acid esterase.

Hình 1 : V .7 ị trí tấn công của endo -1,4- - β xylanase trên mạch xylan

S thự ủy phân ủa các enzyme thủy phân polysaccharide kiểu như cellulase c

và xylanase có th là k t quể ế ả ủ c a sự duy trì hay ngh ch chuy n c a trung tâm ị ể ủanomeric của các monomer đường khử ủ c a carbonhydrat [10] Đề xuất này bao gồm một hoặc hai trạng thái chuy n tiể ếp hóa học Sự ị dch chuyển glycosyl thường d n ẫ

đến s thay i tính ái nhân C bão hòa của trung tâm anomeric và di n ra vự đổ ở ễ ới sự duy trì ho c ngh ch chuy n cặ ị ể ủa cấu hình anomeric Có s liên quan cự ủa cơ chế ị d ch chuyển kép cho sự duy trì anomeric của sản phẩm

Cơ chế ị d ch chuy n kép bao g m các đ c đi m: ể ồ ặ ể

- Xúc tác axit với vi c thêm mệ ột proton vào cơ chất

- Một nhóm carboxyl của enzyme ở ạng thái hoạt động tr

- Một liên kết trung gian cộng hóa trị glycosyl xuất hi n giệ ữa enzyme với cacbonhydrat này trong đó cấu hình anomeric của đường tham gia liên

kết này đối lập với đường của cơ chất

Các tương tác không phả ội c ng hóa tr ị đượ ạc t o ra v i t l ớ ỷ ệ tăng lên [3]

Hình 1 8: Cơ chế ủ th y phân xylan c a 1X ủ NB

a) Cơ chất xylan được g n vào v ắ ị trí lõm o thành gi a tyr65 và tyr69 tạ ữglu172 là ch t xúc tác acid/base glu78 là ấ , tác nhân b) Glycone được gắ ớn v i glu78, liên kết này được giữ trong su t phố ả ứn ng chuy n glycosylể c) Nước thay thế tác nhân d) Phá ỏ liên kết và làm yếu glycone cho phép enzyme di chuyển đến một vịb trí mới trên cơ chất Bởi vì aglycone được giải phóng trong (b) và glycone được giải phóng trong (d) Nhi u xylanase cề ủa họ 11 thể ệ hi n một cơ chế ắ c t trong m ch ng u ạ ẫnhiên hơn là theo một quy lu t nhậ ất định [56 ]

Leggio và các cộng sự (2000) [23] xu t cơ ch đề ấ ế xúc tác c a xylanase qua ủ

3 giai đoạn :

- Xylanase nhận bi t và g n vào xylan ế ắ

- Gốc xylosyl ở ị v trí -1 bị làm biến dạng và bị làm lỏng lẻo hướng về phía

gốc xúc tác, liên kết glycosidic bị cong và phá vỡ để ạ t o thành d ng liên ạ

kết cộng hóa trị enzyme-cơ chất trung gian

- Chất trung gian bị ấn công bở ộ t i m t phân t nước hoạt động, tiếp theo đó ử

cơ chế ủ th y phân glycosyl c n ti p t c di n ra và s n phổ điể ế ụ ễ ả ẩm được gi i ảphóng

1.2 5 Ứng dụng của xylanase

Nh ng zyme ữ en có hoạt tính xylanase là hemicellulase mà xúc tác phả ứn ng thủy phân xylan, thường liên kết với các thành ph n cellulose và lignin cầ ủa tế bào cây Vì vậy mà các enzyme phân hủy xylan được sản xuất nhờ vi k ẩn Bacillushu

macerans Cơ chất có th s dể ử ụng như một ngu n cơ chấồ t C d ng r n lignocellulose ạ ắnhư:

- Công nghệ vi sinh th c ph m /công ngh ch t đ c / ki m soát chự ẩ ệ ấ ộ ể ất lượng

