Nghiên ứu biểu hiện và đặ tính ủa enzyme lp (latex learing protein) tái tổ hợp

Sau nh ng phát hiện ban đầ ềữ u v chủng vi sinh v có khật ảnăng phân hủy cao su thiên nhiên, các nghiên c u ứ đã dầ đi sâu hơn n vào các enzyme thi t yế ếu tham gia vào con đường phân gi

TRƯỜ NG Đ Ạ I H C BÁCH KHOA HÀ N I Ọ Ộ

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGUYỄ N TH THÚY NGÂN Ị Ngành: Công nghệ sinh học

Giả ng viên hư ớ ng dẫn: PGS.TS Nguyễ n Ti n Dương ế

Viện: Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm

HÀ N I - 2020 Ộ

Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17061132226361000000

1

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên c u khoa hứ ọc do chính tôi thực hiện dướ ự ới s hư ng d n c a PGS TS Nguyẫ ủ ễn Lan Hương Các số ệ li u s d ng ử ụphân tích trong luận văn có nguồn gốc rõ ràng, theo đúng quy định Các k t qu ế ảnghiên c u trong ứ luận văn do tôi tự thực hi n, tìm hi u, phân tích mệ ể ột cách trung thực và chưa từng được công b ố dưới b t k hình thấ ỳ ức nào

Tôi xin chịu trách nhi m v nghiên c u c a mình ệ ề ứ ủ

Tác gi ả

Nguy n Th Thúy Ngân ễ ị

2

L I C Ờ ẢM ƠN

Để hoàn thành nhi m v ệ ụ được giao của đề tài, ngoài s c gự ố ắng học hỏi

c a b n thân còn có s ủ ả ự hướng d n t n tình c a thẫ ậ ủ ầy cô và s ự giúp đỡ độ ng viên của người thân và b n bè ạ

Tôi xin chân thành cảm ơn tới PGS TS Nguyễn Lan Hương – ộ B môn Công nghệ Sinh học, Vi n Công nghệ ệ Sinh học & Công nghệ Thực phẩm đã hướng d n và chẫ ỉ ả ậ b o t n tình cho tôi trong su t quá trình hố ọ ậc t p, nghiên c u và ứhoàn thành tài nghiên cđề ứu này Tôi cũng xin gử ời l i cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Daisuke Kasai Khoa K– ỹ thu t Sinh hậ ọc, Trường Đại học Công nghệ Nagaoka, Nhật Bản cùng các thầy cô giáo của Trường Đại học Bách Khoa Hà

N i (HUST) ộ và Đạ ọi h c Công nghệ Nagaoka (NUT), Nhật Bản đã hỗ ợ tr tôi v ề

ki n thế ức chuyên môn, thủ ụ t c hành chính

Bên cạnh đó, gia đình và bạn bè luôn luôn là động lực, đặc bi t là các anh ệchị và b n làm vi c t i phòng thí nghi m Trung tâm khoa h c và công nghạ ệ ạ ệ ọ ệ cao

su, HUST và phòng thí nghi m Kệ ỹ thuật vi sinh môi trường, NUT đã giúp đỡ tôi

r t nhi u trong su t quá trình hấ ề ố ọ ậc t p, nghiên c u và hoàn thành luứ ận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn dự án GAICEE c a AUN/SEED-net ủ và đề tài nghiên cứu cơ bản KHKT v i mã s 106.04-2017 c a qu NAFOSTED thu c B ớ ố ủ ỹ ộ ộKhoa học và Công nghệ là ngu n hồ ỗ ợ tài chính cho đề tr tài nghiên c u này ứ

Hà N i, ngày 17 ộ tháng 11 năm 2020 Học viên

Nguy n Thễ ị Thúy Ngân

3

TÓM TẮT

D a trên tự ốc độ phát tri n chóng mể ặ ủt c a cu c s ng hiện đạ ự gia tăng ộ ố i, s nhanh các v t li u, s n phậ ệ ả ẩm có ngu n gồ ốc cao su thiên nhiên là nguyên nhân chính gây ra một lượng phế thải ra ngoài môi trường Do đó, quản lý chất thải đóng một vai trò quan tr ng trong chu trình s n xu t và tiêu thọ ả ấ ụ ả s n phẩm cao su Mặc dù hỏa thiêu hay chôn l p là nhấ ững phương pháp truyền thổng phổ ế bi n nhưng thường tiêu t n nhiố ều năng lượng, thời gian, di n tích và có thệ ể ẫn đế d n nhiều căn bệnh đặc hữu khác Vì v y, nhậ ững nghiên c u ng d ng công nghứ ứ ụ ệsinh học vào xử lý chất thải cao su dần được chú tr ng nhọ ằm hướng t i mớ ột giải pháp b n về ững hơn Sau nh ng phát hiện ban đầ ềữ u v chủng vi sinh v có khật ảnăng phân hủy cao su thiên nhiên, các nghiên c u ứ đã dầ đi sâu hơn n vào các enzyme thi t yế ếu tham gia vào con đường phân gi i N i b t trong s ả ổ ậ ố đó là Latex clearing protein (Lcp) v i vai trò là ớ enzyme oxi hóa bước đầu Nhằm đóng góp thêm vào hệ thống thông tin v ề Lcp như mộ ựt l a chọ ứn ng dụng trong tương lai,

