Nghiên Cứu Biểu Hiện Gen Laccase Từ Nấm Mốc Fusarium Oxysporum Trong Nấm Men Pichia Pastoris Và Đặc Điểm Enzyme Tái Tổ Hợp.pdf

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM  TRƯƠNG THỊ BÉ NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN LACCASE TỪ NẤM MỐC Fusarium oxysporum TRONG NẤM MEN Pichia pastoris VÀ ĐẶC ĐIỂM ENZYME TÁI TỔ HỢP LUẬN VĂN THẠC SĨ SIN[.]

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM  TRƯƠNG THỊ BÉ NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN LACCASE TỪ NẤM MỐC Fusarium oxysporum TRONG NẤM MEN Pichia pastoris VÀ ĐẶC ĐIỂM ENZYME TÁI TỔ HỢP LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM Đà Nẵng – Năm 2021 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 16990037656311000000 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM  TRƯƠNG THỊ BÉ NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN LACCASE TỪ NẤM MỐC Fusarium oxysporum TRONG NẤM MEN Pichia pastoris VÀ ĐẶC ĐIỂM ENZYME TÁI TỔ HỢP Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.01.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN ĐỨC HUY Đà Nẵng – Năm 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả luận văn Trương Thị Bé LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn “Nghiên cứu biểu gen laccase từ nấm mốc Fusarium oxysporum nấm men Pichia pastoris đặc điểm enzyme tái tổ hợp”, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến Ban Giám Hiệu; Phịng Sau đại học; Khoa Sinh – Mơi trường; Hội đồng khoa học trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng; thầy Giảng viên nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Đức Huy, người tận tình hướng dẫn, dạy, truyền đạt kiến thức chun mơn, động viên tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Ngồi tơi cám ơn đến ThS Nguyễn Mỹ Lệ, ThS Đặng Thị Thanh Hà, CN Lê Thị Kim Thoa cán Phịng thí nghiệm Cơng nghệ enzyme protein, Viện Công nghệ sinh học hỗ trợ q trình triển khai thí nghiệm Xin chân thành cảm ơn ủng hộ, động viên, giúp đỡ từ phía gia đình bạn bè đồng nghiệp suốt trình thực đề tài Mặc dù cố gắng chắn luận văn không tránh khỏi sai sót, kính xin góp ý dẫn thêm Xin trân trọng cảm ơn! Đà Nẵng, 02 tháng năm 2021 Tác giả Trương Thị Bé NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN LACCASE TỪ NẤM MỐC Fusarium oxysporum TRONG NẤM MEN Pichia pastoris VÀ ĐẶC ĐIỂM ENZYME TÁI TỔ HỢP Ngành: Sinh học thực nghiệm Họ tên học viên: Trương Thị Bé Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Đức Huy Cơ sở đào tạo: Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng Tóm tắt: Những kết luận văn Chuyển thành cơng gen mã hóa laccase (cFolac1) vào P pastoris Sự diện cFolac1 genomic P pastoris kiểm tra khẳng định phản ứng PCR Laccase tái tổ tợp tinh từ môi trường nuôi cấy chủng P pastoris tái tổ hợp với khối lượng phân tử khoảng 76 kDa Chủng P pastoris tái tổ hợp sinh tổng hợp laccase cao nuôi cấy 25oC, tốc độ lắc 210 rpm, mật độ tế bào ban đầu OD600 = với hoạt tính enzyme đạt giá trị 3552,8 U/L Laccase tái tổ hợp, có khoảng nhiệt độ tối ưu 55oC, pH tối ưu 4,5, ion Cu2+ tăng