- Kĩ thuật môi trường

- X ửlý sinh học /phân bón /biến đổi sinh học

Ứ ng d ng thương m i: ụ ạ

- Ứng d ng k thu t gene công nghi p ụ ỹ ậ ệ

- Rượu vang và các loại rượu

- Nước ng t và th c ph m t nhiên ọ ự ẩ ự

- Thực phẩm cho sức khỏe

- Sản phẩm thực phẩm nói chung

- Công nghiệp d t, gi y và các ngành công nghiệp khác ệ ấ

Xylanase thường được s d ng k t h p v i nhi u enzyme khác như ử ụ ế ợ ớ ềcellulase, mananase, … [20]

S d ử ụ ng trong làm bánh mỳ cđể ải thiện tính nhão ủa bột nh c ào (kh ả năng làm việc, tính bền) và để ối ưu quá trình sả t n xuất quá trình lên men ở điề u kiện ôn hòa hơn Cải thiện hương vị và mùi v , tị ăng cường s ự ổn định cho b t nhào, ru t ộ ộ

mềm và mịn, cải thiện cơ cấu ruột bánh, tăng thể tích v giòn, thay th các hóa chất ỏ ế

ph ụ gia là do liên quan đến sự tương tác giữa lúa mì và gluten protein arabinoxylan

dẫn đến tăng cường thêm sự co giãn của gluten

Xylanase có thể ử ụng để s d trộn vào bánh Trong s n xuả ất rượu vang và nước qu s dả ử ụng xylanase tăng cường kh ả năng trích ly c a qu Trong công ngh ủ ả ệ

sản xuất cồ xylanase giải phóng chất nhầy trong hn ạt ngũ cốc để ử ụ s d ng trong quá trình lên men

Trong công nghệ in báo xylanase cùng với cellulose tỉ ệ l 50:50 s làm cho ẽ

giấy báo sau in sáng hơn, nét hơn, chống bẩn tốt hơn, năng suất cũng cao hơn so với

s dử ụng chất hóa học

Trong sản xuất rượu vang xylanase được sử ụng để phân hủy xylan, dpectin và hemicellulose có m t trong hoa qu thành các phân tặ ả ử đơn giản như xylose và glucose Bằng sự phá h y thành t bào, nó giúp chiủ ế ết các chất trong nước

qu tả ốt hơn

S d ử ụ ng trong công nghiệp giấ y để tăng cường sức bền của sợi trong tẩy

trắng bột giấy từ tre và cây khuynh diệp, tăng kh ả năng lọc b t gi y và gi ộ ấ ữ nước,

giảm thời gia ử lý bột giấy mớ tăng cường sự ự do trong các sợi tái chế, lon x i, t ại bỏ

có chọ ọn l c xylan t b t giấ tăng ờừ ộ y cư ng kh ả năng tấy tr ng gi y, giảm tính nhớt ắ ấ

Đặc bi t xylanase s d ng trong ngành công nghi p này v i mệ ử ụ ệ ớ ục đích như một ch t ấthay thế ế ố ẩ y u t t y tr ng hóa hắ ọc như chlorine và các dẫn xu t c a nóấ ủ , giđể ảm thiểu

nh ng ữ ảnh hưởng có hại đến môi trường [20]

Xylanase từ ấ n m s i ợ thì thích h p cho các quá trình công nghiợ ệp được phát tri n gể ần đây mà có ên quan đến tẩy trắng bột giấ Trên thực tế điều kiện tối ưu li y

của xylanase được sử ụng cho xử lý bột giấy trong công nghi p gi d ệ ấy là ở pH acid

và nhiệt độ 50P o

P

C

84T

Hình 1 9: Cấ u trúc c a xylan và v trí c t các enzym trong quá trình s n xu t gi ủ ị ắ e ả ấ ấ y

Có 5 enzyme tham gia phả ứn ng trong quá trình s n xu t gi y theo tr nh tả ấ ấ ì ự

Phân h ủ y ch t th i n ấ ả ông nghi ệ p (rơm, ạr )