đề tài này hướng t i nghiên c u khớ ứ ả năng biểu hi n Lcp tái tệ ổ hợp t ừRhodococcus sp E2 và Nocardia farcinica NBRC 15532 và xác định mộ ố đặt s c tính nhằm nâng cao hi u qu xệ ả ử lý cao su thiên nhiên

c m

Để đạt đượ ục tiêu c a nghiên c u, gen mã hóa Lcp ủ ứ được tách dòng t ừchủng t nhiên ự Rhodococcus sp E2 và N farcinica NBRC 15532, bi n nế ạp vào chủng bi u ể hiện Escherichia coli BL21(DE3) S bi u hi n c a hai gen ự ể ệ ủ lcps này trong E coli BL21(DE3) được nghiên c u v i s có mứ ớ ự ặ ủa môi trườt c ng chọn lọc chứa ampicillin (Ap), chấ ả ứt c m ng IPTG, nhiệt độ ả c m ứng 15 oC Sau đó,protein Lcp được thu nhận bằng phương pháp siêu âm phá tế bào r i tinh sạch ồ

b ng s c kí ái l c c t coban Nghiên c u s dằ ắ ự ộ ứ ử ụng các phương pháp điệ n di gel natri dodecyl sulfate polyacrylamide (SDS-PAGE) ki m tra để ể trọng lượng phân

t protein, nhuử ộm Schiff, s c ký l gel (GPC) làm rõ khắ ọc để ả năng phân hủy cao

su và điện c c oxi ự đo hoạt độ ủa Lcp cũng như khả c o sát ảnh hưởng c a ion kim ủloại, pH, nhiệt độ ới ho t ạt độ riêng c a enzyme ủ

Kết qu nghiên cứu đã chứng minh gen lcps Rhodococcus ả t ừ sp E2 và N farcinica NBRC 15532 có trong lượng phân t xử ấp xỉ 46 kDa, được bi u hiện ểthành công trong E coli BL21(DE3) v i ho, ớ ạt độ riêng lần lượt là 0,65 U/mg và 0,625 U/mg Theo k t qu ế ả nhuộm Schiff và phân tích GPC, Lcp có khả năng

4

phân hủy cao su thiên nhiên thành hỗn hợp các oligoisoprene chứa nhóm aldehyde hoặc ketone Bên c ạnh đó, khi tham gia vào phả ứn ng phân hủy cao su tách protein, Lcp hoạt động tối ưu ở pH 7,5, nhiệt độ 35 oC và b c chị ứ ế khi có

mặ ủt c a mộ ốt s ion kim lo Nhìn chung, nhại ững d li u ữ ệ này đã bước đầu hỗ ợ tr xây dựng phương án ứng d ng các Lcp tái t hụ ổ ợp tham gia vào hệ thống xử lý chất thải cao su thiên nhiên

Học viên

Nguy n Thễ ị Thúy Ngân

5

M C L C Ụ Ụ

LỜI CAM ĐOAN 1

L I C Ờ ẢM ƠN 2

TÓM TẮT 3

M C L Ụ Ụ C 4

DANH M C B Ụ Ả NG 7

DANH M C HÌNH V Ụ Ẽ 8

DANH M Ụ C Ừ VIẾT TẮT 9 T M Ở ĐẦ U 10

CHƯƠNG 1 TỔ NG QUAN 11

1.1 T ng quan v cao ổ ề su 11

1.1.1 Ngu n gồ ốc c a cao su thiên nhiênủ 11

1.1.2 Đặc tính cao su thiên nhiên 11

1.1.3 Tình hình s n xu t, tiêu thả ấ ụ cao su tại Vi t Nam ệ 13

1.2 Các phương pháp xử lý chất thải cao su thiên nhiên 14

1.2.1 Phương pháp nhiệt phân 14

1.2.2 Phương pháp chôn lấp 14

1.2.3 Phân hủy cao su bằng phương pháp sinh học 15

1.3 Latex clearing protein (Lcp) 17

1.3.1 Tổng quan và con đường phân hủy poly (cis-1,4-isoprene) được đề xu t v i s tham gia c a Lcp ấ ớ ự ủ 17

1.3.2 Những nghiên c u v enzyme Lcp tái t hứ ề ổ ợp trong và ngoài nước 19 CHƯƠNG 2 VẬ T LIỆU, PHƯƠNG PHÁP 22

2.1 Vậ ệt li u 22

2.1.1 Chủng gi ng, plasmitố , môi trường nuôi c y ấ 22

2.1.2 Hóa chất 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Sơ đồ nghiên c u ứ 23

2.2.2 Phương pháp phân tích 23

2.2.3 Tiến trình thí nghi m ệ 27

CHƯƠNG 3 KẾ T QU VÀ TH Ả Ả O LUẬN 29

3.1 Biểu hi n gen ệ lcps t ừ Rhodococcus sp E2 và Nocardia farcinica NBRC 15532 trong E coli BL21(DE3) 29

6

3.2 Khảo sát mộ ố đặt s c tính c a enzyme Lcpủ E2 và LcpNBRC15532 31

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng c a nhiủ ệt độ và pH đến hoạt độ riêng của LcpE2 và LcpNBRC15532 313.2.2 Khảo sát ảnh hưởng c a ion kim loủ ại đến hoạt độ riêng của LcpE2 và LcpNBRC 15532 333.2.3 Phân tích s n phả ẩm phân hủy poly (cis-1,4-isoprene) b ng GPCằ