hoạt tính enzyme ion Fe2+ ức chế hoạt động laccase Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận văn Luận văn góp phần cung cấp kết khoa học đặc điểm laccase từ F oxysporum biểu nấm men P pastoris Đây nghiên cứu giới cơng bố kết đặc tính enzyme Enzyme tái tổ hợp sử dụng cho mục đích khác hỗ trợ xử lý nguyên liệu sản xuất ethanol sinh học, xử lý ô nhiễm môi trường hợp chất hữu gây Hướng nghiên cứu đề tài Tối ưu hóa sản xuất rFolac1 quy mô hệ lên men nhằm tăng khả sản xuất enzyme tái tổ hợp Thử nghiệm ứng dụng laccase tái tổ hợp điều kiện phịng thí nghiệm thực tế để xử lý nhiều hợp chất gây ô nhiễm kim loại nặng, chất kháng sinh (trong nước thải y tế), thuốc nhuộm tổng hợp Từ khóa Laccase; DNA tái tổ hợp; Fusaryum oxysporum; Pichia pastoris Xác nhận GV hướng dẫn TS Nguyễn Đức Huy Người thực hiện đề tài Trương Thị Bé Recombinant expression and characterization laccase from Fusarium oxysporum in Pichia pastoris Major: Experimental Biology Student’s name: Truong Thi Be Academic advisor: Dr Nguyen Duc Huy Training institution: The University of Danang, University of Science and Education Summary: The mjor results of study The study reported the expression and characterization recombinant laccase produced by yeast Pichia pastori The recombinant expression of laccase in P pastoris experiments were carried out at different conditions, resulting in optimal conditions of temperature of 25oC, shaking speed of 210 rpm, and cells density of OD600 = produced highest protein concentration of 0.9 µg/µl with specific activity of 66.538 U/mg Recombinant laccase exhibited highest activity at temperature of 55oC, pH of 4.5, Cu2+ increased antivity while Fe2+ inhibited enzyme activity Scientific and pratical significant of the study The study provided new founding about recombinant laccase from F oxysporum in P pastoris This is first report on characterization recombinant laccase from F oxysporum in P pastoris Recombinant enzyme can be able to apply for material treatment in bioethanol production, environmental pollution by organic compounds treatment,… Further aspects of study - Production recombinant enzyme in large scale - Purification and performance enzyme structure study - Application recombinant enzyme for environmental pollution treatment such as synthetic dyes Keywords Laccase; recombianant DNA; Fusaryum oxysporum; Pichia pastoris Academic advisor Nguyen Duc Huy Student Truong Thi Be MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 LACCASE 1.1.1 Giới thiệu chung laccase 1.1.2 Cấu tạo laccase 1.1.4 Đặc tính laccase 1.1.5 Các nguồn thu nhận laccase 11 1.1.6 Ứng dụng laccase 14 1.2 HỆ THỐNG BIỂU HIỆN Pichia pastoris 18 1.2.1 Giới thiệu chung hệ thống P pastoris 18 1.2.2 Ưu, nhược điểm P pastoris so với hệ thống biểu khác 19 1.2.3 Hệ thống biểu tái tổ hợp tương đồng sử dụng P pastoris 20 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 26 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.2.1 Phân lập trình tự mã hóa protein từ Folac1 26 2.2.1.1 Khuếch đại vùng mã hóa gen laccase 26 2.2.1.2 Gắn sản phẩm PCR vào vector tạo dòng 27 2.2.1.3 Biến nạp vào E coli TOP10 chọn lọc thể biến nạp 27 2.2.1.4 Giải mã phân tích trình tự gen laccase 28 2.2.2 Biểu cFolac1 Pichia pastoris 28 2.2.2.1 Tạo dòng vector biểu pPICZαA 28 2.2.2.2 Biến nạp vào P pastoris 29 2.2.2.3 Biểu gen laccase 29 2.2.2.4 Xác định hoạt độ enzyme tái tổ hợp 30 2.2.