Nghiên ứu biểu hiện gen kháng thể tái tổ hợp đặ hiệu kháng nguyên ung thư vú her2 trong tảo chlamydomonas reinhardtii

coli Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EGFR Epidermal Growth Factor Receptor = Thụ th các y u t ể ế ốtăng trưởng biểu bì ER Estrogen EtBr Ethidium bromide Fab Fragmen

TRẦN THỊ HUYỀN TRANG

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN UNG THƯ VÚ HER2

TRONG TẢO CHLAMYDOMONAS REINHARDTII

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :

PGS TS LÊ QUANG HUẤN

Hà Nội – 2010

1708177934243f2b4e9ad-fc27-4dba-8129-b9e7f4528d18

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu mà bản thân tôi đã trực tiếp thực

hiện

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa

từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2010

Tác giả ậ lu n v n ă

Trần Thị Huyền Trang

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc nhất tới PGS TS Lê

Quang Huấn- Trưởng phòng công nghệ Tế bào Động v t, Vi n Công ngh Sinh ậ ệ ệ

học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là người thầy tr c ti p hướng d n ự ế ẫ

tôi trong suốt quá trình làm khoá lu n này ậ

Trong quá trình thực tập và thực hiện đề tài t i phòng thí nghiệm, tôi đã ạ

nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của KS Đặng Thị Minh Lụa và toàn thể cán bộ

nhân viên phòng Công nghệ ế T bào Động vật, nhân dịp này tôi muốn gửi l i cờ ảm

ơn chân thành nhất vì sự giúp đỡ quý báu ó đ

Để hoàn thành khoá luận này không th không nói t i công lao c a các ể ớ ủ

thầy, cô giáo Viện Công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm, Viện Đào tạo

Sau đại học - Đại học Bách Khoa - Hà Nộ đi ã giảng dạy, truyền đạt cho tôi

những kiến thức và tạo đ ềi u kiện, tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian h c t p ọ ậ

tại trường

Cuối cùng, tôi xin g i lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè, đồng ử

nghiệp cơ quan công tác Chi cục Bảo vệ Bảo v th c v t – Hà Nộ đệ ự ậ i ã luôn bên

cạnh động viên, chia sẻ những khó khăn giúp tôi hoàn thành khoá học và thực

hiện tốt khoá luận này

Một lần nữa cho tôi xin cảm ơn về mọi sự giúp đỡ quý báu đó!

Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2010

Học viên

Trần thị Huyền Trang

MỤC LỤC

Trang

M Ở ĐẦ ……… 1 U

Chương 1 TỔNG QUAN……… 3

1.1 Tổng quan về ệ b nh ung thư vú……… 3

1.1.1 Khái niệm ung thư vú (UTV) 3

1.1.2 Phân loại 3

1.1.3 Nguyên nhân gây UTV 6

1.1.4 Các phương pháp đ ềi u trị ung thư vú……… 8

1.2 Kháng nguyên HER2 đặc hiệu tế bào ung thư vú………. 9

1.2.1 Cấu trúc của gen HER2  9

1.2.2 Cấu trúc kháng nguyên HER2………  9

1.2.3 Cơ chế hoạt động của thụ thể HER2………  11

1.3 Ung thư vú dương tính HER2 11

1.4 Kháng thể tái tổ ợ h p đặc hiệu kháng nguyên HER2……… 13

1.4.1 Khái niệm 13

1.4.2 Kháng thể đơn dòng và ứng dụng đ ềi u trị ung thư vú 16

1.5 Các phương pháp sản xuất kháng thể đơn dòng……… 18

1.5.1 Phương pháp tạo dòng tế bào lai hybridoma……… 18

1.5.2 Phương pháp tái tổ hợp……… 19

1.6 Các hệ thống biểu hiện gen truyền thống……… 20

1.6.1 Hệ thống bi u hiể ện t bào vi khuế ẩn……… 20

1.6.2 Hệ thống bi u hiể ện t bào nế ấm men……… 21

1.6.3 Hệ thống bi u hiể ện t bào ế động vật có vú……… 21

1.6.4 Hệ thống bi u hiể ện t bào thế ực v t……… ậ 21 1.6.5 Hệ thống bi u hiể ện vi tảo……… 22

1.7 H biệ ểu hiện tảo Chlamydomonas reinhardtii……… 23

1.7.1 Đặc đ ểi m sinh học……… 23

1.7.2 Ứng dụng của tảo Chlamydomonas reinhardtii trong công nghệ gen…… 25

1.8.Phương pháp chuyển gen vào tảo Chlamydomonas reinhardti thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens……… 27

1.8.1 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens……… 28

1.8.2 Cơ chế chuyển gen của Agrobacterium tumefaciens……… 29

1.8.3 Hệ thống vector dùng trong chuyển gen……… 29

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP……… 31

2.1 VẬT LIỆU 31

2.1.1 Sinh phẩm 31

2.1.2 Hoá chất và môi trường……… 31

2.1.3 Thiết bị máy móc ……… 33

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 33

2.2.1 Phương pháp tách plasmid từ vi khuẩn E coli ……… 33

2.2.2 Phương pháp khuếch đại gen bằng PCR……… 35

2.2.3 Phương pháp đ ệi n di trên gel agarose ……… 36

2.2.4 Phương pháp thu DNA từ gel agarose……… 36

2.2.5 Phương pháp cắt, gắn AND……… 37

2.2.6 Phương pháp biến nạp plasmid vào E coli……… 38

2.2.7 Phương pháp xác định trình tự nucleotide của DNA……… 39

2.2.8 Biến nạp vector chuyển gen tái t hợp vào Agrobacterium tumefaciens bằng ổ phương pháp xung đ ệi n……… 39

2.2.9 Phương pháp chuyển gen vào tảo C reinhardtii nhờ A Tumefaciens……… 41

2.2.10 Phương pháp đếm tế bào……… 42

2.2.11 Phương pháp kiểm tra biểu hiện gen GUS bằng nhuộm hoá mô tế bào…… 42

2.2.12 Phương pháp tách ADN tổng số ủ c a tảo……… 42

2.2.13 Phương pháp tách protein tổng số ừ ả t t o……… 43

2.2.14 Phương pháp đ ệi n di protein trên gel polyacrylamide……… 43

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN……… 45

3.1 Khuếch đại o n gen mã hoá kháng thể tái tổ ợđ ạ h p từ vector pStrepHis1525/antiHER2 ……… 45

3.2 Thiết kế vector chuyển gen mang gen mã hóa kháng thể đặc hiệu kháng

nguyên HER2……… 51

3.3 Biến nạp vector chuyển gen tái tổ ợ h p vào vi khuẩn A tumefaciens………… 58

3.4 Chuyển gen vào tảo Chlamydomonas reinhardtii……… 60

3.4.1 Phương pháp và đ ềi u kiện chuyển gen vào tảo C reinhardtii thông qua A tumefaciens……… 60

3.4 2 Kiểm tra sự chuyển gen antiHER2 vào t o C reinhardtii bằả ng ph n ng ả ứ PCR……… 63

3.5 Kiểm tra sự biểu hiện gen GUS……… 66

3.6 Kiểm tra sự biểu hiện của gen antiHER2 trong tảo C reinhardtii……… 68

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 71

Kết luận……… 71

Kiến nghị……… 72

TÀI LIỆ U THAM KH O Ả 73

PHỤ LỤC……… 80

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT T T Ắ

BRCA Breast cancer = ung thư vú

ddNTP Dideoxyonucleotit triphosphat

dNTP Deoxyonucleotit triphosphat

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EGFR Epidermal Growth Factor Receptor = Thụ th các y u t ể ế ố

tăng trưởng biểu bì

MAbs Monoclonal antibody = Kháng thể đơn dòng

MAPK Mitogen-activated protein kinases

mARN Messenger acid ribonucleic

Nos Nospaline synthease

NPTII Neomycin phosphotransferase gene

SDS-Page SDS- Polyacrylamide gel electrophoresis

Ti-plasmid Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u

VH Variable region of heavy chain = vùng biến đổi của chuỗi

nặng Vir Virulence region = vùng gây độc

VL Variable region of light chain = vùng biến đổi của chuỗi

nhẹ

X- Glu 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide

DANH MỤC CÁC BẢNG

3.1 Thành phần phả ứn ng PCR khuyếch đại gen AntiHER 2 47

3.2 Thành phần phả ứn ng cắt plasmid pBI101 và pJet1.2 mang

3.3 Thành phần phả ứn ng ghép nối giữa gen antiHER2 vào

3.4 Thành phần phả ứn ng PCR khuyếch đại o n AntiHER2 từ đ ạ

ADN tổng số ủ c a tảo C reinhardtii 64

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.3 Cơ chế gây ung thư do biểu hiện quá mức HER2 12

1.5 Sơ đồ c u tạo của mảnh kháng thể đơn chuỗi ấ 16

1.6 Cấu t o tạ ế bào tảo Chlamydomonas reinhardtii 24

3.1 Cấu trúc kháng thể tái tổ ợ h p đặc hiệu HER2 46

3.2 Đ ệi n di đồ sản phẩm PCR với cặp mồi AntiHER2F /AntiHER2R 48

3.4 Vi khuẩn E coli mang vector tái t hợổ p m c trên môi trường có ọ

chứa Amppicllin sau 15 giờ nuôi cấy ở 370C

49

3.5 Sản phẩm cắt pJet1.2 tái tổ hợp b ng Enzyme gi i h n BamH I, ằ ớ ạ

Sac I

50

3.6 Đ ạo n T- DNA của vector chuy n gen pBI101 ể 52

3.7 Sản phẩm cắt loại bỏ gen GUS của pBI101 b ng 2 enzyme ằ

BamH I, Sac I

54

3.8 Kết quả tách plasmid từ E coli TG1 đã biến nạp pBI101 tái tổ hợp 55

3.9 Kết quả ả s n phẩm PCR t plasmid tách t khu n l c E coli TG1 ừ ừ ẩ ạ

sau biến nạp

56

3.10 Một đ ạo n Chromatograph của gen antiHER2 57

3.11 Kết quả biến nạp vector pBI101 tái tổ hợp vào A tumefaciens

sau 24 giờ nuôi cấ ởy nhiệt độ 28oC

59

3.12 Kết quả ả s n phẩm PCR từ khuẩn lạc A tumefaciens biến nạp 59

3.13 Hình thái tế bào tảo C reinhardtii trên môi trường TAP sau 7

ngày nuôi cấy

61

3.14 Tảo C reinhardtii chuyển gen sau 2 tu n nuôi c y trên môi ầ ấ

trường TAP

63

3.15 Kết quả tách ADN tổng số ủ c a tảo C reinhardtii chuy n gen ể 63

3.16 Kết quả sản ph m PCR t ADN t ng s tảo C reinhardtii ẩ ừ ổ ố

M Ở ĐẦU

Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật và công nghiệp, đời

sống vật chất của con người ngày một nâng cao, nhưng mặt trái c a sựủ phát tri n ể