34

CHƯƠNG 4 KẾ T LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37

4.1 Kết lu n 37ậ4.2 Kiến nghị 37

PHỤ LỤC 38 TÀI LI U THAM KH Ệ Ả O 39

7

Bảng 1: Di n tích, sệ ản lượng và năng suất cây cao su t i Vi t Nam 14 ạ ệBảng 2: Chủng, plasmits và oligonucleotide 23 Bảng 3: Môi trường nuôi c y và dung dấ ịch đệm 23 Bảng 4 Dung d: ịch trong phương pháp SDS-PAGE 26

8

Hình 1.1 Công thức hóa học đơn phân isoprene của cao su 11Hình 1.2 Cấu trúc mạng lưới cao su thiên nhiên 12Hình 1.3 D ự đoán con đường phân gi i poly(ả cis-1,4-isoprene) c a vi khuủ ẩn G polyisoprenivorans VH2 v i s tham gia c a Lcp d a trên phân tích genome và ớ ự ủ ự

đột bi n gen 18ế

Hình 3.1 Kết quả SDS-PAGE xác định kích thước enzyme Lcp 29Hình 3.2 Hoạt độ ủ c a enzyme LcpE2 và LcpNBRC15532 được xác định bằng phương pháp đo độ tiêu thụ oxi 31Hình 3.3 Khảo sát ảnh hưởng c a nhiủ ệt độ đế n hoạt độ riêng c a enzyme Lcp 32ủHình 3.4 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt độ ủ c a enzyme Lcp 32Hình 3.5 Ảnh hưởng c a ion kim loủ ại đến hoạt độ riêng c a enzyme Lcpủ NBRC15532 33Hình 3.6 Ảnh hưởng c a ion kim loủ ại đến hoạt độ riêng c a enzyme Lcpủ E2 33Hình 3.7 Phân tích GPC phổ ả s n phẩm phân hủy poly(cis-1,4-isoprene) sau khi phả ứn ng v i Lcps trong 24 gi ớ ờ 34Hình 3.8 Ki m tra khể ả năng phân hủy DPNR c a Lcp tái t hủ ổ ợ ừp t Rhodococcus

sp E2 và N farcinica NBRC 15532 b ng thu c nhu m Schiff.ằ ố ộ 35

9

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DPNR Deproteinised Natural Rubber Cao su tách protein

MALDI-TOF Matrix assisted laser

desorption ionization-time of flight mass spectrometry

Phép đo khối phổ thời gian bay / thời gian ion hóa bằng tia laser

hỗ ợ tr quang phổ

SDS-PAGE Sodium

dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis

Đ ệi n di gel natri dodecyl sulfate polyacrylamide

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ng chu i polymerase ứ ỗ

10

M Ở ĐẦ U

Cao su thiên nhiên (NR) đã trở thành polyme có giá trị thương phẩm cao

t ừ hàng trăm năm nay và trở thành v t li u quan tr ng trong ngành công nghi p ậ ệ ọ ệ

s n xuả ất găng tay, ăm ốs l p Bên c nh nhạ ững vai trò không thể thay thế ủ c a NR trong đờ ống con người s i, một lượng l n các s n phớ ả ẩm cao su đã qua sử ụ d ng được thải ra môi trường hằng năm đã gây các tác động xấu đến môi trường sinh thái Những phương pháp xử lý truy n thống như hỏa thiêu ho c chôn lề ặ ấp thường gây ra các chất ô nhi m thễ ứ ấp Do đó, c nh ng nghiên c u ng d ng công nghữ ứ ứ ụ ệsinh học vào xử lý chất thải cao su trong những năm gần đây được thực hiện nhiều hơn nhằm hướng đến một hệ sinh thái b n về ững Nhánh nghiên c u này ứkhông chỉ ừ d ng lại ở những phát hi n v ệ ề chủng vi sinh v t có khậ ả năng phân hủy cao su thiên nhiên mà còn đi sâu hơn nữa là các thông tin quan tr ng v ọ ề các enzyme thi t yế ếu tham gia vào con đường phân gi i cao su c a vi sinh v t Trong ả ủ ậ

đó, enzyme nhận đượ ực s quan tâm của đông đảo các nhà khoa học là Lcp với vai trò là enzyme oxi hóa bước đầ trong con đườu ng phân hủy NR Đặc bi t khi ệ

có s phát tri n cự ể ủa các kĩ thuật sinh học phân t , tiử ềm năng của Lcp tái t hổ ợp

có ngu n gồ ố ừc t nhi u nhóm vi sinh v t khác nhau trong ng d ng xề ậ ứ ụ ử lý chất thải cao su thiên nhiên đã dần được làm sáng tỏ Để đóng góp thêm vào hệ thống thông tin v ề Lcp như mộ ựt l a chọ ứn ng dụng trong tương lai, đề tài “ Nghiên cứu biểu hiện và đặc tính c a enzyme Lcp (Latex clearing protein) tái t h ủ ổ ợp” đã

