β ,4 xylan là các 1 -polysaccharide của đường xylose được tìm thấy trong thành tế bào trong tất cả các loại thực vật trên cạn và trong hầu hết các phần của cây.. Nhưng có 2 h r t ọ ấph b
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - DƯƠNG THỊ LƯƠNG LIÊN TÁCH DÒNG, BIỂU HIỆN GENE XYNA TỪ BACILLUS SUBTILIS CN2 TRÊN E COLI BL21 VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH CỦA XYLANASE TÁI TỔ HỢP LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS TRẦN LIÊN HÀ Hà Nội – 2011 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17057205325451000000 Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học LỜI CAM ĐOAN Tôi Dương Thị Lương Liên xin cam đoan nội dung luận văn với đề tài “Tách dòng, biểu gene xynA từ B subtilis CN2 E coli BL21 nghiên cứu đặc tính enzyme xylanaseA tái tổ hợp” cơng trình nghiên cứu sáng tạo tơi thực hướng dẫn PGS.TS Trần Liên Hà Bộ môn Vi sinh - Hố sinh Sinh học phân tử - Viện Cơng nghệ Sinh học Thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội giúp đỡ TS Ogasawara Wataru Khoa Kỹ thuật Sinh học - Trường Đại học Công nghệ Nagaoka, Nhật Bản Dương Thị Lương Liên CH09-11 i Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học LỜI CẢM ƠN Trước hết cho xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới PGS.TS Trần Liên Hà Bộ mơn Vi sinh - Hố sinh Sinh học phân tử, Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Người hướng dẫn, định hướng nghiên cứu tận tình giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu, người mang lại cho khám phá sống, nghị lực vươn lên khơi gợi say mê tính sáng tạo Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Ogasawara Wataru TS Takanori Furukawa người hướng dẫn tận tình bảo cho tơi thời gian tơi học tập nghiên cứu phịng thí nghiệm PGS TS Ogasawara, Khoa Kỹ thuật Sinh học Trường Đại học Công nghệ Nagaoka, Nhật Bản Nơi mà thu nhiều kiến thức kinh nghiệm thực tế, giúp trưởng thành nghiên cứu làm chủ kiến thức Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới toàn thể bạn sinh viên toàn thể cán phịng thí nghiệm cơng nghệ sinh học C4 – 401 tồn thể thầy bạn bè viện, phịng thí nghiệm vi sinh C10, thành viên phịng thí nghiệm TS Ogasawara giúp đỡ tạo điều kiện nhiều cho q trình nghiên cứu Cuối lịng biết ơn tới bố, mẹ, anh, chị, em gia đình tơi, người bạn tôi, người động viên ủng hộ suốt thời gian học Hà Nội, ngày 29 tháng 11 năm 2011 Học viên Dương Thị Lương Liên Dương Thị Lương Liên CH09-11 ii Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN - i LỜI CẢM ƠN - ii T 35 T 35 T 35 T 35 MỤC LỤC - iii T 35 T 35 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG viii T 35 T 35 T 35 T 35 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ix MỞ ĐẦU - T 35 T 35 T 35 T 35 CHƯƠNG I - TỔNG QUAN 1.1 Xylan T 35 T 35 T 35 T 35 1.2 Xylanase 1.2.1 