đó là t o ra hàng lo t các y u t gây ô nhi m môi trường nh hoá ch t, phóng x ạ ạ ế ố ễ ư ấ ạ

là những nhân tố đầy rủi ro có thể gây ung th - c n b nh hi m nghèo và là n i ư ă ệ ể ỗ

hoang mang của toàn nhân loại Ước tính, n m 2010, Vi t Nam có ít nhất ă ệ

126.300 ca ung thư mắc mới trong ó, ung thư vú, dạ dày, phổi, đại trực tràng đ

vẫn gặp nhiều nhất [71]

Ung thư vú là loại ung thư thường thấy ở phụ nữ, chiếm 25% tỷ ệ ử vong do l t

ung thư ở các nước phát triển Theo tổ chức y tế thế giới WHO, năm 2004, ước

tính có khoảng 1,2 triệu người trên toàn thế giới bị ung thư vú Trên toàn thế

giới, tỷ lệ ph nữ mắc bệụ nh ung th vú gia t ng đều đặn h ng n m, ung th vú ư ă ằ ă ư ở

phụ nữ được x p vào h ng nguy c hàng đầu, nguyên nhân gây t vong th hai ế ạ ơ ử ứ

sau ung thư phổi Nếu không được đ ềi u trị, dạng ung thư này nhanh chóng gây

nguy hiểm tới tính mạng, nh ng có ph n ng t t n u được i u tr s m [52,59] ư ả ứ ố ế đ ề ị ớ

Liệu pháp kháng thể đơn dòng đang được rất nhiều nhà khoa học nghiên cứu

và đã tìm ra nhiều kháng nguyên đích để iđ ều trị bệnh ung th Đối v i m i d ng ư ớ ỗ ạ

ung thư có một vài kháng nguyên đặc trưng cho từng loại, với ung thư vú đó là

kháng nguyên HER2 Protein HER2 được mã hoá bởi gen HER2 (Human

Epidermal Growth Factor), thuộc h các th th sinh trưởng c a các t bào bi u ọ ụ ể ủ ế ể

bì Khi biểu hiện quá mức thụ thể HER2 sẽ làm tế bào phân chia không thể kiểm

soát dẫn đến ung th Sự biểư u hi n quá m c c a HER2 đượệ ứ ủ c xác nh trong 25 - đị

35% bệnh nhân ung thư vú và một số bệnh ung th khác nh ung th bu ng ư ư ư ồ

trứng, ung thư tử cung Vì vậy, trên thế giới rất nhiều nhà khoa họ đc ã nghiên

cứu để sử dụng công ngh DNA tái t hợ ạệ ổ p t o ra các kháng th đơn dòng tái t ể ổ

hợp đặc hiệu với HER2 giúp cho sự chẩn đoán và mang lại hiệu quả cao hơn

trong đ ềi u trị ung thư vú [52,59]

Tuy nhiên, sau khi có được gen tái tổ hợp thì vi c bi u hi n để thu nh n và ệ ể ệ ậ

tinh sạch các kháng thể tái tổ hợp này là m t v n đề nan gi i Hiệộ ấ ả n nay, có r t ấ

nhiều hệ biểu hiện được sử dụng để sản xu t kháng th đơn dòng bao g m c ấ ể ồ ả

prokaryote và eukaryote Trong những năm gầ đn ây, khả năng chuy n gen vào ể

tảo để sản xu t kháng th tái t hợấ ể ổ p, vaccin, protein di t sâu hay s n xu t hydro ệ ả ấ

sinh họ đc ã được chứng minh Tảo lục đơn bào Chlamydomonas reinhardtii được

biết đến là một hệ thống biểu hiện có khả năng sản xuất các phân tử protein hiệu

quả với chi phí th p, t c độ phát tri n nhanh, có kh năấ ố ể ả ng l p ráp các phân tử ắ

phức tạ để hình thành phân tử hoạt tính, rất an toàn và khả năp ng tinh s ch ạ

protein tái tổ hợp đơn gi n [14,47] Vì vậy, tảo này được xem là tế bào chủ có ả

tiềm năng rất lớn cho việc sản xuất các protein thuốc cho đ ềi u trị bệnh trong ó đ

có kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư vú HER2

Xuất phát từ nh ng c sởữ ơ khoa h c và thựọ c ti n trên, chúng tôi ti n hành ễ ế

thực hiện đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen kháng thể tái tổ hợ p đặc hi u ệ

kháng nguyên ung thư vú HER2 trong tảo Chlamydomonas reinhardtii”

Mụ c tiêu c a đề tài: ủ

- Thiết kế được vector chuyển gen mang gen mã hóa kháng thể đặc hiệu

kháng nguyên HER2

- Nghiên cứu chuyển gen kháng thể đặc hiệu kháng nguyên HER2 vào trong

tảo Chlamydomonas reinhardtii

- Nghiên cứu khả năng bi u hi n c a kháng th trong t o Chlamydomonas ể ệ ủ ể ả

reinhardtii

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về ệ b nh ung thư vú

1.1.1 Khái niệm ung thư vú (UTV)

Ung thư là bệnh lý ác tính của tế bào, khi bị kích thích bởi các tác nhân sinh

ung thư tế bào t ng sinh m t cách vô h n độ, vô t ch c không tuân theo các c ă ộ ạ ổ ứ ơ

chế phát triển bình thường Ða số bệnh ung th sẽư hình thành nên các kh i u ố

Khác v i các khớ ối u lành tính chỉ phát triển tại chỗ, có vỏ bọc xung quanh và

thường rất chậm, các khối u ác tính (ung thư) có xu hướng xâm lấn sang các tố

chức lành tính xung quanh Hiện nay, có trên 200 loại ung thư khác nhau đã được

phát hiện [3]

Ung thư vú là bệnh ung thư bắt ngu n t mô vú Nguyên nhân ch yếồ ừ ủ u c a ủ

bệnh UTV là do sự phát triển bất thường của các tế bào kiến tạo nên các thành

phần của vú, cụ thể nh do s b t thường b t ngu n t ng tuy n được g i là ung ư ự ấ ắ ồ ừ ố ế ọ

thư ố ng tuyến (ductual carcinomas), hay sự phát triển bất thường của các tiểu

thuỳ dẫn đến ung th ti u thu (lobular carcinomas) [65] Có nhi u lo i ung th ư ể ỳ ề ạ ư

vú khác nhau với mức độ lan truyền, mức độ xâm lấn và mức độ tác động đến

gen khác nhau và mỗi loại ung th lại có mức độ lành tính, ác tính khác nhau ư

Tuy nhiên, có 1 đ ểi m chung là UTV nếu không được chẩ đn oán sớm và chữa trị

kịp thời, các tế bào ung thư sẽ phát tri n nhanh chóng trong vú, i vào các m ch ể đ ạ

máu hay mạch bạch huy t, chạy tớế i các h ch, có thểạ xâm l n sang các b ph n ấ ộ ậ

khác, gây ra đau đớn cho bệnh nhân và cuối cùng sẽ ẫ d n đến tử vong [3,31]

1.1.2 Phân loại

UTV có thể được phân loại theo nhi u cách khác nhau ph thu c vào các giai ề ụ ộ

đ ạo n phát tri n, b nh h c, m c độ bệể ệ ọ ứ nh, th th , s có m t hay v ng m t c a các ụ ể ự ặ ắ ặ ủ

gen đặc trưng cho bệnh

- Theo giai đ ạ o n phát tri n (TNM): Là phương pháp phân loạ ể i UTV d a ự

vào kích thước của khối u (T), khối u dù có hay không lan sang u hạch (N) ở

nách, và khối u đã di căn (M) hay lây lan sang các phần khác của cơ thể Các giai

đ ạo n chính:

Giai đ ạo n Tis là ung thư biểu mô tại chỗ, giai đ ạo n tiền ác tính, có biểu hiện

Giai đ ạo n từ 1-3 là giai đ ạo n ung thư sớm và có khả năng chữa khỏi được

Giai đ ạo n 4 là giai đ ạo n ung thư di căn và không có khả năng chữa khỏi [65]

- Theo bệ nh h c: Theo phương pháp này UTV được chia thành 2 dạng chính ọ

là ung thư biểu mô ống dẫn hay tiểu thùy Ung thư ở các mô khác được xem như

là loại ung thư hiếm gặp [65]

Ung thư bi u mô tể ại chỗ (Carcinoma in situ): Các tế bào ung thư trong biểu

mô tăng sinh nhanh chóng, không xâm lấn sang các mô xung quanh

Ung thư xâm lấn (Invasive carcinoma) thì có sự xâm lấn sang các mô xung

quanh

- Theo cấp độ bệnh: Các tế bào bình thường qua quá trình bi t hóa s hình ệ ẽ

thành nên các cơ quan khác nhau trong cơ thể với các ch c n ng riêng bi t V i ứ ă ệ ớ

các tế bào ung thư, do mất đ ự phân hoá, tếi s bào tr nên h n độn, m t tr t t , các ở ỗ ấ ậ ự

tế bào sẽ phân chia không ki m soát được Các nhà nghiên c u b nh h c cho ể ứ ệ ọ

rằng các tế bào có sự phân hoá tốt (giai đ ạn thấp), mức phân hoá ở mức độ vừa o

phải (giai đ ạo n trung bình), và mức phân hoá kém (giai đoạn cao) Các trường

hợp ung thư ở mức độ phân hoá kém thì được chẩ đn oán là b nh r t n ng [65] ệ ấ ặ

- Theo tình trạ ng th th : Mỗi tế bào đều có các thụ thể đặc trưng trên bề ụ ể

mặt tế bào, trong tế bào chất và nhân Với các tế bào UTV, 3 loại th thụ ể đặc

trưng là thụ thể estrogen (ER), thụ thể progesterone (PR) và HER2/neu Tùy

thuộc vào sự có mặt hay không của các loại th th này các nhà khoa họ đụ ể c ã chia

UTV thành các dạng dương tính ER (ER+), âm tính ER (ER-), PR+, PR-,

HER2+, HER2- Các tế bào mà không có các thụ thể này thì được gọi là dạng cơ

bản hay âm tính với cả ba thụ thể Căn cứ vào tình trạng thụ thể có thể chẩn đoán

loại ung thư vú và xác địch chính xác mục tiêu đ ềi u trị [17,58,65]