được ti n hành ế

M c tiêu chính c ụ ủa đề tài:

- Thu nhậ và xác định đượn c mộ ố đặt s c tính c enzyme tái t hủa ổ ợp Lcp t ừ N farcinica NBRC 15532 và Rhodococcus sp E2

N i dung c ộ ủa đề tài:

- Biểu hi n gen lcps t ệ ừ Rhodococcus sp E2 và N farcinica NBRC 15532 trong

E coli BL21(DE3)

- Khảo sát mộ ố đặt s c tính c a enzyme LcpE2 và LcpNBRC15532 ủ

11

1.1 T ổ ng quan v cao ề su

1.1.1 Nguồn gốc của cao su thiên nhiên

Trong 100 năm qua, cao su thiên nhiên (NR) đã được ứng d ng r ng rãi ụ ộvới hơn 100.000 loạ ải s n phẩm do những đặc tính quan trọng như tính đàn hồi, chịu ma sát, chịu nén [1] Cao su thiên nhiên là lo i v t liạ ậ ệu được sản xuấ ừt t

mủ cây cao su (Hevea brasiliensis) c a hủ ọ Đạ i kích (Euphorbiaceae) NR lần đầu tiên được phát hi n và s d ng vào thệ ử ụ ế ỷ k 16 t i Nam M ạ ỹ sau đó nó được đem gieo tr ng t i Anh và phát tri n mồ ạ ể ạnh t i khu v c châu Âu Tuy nhiên cao su ch ạ ự ỉđược s d ng phổ ến khi quá trình lưu hóa đượử ụ bi c các nhà khoa học tìm ra vào năm 1839 [2] Lúc này người ta đã biến mủ cao su d ng l ng thành d ng khạ ỏ ạ ố ới v i

độ đàn hồi cao hơn Ngày nay, cao su được tr ng chồ ủ ế y u ở các nước châu Á như Thái Lan, Malaysia, Vi t Nam, Philipin, ệ Ấn Độ và Trung Quốc Theo thống kê

c a Hi p hủ ệ ội Các nước S n xu t Cao su t nhiên (ANRPC), sả ấ ự ản lượng NR trên thế ới đạ gi t 13,80 tri u tệ ấn vào năm 2019 Sản lượng d ki n s ự ế ẽ tăng 2,7% lên 14,177 tri u tệ ấn vào năm 2020 [3]

1.1.2 Đặc tính cao su thiên nhiên

Mủ cao su thiên nhiên là dạng nhũ tương bao gồm 3 đơn vị trans-isoprene

ở một đầu c a phân t , ti p theo là vài ủ ử ế trăm đến vài nghìn đơn vị cis-isoprene [4] Bên cạnh 25-35% (wt/wt) polyisoprene, mủ cao su còn chứa 1-1,8% (wt/wt) protein; 1-2% (wt/wt) carbohydrates; 0,4-1,1% (wt/wt) chất béo trung tính; 0,5-0,6% (wt/wt) chất béo phân c c; 0,4-0,6% (wt/wt) ự chất vô cơ; 0,4% (wt/wt) amino acids, amides, ; và 50-70% (wt/wt) nước v i các chớ ất huy n phù có khề ối lượng khoảng 106 Da [5-7]

Hình 1.1 Công th c hóa hứ ọc đơn phân isoprene của cao su [2]

12

Polyme tạo thành được bao phủ ớ b i mộ ớp protein và lipit, có đườt l ng kính t 3 ừ

đến 5 m Lμ ớp này ngăn cách các phân tử cao su k nư c vỵ ớ ới môi trường ưa nước Bởi vì mộ ố ạt s lo i protein có khả năng gây dị ứ ng nên công nghệ ạ ỏ lo i b protein đã được phát tri n và tể ạo ra các s n phả ẩm cao su tách protein (DPNR)

Hình 1.2 C u trúc mấ ạng lưới cao su thiên nhiên [8]

Theo mô phỏng trong hình 1.2, các k t nế ối chu i khác nhau d n n s ỗ ẫ đế ựhình thành c a c u trúc mủ ấ ạng nhánh, hình sao và mạng, được gọi là “mạng t ựnhiên” Cấu trúc vi mô độc đáo này mang lại các đặc tính cơ học c a cao su t ủ ựnhiên, bao gồm khả năng phục hồi, đàn hồi, độ ề b n kéo, chống mài mòn và va

đập, phân tán nhiệt hiệu qu và d uả ễ ốn ở nhiệt độ thấp mà cao su t ng hổ ợp không thể sánh được [9] Polyisoprene t ng h ổ ợp có thể đượ ảc s n xu t v i các tính chấ ớ ất vật lý tương tự như cao su tự nhiên với độ tinh khi t t 98-99% Tuy nhiên, ế ừ độ

ổn định ng su t, khứ ấ ả năng xử lý và các thông s khác c a polyisoprene t ng hố ủ ổ ợp

v n kém ẫ hơn so với cao su t nhiên [10] Trên thự ự ếc t , cao su isoprene t ng hổ ợp được s n xu t thông qua quá trình trùng hả ấ ợp hóa họ ủa isoprene, thu đượ ừc c c t phần naphtha c a d u mủ ầ ỏ Cho đến nay, các lo i cao su t ng hạ ổ ợp khác nhau là cao su styren-butadien (SBR), acrylonitrile-butadien đồng polyme (NBR latex), ethylene-vinyl clorua đồng polyme (EVCL), polybutadiene, polychloroprene [11]