Các đặc tính sinh h c và hoọ ạ ột đ tối ưu của xylanase phù hợp với phương pháp công nghi p hiệ ện đ i đạ ể ẩ t y trắng bột giấ Đây là mộy t s thuự ận lợ đểi nâng cao chất lượng quá trình t y tr ng bẩ ắ ằng phương pháp sinh học, thân thi n v i môi ệ ớtrường và tránh s t o thành các s n phự ạ ả ẩm phụ độc cho người khi s dử ụng công ngh ệ hóa học Đặc biệt hơn xylan được tổng hợp từ ấm, có khả năng lên men ở nnhiệt độcao

Một vài enzym đã sản xuất để ử ụng trong thực phẩm được ghi nhận là e s dnguyên nhân gây d ng khi hít phị ứ ải Điều này thể hiện rằng d ị ứng enzyme trong điều ki n nhà máy s n xu t là d x y ra Giệ ả ấ ễ ả ống như các enzyme khác, xylanase có

th là ngể uyên nhân dị ứng nghề nghiệp với những người nh y cạ ảm Năm 1998, hi p ệhội các nhà máy lên men các sản phẩm enzyme cử nhóm làm việc đối với khách hàng d ng tị ứ ừ nh ng zymữ en e có trong thực phẩm, dị ứng được thực hiệ phân tích n sâu t i chạ ỗ Nhóm đã kết luận r ng kằ hông có nh ng d u hi u khoa hữ ấ ệ ọc nào gây

ph n ả ứng dị ứng cho những người tiêu dùng ớ ộ ố lượng nhỏ v i m t s enzyme có trong

thực phẩ và nhữ enm ng zyme còn lại trong thực ph m không gây ra b t kẩ ấ ỳ ự ủ s r i ro nào cho người tiêu dùng Xylanase của nấm và vi khuẩn đã từng được sử ụ d ng trong th c ph m v i sự ẩ ớ ố lượng l n trong nhiớ ều năm

Do xylanase nh y c m v i nhi t và có thạ ả ớ ệ ể mất hoạ tính trong quá trình t nướng bánh ho c n u chín thặ ấ ức ăn Các thí nghiệm được th c hi n v i xylanase cho ự ệ ớ

thấy rằng các enzyme hoạt động nhiở ệt dưới 50P

1.2.6 Dạng sản phẩm xylanase trên thị trường

Xylanase có thể được xử lý dưới dạng:

- Dạng rắ : như các vi hạt, viên, bột n

- Dạng lỏng

C ảhai dạng này đều được làm công thức với thành phần phù hợp như chất

ổn định, ch t b o v và ch t mang phù h p cho sấ ả ệ ấ ợ ử ụ d ng trong thực phẩm mang lại

hiệu quả kinh tế cao có thể ùng thay cho chấ d t ph ụ gia mà không độc h i v i môi ạ ớtrường và ngườ ử ụi s d ng

Hì nh 1 10: Các dạng sản phẩm xylanase trên thị trườ ng

1.3 Những thành tựu trong tách dòng và biểu hiện gene xyn mã hoá A xylanase

1.3.1 Ở nước ta

Hiện nay các nghiên cứu về xylanase mới chỉ ập trung nghiên cứu đặc tính txylanase của các chủng và khả năng ứng d ng c a chúng Ví d nghiên c u vụ ủ ụ ứ ềxylanase của Aspergillus niger và ứng dụng trong tẩy trắng bột giấ ủy c a Nguyễn Văn Diệp và c ng s (2005) [39] ộ ự

Công trình nghiên c u khứ ả năng sinh tổng h p enzym xylanase cợ e ủa nấm

mốc Aspergillus oryzae (8,8 U/mg protein) và đã tách dòng biểu hiện thành công 2

gene của Aspergillus oryzae (gene xylitol dehydrogenease XdhA AB109101 và gene L-Arabinitol 4- dehydrogenease LadA AB116938) c a Tr n Liên Hà và củ ầ ộng

s ự(2004, 2005)