Như vậy, UTV r t a d ng v cảấ đ ạ ề khía c nh tri u ch ng lâm sàng, tác nhân ạ ệ ứ

gây bệnh và đặc đ ểi m hình ảnh Hiện nay có nhiều hệ thống phân loại UTV,

trong đó hệ thống phân loại phổ biến hiện nay là hệ thống phân loại của Tổ chức

Y tế thế giới WHO Hệ thống này phân loại UTV thành 4 kiểu chính [63]

- Ung thư không xâm lấn (tại chỗ) : ung thư ố ng tuyến tại chỗ

ung thư tiểu thùy tại chỗ

- Ung thư xâm nhiễm: ung thư ố ng tuyến xâm nhiễm

ung thư tiểu thùy xâm nhiễm

- Ung thư viêm nhiễm

- Bệnh paget núm vú

Các dạng ung thư vú được thể hiệ ởn Hình 1.1

Hình 1.1 Các d ạng ung thư vú

I-ung thư ố ng tuyế n t i ch ; II- ung thư tiểu thùy tại chỗ; III- ung thư ố ạ ỗ ng tuyến

thâm nhiễm; IV- ung thư tiểu thùy thâm nhiễm Trong đ ó: hình ảnh tuyến vú: A: ống ở

tuyến; B: tiểu thuỳ; C: vùng giãn nở củ ố a ng tuy n để gi sữ ế ữ a; D: núm vú; E: mô m ; ỡ

F: cơ ng ực; G: thành ngự ở c, hình phóng to: A: t bào ế ố ng/ti ể u thu ỳ bình thường; B: tế

bào ống/tiểu thuỳ ung th ; C: màng rìa; D: lõi ống ư

I II III IV

1.1.3 Nguyên nhân gây UTV

Có rất nhiều nguyên nhân gây nên UTV tiêu bi u nh gi i tính, tu i tác, mức ể ư ớ ổ

độ hormone Trong một nghiên c u công b năứ ố m 1995, nh ng nguyên nhân nêu ữ

trên chiếm khoảng 47% trong tổng số các ca UTV, chỉ 5% là do yếu tố di truyền

[65]

Tuổi tác và tiề n s sinh s n ử ả

- Tiền sử ệ b nh nhân: Những phụ ữ đ n ã bị ung thư vú ở 1 bên thì nguy cơ ắ m c

bệnh ở bên vú còn lại sẽ cao hơn [65]

- Tiền sử gia đình: nếu trong gia ình có m , ch hay em gái b ung th vú thì đ ẹ ị ị ư

nguy cơ bị bệnh ung th vú c a h là rấư ủ ọ t cao Các nguy c sẽơ cao h n n u các ơ ế

thành viên của gia đình bị ung thư vú trước 40 tuổi [65]

- Tuổi tác: Tuổi càng cao thì nguy cơ UTV càng cao Phần lớn phụ nữ da

trắng mắc bệnh UTV ở tuổi 50 đến 60 Tuổi dậy thì, tuổi mãn kinh và tiền sử

mang thai là những y u t liên quan ch t ch với UTV Người ta đã chứng minh ế ố ặ ẽ

rằng ở những phụ nữ có kinh l n đầu s m thì thườầ ớ ng có hàm l ng estradiol cao ượ

hơn so với phụ nữ bình thường, hormon này óng vai trò quan tr ng trong quá đ ọ

trình phát triển UTV Mãn kinh mu n sau tu i 55 và mãn kinh mu n m t n m t ộ ổ ộ ộ ă ỉ

lệ UTV tăng 3 % Phụ nữ ch a mang thai có nguy c mắư ơ c UTV cao g p 1,4 l n ấ ầ

so với phụ nữ có mang thai Phụ nữ sinh con l n đầu càng s m thì nguy cơ mắc ầ ớ

UTV càng thấp và tỉ lệ này t ng 3% cho m i n m ch m sinh con l n đầu Sinh ă ỗ ă ậ ầ

con sau 30 tuổi có nguy cơ bị UTV cao g p t 2 - 5 l n so v i nhóm sinh con ấ ừ ầ ớ

trước tuổi 19 [23,37,43]

Nhiều nghiên cứu cho thấy có sự liên quan giữa dùng thuốc tránh thai trong

thời gian dài với UTV Nếu dùng thuốc tránh thai trên 8 năm, nguy cơ mắc UTV

tăng 1,7 lần, còn nếu dùng trên 10 năm thì nguy cơ tăng đến 4,1 l n Nh ng cu c ầ ữ ộ

nghiên cứu mới nhất cho thấy phụ ữ n dùng các loại thuốc nh ưPrempro, Provera

hay Premarin sau khi tắt kinh có th làm t ng nguy c m c b nh UTV [37,43] ể ă ơ ắ ệ

Yếu tố di truyền

Đột biế ở ộn m t số gen có thể làm cho tế bào bình thường chuyển thành dạng ác

tính Năm 1994, người ta tìm thấy s liên quan gi a đột bi n gen c chếự ữ ế ứ kh i u ố

BRCA-1 và BRCA-2 nằm trên nhi m s c th 17 và 13 với bệnh UTV, ung thư ễ ắ ể

buồng trứng và mộ ốt s loại ung thư khác Do nằm trên nhiễm sắc thể thường, các

gen này có thể di truyền từ bố ho c mẹ (xác suất là 1/2) Những phụ nữ mang các ặ

gen này có nguy cơ bị UTV cao N u nguyên nhân do nh ng r i ro trong cu c ế ữ ủ ộ

sống thì khả năng ung th vú là 12% thì phụ nữư có 1 trong nh ng gen này thì có ữ

nguy cơ ị b khoảng 60% Khoảng 5% các trường h p UTV có đột biến gen BRCA-ợ

1 và thường bị bệnh khi còn tr Đột bi n gen BRCA-2 cũng có nguy cơ gây UTV ẻ ế

ở ữ n tương đương v i nguy c đột biến gen BRCA-1 [23,37,43] ớ ơ

Đột biến gen p53 và m t sốộ gen khác c ng liên quan v i nguy c UTV ũ ớ ơ

Những hội chứng do các rối loạn về di truyền như hội ch ng Li-Fraumeni, h i ứ ộ

chứng Cowden, hội chứng Muir, giãn mạch thất đ ềi u cơ cũng có th làm xu t ể ấ

hiện UTV Những nghiên cứu gầ đây cho thấy có khoảng 10% UTV do di n

truyền [23]

Các yếu tố dinh dưỡng và môi trường

Chế độ và thói quen ăn uống ăn thức ăn giàu chất béo, sử dụng rượu bia,

thuốc lá, phóng xạ có ảnh hưởng t i kh n ng m c UTV M t s lo i th c ph m, ớ ả ă ắ ộ ố ạ ự ẩ

thuốc reserpin, cafein, thuốc xịt tóc, sự tiếp xúc với tia bức xạ ion hóa từ nguồn

tự nhiên hay nhân tạo sẽ làm tăng nguy cơ phát triển UTV Nhiều nghiên cứu gần

đây c ng cho th y các h p ch t h u c ch a Clo nh PCBs (polychlorinated ũ ấ ợ ấ ữ ơ ứ ư

biphenyls) cũng làm tăng nguy cơ ắ m c UTV [9,43]

Ngoài ra, còn một số yếu t rủi ro khác như vấố n đề liên quan n ch ng t c đế ủ ộ

như phụ nữ da tr ng thì mắc ung thư vú nhiắ ều hơn là phụ nữ Châu Á, Châu phi,

Châu Mỹ La tinh [65]

1.1.4 Các phương pháp đ ề i u trị ung thư vú

Các phương pháp truyền thống: bao gồm phương pháp ph u thu t, hóa trị ẫ ậ

và xạ trị Trong đ ềi u trị ung thư vú chúng ta nên kết hợp các phương pháp trên

thì mới đạt hi u qu t t Việc lựa chọn phương pháp ệ ả ố đ ềi u trị ầ c n dựa vào mức độ

xâm lấn theo sự chẩn đoán và khả năng tái phát l i b nh Ung th giai đ ạạ ệ ư o n 1

được đ ềi u tr vớị i phương pháp ph u thu t c t kh i u k t h p hoặẫ ậ ắ ố ế ợ c không k t h p ế ợ

với chiếu phóng xạ Ung thư giai đ ạn 2 và 3 với tiên lượng xấu và rủi ro bị tái o

phát bệnh cao thì phả đ ềi i u trị bằng cách ph u thu t (ph u thu t c t kh i u hay ẫ ậ ẫ ậ ắ ố

cắt toàn bộ vú có hoặc không kết hợp với việc cắt cả u hạch), phóng xạ, và hoá trị

liệu Nếu ở giai đ ạo n 4, ung thư đ ã di căn thì không có khả năng ch a tr và s ữ ị ẽ

được kiềm ch bằế ng cách k t h p c a t t c các cách i u trịế ợ ủ ấ ả đ ề trên t ph u thu t, ừ ẫ ậ

phóng xạ, hoá trị và các liệu pháp mục tiêu Các cách đ ềi u tr này s làm kéo dài ị ẽ

thời gian sống của bệnh nhân ung thư giai o n 4 lên khoảng 6 tháng [35,50,65] đ ạ

Các phương pháp hiện đại: hiện nay, trong i u tr ung th vú li u pháp đ ề ị ư ệ

ngăn cản hormone và sử dụng kháng thể đơn dòng đang được chú ý

- Liệu pháp ngăn cản hormone: một s loố ại ung thư vú yêu cầu c n phầ ải có

estrogen để có thể tiếp tục phát triển Chúng có thể được nhận diện bằng cách xác

định sự có m t c a th th estrogen (ER+) và th thể progesterone (PR+) trên bề ặ ủ ụ ể ụ

mặt của chúng Loại ung thư vú này có th i u tr b ng thu c ng n c n quá trình ể đ ề ị ằ ố ă ả

tạo ra estrogen hay ngăn cản các thụ thể như loại thuốc tamoxifen hay loại ức chế

aromatase [65]

- Kháng thể đơn dòng: Đây là phương pháp khá phát triển trong việ đ ềc i u trị

ung thư vú do HER2+ Trastuzumab (Herceptin), một lo i kháng th đơn dòng ạ ể

của HER2 đã được sử dụng r t hiệấ u qu và r ng rãi trong đ ềả ộ i u trị UTV dương

tính HER2 Tuy nhiên giá cả các loại kháng thể đơn dòng này rất cao vì vậy các

kháng thể đơn dòng khác cũng ang được nghiên cứu và thửđ nghiệm nhằm nâng

cao hi u quệ ả và giảm giá thành sản phẩm [35,65]