13

1.1.3 Tình hình sản xuất, tiêu thụ cao su tại Việt Nam

Ở Vi t Nam, cây cao su được tr ng t ệ ồ ừ năm 1897 Đến nay, di n tích tr ng ệ ồcây cao su được mở ộng và đượ ồ r c tr ng trên khắ ả ớp c nư c [12] Di n tích, sản ệlượng và năng suất cây cao su không ngừng tăng từ 2010 đến 2014 và được duy trì ổn định Cho đến ngày nay Việt Nam đã giữ mức năng suất bình quân 1,6 –1,7 tấn/ha/năm trong 9 năm liên tụ ể ừ 2009, đây là mức k t c cao nhấ ạt t i khu vực châu Á và thứ hai trên thế ớ gi i trong những năm gần đây Năm 2013, Việt Nam

đã vươn lên đứng thứ ba v sề ản lượng cao su thiên nhiên Năm 2017, Việt Nam tiế ụp t c duy trì v trí này v i sị ớ ản lượng 1.094.500 t n trên di n tích 969.700 ha và ấ ệxuất khẩu 1.395.000 tấn đế hơn 80 thị trườn ng, chi m kho ng 12% thế ả ị phần thế giới, chỉ sau Thái Lan (38%) và Indonesia (27%) [13]

Bảng 1: Di n tích, sệ ản lượng và năng suất cây cao su t i Vi t Nam [14] ạ ệ

(ha)

DT thu ho ch ạ (ha)

Sản lượng (tấn)

Năng suấ t (kg/ha/năm)

s n phả ẩm gỗ cao su c a ngành công nghi p chủ ệ ế ến, đã đạ bi t 4,847 t ỷ USD năm

2016, đóng góp 2,7% vào tổng kim ngạch xu t khấ ẩu c a c nưủ ả ớc và vượt mức 5

t ỷ USD trong năm 2017 [14] Bên c nh nhạ ững l i ích mà cao su mang l i, nó ợ ạcũng gây ra những ảnh hưởng nghiêm tr nọ g đến môi trường Theo ước tính, mỗi

14

năm nước ta thải ra kho ng 400.000 t n cao su phả ấ ế ệu (tương đương vớ li i 30.000

t n/tháng) [15]ấ

1.2 Các phương pháp x lý ch t th i cao su thiên nhiên ử ấ ả

Thông thường, các s n phả ẩm cao su có tu i thổ ọ cao và c n một thời gian ầ

rất dài để phân hủy t nhiên do thành phần phứ ạ ủự c t p c a chúng, bao gồm lưu huỳnh và chất chống oxy hóa [16] Hiện nay, trên thế ới, các phương pháp xử gi

lý chất thải NR chủ ế y u là nhi t phân, chôn l p và ệ ấ ứng d ng công nghụ ệ sinh học

1.2.1 Phương pháp nhiệt phân

Nhi t phân là mệ ột phương pháp quản lý chất thải phổ ến đã đượ ử bi c s dụng để xử lý chất thải cao su b ô nhi m Quá trình nhi t phân l p xe cao su ph ị ễ ệ ố ếthải xu t hi n tấ ệ ại nhà máy Waste Gen (Anh) vào năm 1989 và nhà máy tại Hamburg (Đức) vào năm 2002 Sau đó quá trính nhiệt phân l p xe cao su phố ếthải xu t hiấ ện ở nhiều nước như Thụy S , M , Nga, Ucraina, Ấn Độ và nhi u ỹ ỹ ềnướ khác Phương pháp này thường đượ ực c l a chọn do có thể ạ ỏ lo i b chất thải hiệu qu và ti t ki m thời gian Song, một trong những nhược điểm c a nó là yêu ả ế ệ ủ

c u nhiầ ệt độ cao (ít nhất 850 °C) để chuy n v t li u thể ậ ệ ải thành tro, khí và nhi t ệNgoài ra, nó thải ra một lượng lớn carbon dioxide và các khí độc khác, các hợp chất lưu huỳnh, hydrocacbon và ôxít cacbon và nitơ, do đó sẽ gây ô nhi m môi ễtrường và dẫn đến s nóng lên toàn c u [17] Các ự ầ chất ô nhi m có thễ ể được thu hồi khi s dử ụng lò đốt có kiểm soát Tuy nhiên, đây không phải là một quá trình đơn giản Thi t k phế ế ứ ạc t p của lò đốt được yêu cầu để ểm soát lượ ki ng khí thải

và cần được trang b máy lị ọc để i b các chloạ ỏ ất gây ô nhiễm như clo Khí thải clo thường đến t viừ ệc đốt các s n phả ẩm cao su phế thải và phế ệ li u có chứa polyme cloropren Bên cạnh đó, người ta đã báo cáo rằng gần như tấ ảt c các lo i ạcao su khác nhau đều có chứa các chấ ỏng như muội than, đất l t sét, cacbonat canxi ho c các hặ ợp chất silica ngậm nước Khi đốt, chúng t o ra tro, có thạ ể chứa kim lo i nạ ặng Điều này ngụ ý rằng đốt cao su phế ệ li u không phải là mộ ựt l a chọn tốt để ử x lý chất thải cao su [18]