Năm 2004, Nguyễn Th Uyên Th o và các c ng s ã công b nghiên cị ả ộ ự đ ố ứu

v viề ệc sử ụng vi nấm Trichoderma để thu nhận các enzyme cellulase, xylanase và d pectinase từ nguồn nguyên li u là bã khoai mì Tệ ổ hợp enzyme này được nghiên cứu và ứng dụng vào sản xuất thức ăn chăn nuôi [37]

Đỗ Th Tuyên và c ng s ti n hành nghiên cị ộ ự ế ứu và đánh giá mộ ốt s tính ch t ấhóa lý của chủng Aspergillus niger DSM1957 trên d ch tinh sị ạch sơ bộ [9] Ho t ạ

tính của enzym xylanase đạt cao nhấ ởe t nhiệt độ 55o P

P

C, pH là 5,0 Ho t tính ạxylanase bị ả gi m khi ủ ớ v i m t sộ ố ion kim loại (FeP

2+

P, FeP

3+

P, CaP

2+

P, MgP

2+

P, ZnP

2+

P, CuP

2+

P,

Bên cạnh đó cũng có mộ ố đềt s tài nghiên cứu về xylanase tái tổ ợp Năm h

2009, Nguy n Th Thu Thùy và cễ ị ộng sự đã biểu hiện và đánh giá tính chất hóa lý

của xylanase tái tổ ợp từ Aspergillus oryzae h VTCC – F187 trong Pichia pastoris

GS115 [38]

Nguyễn Hải Chiều và cộng sự (2008) biểu hiện thành công một cDNA xylanase phân l p tậ ừ Aspergillus awamoris trong Pichia pastoris Xylanase tái tổ

hợp có hoạt tính cao nhấ ở pH 4,0 Dải bền nhiệt của enzyme từ 20 - 60°C [36] t

Lê Văn Trường, Thomas Schweder đã biểu hi n gene mã hóa xylanase ệtrong Bacillus subtilis s dử ụng promoter alpha-amylase từ Bacillus amyloliquefaciens Sau khi biểu hiện, lượng rXynA được tiết ra với mứ ộc đ cao, đạt khoảng 0,5 mg/ml trên môi trường BMM Nhiệt độ ối ưu và pH tối ưu cho hoạt ttính xylanase là 50P o

P

C, pH 6,0

1.3 2 Trên thế giới

Các gen e xylanase đã biểu hiệ n và gi i trình t ả ự :

- Gene xynA, xynB, gene A và B mã hóa X22 và X24, gene xln xln XYL2, XYL3, gene (xyl11), gene xynZG , gene dna dnaK– J (Bacillus), gene Xyn11, gene xylanase BS1, BS2, BS3,…

- Nghiên cứu xylanase t vi khu n gừ ẩ ồm có các loài Bacillus subtilis, Bacillus pumilis, Aeromonas caviae,… Nấm men như Candida tropicalis, Trichoderma reesei, Trichoderma koningii, Nấm mốc như Aspergillus niger, Aspergillus usamii, Aspergillus oryzae, Penicillium purpurogeneum,…

- Bi ểu hiện trên vi khuẩ E coli B subtilis), nấm men (Saccharomyces n ( ,

cerevisiae), nấ m m c (Aspergillus kawachii),ố … đã tạo ra xylanase tái tổ ợp, Với kĩ hthuật này đã nâng cao được hoạt lực của enzym lên nhiều lần so với chủng gốc ban e

đầu Tuy nhiên h thệ ống biểu hiện ảnh hưở đến hiệu quả ủa quá trình Quereshy ng c

và c ng sộ ự (2000) đã chỉra r ng khi bi u hi n gene xylanase cằ ể ệ ủa Bacillus circulans

lên Bacillus subtilis có nhiều ưu điểm hơn biể u hi n trên E coli Ho t l c c a ệ ạ ự ủ

enzyme tái tổ ợ ở Bacillus subtilis (1120 U) hơn 14 ần so vớ ở h p l i E coli (79 U)

[46] Nguyên nhân của sự tăng lên này là do tính tương đồng của vật chủ do đó giúp tăng cường quá trình phiên mã, dịch mã cũng như ổn định c a gene bi u hi n ủ ể ệChính vì vậy mà các hệ thống biểu hiện luôn được nghiên cứu và ứng dụng