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến biểu laccase tái tổ hợp 30 2.2.3.1 Thời gian cảm ứng 30 2.2.3.2 Nồng độ chất cảm ứng 31 2.2.3.3 Mật độ tế bào 31 2.2.3.4 Nhiệt độ nuôi cấy 31 2.2.3.5 Tốc độ lắc 31 2.2.4 Tinh enzyme tái tổ hợp 31 2.2.5 Điện di SDS – PAGE 32 2.2.6 Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ laccase tái tổ hợp 32 2.2.6.1 Ảnh hưởng pH 32 2.2.6.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 33 2.2.6.3 Ảnh hưởng ion kim loại 33 2.2.7 XỬ LÝ THỐNG KÊ 33 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34 3.1 BIỂU HIỆN GEN LACCASE TRONG Pichia pastoris 34 3.1.1 Tạo dịng cFolac1 vào pGEM®T-Easy biến nạp vào E coli Top10 34 3.1.2 Tạo dòng vào vector biểu pPICZαA 34 3.2 TỐI ƯU HÓA SỰ BIỂU HIỆN LACCASE TÁI TỔ HỢP 37 3.2.1 Ảnh hưởng thời gian cảm ứng 37 3.2.2 Ảnh hưởng mật độ tế bào 37 3.2.3 Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng 39 3.2.4 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy 40 3.2.5 Ảnh hưởng tốc độ lắc 42 3.2.6 Tinh enzyme 43 3.3 Khảo sát đặc điểm enzyme tái tổ hợp 44 3.3.1 Ảnh hưởng pH 44 3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 45 3.3.3 Ảnh hưởng ion kim loại 46 Chương BÀN LUẬN 48 KẾT LUẬN 53 KIẾN NGHỊ 53 PHỤ LỤC 61 DAI HOC DA NANG TRUONG D~I HQC SU PH~M S6: ~~1/QD-DHSP CONG HoA XA HOI cnn NGHiA VlE:T NAM DQc l~p - T\f - Hanh phuc Da NJng, O?thang V' ndm 2019 QUYETDINH V~ vi~c giao d~ tai va trach nhiem hmmg din lu~n van thac si HIEU TRUONG TRUONG DAI HOC SU PHAM Can cir Nghi dinh s6 32/CP 04 thang nam 1994 cua Chinh phu vS viec l~p Dai h9C Da N~ng; Can cir Thong nr s6 OS/2014/TT-BGDDT 20/3/2014 cua Bi) GD&DT vS viec ban hanh Quy eh~ t6 chirc va hoat di)ng cua dai h9C vung va cac co sa giao due dai h9Cthanh vien; Can cir Quyet dinh s6 6950/QD-DHDN 01112/2014 cua Giam d6c Dai h9C Da N~ng ban hanh Quy dinh nhiern vu, quyen han cua Dai h9C Da N~ng, cac co sa giao due dai h9Cthanh vien va cac don vi tnrc thuoc; Can cir Thong tu s6 15/2014/TT-BGDDT 15/5/2014 cua Bi) GD&DT vS vi~c ban hanh Quy ch~ Dao t~o trinh di) th~c sI; Can cu Quy~t dinh s6 4569/QD-DHDN 29/12/2017 cua Giam d6c D~i h9C Da N~ng vS vi~c cong nh~n h9C vien cao h9C trung tuy~n kh6a 36; Can cu Quy~t dinh 1060IQD-DHSP 01111/2016 cua Hi~u truang Truang D~i h9C Su ph~m - DHDN vS vi~c ban hanh Quy dinh dao t~o trinh di) th~c sI; Xet dS nghi cua Ban chu nhi~m Khoa Sinh- Moi truangvS vi~c Quy~t dinh giao dS tai va traeh nhi~m huang dftn lu~n van th~c sI; Xet dS nghi cua ong Truang Phong Dao t~o, QUYETDINH: Di~u 1: Giao eho h9C vien TrU'ong Thi Be, nganh Sinh hqc th\fc nghi~m, khoa 36, thlJc hi~n dS tai lu~n van Nghien crru b!~u hi~n gen l_:tccase tir Fusarium oxysporum Pichia pastoris va d~c diem enzyme hii to h