Tên gọi đặc tính xylanase T 35 T 35 T 35 T 35 1.2.2 Phân loại xylanase T 35 T 35 1.2.3 Cấu trúc không gian chiều xylanase 1.2.4 Chức chế thủy phân xylanase T 35 T 35 T 35 T 35 1.2.5 Ứng dụng xylanase 13 1.2.6 Dạng sản phẩm xylanase thị trường 16 T 35 T 35 T 35 T 35 1.3 Những thành tựu tách dòng biểu gene xynA mã hoá xylanase 17 1.3.1 Ở nước ta 17 T 35 T 35 T 35 T 35 1.3.2 Trên giới 18 T 35 T 35 CHƯƠNG - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP - 21 2.1 Vật liệu nghiên cứu 21 T 35 T 35 T 35 T 35 2.1.1 Chủng giống vector cho tách dòng biểu 21 2.1.2 Môi trường nuôi cấy giữ giống vi sinh vật 21 T 35 T 35 T 35 T 35 2.1.3 Hóa chất, enzyme, kit, thiết bị sử dụng 21 2.2 Nội dung nghiên cứu 23 T 35 T 35 T 35 T 35 2.2.1 Tách dòng 23 2.2.1.1 Tách DNA tổng số 23 T 35 T 35 T 35 T 35 2.2.1.2 Thiết kế mồi 24 T 35 T 35 2.2.1.3 Khuếch đại gene 25 2.2.1.4 Tinh sản phẩm PCR 25 T 35 T 35 T 35 T 35 2.2.1.5 Kiểm tra sản phẩm điện di gel agarose 26 2.2.1.6 Phản ứng nối gốc phosphate đầu 5’ gene xynA khuếch đại 26 2.2.1.7 Cắt sản phẩm PCR, pET22b(+) enzyme giới hạn 27 T 35 T 35 T 35 T 35 Dương Thị Lương Liên CH09-11 T 35 T 35 iii Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học 2.2.1.8 Loại bỏ nhóm phosphat đầu 5’ vector tách dòng 28 T 35 T 35 2.2.1.9 Phản ứng nối 29 2.2.1.10 Tạo tế bào khả biến E coli DH5α E coli BL21(DE3) 30 T 35 T 35 T 35 T 35 2.2.1.11 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E coli 31 2.2.1.12 Chọn lọc khuẩn lạc chứa gene 32 T 35 T 35 T 35 T 35 2.2.1.13 Tách chiết plasmid DNA 33 T 35 T 35 2.2.2 Giải trình tự 34 2.2.2.1 Giải trình tự DNA theo phương pháp dideoxy 34 T 35 T 35 T 35 T 35 2.2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA plasmid tinh PEG 4000 34 2.2.2.3 Giải trình tự máy giải trình tự CEQ 2000 Dye Terminator Cycle T 35 T 35 T 35 sequencing 35 2.2.3 Biểu gene 36 T 35 T 35 T 35 2.2.3.1 Hệ thống biểu pET 36 2.2.3.2 Phương pháp bổ sung chất cảm ứng IPTG 38 T 35 T 35 T 35 T 35 2.2.3.3 Phương pháp bổ sung chất cảm ứng α-lactose 39 T 35 T 35 2.2.4 Phương pháp điện di protein SDS-PAGE 39 2.2.5 Tinh protein xylanase tái tổ hợp 40 T 35 T 35 T 35 T 35 2.2.5.1 Phương pháp tách protein 40 2.2.5.2 Phương pháp tinh protein dựa trình tự His-tag 41 T 35 T 35 T 35 T 35 2.2.6 Phương pháp xác định hoạt độ xylanase 43 2.2.6.1 Phương pháp Nelson-Somogyi 43 T 35 T 35 T 35 T 35 2.2.6.2 Phương pháp đục lỗ thạch xác định vòng phân giải 44 2.2.7 Phương pháp xác định nồng độ protein (Bradford) 44 T 35 T 35 T 35 T 35 2.2.8 Khảo sát đặc tính xylanase A 45 T 35 T 35 2.2.8.1 Xác định độ bền pH 45 2.2.8.2 Xác định pH tối ưu 45 T 35 T 35 T 35 T 35 2.2.8.3 Xác định nhiệt độ tối ưu 45 2.2.8.4 Xác định độ bền nhiệt độ 45 T 35 T 35 T 35 T 35 CHƯƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN - 46 3.1 Tách dòng 46 T 35 