Các nhà khoa học đã không ngừng tìm kiếm các enzyme có hoạ ực cao t ltrên các loài sinh v t phậ ổ biến như: Nấm m c, vi khu n, x khu n, n m men, và ố ẩ ạ ẩ ấ

đã đạt được nhi u thành tề ựu đáng kể Ch xét riêng v xylanase ta có:ỉ ề

A awamori, A kawachi, A tubingenesis,…

Quá trình biểu hiện này lại chưa được biết nhiề ề cơ chế ểm soát sựu v ki

biểu hiện gene xylanase mà chỉ trong từng trường hợp của gene xlnA của A tubigenesis mới điều hòa được các nhân tố liên quan trong xylanase cụ ể được xác th

định rõ ràng trong promoter c a gene ủ

Hai gene của A nidulans là xlnA và B mã hóa xylanase X22 và X24xln t ừnhững chủng nấm này đã được tách dòng và gi i trình tả ự cDNA và được biểu hiện trong phòng thí nghi m lên chệ ủng Saccharomyces cerevisiae dướ ự ểi s ki m soát của promoter điển hình c a n m men và k t qu là trong c u t o chromosome c a ch ng ủ ấ ế ả ấ ạ ủ ủ

nấm men này đã mang gene xylanase tái tổ ợ h p

Tách dòng và bi u hiể ện không đồng nh t gene m i mã hóa xylanase tấ ớ ừ

Plectosphaerella cucumerina (xynZG) theo phương pháp genome-walking PCR và

chuyển gene và Pichia pastoris GS115 [o 62]

Tách dòng và bi u hi n gene trên n m menể ệ ấ

1 Kit biểu hiện protein “K lactis” (vector biểu hiện pKLAC2) trên vật chủ (nấm men Kluyveromyces lactis) [35]

Cung c p mấ ột phương pháp d dàng cho biễ ểu hiện m t gene quan tâm vào ộnấm men Kluyveromyces lactis Protein có thể được s n xu t n i bào ho c ngoại ả ấ ộ ặbào, sử ụ d ng vector bi u hi n pKLAC2 V i kit này chúng ta s có nhiể ệ ớ ẽ ều điểu kiện thuận lợi hơn trong quá trình tách dòng và biểu hiện gene trên nấm men Đây sẽ ạo tnên một bước ngo t l n trong bi u bi n gene trên thặ ớ ể ệ ế ớ gi i

2 Meltem AfiAN và cộng s ự (2007) đã biểu hiện gene -(1,3-1,4)-β

Glucanase lên Streptococcus salivarius subsp thermophilus [29]

Tách dòng và bi u hi n gene xylanase trên vi khuể ệ ẩn, đặc bi t là ệ Bacillus

1 Charles C Lee và cộng sự (2008) đã tách dòng gene xyn11 từ Bacillus licheniformis và ng ên cứu đặc tính của enzym tái tổ hơp trên vật chủhi e là

5 Tách dòng và bi u hi n gene xylanase tể ệ ừ Bacillus polymyxa lên E coli

[13,47]

6 Xylanase từ Bacillus, Vector bi u hi n cho xylanase pUB BPX12 cho ể ệ

-Bacillus pumilus là PRL B12, Xylanase gene từ pumilus PRL B12 vector tách B

dòng plasmid pUB131 [41]

C HƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP -

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Chủng giống và vector cho tách dòng và biểu hiện

Nguồn sinh vậ chủ Bacillus subtilist: ng CN2 [57] được chọn lọ ừ ộ sưu c t b

tập giống của Bộ môn Vi sinh Hoá sinh inh h c phân t- - S ọ ử, Viện Công nghệ Sinh

học và T ực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nộh i

T ếbào chủ: ững tếNh bào E coli DH5α (Promega) có khả năng tương thích

với phương pháp chọn lọc lacZ xanh/trắng, dễ dàng được chuyển bằng plasmid DNA hi u quệ ả cao, E coli BL21(DE3) (Novagen) (mang m t b n sao c a gene mã ộ ả ủhoá T7 polymerase trong lamda lysogen (DE3) trên chromosome [22]) được sử

dụng cho ểu hiện protein tái tổ ợ bi h p

Vector PUC118 là plasmid vector t hãng Invitrogen ừ được sử ụ d ng chotách dòng, vector pET22b(+) (Novagen) dùng cho tách dòng và bi u hiể ện