1.2.2 Phương pháp chôn lấp

Săm, lốp, gang tay, các v t d ng y t và các lo i rác thậ ụ ế ạ ải cao su tương tự

l n trong rác thẫ ải sinh ho t t các hạ ừ ộ gia đình s ẽ được chuyên chở ớ t i các bãi rác

đã được xây dựng trước để ế ti n hành chôn l p Công nghấ ệ này tuy đơn giản, chi

15

phí xử lý thấp nhưng thời gian phân hủy trong đất chậm (phân hủy hoàn toàn mất kho ng 50-ả 80 năm) do đó đòi hỏi di n tích s dệ ử ụng đấ ớt l n nên chi m nhiế ều đất đai trồng tr t M t khác, viọ ặ ệc đổ ố l p xe và các chất thải cao su r n khác ra ngoài ắtrờ ạo điềi t u ki n thích hợp cho s sinh s n cệ ự ả ủa các loài côn trùng và động vật gặm nhấm không mong mu n, có thố ể ẫn đế d n các bệnh đặc hữu khác nhau Người ta ước tính rằng vào năm 2011 trong tổng s l p xe phố ố ế thải đượ ạc t o ra trên toàn c u, chầ ỉ 5% được xu t khấ ẩu để chế ế bi n tiếp, 7% được tái chế tại chỗ và 11% được đốt để làm nhiên li u, trong khi 77% còn l i mệ ạ ỗi năm được đổ ấ ợ b t h p pháp, tích lũy hoặc b lo i b ị ạ ỏ trong đất [19] Hơn nữa, do mực nước bi n dâng ểcao và diện tích đất toàn c u ngày càng gi m, nên chôn l p không phầ ả ấ ải là phương pháp phù hợp

1.2.3 Phân hủy cao su bằng phương pháp sinh học

1.2.3.1 Phân hủy cao su bằng vi sinh vật

Cho đến nay, mộ ốt s loài vi khuẩn đã được phân l p do khậ ả năng phân hủy poly (cis-1,4- isoprene), bao g m c cao su t nhiên và cao su t ng hồ ả ự ổ ợp Vi khu n phân hẩ ủy cao su có thể được tách thành hai nhóm, tùy thu c vào con ộđường phân hủy cao su c a chúng ủ

Đầu tiên, s phát tri n c a các vi sinh v t phân gi i cao su dự ể ủ ậ ả ẫn đến s hình ựthành vòng sáng có thể nhìn thấy xung quanh các khu n l c khi nuôi c y trên môi ẩ ạ ấtrường thạch đặc có chứa cao su Ki u hình vòng sáng là k t qu c a vi c ti t ra ể ế ả ủ ệ ếcác enzym phân gi i cao su Các enzym này khu ch tán vào thả ế ạch và phân cắt ngoại bào polyme thành các s n phả ẩm có kích thước phân t ử thấp hơn, cũng là polyisopren hầu như không hòa tan, có thể đượ ếc t bào hấp thụ và s dử ụng như một nguồn cacbon và năng lượng Các đạ ệi di n mạnh nhất trong nhóm này là các chủng thu c v các chi ộ ề Micromonospora Actinoplanes Streptomyces , , nhưS.coelicolor 1A, S.griseus 1D, Streptomyces sp K30, hoặc Xanthomonas sp.35Y and Rhizobacter gummiphilus NS21 [20-23]

Nhóm thứ 2 điển hình là các chủng Gordonia polyisoprenivorans VH2 (G polyisoprenivorans VH và Kd2, G westfalica Kb2, N farcinica E1 và NVL3, 2)Nocardia nova SH22a, và Rhodococcus rhodochrous RPK1(R rhodochrous RPK1) không t o thành các vòng sáng khi nuôi ạ trên môi trường đặc [24-29] Do

đó, để nh n biậ ết được s phân hự ủy cao su, các ch ng này ủ thường được ti p xúc ế

16

v i các miớ ếng cao su trong môi trường lỏng, khi đó sẽ có s k t dính c a quự ế ủ ần thể vi sinh v t trên b mậ ề ặt cao su và s dử ụng các phương pháp phân tích tiếp theo

để chứng minh khả năng phân hủy

Vai trò c a vi sinh v t trong quá trình phân gi i là gi i phóng các enzym ủ ậ ả ả

để oxi hóa các chu i polyisoprene thành các phân t ỗ ử nhỏ và các s n phả ẩm này được hấp thu vào các t ếbào để ử s d ng là mụ ột nguồn cacbon và năng lượng Các

s n phả ẩm cu i cùng c a quá trình này là COố ủ 2, H2O và các s n phả ẩm phụ chúng

có thể được s d ng b i các loài vi sinh v khác [4][30] Tuy nhiên, m t s khó ử ụ ở ật ộ ốkhăn gặp phải khi s d ng vi sinh v t phân hử ụ ậ ủy cao su đã được đề xu t Thông ấ thường, s phát tri n c a vi khu n s d ng cao su t nhiên làm ngu n cacbon ự ể ủ ẩ ử ụ ự ồ