T 35 T 35 T 35 3.1.1 Tách DNA tổng số 46 T 35 T 35 3.1.2 Thiết kế mồi 47 3.1.3 Khuếch đại gene 49 3.1.4 Nối sản phẩm PCR với vector tách dòng 49 T 35 T 35 T 35 T 35 T 35 Dương Thị Lương Liên CH09-11 T 35 iv Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học 3.1.5 Biến nạp vào tế bào khả biến E coli DH5α 50 T 35 T 35 3.1.6 Chọn lọc plasmid chứa gene đích 52 3.2 Giải trình tự 54 T 35 T 35 T 35 T 35 3.2.1 Tinh plasmid PEG 4000 54 3.2.2 Kết giải trình tự 55 T 35 T 35 T 35 T 35 3.3 Biểu gene xynA từ Bacillus subtilis CN2 59 T 35 T 35 3.3.1 Biến nạp vào tế bào khả biến E coli BL21(DE3) 59 3.3.2 Sử dụng chất cảm ứng IPTG 60 T 35 T 35 T 35 T 35 3.3.3 Sử dụng chất cảm ứng α-lactose 63 3.3.3.1 Tối ưu hố điều kiện ni cấy với chất cảm ứng α-lactose 63 T 35 T 35 T 35 T 35 3.3.3.2 Hoạt tính xylanase tái tổ hợp mơi trường đặc 1% xylan 66 3.4 Tinh protein xylanase A tái tổ hợp 66 T 35 T 35 T 35 T 35 3.4.1 Sử dụng nhựa Ni-NTA 67 3.4.2 Sử dụng nhựa TALON 69 T 35 T 35 T 35 T 35 T 35 T 35 3.4.3 Đánh giá chất lượng trình tinh 70 T 35 T 35 3.5 Khảo sát đặc tính xylanase tái tổ hợp 70 3.5.1 Độ bền pH xylanase tái tổ hợp 71 T 35 T 35 T 35 T 35 3.5.2 pH tối ưu xylanase tái tổ hợp 72 3.5.3 Nhiệt độ tối ưu xylanase tái tổ hợp 73 T 35 T 35 T 35 T 35 3.5.4 Độ bền nhiệt độ xylanase tái tổ hợp 74 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ - 77 T 35 T 35 T 35 T 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 78 PHỤ LỤC - 84 T 35 T 35 T 35 T 35 Dương Thị Lương Liên CH09-11 v Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Tên đầy đủ Amax Optical density maximum (mật độ quang cực đại) Amp Ampicillin APS Ammonium persulfate B subtilis Bacillus subtilis BB Bug Buster bp Base pair BSA Bovine Serum Albumin C Carbon CI Chloroform/isoamylalcohol 10 CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide 11 ddH2 O Nước đề ion lần 12 ddNTP Dideoxyribonucleotide triphosphate 13 DMSO Dimethyl sulfoxide 14 DNA Deoxyribonucleic acid 15 dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate 16 DTT Dithiothreitol 17 E coli Escherichia coli 18 EDTA Ethylen diamin tetra acetate 19 EtBr Ethydium bromide 20 EtOH Ethanol 21 IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside 22 kDa Kilo Dalton 23 kV 24 LB Kilo volt Luria-Bertani 25 mRNA Messenger RNA (RNA thông tin) 26 MW Molecular weight (khối lượng phân tử) 27 NTA Nitriloacetic acid R R Dương Thị Lương Liên CH09-11 vi Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học 28 nu Nucleotide 29 OD Optical density (mật độ quang) 30 PCR Polymerase Chain Reaction 31 PDA Potato Dextrose Agar 32 rpm Revolutions per minute (vòng/phút) 33 SDS Sodium dodecyl sulphate 34 SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel ectrophoresis T 35 T 35 35 SLS Sample loading solution (dung dịch tra mẫu) 36 TAE