2.1.2 Môi trường nuôi cấy và giữ giống vi sinh vật

Các môi trường LB và TB nuôi c y vi khuấ ẩn được thanh trùng nhiở ệt độ

121P o

P

C trong 20 phút

Môi trườ ng nuôi c y: m ấ ôi trường LB [C.8]

Môi trườ ng bi u hi n: m ể ệ ôi trường LB thêm chất cả ứng IPTG với các m

nồng độkhác nhau và thêm MgCl2 Môi trường Terrific Broth (TB) [55] được pha như phần ph l c [P.7] ụ ụ

Môi trườ ng gi gi ng: ữ ố

- Môi trường giữ ống PDA gi [C.9]

- Môi trường gi gi ng Glycerol l ng: mữ ố ỏ ôi trường LB l ng và Glycerol ỏ10% Hoạt hoá vi khuẩn với thời gian 14 đến 16 h (qua đêm) bằng LB

lỏng, sau đó bổsung Glycerol 100% với thể tích chiế 10% tổng thểm tích dung dịch

2.1.3 Hóa chất, enzyme, kit, thiết bị sử dụng

Hóa chất:

* Glucose, Xylose, Agar, Agarose, Bacto Triptone, Bacto yeast extract (cao n m men)ấ , KHR 2 RSOR 4 R, NaCl, MgSO4.7HR 2 RO, NaHR 2 RPOR 4 R, NaR 2 RHPOR 4 R, MgClR 2 R, Glycerol, Acid acetic, Ethanol 100%, NaCl, Tris, HCl, Methanol, NaR 3 RPOR 4 R, Boric acid, (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan)

* Birchwood xylan, Beechwood xylan (Sigma)

* Ampicilin, IPTG, X-gal,

Hoá ch t trong phấ ả ứn ng PCR t hãng Từ akara

Kit:

Tách plasmid Plasmid Midi kit (100) - , nh Ni-NTA (Qiagen), TALON ựa (invitrogen), Kit tách protein - Bug Buster (Invitrogen), DNA Ligation Mix (Takara), kit loại bỏ nhóm phosphate đầu 5’ rAPid alkaline phosphatase (Roche Applied Science (USA))

o

P

C (Bio-shaker ,TAITEC)

- Máy Gradient PCR (Takara), máy điện di (GelMate2000, TOYOBO), máy soi gel (STAGE-1000, AMZ) máy quang ph, ổ (đo ho t tính enzyme)ạ (UV mini

1240, SHIMADZU)

- Máy li tâm nhiệt độ phòng (KUBOTA 1120 , máy li tâm nhiệt thay đổi )(TOMY MX 105, TOMY suprema 21), máy Spindown (CAPSULEFUGE, TOMY -PMC-060), máy vontex (VORTEX-GEN , 2)

- B ể ổn nhiệ (Thermal Robo TR 2A, AS ONE), máy n nhit - ổ ệt (CTU-Mini, TAITEC),

- Máy lọc nước Mili Q, Ultrapure Water System (Aquarious ADVANTEC), máy làm đá (HOSHIZAKI)

- Máy g ải trình tự CEQ 2000XL DNA Analys system (BECKMAN iCOULTER)

- Máy đo quang Multi-Detection Microplate Reader POWERSCANⓇHT (Bradford microplate)

- Các thiết bị nghiên cứu khác: cân điện tử, máy đo pH, pipetman eppendoft (pipette, thermo scientific), eppendoff (Trefflab), Pipette tip 100μl và 1000μl (QSP),