di n ra trong mễ ột thời gian dài Quá trình phân hủy sinh học kéo dài hàng tuần

ho c thặ ậm chí hàng tháng để đạt được đủ khối lượng t bào ho c s n phế ặ ả ẩm phân

c t c a polyme Th i gian phát tri ít nhắ ủ ờ ển ất 4-6 tuần đố ới v i chủng G wesfalica Kb1 [31] và Bacillus sp S-10 [32] hoặc lên t i 10-12 n vớ tuầ ới Streptomyces coelicolor 1A [4], Thermomonospora curvata E5 [26] hay Streptomyces sp K30 [22] Ngoài ra, nhi u s n phề ả ẩm cao su khác nhau có ch a các chứ ất phụ gia độc hại đối v i vi sinh v [33]ớ ật Các chất phụ gia này có thể thúc đẩy hoặc c chứ ế quá trình phân hủy các s n phả ẩm cao su b ng vi sinh v t [34]ằ ậ

1.2.3.2 Phân hủy cao su thiên nhiên bằng enzyme

Để ểu đượ hi c s phân c t các mự ắ ạch cao su và phân h y nó thành các sủ ản phẩm trung gian b i các t bào vi khuở ế ẩn, điều c n thi t là quan sát vai trò c a các ầ ế ủenzym quan trọng tham gia bước đầu vào quá trình phân hủy sinh học cao su Cho đến nay, hai lo i enzyme phân hạ ủy cao su nổ ậi b t nhất là Rubber oxygenase

A (RoxA) và Lcp [35]

RoxA là một enzym ngoại bào được phát hi n t ệ ừ canh trường nuôi c y ấchủng Xanthomonas sp 35Y v i s có mớ ự ặt của cao su Cho đến nay, chưa protein nào có c u trúc phân t ấ ử tương đồng RoxA được phát hiện ở các loài vi khuẩn Gram dương [36] Tính chất hóa sinh của RoxA đã được phân tích in vitro khi nuôi c y ấ Xanthomonas sp 35Y trong môi trường mu i khoáng chố ứa cao su t ừ7-9 ngày Phân t khử ối ước tính c a RoxA kho ng 65 kDa và hủ ả ấp thụ ở bướ c sóng 406 nm [21] Enzyme RoxA phân gi i c NR và poly( ả ả cis-1,4-isoprene) tổng hợp thành 12-Oxo-4,8-dimethyltrideca-4,8-diene-1-al (ODTD) là s n phả ẩm chính

17

[21][37] Kết qu này cho thấy RoxA thu c nhóm phân c t ki u ả ộ ắ ể exo Enzyme RoxA hoạt động đượ ởc nhiệt độ phòng và không c n b sung thêm chầ ổ ất phụ gia nào khác [38] Hoạt độ cao nhấ ủt c a RoxA35Y là 2,6 U/mg t i 37 ạ oC[36] Cho đến nay, nhưng thông tin chi tiết v RoxA trong các chủng vi sinh vật khác chưa ềđược công b chi ti ố ết

Lcp là một enzyme oxi hóa n i b t khác có khổ ậ ả năng phân hủy c cao su ả

t ng hổ ợp và cao su t nhiên Trên thự ế, Lcp tham gia vào bướự c t c phân c t ban ắ

đầu c a polyisopren, và phân b r ng rãi trong ngành ủ ố ộ Actinobacteria có khả năng phân gi i cao su, chả ẳng hạn như chủng Streptomyces sp K30 (LcpK30) [22], G wesfalica Kb1 (LcpKb1) [31], G polyisoprenivorans VH2 (LcpVH2) [24], Actinoplanes missouriensis [20], N farcinica NVL3 (Linh et al., 2017, Ibrahim

et al., 2006), N.nova SH22a [28], and R rhodochrous RPK1 [29] Trái v i RoxA, ớLcp c t ngắ ẫu nhiên trong mạng lưới NR (ki u ể endo), s n phả ẩm phân hủy là hỗn

hợ ừp t C20 n Cđế 70 [39] Trọng lư ng phân t ợ ử các protein Lcp đã được tìm thấy thường nằm trong khoảng 41 n 48 kDa, đế nhỏ hơn nhiều so v i phân t khớ ử ố ủi c a RoxA Vớ ếi k t qu t các nghiên cả ừ ứu trước cho thấy hoạt độ ủ c a Lcp tái t hổ ợp cao hơn so với RoxA, LcpK30 (4,7 U/mg 37 ở oC), LcpRPK1 ,1 U/ t i 30 (3 mg ạ oC)

và LcpVH2 (1.3 U/mg t i 23 ạ oC)

1.3 Latex clearing protein (Lcp)

1.3.1 Tổng quan và con đường phân hủy poly ( -1,4-cis isoprene) được đề xuất với sự tham gia của Lcp

Qua những nghiên cứu trước đây, gen mã hóa cho Lcp chỉ được tìm thấy trong các chủng vi khu n ẩ Gram dương Những thông tin chi ti t v ế ề Lcp được mô

t u tiên trong các nghiên c u v khả đầ ứ ề ả năng phân hủy cao su c a chủng ủStreptomyces sp K30 [22][40][41] Trình t axit amin c a Lcpự ủ K30 có s ự tương