1.2 Kháng nguyên HER2 đặc hiệu tế bào ung thư vú

1.2.1 Cấu trúc của gen HER2

Gen HER2 thuộc họ gen mã hóa các thụ thể sinh trưởng c a các t bào bi u bì ủ ế ể

HER (Human Epidermal Growth Factor Receptor) được nghiên cứu phát hiện ra

với tên HER-2 và c-erbB-eerG b i ở hai nhóm nghiên cứu độc lập vào năm 1985

(Coussens et al., 1985; Semba et al., 1985) Tuy nhiên các nghiên cứu sau đó cho

thấy hai gen này hoàn toàn giống nhau và thống nhất đặt tên gọ HER-2/neu i

(HER2) Nó còn có các tên gọ i khác nh v-erb-b2, Neu, TKR1, NGL HER2 nằm ư

ở nhi m s c th sốễ ắ ể 17, g n v i tâm động, vịầ ớ ở trí q11.2 q12.0, HER2 là m t gen ộ

tiền ung thư (proto-oncogen) có chiều dài 30528 bp chứa 27 exon, tổng chiều dài

các exon là 4477 bp trong đó exon dài nhất có 969 bp, exon ngắn nhất có chiều

dài 48 bp, gen này có 3 bản sao tương đồng tương ứng với 3 allele B1(

Ile-654/Ile655); allele B2 (Ile-654/Val-655); allele B3 (Val-654/Val-655) Mặc dù

kích thước gen HER2 trong hệ gen là rất lớn nhưng quá trình hiệu chỉnh sau khi

phiên mã tạo ra mRNA trưởng thành với khoảng 1800 bp [18,31,34,53,68]

1.2.2 Cấu trúc kháng nguyên HER2

HER2 là thành viên của họ thụ thể các y u t tăế ố ng trưởng bi u bì có ho t tính ể ạ

tyrosine kinase (EGFR – Epidermal Growth Factor Receptor) nằm trên bề mặ ết t

bào ở người, nó tương đương với protein neu ở chuột [18,34,68] Các thành viên

của họ thụ thể này có vai trò quan trọng đối với sự sinh sản, biệt hóa và phát triển

của tế bào Thụ thể có hoạt tính tyrosine kinase là các thụ thể nằm trên b mặ ếề t t

bào có ái lực cao đối với các yếu tố phát triển (GF – Growth Factor) có bản chất

là polypeptide, các cytokine và các hormone Thụ thể tyrosine kinase có vai trò

đ ềi u hòa, giúp cho các quá trình trong t bào được di n ra bình thường, ngoài ra ế ễ

nó còn có vai trò quan trọng trong việc hình thành và phát triển của nhiều dạng

ung thư trong đó có UTV [10,11,12]

Họ các thụ thể của y u t tăế ố ng trưởng bi u mô g m 4 lo i th th : HER-1, ể ồ ạ ụ ể

HER-2, HER-3 và HER-4 Trong đó được biết đến và được nghiên cứu nhiều

nhất là HER-2, khối lượng phân tử khoảng 185 kDa (còn được gọi là

p185HER2), cấu trúc không gian của nó gồm 3 phần:

+ Một vùng ngoại bào giàu Cystein có chứa phần đầu N c a thụ thểủ N m ằ ở

vùng ngoại bào này là một vùng lớn có khả năng g n k t v i các y u t tăng ắ ế ớ ế ố

trưởng biểu mô

+ Vùng xuyên màng lipit

+ Vùng nội bào có chứ đa uôi C có mang các gốc tyrosine được phosphoryl

hóa chịu trách nhi m cho ho t tính tyrosine kinase của thụ thể (Hình 1.2) ệ ạ

Hình 1.2 Cấu trúc của protein HER2 [46]

Cấu trúc của HER2/neu: (1): Vùng ngoại bào gồm có 2 vùng liên kết với chất cảm

ứng LD1, LD2 (Ligand binding regions); (2): Hai vùng giàu Cystein (CR1 và CR2);

(3): Một vùng xuyên màng (TM – transmembrane); (4): Một vùng có hoạt tính tyrosine

kinase (TK); (5): Mộ đ t uôi Cacboxyl (CT – Carboxyl terminal)

Thụ thể HER2 bao g m ph n ngo i bào kho ng 632 amino acid, vùng chuy n ồ ầ ạ ả ể

màng đơn chuỗi dài 22 amino acid và vùng tyrosine kinase nội bào được g m ồ

580 amino acid Vùng ngoại bào của HER2 gồm 4 tiểu vùng: Tiểu vùng I bao

gồm các gốc amino acid từ vị trí s 1 đến v trí 195 (SEQ1); ti u vùng II t 196 - ố ị ể ừ

319 (SEQ2); tiểu vùng III từ 320 - 488 (SEQ3); tiểu vùng IV từ 489 -630

(SEQ4) Thụ thể HER bình thường tồn tại ở trạng thái đơn phân bất hoạt Sự hoạt

hóa thụ thể xảy ra khi có ligand bám vào và làm ho t hóa m t dãy các quá trình ạ ộ

dẫn đến sự nhị hợp (dimer) giữa các thụ thể, và cuối cùng làm trung gian cho các

quá trình sinh học như ự ă s t ng trưởng và biệt hóa tế bào [10,15,16]

1.2.3 Cơ chế hoạt động củ a th thể HER2 ụ

HER2 là một thụ thể không c n liên k t ph i t , có thể biểu hiện trong nhiều ầ ế ố ử

loại mô của con người và biểu hiện quá mức trong 25-35% các ca ung thư vú

Thụ thể HER2 không cần có các chất liên k t để ho t hóa mà c u trúc c a nó ế ạ ấ ủ

luôn luôn trong trạng thái “mở”, b t chước trạắ ng thái liên k t v i ligand, làm cho ế ớ

nó có khả năng b t c p hình thành tr ng thái dimer v i b n thân nó ho c v i các ắ ặ ạ ớ ả ặ ớ

thành viên khác trong họ như HER1, HER3, HER4 ở trạng thái đã liên kết với

ligand để hoạt động Quá trình nhị hợp vùng ngo i bào làm ho t hoá vùng xuyên ạ ạ

màng của thụ thể ẫ, d n đến s t phosphoryl hóa hàng lo t g c Tyrosine của vùng ự ự ạ ố

nội bào Các gố đc ã được phosphoryl hoá đó hoạt động như một trung tâm liên

kết của protein có chứa Src homology 2 (SH2) hoặc vùng liên kết

phosphotyrosine (PTB) Nó còn gồm có các protein liên kết như Shc, Crk, Grb2,

Grb7, kinase như phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), protein phosphatase

tyrosine SHP1 và SHP2 và yếu tố trao đổi nucleotide guanidin như SOS M i th ỗ ụ

thể đều có một vùng liên kết riêng khác bi t, qua đó sẽ hình thành các phức hệ ệ

protein nối khi có sự phosphoryl hóa Đ ềi u này d n đến hàng loạt các con đường ẫ

mà chúng kích hoạt Hai con đường quan trọng nhất được hoạt hoá bởi sự nhị

phân trong họ HER là PI3K/Akt kích hoạt cho các tế bào khối u sống sót và con

đường hoạt hoá MAPK (mitogen – Activated protein kinase) kích thích quá trình

biệt hoá tế bào Cả hai con đường này đều dẫn truyền tín hiệ đến đích cuối cùng u

là nhân và kích hoạt sự hoạt động của gen đích [10,11,18,34,53]

1.3 Ung thư vú dương tính HER2

Sự biểu hiện quá m c c a HER2 là tác nhân làm tăng dimer hóa giữa HER2 ứ ủ

với chính nó và các thụ thể khác (HER1, HER3) Đó cũng là những tín hiệu khởi

đầu cho các con đường sinh ung thư khác nhau Tuy nhiên m i liên quan gi a ố ữ

các con đường đó là rất khó để có thể xác định Dưới ây là m t đề xu t c a đ ộ ấ ủ

Moasser về con đường sinh ung thư do sự biểu hiện quá mức của HER2 (Hình

1.3)

Hình 1.3 Cơ chế gây ung thư do biểu hiện quá mức HER2

Sự biểu hiện quá mức của HER2 là nguyên nhân của sự tăng dimer hóa T ng ă

dimer HER2-EGFR dẫn tới sự ă t ng sinh và sự xâm lấn của tế bào Sự ă t ng dimer

hóa đồng hình HER2 làm mất tính phân cực của tế bào Sự tăng dimer

HER2-HER3 có ảnh hưởng tới sự ă t ng sinh, khả ă n ng tồn tại, tính xâm lấn và chức năng

trao đổi chất của tế bào Tăng sự biểu hiện quá mức của HER2 làm tăng isoform

hiếm ∆HER2 dẫn tới tăng cường độ truyền tín hiệu Một vài yếu tố phiên mã

được cả ứm ng trong nh ng t bào có s bi u hi n quá m c HER2 là kếữ ế ự ể ệ ứ t qu của ả

những sự thay đổi biểu hiện gen ở ứ m c dư thừa [52]

Feldman và cs đã đưa ra mô hình về con đường truyền tín hiệu của những th ụ

thể hoạt động này Ở trạng thái hoạt động nó kích thích con đường truyền tín hiệu

phosphatidyl inositol 3′-kinase (PI3K) thông qua việc gắn ti u ph n p85 vào Akt, ể ầ

dẫn tới hoạt hóa Akt Akt làm bất ho t các phân t ti n apoptosis bao g m Bad, ạ ử ề ồ

caspase-9, và p53 Thêm vào đó, dưới tác động của Akt, các hoạt động chuyển

hóa glucose, các kênh vận chuyển glucose (GLUT) (nhờ sự phosphoryl GSK3)

và sự tổng h p protein, chu trình phát tri n củ ếợ ể a t bào (thông qua s phosphoryl ự

hóa của protein p90RSK, p70S6K, mTOR) đều tăng lên là những nhân tố ngăn

chặn quá trình apoptosis Hơn thế nữa, s ho t hóa các yếự ạ u t phiên mã ố κ

B (nuclear factor κB) còn kích ứng sự biểu hi n cệ ủa các gen anti-apoptosis thông

qua các protein c-IAP1-2, TRAP 1-2, và A1/Bfl-1 Kết quả của s tăng sinh này ự

cũng là một trong những nguyên nhân dẫn tới quá trình hình thành ung thư

[52,59]

Vùng thiết yếu của HER2 trong hệ thống truy n tín hi u ã được nghiên c u t o ề ệ đ ứ ạ

ra các kháng thể đơn dòng (MAbs) kháng lại HER2 cho liệu pháp đ ềi u trị ung

thư Đặc biệt là kháng thể đơn dòng trastuzumab (Herceptin) có ho t tính kháng ạ

lại khối u chống l i s bi u hiệạ ự ể n quá m c HER2 và được sử dụứ ng r ng rãi trong ộ