Centrifure tube (IWAKI) máy hút chân không,,

2.2 Nội dung nghiên cứu

 Phầ ỏn l ng bên trên chuy n sang ng ependoff m i + 0,6V1 isopropanol ế ố ớ

 Lắc đến khi nhìn thấy DNA ↓ trắng

 Li tâm 5 phút ở 10000 rpm  Loại lỏng

 DNA pellet + 500 µl ethanol 70%

 Li tâm 10 phút ở 10000 rpm

 Pellet  làm khô hòa tan = 50 µl 1xTE B ảo quả ởn -20°C

Phương pháp tách DNA tổng s ựợố đ c thay đổi b i Ausubel và c ng s ở ộ ự

được tr n v i 0,5 ml ộ ớ nước cất đã tiệt trùng chuy n vào ng effendoff r i li tâm ể ố ồtrong 5 phút ở 10000 rpm Lấy phần pellet hòa trong 567 µl đệm 1×TE [C.4] Sau

10000 rpm

Phầ ỏn l ng bên trên được chuy n sang ng li tâm m i B sung isopropanol ể ố ớ ổ(lạnh) bằng 0 6 thể tích phần lỏ, ng để kết tủa nucleic acid Ống được lắ ếc đ n khi DNA tr ng k t t a nhìn ắ ế ủ thấy được Li tâm tiếp trong 5 phút, i bloạ ỏ ầ ph n lỏng bên trên, phần pellet phía dưới đượ ửc r a với 500 µl ethanol 70% (lạnh) Li tâm trong 10 phút, sau đó loại hết ethanol bằng micropipette, pellet được làm khô hoàn toàn và hòa tan trong 1×TE (50 µl) Bảo qu n ở -20 ả °C

2.2 1.2 Thiết kế mồ i

Mồi chạy PCR phải đảm bảo các điều kiện sau:

- Chiều dài mồi từ 19 đế 30 nu, tối ưu là 20 đến n 22 nu

- Dimer và hairloop càng ít càng t t và m i xuôi và mố ồ ồi ngược không bắt

cặp với nhau nhất là ở đầu 3’, dG> 0

Công thức đơn giản tính nhiệt độnóng ch y cả ủa mồi [48]:

+

P]) + 0,41 x (%GC) – 675 : N

TR a opt R= 0,3 x TR m mồi R + 0,7 x TR m sản phẩm R – 25

Trong đó N là số lượ ng nucleotid trong mồi PCR thường được th c hi n ự ệ ở

nồng độcation hoá trị 1 là 50 mM

Công cụ ỗ ợ h tr : phần mềm vecto NTI, fast PCR, biomath caculator, blast NCBI, .

2.2 1.3 Khuếch đại gene

Sản phẩm PCR có thể được nhận biết bằng kích thước của chúng qua việc

s d ng ử ụ điện di gel agarose

 Thêm 1/10 thể tích Sodium acetat pH 5,2

 Thêm 10 μl TE RNase, giữ ở- -20 °C

 Kiểm tra kết quả ằng điện di gel Agarose b

2.2 1.5 Kiểm tra sản phẩm bằng điện di gel agarose

Các bước ti n hành th c hi n theo Sambrook (2003) [49] ế ự ệ

Cách tiến hành:

Các ph n khuầ ếch đại được tách b ng gel 1% agarose (1g agarose hòa tan ằtrong 100 ml 1xTAE [C.1, C.3] bằng cách đun sôi) ổ b sung EtBr Để nguội dịch agarose t m 50ầ P o

P

C đến 60P o

P

C thì đổ vào khuôn ngang và cài lược tạo gi ng gel, 2ế µl

sản phẩm được lấy ra và trộn với 10 µl MiliQ HR 2 RO và 1 µl đệm 10x gel loading Sau đó mẫu s ẽ được tra vào t ng gi ng gel, thêm 5 µl markerừ ế 1 kb hoặc 6 µl marker

100 bp vào giếng đầu tiên hoặc giếng giữa, sau đó chạ ở điệy n th 100V ho c 50V ế ặ