Tris-Acetate-EDTA 37 TB Terrific broth 38 Tb Teriffic Broth 39 TE Tris-EDTA 40 TEMED Tetramethylethylenediamine 41 TE-RNase Tris-EDTA- Ribonuclease 42 Tm Temperature melting (nhiệt độ nóng chảy) 43 X-gal 5-bromo-4-chloro-indolyl-galactopyranoside Dương Thị Lương Liên CH09-11 vii Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Thành phầ n chu kì nhiệt phản ứng PCR 25 Bảng 2.2: Thành phầ n phản ứng cắt enzyme giới han cua pET22b(+) 28 Bảng 2.3: Thành phầ n phản ứng cắt enzyme giới hạn cua san phâm PCR 28 Bảng 2.4: Thành phầ n phản ứng loại bỏ nhóm phosphat c vector 29 Bảng 2.5: Nồng độ khuôn DNA cho ph ản ứng giải trình t ự 35 Bảng 3.1: Bảng mô tả độ tương đ ồng gene xynA từ B subtilis CN2 vớ i trình tự khác từ ngân hàng Genbank 56 Bảng 3.2: Các đặc điểm c xylanase từ chủng thuộc chi Bacillus khác 67 Bảng 3.3: Kế t tinh s ạch xylanase tái t ổ hợp từ E coli BL21 (DE3) 70 Bảng 4.1: Giá trị OD đo tương ứng với nồng độ xylose 89 Bảng 4.2: Giá trị OD đo tương ứng với nồng độ BSA 89 Bảng 4.3: Thành phầ n Gel 15% cho gel 89 Bảng 4.4 Đệ m sodium phosphate 90 Bảng 4.5: Đệ m sử dụng đ ể xác định độ bề n pH 90 Dương Thị Lương Liên CH09-11 viii Viện CNSH&CNTP - ĐHBKHN Luận văn thạc sỹ khoa học DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1: Dạng đơn giản xylan Hình 1.2: Dạng phức tạp xylan Hình 1.3: Đơn vị cấu trúc xylan từ cỏ [8] Hinh 1.4: Cấu hình khơng gian G11 xylanase từ Bacillus subtilis (XYNA) Hình 1.5: Họ 11 xylanase từ Bacillus circulans (1XNB) Trichoderma harzianum (1XND) Hình 1.6: Cơ chế hoạt động xylanse dạng đơn giản 10 Hình 1.7: Vị trí cơng endo-1,4-β-xylanase mạch xylan 11 Hình 1.8: Cơ chế thủy phân xylan 1XNB 12 Hình 1.9: Cấu trúc xylan vị trí cắt enzyme q trình sản xuất giấy 15 Hình 1.10: Các dạng sản phẩm xylanase thị trường 17 Hình 2.1: Phản ứng nối vector pUC118 gene xynA 29 Hình 2.2: Phản ứng chèn xynA gene vào pET22b(+) 30 Hình 2.3: Vector biểu pET22b(+) 37 Hình 2.4: Nguyên tắc phương pháp sắc ký lực sử dụng Ni2+ 42 P P Hình 3.1: Điện di DNA tổng số tách từ B subtilis CN2 gel agarose 1% 46 Hình 3.2: Trình tự mồi xi mồi ngược 47 Hinh 3.3: Vị trí cắt enzyme giới hạn xynA mang kí hiệu AF027868.1 48 Hình 3.4: Kết chạy PCR với cặp mồi thiết kế 49 Hinh 3.5: Điện di đồ kết thao tác thực trước nối 50 Hình 3.6: Chọn lọc khuẩn lạc chứa vector tái tổ hợp pUC118-xynA môi trường chứa X-gal-IPTG 51 Hình 3.7: Khuẩn lạc sau biến nạp plasmid tái tổ hợp pET-xynA vào E coli DH5α 51 Hình 3.8: Điện di đồ kết tách plasmid pET22b (+) tái tổ hợp cắt enzyme giới hạn 52 Hình 3.9: Điện di đồ kết tách plasmid pUC118 tái tổ hợp cắt enzyme giới hạn 53 Hình 3.10: Điện di đồ tinh plasmid pET-xynA PEG 54 Hình 3.11: Tinh vector pUC-xynA PEG cắt enzyme giới hạn 55 Hình 3.12: Trình tự nu gene xynA từ B subtilis CN2 56 Dương Thị Lương Liên CH09-11 ix