đ ềi u tr [63] ị

1.4 Kháng thể tái tổ ợ h p đặc hi u kháng nguyên HER2 ệ

1.4.1 Khái niệm

Kháng thể là các immunoglobulin (có bản chất glycoprotein), do các tế bào

lympho B, các tương bào (biệt hóa từ lympho B) tổng hợp và tiết ra giúp hệ miễn

dịch nhận biết và vô hiệu hóa các tác nhân lạ, chẳng hạn các vi khuẩn hoặc virus

Các kháng thể có cấu tạo hình chữ Y, có hai bộ “cành” gắn vào một “thân”

Các đầu của Y (Fab) được gọi là các vùng bi n đổi, phía đầu các cành ch a các ế ở ứ

vùng gắn kết kháng nguyên (vùng quyết định bổ trợ, CDR) và thân (Fc) là một

vùng hằng định Kháng thể gồm 4 chu i polypeptide, 2 chu i n ng và 2 chu i ỗ ỗ ặ ỗ

nhẹ Chuỗi nặng và chuỗi nhẹ được nối với nhau bằng 1 c u disulfide, hai chu i ầ ỗ

nặng được nối với nhau bởi 2 cầu disulfide Kiểu của chuỗi nặng quyết định phụ

dạng của Ig (IgA, IgD, IgG, IgM và IgE) Mỗi chuỗi có vùng bi n đổi và vùng ế

hằng định (vùng không biến đổi) Vùng biến đổi nằm ở đầu amino (NH2-) của

chuỗi polypeptide (các amino axit từ 1-110) (Hình 1.4) [4,55]

Hình 1.4 S ơ đồ c u tạo củ ấ a kháng th ể

Kháng thể đơn dòng

Kháng thể đơn dòng là thu t ngữ chỉ các kháng thể thu nhậậ n được t mộ ậừ t t p

hợp các kháng thể đồng nhất với nhau về bản ch t, nghĩấ a là kháng th đơn dòng ể

là tập hợp các kháng thể đồng nhất cùng nhận biết và gắn kết với một epitope

Ngược lại, các kháng thể đ a dòng là tập hợp nhiều loại kháng thể không đồng

nhất và nhận biết các epitope khác nhau [4]

Kháng thể đơn chu i – M nh kháng th ỗ ả ể

Trong cấu tạo của bất kỳ một kháng th tựể nhiên nào đều có 4 vùng bi n đổi ế

(V - Variable) ở đầu t n hai "cánh tay" của chữ Y Sự kếậ t h p gi a 1 vùng bi n ợ ữ ế

thiên trên chuỗ ặi n ng (VH) và 1 vùng biến thiên trên chuỗi nhẹ (VL) tạo nên vị trí

nhận diện kháng nguyên (paratope) Như vậy, m i immunoglobulin có hai v trí ỗ ị

gắn kháng nguyên Hai vị trí này giống nhau như đúc, qua đó một kháng thể có

thể gắn được v i 2 kháng nguyên gi ng nhau Hai "cánh tay" c a ch Y còn g i ớ ố ủ ữ ọ

là Fab (tức là phần nhận biết kháng nguyên, F: fragment, ab: antigen binding)

Vùng kháng nguyên gắn vào kháng thể ọ g i là epitope

Các kháng thể tự nhiên thường có kích th c l n, khi có m t tác nhân gây ướ ớ ộ

bệnh xâm nhập vào trong cơ thể, nó được tổng hợp chậm và do có kích thước lớn

nên đôi khi nó được chuyển đến đích tác dụng chậm Với công nghệ DNA tái tổ

hợp hiện nay, đã có nhiều nhà khoa học nghiên cứu tạo ra các kháng thể tái t ổ

hợp, tối ưu hóa các kháng thể đ ó mà v n đảm b o được tính đặc hi u v i kháng ẫ ả ệ ớ

nguyên Cho đến nay đã có nhiều thế ệ h kháng thể tái tổ ợ h p được sản xuất ra

Các phân tử kháng th ch a các domain protein riêng bi t mà có th phân ể ứ ệ ể

tách bằng protease hoặc được tạo ra nhờ kỹ thu t tái t hợậ ổ p Hai m nh kháng ả

thể được thiết k g n v i kháng nguyên - Fab và Fv ã được tách dòng và b c ế ắ ớ đ ộ

lộ trên phage Mảnh kháng th lớể n h n - Fab g m các ph n Vơ ồ ầ H - CH và VL - CL

liên kết với nhau bằng cầu disulfide, còn mảnh kháng thể nhỏ hơn Fv ch bao ỉ

gồm vùng VH và VL

Dạng tái tổ hợp c a Fv là m nh bi n đổi đơn chu i (scFv) Hai vùng bi n đổi ủ ả ế ỗ ế

trong mảnh kháng thể tái tổ hợp đơn chu i (scFv) được n i v i nhau b ng m t ỗ ố ớ ằ ộ

đ ạo n peptide, thường g m 15 axit amin có trình tự (Gly4Ser)3 và được biểu hiện ồ

như một chuỗi polypeptide đơn Đ ạo n nối cho phép vùng biến đổi của chuỗi nặng

(VH) kết hợp với vùng biến đổi của chuỗi nhẹ (VL) tạo thành phân tử đơn chu i ỗ

(Hình 1.5) Phân tử tái tổ hợ ạp t o ra v n b o t n ho t tính nh n bi t và liên k t ẫ ả ồ ạ ậ ế ế

đặc hiệu với kháng nguyên ích Đặc i m c a các m nh kháng th khác nhau đ đ ể ủ ả ể

được tóm tắt trong bảng 2.1 [4,54,55]

Hình 1.5 Sơ đồ c u tạo của mảnh kháng thể đơn chuỗi ấ

B ảng 2.1 Một số mảnh kháng thể đơn chuỗi Mảnh

kháng thể Kích thước

S ố

ScFv 25-30 kDa 1 Vùng VH và VL nối v i nhau ớ

bằng một linker dài 15 axit amin

Fv 25 kDa 1 Giữa VH và VL không có đ ạo n

nối (linker) Minibody 80 kDa 2 Một protein dung hợ ởp trạng

thái nhị phân gồm 2 mảnh CH3

scFv-Fab 50 kDa 1 Gồm hai chuỗi: VH-CH1 và

VL-CLF(ab’)2 100 kDa 2 Gồm 2 phân tử Fab

IgG 150 kDa 2 Phân tử kháng thể mẹ gồm: 2

chuỗi nặng (VH-CH1-CH2-CH3) và

2 chuỗi nhẹ (VL-CL)

1.4.2 Kháng thể đơn dòng và ứng dụ ng i u trị ung thư vú đ ề

Hiện nay, việc chẩn đoán đúng các giai đ ạo n UTV là yếu tố rất quan trọng

trong việc lựa chọn phương pháp đ ềi u trị hiệu quả Phương pháp đ ềi u trị UTV

dương tính HER2 chủ yếu là phương pháp tr li u, ph u thu t và x tr Tuy ị ệ ẫ ậ ạ ị

nhiên, các phương pháp này đa phần chỉ áp dụng đối với các trường h p khợ ối u

đã phát triển và ở giai đ ạo n muộn nên có hiệu quả thấp Nắm được sinh lý học

của HER2 từ những nghiên cứu cơ bản để tìm ra biện pháp đ ềi u trị ừ t những năm

1980 nhóm nghiên cứu Genentech (Genetech, Inc 4817400, South San

Francisco, CA 94080-4990) đã bắt đầu làm việc trên những nghiên c u c b n v ứ ơ ả ề

HER2 nhằm tạo ra kháng thể đơn dòng m c tiêu để “làm t t” gen HER2 Hi n ụ ắ ệ

nay, sử dụng công ngh DNA tái t hợệ ổ p các nhà khoa h c ã nghiên c u để tạo ọ đ ứ

ra các kháng thể đơn dòng tái tổ hợp đặc hi u v i HER2 giúp cho s ch n oán ệ ớ ự ẩ đ

và đ ềi u trị UTV có hiệu quả cao hơn [51]

Ở Vi t Nam, các thuốệ c ch a ung thư có bản chất kháng thể đơn dòng cũng đã ữ

xuất hiện nhưng với giá thành rất cao, phạm vi áp dụng hẹp, không thể đ áp ng ứ

được nhu cầu ch a trị củữ a b nh nhân Do ó vi c nghiên c u và đưa vào s n xuất ệ đ ệ ứ ả

các thuốc ch a tr ung th bằng công nghệ DNA tái tổ ợữ ị ư h p đang rất được quan tâm

Đối vớ ệi b nh UTV dương tính với HER2 thì bước đầu tiên của quá trình là tách

được toàn bộ gen HER2, sau đó có thể phát triển theo các hướng quan tâm như chế

tạo thuốc hay tạo các kít chẩn đoán s m Hi n nay, m t s lo i kháng thể đớ ệ ộ ố ạ ang

được sử dụng trong i u tr UTV dương tính v i HER2 nh Herceptin (còn được đ ề ị ớ ư

gọi là Trastuzumab) là một kháng thể đơn dòng có nguồn gốc từ DNA murine,

trực tiếp chống lại vùng ngoại bào (ECD) của thụ thể HER2 Cũng như các kháng

thể đơn dòng kháng HER2, Herceptin là một phân tử kháng thể IgG1 của người,

với vùng quyết định bổ sung của kháng thể chuột - 4D5 Việc cải biến của murine

4D5 tạo nên nhiề ư đ ểu u i m: Vùng không biến đổi người làm trung gian cho ở

toàn bộ hoạt động tác động i với vật chủ, có vai trò trong sự phát triển HAMA đố

(Human Antimouse Antibody – hiện tượng cơ thể sinh kháng thể chống lại kháng

thể chuột), và làm cho ái lực liên kết với kháng nguyên cũng được tăng lên

[4,15] Herceptin (Tratuzumab) gắn kết với vùng ngo i bào cạ ủa thụ thể HER2 trên bề

mặt tế bào ung th vú, c chế sựư ứ phân c t vùng này để tương tác với các thụ thể khác ắ

trong họ HER, làm cảm ứng sự chết theo chương trình của tế bào ung thư, giảm sự

biệt hóa tế bào, làm giảm sự biểu hiện của HER2… Herceptin được FDA chấp thuận

sử dụng lần đầu tiên kết hợp v i paclitaxel trong việ đớ c iều trị UTV di căn dương tính

vớ ự ểi s bi u hiện quá mức thụ thể HER2 [35,58,65]