đến khi bromophenol blue ch m t i v ch th 3 ho c th 4 t ạ ớ ạ ứ ặ ứ ừ dưới lên c a khuôn ủ

nhựa đựng gel chạy tầm 45 ặc 90 phút Đoạn DNA được quan sát trong hệ ố ho th ng soi gel c a phòng thí nghiủ ệm

2.2.1.6 Phản ứng nối gốc phosphate ở đầu 5’ gene xyn đã khuếch đạiA

S dử ụng kít Blunting kination, Các bước thưc hiện tiến hành theo khuyến cáo của nhà s n xu t [24] ả ấ và theo Sambrook (2003) [49]:

Thành ph n ph ầ ả n ng ứ (Blunting Kination Ligation reaction):

- Sản phẩm PCR tinh sạch 2 ~ 20 pmol 0,

- Đệm 10X Blunting kination 2 μl

- Hỗn hợp blunting kination enzyme 1 μl

- dd HR 2 RO x μl

 Chuyển phần dịch nổi phia trên sang ống tube mới

 Thêm 1/10 thể tích Sodium acetat pH 5,2

2.2.1.7 Cắt sản phẩm PCR , pET22b(+) bằn enzyme giới hạn g

Phả ứn ng c t b ng enzyme gi i h n MscI và XhoI ắ ằ ớ ạ

Mục đích để ạo 2 đầ t u dính ở ản phẩm PCR giúp tăng hiệu quả ả ứ s ph n ng nối khi nối với vector pET22b(+) cũng được cắt bằng cặp enzyme giới hạn tương

ứng

Ti ế n hành:

Ở đây sản phẩm PCR và vector pET22b(+) cùng được c t b i 2 enzyme ắ ở

giới hạ Mscn I và Xho Thành phần của phản ứng được mô tả ụ ểI c th trong 2 b ng ảsau:

2.2.1.8 Loại bỏ nhóm phosphat ở đầu 5’ của vector tách dòng

Loại bỏ nhóm phosphat ở đầu 5’của vector tách dòng pET22b(+), PUC118

đã cắt b ng enzyme gi i h n ằ ớ ạ alkaline phosphatase [19] Mục đích nhằm tăng hiệu

qu ả chèn đoạn gene đích bằng cách gi m s t nả ự ự ối của chính các đầu dính c a ủvector trước khi thực hiện phản ứng gắ đoạn gene muốn chèn vào vector tạn o plasmid tái tổ ợ h p [21] S d ng kit ử ụ rAPid alkaline phosphatase của hãng Roche Applied Science (USA) s hiố ệu 04898133001

th

Các bước tiến hành ực hiện theo khuyến cáo c a nhà s n xuủ ả ất [28]:

Bảng 2.4: Thành phầ phản ứng loại bỏ nhóm phosphat của vectorn

Thành phần Thể tích(μl) Nồng độ cuối

Đệm rAPid alkaline phosphatase (10X) 2 1 X

Enzyme rAPid alkaline phosphatase 1 1 U

Nước khử ion đã tiệt trùng X

Trộn hỗn hợp phả ứng thật đều, sau đó li tâm nhẹ Ủ DNA đầu bằng ởn

37P o

P

C trong 10 phút (PUC118 c t bắ ằng HincII), nếu DNA đầu dính (pET22b(+) cắt

bằng 2 enzyme MscI và XhoI) thì ủ ở 37P

đầu 3' hydroxyl trong mạch đôi của DNA ho c RNA Enzyme này có th n i các ặ ể ố

đầu bằng và các đầu dính cũng như sửa ch a các l h ng đ t gãy trên mạ h đơn ữ ỗ ổ ứ ctrong mạch đôi của DNA, RNA hoặc các mạch lai DNA/RNA [11,31]

Hình 2 : Ph 1 ả ứ n ng n i vector pUC118 và gene ố xynA

Ti ế n hành :

Nối sản phẩm PCR sau khi gắn nhóm phosphate vào đầu 5’ của đoạn gene với vector pUC118 sau khi loại bỏ nhóm phosphate Sử ụ d ng bộ kit ligation mix và