Tuy nhiên, hiện nay có nhiều trường hợp ung thư vú và một s loố ại ung thư

khác có sự biểu hiện HER2 thấp hay ở mức độ vừa ph i Trong nhi u kh i u, ả ề ố

chức năng HER2 như là một đồng thụ thể ư u tiên liên kết v i các d ng dimer ớ ạ

khác loại với HER1 (EGFR), HER3 hay HER4 Đối với lý do này, một kháng thể

đơn dòng là 2C4 với m c tiêu nh m đến HER2 nh là m t đồng th th dưới ụ ắ ư ộ ụ ể

hoạt tính phát triển liên kết, 2C4 thành liên kết với vùng nh hợị p c a HER2 và bất ủ

hoạt quá trình nhị hợp c a thụ thể HER2 với chính nó hoặc với các thành viên khác ủ

trong họ HER, qua đó làm bất hoạt cả chất liên kết hoạt hóa tín hiệu HER2 2C4 có

khả năng chống lại nhiều loại kh i u rố ắn Ngoài ra, kháng thể đơn dòng Pertuzumab

có hoạt tính trong cả khối u không có sự biểu hiện mạnh HER2 [68]

1.5 Các phương pháp sản xuất kháng thể đơn dòng

1.5.1 Phương pháp tạo dòng tế bào lai hybridoma

Cuối những năm 1970 Cesar Milstein và Georges Kohler đã đề xuất kỹ thuật

hybridoma (tế bào lai giữa 1 lympho B có khả năng s n xu t kháng th vớả ấ ể i 1 t ế

bào ung thư có khả năng phân chia vô h n) K thu t này ã tạo ra một tiến bộ ạ ỹ ậ đ

đáng k trong việể c nghiên c u thu nhận các kháng thể đơn dòng với tính đặc hiệu ứ

cao

Các dòng tế bào hybridoma được tạo ra bằng cách cho tế bào B tương thích từ

động vậ đt ã được gây miễn d ch dung h p v i các t bào myeloma – t bào kh i ị ợ ớ ế ế ố

u tủy xương có khả ă n ng sống lâu trong môi trường nuôi cấy, tế bào lai này được

gọi là hybridoma Để sản xu t kháng th đơn dòng mong mu n, các tếấ ể ố bào ph i ả

được nuôi theo 2 cách khác nhau: tiêm vào khoang màng bụng của những con

chuột phù hợp (in vivo) hoặc nuôi cấ y mô in vitro S n xu t kháng th đơn dòng ả ấ ể

bao gồm sản xuất in vivo ho c in vitro ho c tổ ợặ ặ h p cả hai phương pháp trên

Kỹ thuật hybridoma gồm các bước chủ yếu sau:

- Gây miễn dịch chuột bằng kháng nguyên ích đ

- Dung hợp tế bào myeloma với tế bào lách chuột

- Chọn lọc các tế bào lai có khả năng s n xu t kháng th đơn dòng đặc hi u ả ấ ể ệ

kháng nguyên đích [4]

1.5.2 Phương pháp tái tổ ợ h p

Các kháng thể đơn dòng sản xuất theo phương pháp hybridoma khi ứng dụng

trong đ ềi u trị lại g p tr ng i r t l n v tính hi u qu do chúng nhanh chóng b ặ ở ạ ấ ớ ề ệ ả ị

trung hòa (cơ thể người bệnh sinh kháng thể kháng lại nó, gọi tắt là hi n tượng ệ

HAMA) Vì vậy, để kh c phắ ục vấn đề này các nhà khoa h c đọ ã sử ụ d ng kỹ thuật

gen để: (1) tạo ra kháng thể đơn dòng dạng ghép, (2) sản xuất kháng thể có bản

chất người hoàn toàn

Trong kỹ thuật này, các gen từ các nguồn tế bào lympho B khác nhau (ví dụ

từ chuột, người) được kết hợp với nhau để tạo các gen tái t hợp mã hóa kháng ổ

thể đơn dòng có vùng gắn kết kháng nguyên đồng nhất, gắn kết với cùng 1

epitope của kháng nguyên; kháng thể đơn dòng khi đó có thể là:

- Kháng thể đơn dòng ghép: có vùng biến đổi nguồn gốc từ chuột và vùng

hằng định nguồn gốc từ người

- Kháng thể đơn dòng nhân hóa: mang vùng quyết định tính bổ trợ (CDR)

nguồn gốc từ chuột, phần còn lại của vùng biến đổi và vùng hằng định nguồn gốc

từ người

- Kháng thể đơn dòng kh : có vùng biế ỉ n đổi t kh và vùng h ng định t ừ ỉ ằ ừ

người

- Kháng thể đơn dòng gà: là kháng thể thu được thông qua việc gây miễn dịch

bằng kháng nguyên có nguồn gốc từ động vật có vú Do sự cách xa nhau trong hệ

thống phân loại nên phản ứng miễn dịch này ở gà diễn ra mạnh hơn ở động vật

có vú

- Kháng thể đơn dòng người: là kháng thể có nguồn gốc hoàn toàn từ người

Các gen mã hóa vùng biến đổi có ngu n gốc từ người được chuyểồ n vào chu t ộ

(chuột chuyển gen) hoặc thực khuẩn thể (thư viện phage) để sản xu t kháng th ấ ể

đơn dòng người [57] Các kháng thể có b n ch t hoàn toàn t người mới được ả ấ ừ

nghiên cứu trong những năm gần đây và đang trong giai đ ạo n thử nghiệm [4]

Bằng các phương pháp tạo tế bào hybridoma, phương pháp sinh học phân tử

như tạo gen tái t hợổ p, k thu t phage display,… ta có thể tạỹ ậ o được các dòng t ế

bào tái tổ hợp có kh năả ng sinh t ng h p kháng th đơn dòng đặc hi u kháng ổ ợ ể ệ

nguyên đích Tuy nhiên, sau khi có được gen tái tổ hợp thì việc bi u hi n để thu ể ệ

nhận và tinh sạch các kháng thể đơn dòng tái tổ hợp này là m t v n đề nan gi i ộ ấ ả

Vì vậy, hiện nay các nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn dòng đang tập trung vào

biểu hiện các kháng thể này trong các hệ biểu hiện khác nhau nhằm sản xuất

kháng thể đơn dòng có hoạt tính, hiệu suất cao, đơn giản về thao tác, an toàn và

chi phí thấp…[4]

1.6 Các hệ th ng biểu hiện gen truyền thống ố

Biểu hiện gen tạo sản phẩm protein tái tổ hợp nói chung, kháng thể tái tổ ợp h

nói riêng là một kỹ thuật quan trọng Trong ó, vi c l a ch n h th ng bi u hi n đ ệ ự ọ ệ ố ể ệ

là một bước rất quan tr ng Hi n nay, h th ng các t bào ch (Host cell) thường ọ ệ ệ ố ế ủ

được sử dụng trong biểu hiện kháng thể đơn dònggồm: tế bào vi khuẩn, tế bào

nấm men, tế bào động vật có vú và thực vật

1.6.1 Hệ th ng biểu hiện tế bào vi khuẩn ố

Do sự phát triển với tốc độ nhanh của vi khuẩn, tỷ lệ tạo s n ph m cao và d ả ẩ ễ

dàng thực hiện các thao tác với gen, hệ thống biểu hiện vi khuẩn thường được lựa

chọn để tạo các protein kích thước nh và các chu i peptid Hiệỏ ỗ n nay, vi khu n ẩ

E coli là tế bào chủ được u chuộng nhất trong biểu hiện gen đặc biệt là chủng ư

E coli BL21 được sử ụ d ng rộng rãi để biểu hiện nhiều loại gen khác nhau Ngoài

ra, vi khuẩn Bacillus subtilis, Bacillus megaterium cũng được sử dụng làm tế bào

biểu hiện gen Tuy nhiên, ứng dụng của chúng bị hạn ch , do prokaryot không ế

thể thực hiện các quá trình biến đổi sau dịch mã như glycosyl hoá là bước rất cần

thiết tạo ch c n ng c a protein đặc bi t là kháng th có c u hình không gian ph c ứ ă ủ ệ ể ấ ứ

tạp Ngoài ra, các protein tái tổ hợp thường được t o ra d ng th vùi không hoà ạ ở ạ ể

tan được và phải được tinh chế, gấp nếp, các bước này đều tốn nhiều chi phí

Nội độc tố vi khuẩn cũng có thể gây khó khăn cho các bước tinh chế và có thể

gắn vào các protein đã được biểu hiện [5,14,28]

1.6.2 Hệ th ng biểu hiện tế bào nấm men ố

Nấm men là nhóm tế bào chủ được sử dụng rộng rãi trong biểu hiện gen c a ủ

sinh vật bậc cao với nhiều u ư đ ểi m cho phép sử dụng c hai lo i vector bi u hi n ả ạ ể ệ

trong prokaryot và eukaryot Nấm men kết hợp các ư đ ểu i m của hệ thống vi

khuẩn với các đặc trưng biểu hiện gen của eukaryot như có thể thực hiện

glycosyl hoá hay thay đổi cấu trúc protein sau dịch mã nhưng sự biến đổi thường

được thực hi n không chính xác và k t qu là t o ra các s n ph m không g p n p ệ ế ả ạ ả ẩ ấ ế

hay glycosyl quá mức Nấm men S Cceseivisiae và Pichia Pastoris là các tế bào

biểu hiện gen được ưu chuộng nhất trong các hệ thống biểu hiện gen [5,13,14]

1.6.3 Hệ th ng biểu hiện tế bào động vật có vú ố

Sự dụng t bào động v t có vú nuôi c y để bi u hi n các protein tái t hợp ế ậ ấ ể ệ ổ

bộc lộ mộ ố ư đ ểt s u i m h n h th ng vi sinh v t ó là khi bi u hi n các protein tái ơ ệ ố ậ đ ể ệ

tổ hợp ph c t p có s đồng nhất cao vớ ơ ểứ ạ ự i c th con người v mặ ấề t g p n p và s ế ự

bi n ể đổi của protein Hơn nữa protein tái tổ hợp có th được bài ti t ra hệ ốể ế th ng

nuôi cấy tồn tại một thời gian dài.Một số vaccin tái tổ hợp và các protein có ho t ạ

tính sinh học như interferon γ, hGH, interleukien 2, factor VIII thường được

biểu hiện trong các tế bào S2 của ruồi giấm và tế bào trứng chuột đất vàng Trung

Quốc (CHO- Chinese Hamster Ovary) Tuy nhiên, các tế bào động vật nuôi cấy

thường khó khăn để iđ ều khiển, đặc biệt trong sản xuất với quy mô lớn và chi phí

cho môi trường và đ ềi u kiện nuôi cấy rất cao, có thể mấ ừt t 150$ đến 1000 $ cho

một gram protein trước khi được tinh chế Ngoài ra, những rủi ro về ô nhiễm

trong việc tách protein với các nhân tố gây bệnh nh virus và prion la m t tr ư ộ ở

ngại lớn nhất của việc nuôi cấy tế bào động vật có vú [5,14,27]

1.6.4 Hệ th ng biểu hiện tế bào thực vật ố

Chuyển gen vào thực vật được coi là phương pháp có khả năng t o ra s n ạ ả

phẩm protein tái tổ hợp ch c n ng có chi phí thấp và an toàn Cũng như nhóm ứ ă

eukaryot, chúng có khả năng th c hi n vi c bi n đổi sau d ch mã, quá trình sản ự ệ ệ ế ị

xuất có thể ở quy mô lớn Nhiều kháng thể hoặc các đ ạo n biế đổi của kháng thể n

đã được t ng h p trong th c v t, bao g m các kháng th ph c t p nh IgA, c n ổ ợ ự ậ ồ ể ứ ạ ư ầ

lắp ráp và kích hoạt 4 sản phẩm gen tách biệt để lắp ráp thành phân t hoàn ử

chỉnh Tuy nhiên, hệ biểu hiện này cũng có một vài hạn ch nh ki u glycosyl ế ư ể

trong thực vật thường khác với trong động vật có vú dẫn đến làm giảm chức năng

hay tính kháng nguyên của các protein tái tổ hợp Th hai là, vi c nuôi tr ng các ứ ệ ồ

thực vậ ạt t o các protein tái t h p ngoài đồng ru ng một cách an toàn đang gây ổ ợ ở ộ

nhiều tranh cãi Thứ 3 là thời gian từ các bước chuyển gen ban đầu cho tới khi

phân lập được protein đầu tiên phải m t vài n m, th i gian nh vậy là quá dài ấ ă ờ ư

Cuối cùng là việc tinh chế protein từ thực vật là rất khó khăn bởi sự bài tiết các

protein tái tổ ợ h p là không thể [5,14,26]

1.6.5 H ệ th ng biểu hiệ ố n vi t ảo

Chuyển gen vào vi tảo đã và đang ngày càng thu hút sự quan tâm chú ý của

các nhà khoa học trên thế giới Vi tảo là một h thệ ống bi u hi n u vi t, có khả ể ệ ư ệ

năng biểu hiện các protein chức năng ứng dụng trong ngành công nghệ sinh học

và d c phượ ẩm [27,45,48] Vi t o là vi sinh v t có kh năả ậ ả ng quang h p bao g m ợ ồ

cả sinh vật prokaryot (vi khuẩn lam cyanbacteria) đến nhóm tiến hoá khác nhau

của eukaryot Tảo có thể được tìm thấy cả trong nước ngọt và nước mặn, óng đ

góp khoảng 50% lượng cacbon cố định trên toàn cầu [45] Về nguyên tắc, vi tảo

tỏ ra là có tất cả các ưu đ ểm của hệ thống chuyển gen vào thực vậ ội t c ng v i kh ớ ả

năng đặc biệ ủt c a vi sinh v t là t c độ phát tri n nhanh, th i gian t lúc chuy n ậ ố ể ờ ừ ể

gen cho tới khi tạo thành sản phẩm mong muốn ngắn và dễ dàng sản xuấ ởt quy

mô lớn Tất cả các loạ ảo đềi t u có khả năng s dụng COử 2 và ánh sáng như là

nguồn cacbon và nguồn năng lượng của chúng Chúng là một trong những sinh

vật sử dụng hi u qu nh t vi c chuy n n ng lượng m t tr i thành các hợp chất ệ ả ấ ệ ể ă ặ ờ

hữu cơ Các loài cụ thể được xác định hiệu suất quang hợp của 1%-2% trong môi

trường tương đương với tạo sản phẩm khối sinh học khoảng 15-39g chất

khô/m2/1ngày [24]

Các loại vi tảo như Chlorella, Haematococcus và Dunaliella thường được sử

dụng làm các hệ ố th ng bi u hi n các protein có ho t tính nh vaccine, kháng th ể ệ ạ ư ể

tái tổ hợ ăp n được mà không c n ph i tách chiết Trái với thực vật chuyển gen, ầ ả

việc nuôi cấ được thực hiệ độc lập có thể ngăn chặ được vấ đề phát tán các y n n n

gen lạ sang các sinh vật khác Trong trường h p bợ ị thất thoát thì cũng không lo

rủi ro lan truyền t o chuy n gen b i các ch ng trong phòng thí nghi m được s ả ể ở ủ ệ ử

dụng để chuyển gen thường có một vài đột biến để ng n ch n s sốă ặ ự ng sót c a ủ

chúng trong đ ềi u kiệ ự nhiên [14,48,62] n t

Vì vậy hiện nay, vi tảo đang là hệ biểu hiện protein tái tổ hợp đặc bi t là ệ

kháng thể đơn dòng được kỳ vọng r t l n trong tương lai Tuy nhiên cho t i nay ấ ớ ớ

dù tỏ ra có nhiều ưu đ ểi m hơn các hệ thống biểu hiện protein truyền thống,

nhưng khả năng to l n c a chúng vẫớ ủ n ch a được khai thác tri t để vì các phương ư ệ

pháp liên quan tới sinh học phân tử và quy trình nuôi cấy vi tảo chỉ mới được

nghiên cứu rộng rãi trong những năm gầ đn ây [14]

1.7 Hệ biểu hiện tảo Chlamydomonas reinhardtii

Trong những năm gầ đn ây, tảo lục đơn bào Chlamydomonas reinhardtii- một

sinh vật mẫ đu ã được tập trung nghiên cứu rất nhiều và đến nay đã đưa ra một

công cụ hoàn chỉnh ng dụng trong công nghệ gen Một số protein tái tổ ợứ h p ứng

dụng trong y dược đã được biểu hiện thành công trong gen nhân và trong lạp thể

của loại tảo này [32,33,44,47]

1.7.1 Đặc đ ể i m sinh họ [66] c

Chlamydomonas reinhardtii thuộc giới Protistae, ngành Chlorophyta, lớp

Chlorophyeae, bộ Volvocales, họ Chlamydomonadaceae, giống Chlamydomonas

Chlamydomonas reinhardtii là loạ ải t o l c đơn bào có th di động, đường kính ụ ể

khoảng 10 µm, có thể chuyển động trong môi trường nhờ hai lông roi Tảo C

reinhardtii thường được tìm thấy trong đất và nước ngọt Thành tế bào là

glycoprotein giàu hydroxyproline, lục lạp hình cái chén lớn (Hình 1.6) Nó thuộc

nhóm eukaryot mà gen quang hợp được mã hoá ở cả gen nhân và gen l c l p ụ ạ

Thông thường Chlamydomonas có thể phát triển trên môi trường khá đơn giản

với các muối vô cơ trong i u ki n ánh sáng, s dụđ ề ệ ử ng kh năả ng quang h p để ợ

cung cấp năng l ng Chúng cượ ũng có thể phát triển được trong môi trường tối

hoàn toàn và sử dụng acetate như là nguồn cung cấp carbon

Các tế bào sinh dưỡng của loài C reinhardtii là thể đơn b i với 17 nhiễm sắc ộ

thể Dưới đ ềi u kiện phát triển lý tưởng, các tế bào có thể trải qua hai hay ba vòng

của sự phân bào giảm nhiễm trước khi các tế bào con cái được giải phóng từ

thành tế bào cũ vào trong môi trường Vì vậy, m i bước phát triểỗ n đơn có th t o ể ạ

ra 4-8 tế bào con cái/ tế bào mẹ Dưới đ ềi u kiện thiếu nitơ, sẽ xuất hiện các thể

giới tính đơn bội gồm hai lo i là mt (+) và mt (-), chúng có th kếạ ể t h p thành ợ

dạng hợp tử lưỡng bội H p t không hình thành lông roi, và nó tồn tạ ởợ ử i dạng

ngủ nghỉ Trong đ ềi u kiện có ánh sáng thích hợp, hợp tử sẽ phân bào giảm nhiễm

thành 4 tế bào đơn bội có lông roi, và bắt đầu lại vòng đời của tế bào sinh dưỡng

(Hình 1.7) Chlamydomonas có khả năng phát tri n d dưỡng nên nó có thể phát ể ị

triển mà không cần quá trình quang hợp

Hình 1.6 Cấu tạo t bào t o Chlamydomonas reinhardtii ế ả

Hình 1.7 Vòng đời của Chlamydomonas

Gần đây, loại tảo này được sử dụng nh mộư t sinh v t mẫậ u nghiên c u ngày ứ

càng nhiều khi bộ gen của chúng đã được công bố hoàn chỉnh trên ngân hàng

gen Sơ đồ (Chlre3) của trình tự bộ gen nhân c a Chlamydomonas được công b ủ ố

bởi Joint Genome Institute - Cục Năng l ng Mượ ỹ bao gồm 1557 đ ạo n tổng cộng

120Mb Trình tự ủ c a tất cả 3 bộ gen C reinhardtii cũng đã được biết đến Bộ gen

ty thể kho ng 15.8 Kb ả được công bố trên cơ ở s dữ ệ li u NCBI B gen hoàn ch nh ộ ỉ

của lục lạp >200 Kb cũng được công bố trên ngân hàng gen [32,66]

1.7.2 Ứng dụng của tảo Chlamydomonas reinhardtii trong công nghệ gen

Như chúng ta đã biết, vi tảo là nhóm đồng nhất giữa sinh v t prokaryot và ậ

eukaryot chiếm 50% sinh vật cố định cacbon trên trái đất và khả năng ng d ng ứ ụ

trong công nghệ sinh học rất lớn Nhiều loại đã được s d ng để t o ra nh ng s n ử ụ ạ ữ ả

phẩm có chứa các thành phần bổ sung dinh dưỡng cao trong thực phẩm, mỹ

phẩm và ứng dụng trong một số quá trình như xử lý nước thải hay tạo phân bón

sinh học Ngoài ra, vi tảo còn được sử dụng làm h th ng m u cho nh ng nghiên ệ ố ẫ ữ

cứu quá trình quang hợp, nghiên cứu chức năng của lông roi, cảm quang, nghiên

cứu tạo hàm lượng dinh dưỡng cao và một số đã được biết đến như là một hệ

thống biểu hiện nhiều loại protein khác nhau trong đó bao g m một sốồ kháng th ể

và những protein ng dụng để chữa bệnh [44,47] ứ

Chlamydomonas reinhartii là loại vi tảo nhân th t được nghiên c u nhi u ậ ứ ề

nhất hiện nay để ứng dụng trong công nghệ sinh học [32,41,47,64] Năm 1945,

chủng C reinhardtii hoang dại dùng trong phòng thí nghiệm C137 (mt+) phân

lập từ một vùng g n Amherst, Massachusetts V i u i m th i gian tái sinh r t ầ ớ ư đ ể ờ ấ

ngắn, vừa dị dưỡng và tự dưỡng không bắt bu c, có th tái t o b ng sinh s n vô ộ ể ạ ằ ả

tính và hữu tính đã khiến C reinhardtii tr thành một sinh vậở t được l a ch n để ự ọ

phục vụ cho các thí nghiệm chọn lọc [66] Năm 1989, loài này được chuyển gen

thành công với việc bổ sung đột biến nit1 và arg7 lần lượt tương ứng v i gen ớ

nitrate reductase và argininosuccinate lyase [19] Chlamydomonas thường được

sử dụng nh mộư t ki u sinh v t m u nghiên c u nh ng v n đề cơ bản trong sinh ể ậ ẫ ứ ữ ấ

học tế bào và sinh học phân tử như: Tế bào chuyển động như thế nào? Tế bào

phản ứng lại với ánh sáng như thế nào? Tế bào nh n ra một tế bào khác như thế ậ

nào? Các tế bào phả ứn ng lại với sự thay đổi về sự thi u h t dinh dưỡng như thế ế ụ

nào như nitrogen, sulfur Cụ thể mộ ốt s nghiên c u v s ti n hoá được làm v i ứ ề ự ế ớ

Chlamydomonas bao gồm s ti n hóa c a s sinh s n h u tính, s nh hưởng c a ự ế ủ ự ả ữ ự ả ủ

các đột biến, và nghiên cứu sự thích nghi với mức độ khác nhau của lượng CO

2-…[66] Ngoài ra, Chlamydomonas là sinh vật duy nhất đến nay mà b gen nhân, ộ

lục lạp và ty thể đều có thể được chuyển gen vào Nó đã trở thành hệ thống biểu

hiện protein tái tổ hợp r t hi u qu , m t s gen được bi u hi n thành công có ấ ệ ả ộ ố ể ệ

ứng d ng trong dược ph m hay công ngh sinh h c nh bi u hi n Avian ụ ẩ ệ ọ ư ể ệ

metallothionein-II, enzyme pyroline-5-carboxylate synthetase, sử dụng làm s ch ạ

môi trường nước có chứa nhiều kim loại nặng bằng tảo hay sử dụng làm th c ự

phẩm bổ sung giàu các nguyên tố vi lượng cần thiết cho động vật hay biểu hiện

protein kháng nguyên Epitope của Rennibacterium salmoninarum- vi khu n gây ẩ

bệnh trong các trang trại nuôi cá hồi hay các protein của virus gây vết trắng trên

tôm đã được biểu hiện trong tế bào Chlamydomonas và được sử dụng nh một ư

loại vaccine ăn được trong nuôi trồng thuỷ ả s n [14,56] Trong lĩnh vực y học, cấu

trúc protein VP1 của virus gây lở mồm long móng ã được n i vớđ ố i ti u ph n B ể ầ

độc tố gây b nh t để kích thích áp ng mi n dịệ ả đ ứ ễ ch nước bọ ằở t b ng cách liên k t ế

thụ thể ở vị trí h ch GM1, kháng th đơn chu i l n bao g m m nh chu i n ng ạ ể ỗ ớ ồ ả ỗ ặ

của IgA nối với vùng biến đổi c a chuỗi nhẹ cũủ ng được bi u hi n thành công ể ệ

trong lạp thể của lo i t o này… [14,49,61] Vì v y, trong tương lai có th ng ạ ả ậ ể ứ

dụng biểu hiện các loại protein chức năng trong tảo C reinhardtii nhằm tạo chế

phẩm đ ềi u trị bệnh c a con người dưới d ng th c phẩủ ạ ự m hay nước u ng r t kh ố ấ ả

quan, tuy nhiên cho đến nay chưa có tài liệu nào nói đến khả ă n ng này [14]

1.8. Phương pháp chuyển gen vào tảo Chlamydomonas reinhardti thông qua

vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Hiện nay, có nhiều phương pháp biến nạp gen áp dụng cho thực vật nói chung

và tảo nói riêng Tuy nhiên những phương pháp có giá trị thực tiễn quan trọng

chỉ hạn ch trong hai phương pháp chính ó là chuy n gen tr c ti p và chuy n ế Đ ể ự ế ể

gen gián tiếp thông qua Agrobacterium tumerfaciens Phương pháp chuyển gen

trực tiếp là k thu t chuy n gen thông qua ti p nh n DNA tinh ch vào t bào ỹ ậ ể ế ậ ế ế

nhờ sự giúp đỡ ủa các phương tiện hoá học hay vật lý Chuyể c n gen tr c ti p bao ự ế

gồm phương pháp vi tiêm (microinjection), phương pháp dùng hoá chất

polyethylene glycon (PEG), phương pháp dùng súng bắn gen (biolistic), phương

pháp biến nạp bằng xung đ ệi n (electrotransporation) và một vài kỹ thuật khác [1]

Tuy nhiên, trong chuyển gen thực vật, phương pháp chuyển gen gián tiếp thông

qua vi khuẩn Agrobacterium được sử dụng r ng rãi và hi u qu nh t để chuy n ộ ệ ả ấ ể

gen ngoại lai vào tế bào thực vật Hiện nay kho ng 80% cây tr ng chuy n gen ả ồ ể

thương mại hoá được tạo ra thông qua phương pháp gián tiếp nhờ Agrobacterium

[5] Giống như chuyển gen vào thực vật, vi tảo nói chung và tảo C reinhardtii

nói riêng cũng áp dụng các kỹ thuật chuyển gen trên, tuy nhiên hiện nay còn rất ít

nghiên cứu chuyển gen ngoại lai vào C reinhardtii thông qua A tumefaciens

1.8.1 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩ n Gram âm, thu c chi Agrobacterium, ộ

họ Rhizobiaceae, thuộc nhóm vi khu n y m khí Chi Agrobacterium gồm 4 loài, ẩ ế

trong đó A tumefaciens được sử dụng nhi u nh t cho vi c chuy n gen Vi c s ề ấ ệ ể ệ ử

dụng A tumefaciens đã bắt đầu từ 1907, khi người ta phát hiện vi khuẩn này có

khả năng t o nên kh i u cây hai lá m m b thương được g i là kh i u c rễ ạ ố ở ầ ị ọ ố ổ

Trong những năm bảy mươi người ta tìm thấy trong các chủng A tumefaciens tạo

khối u có một plasmid rất lớn có kích thước 200 đến 800 kb Plasmid này cần

thiết cho việc tạo kh i u Vì v y, plasmid này được g i là Ti-plasmid (tumor ố ậ ọ

inducing-plasmid) Ti- plasmid có khả năng chuy n m t s gen chúng mang vào ể ộ ố

tế bào chủ, đây là hiện tượng chuyển gen tự nhiên Sau những khám phá về khả

năng xâm nhiễm và chuyển một đ ạn T- DNA của Ti- plasmid, chúng đã trở o

thành một công cụ ấ ữ r t h u hiệu trong công ngh gen th c v t [5,6] ệ ự ậ

Agrobacterium có 3 thành phần di truy n c n thi t cho quá trình v n chuy n ề ầ ế ậ ể

gen:

- Vùng T-DNA : là đ ạo n DNA chuyển từ vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào

chủ Đặ đ ểc i m của vùng này là xâm nhập ổn định vào bộ gen tế bào chủ, không

mã hoá cho các sản phẩm trợ giúp quá trình biến nạp, độ dài thay đổi khác nhau

ở các Ti- plasmid t nhiên và mang r t nhi u gen có th bi u hi n được [6] ự ấ ề ể ể ệ

- Vùng gây độc Vir (virulence region): gồm 24 gen vir được sắp x p trong 8 ế

operon từvirA đến virH, m i operon chứa mộỗ t s gen Vùng Vir có vai trò kích ố

thích việc biến nạp của T- DNA [20,29]

- Nhiễm sắc thể (NST) của Agrobacterium: Vùng Vir có vai trò chủ yếu trong

quá trình biến nạp T-DNA, tuy nhiên NST của vi khuẩn cũng rất cần thiết đối với

quá trình này Chúng tác dụng lên bề mặ ủ ết c a t bào vi khu n, c th giúp t o ra ẩ ụ ể ạ

exopolysaccarid, chế biến và bài tiết ra ngoài (pscA/exoC, chvA, hvB) đồng thời

gắn vi khuẩn vào tế bào chủ (tt gens)… [29]

1.8.2 Cơ chế chuyển gen của Agrobacterium tumefaciens

Quá trình chuyển T-DNA được bắt đầu vịở trí biên ph i và kếả t thúc vị trí ở

biên trái Đ ạo n T-DNA mang gen mong muốn được chuyển, trước tiên nó phải

được hoạt hoá nh ho t động c a các gen vir Hi n tương này x y ra khi A ờ ạ ủ ệ ả

tumefaciens bắt đầu ti p xúc v i h p ch t ch a phenol được tiết ra từ vết thương ế ớ ợ ấ ứ

của cây hoặc các tế bào nuôi cấy Khi nh n được các phân t tín hi u t vết ậ ử ệ ừ

thương như hợp ch t phenolic (cacbolic acid), acetosyringone (AS), hydro ấ

acetosyringone (OH-AS), flavonoid…, làm dẫn dụ Agrobacterium gắn vào thành

tế bào chủ Trong quá trình tiếp xúc, vi khuẩn tạo ra các sợi cellulose và các sợi

này kết tụ thành bó gắn lên bề mặ ết t bào ch Quá trình này làm c m ng và ủ ả ứ

hoạt hoá các gen vùng vir Sự biểu hiện gen vir tạo các sản phẩm protein của các

gen này có hai chức năng chính: 1, cắt đứt bờ trái và bờ phải để giải phóng

T-DNA 2, bao bọc và vận chuyển T-DNA vào tế bào chủ và tiếp cận với bộ gen tế

bào chủ ộ m t cách an toàn [21]

1.8.3 Hệ th ng vector dùng trong chuyển gen ố

Hiện nay người ta đã thành công trong việc cải biến Ti- plasmid bằng cách

cắt bỏ hầu h t các o n gen gây phát tri n kh i u ch để lạ đ ạế đ ạ ể ố ỉ i o n vir và ph n T-ầ

DNA tối thiểu mang đ ểi m ghép gen Có hai họ vector dùng trong biến nạp thông

qua Agrobacterium tumefaciens:

Vector liên hợp (cointegrate): là một vector Ti mang một số đ ạ o n ch c n ng ứ ă

của một vector thông thường khác của E coli Một vector liên h p g m các phần ợ ồ

sau:

- Một vị trí thích hợp cho phép ghép n i các o n gen quan tâm, thường là có ố đ ạ

nguồn gốc từ một plasmid của vi khuẩn E coli

- Gen chỉ thị có tính kháng kháng sinh để chọn lọc hoạt động được được trong

E coli và A tumefaciens

- Gen chọn lọc hoạt động được ở ế t bào th c v t ự ậ

- Mộ đ ạt o n khởi đầu c a E coli, không ho t động ở Agrobacterium ủ ạ