đồng 50% v LcpVH2, 57% v i Lcpới ớ RPK1 và chúng đều chứa Fe3+ trong trung tâm hoạt động Latex clearing protein được xác định có liên quan đến quá trình chuy n hóa cao su, bể ắt đầu cho s phân c t poly(ự ắ cis-1,4- oprene), và ti p theo là is ếphức hợp oxidoreductase tham gia vào bước ti p theo ế Các gen liên quan đến quá trình phân hủ ủa NR đã đượy c c gi nh trong b gen c a ả đị ộ ủ G polyisoprenivoransVH2 Theo hình 1.3, quá trình phân c t poly (ắ cis-1,4-isoprene) được chia thành năm giai đoạn gồm s phân c t c Lcp và oxi hóa ự ắ ủa ngoại bào, chu i d n chuy n ỗ ẫ ề

18

oligoisoprene qua thành t bàoế , β-oxidation, chuy n hóa acetyl-CoA và ểpropionyl-CoA metabolism, chu i chuy hóa anaplerotic và gluconeogenesis ỗ ển [24]

Hình 1.3 D ự đoán con đường phân giải poly(cis-1,4-isoprene) c a ủ chủng G polyisoprenivorans VH2 v i s tham gia cớ ự ủa Lcp d a trên phân tích genome và ự

đột bi n gen ế [24]

19

1.3.2 Những nghiên cứu về enzyme Lcp tái tổ hợp trong và ngoài nước

1.3.2.1 Thông tin Lcp tái tổ hợp đã được nghiên cứu trên thế giới

Cho đến nay, s phân gi i cao su thiên nhiên bự ả ằng con đường sinh họ đặc c

bi t là s tham gia c a Lcp ệ ự ủ đã nhận được s quan tâm cự ủa đông đảo các nhà khoa học trên thế ớ gi i Sebastian Hiessl và c ng s ộ ự (2014) đã tìm thấy hai trình t gen ự

mã hóa Lcps trong G polyisoprenivorans VH2 Trong nghiên c u này, plasmit ứpET23a(+)::lcp1VH2 được bi n nế ạp vào chủng E coli C41(DE3), đánh giá quá trình phân hủy cao su thông qua mức tiêu thụ oxy, FTIR, Schiff regeant, s c ký ắquang phổ Điều ki n nuôi c y ệ ấ E coli c p 1 37 ºC, 100-150 rpm trong môi ấ ởtrường LB chứa kháng sinh Nuôi cấp 2 đến khi OD đạt 0,4 0,5 h– ạ nhiệt độxuống 20 25 ºC, ti p t c nuôi trong 16 gi , l c 100 150 rpm Ly tâm thu t – ế ụ ờ ắ – ếbào 4 ºC, 3500 x g T ở ế bào được phá b i 100 mM Tris-HCl chở ứa 40 mM imidazole và 500 mM NaCl (pH 7,5, 4 °C) Tinh s ch b ng c t HisTrap FF, 1 ạ ằ ộ

mL c a GE Healthcare Lifescience vủ ới đệm cân b ng c t 100 mM Tris-HCl chằ ộ ứa

40 mM imidazole và 500 mM NaCl (pH 7,5) Rử ộ ới đệa c t v m chứa 60 mM imidazole trong 100 mM Tris-HCl chứa 500 mM NaCl (pH 7,5) Rửa gi i bả ằng

đệm chứa 500 mM imidazole trong 100 mM Tris-HCl chứa 500 mM NaCl (pH 7,5) Tinh s ch l n 2 b ng cạ ầ ằ ột Superdex 200 HP 16/600 Đổi đệm Bis-Tris (200

mM, pH 7,0) b ng c t cut off MWCO 10 kDa 3500 x g Nằ ộ ở ồng độ protein được xác định bằng phương pháp Bradford và SDS – PAGE để ểm tra kích thướ ki c và

độ tinh sạch [42]

Ilcu và c ng s ộ ự đã biến nạp vector mang gen mã hóa Lcp t ừ Streptomyces

sp K30 p4782.1::lcpK30 vào chlà ủng E coli JM109 bằng phương pháp sốc nhiệt và nuôi c p 1 ấ ở nhiệt độ 37 oC Chủng đã biến nạp được nuôi c y c p 2 ấ ấ ởnhiệt độ 22 oC trong vòng 20 24 gi r i thu t bào T – ờ ồ ế ế bào được phá b i b ở ộFrench Press trong đệm KPN (0.1 M potassium phosphate 0.5 M NaCl ) thu –được d ch enzyme thô Dịch enzyme thô được tinh s ch l n 1 v i 30 ml of 5 mM ị ạ ầ ớdesthiobiotin trong đệm KPN r i tinh s ch l n hai v i c t G25 Sephadex 158 ồ ạ ầ ớ ộ(26/160) Hiprep D ch enzyme tinh sị ạch được đổi đệm trong c t cut off 10kDa ộStrep-Tactin HC 10 ml KPN 100 mM, pH 7,7, ch a 150 mM NaCl D ch enzyme ứ ịsau tinh sạch được xác định kích thướ ằc b ng SDS PAGE là 48 kDa Ngoài ra –nhóm nghiên cứu cũng đánh giá sự phân gi i cao su thiên nhiên d a trên các ả ựphương pháp như ắ s c ký l ng cao áp (HPLC)ỏ , điện cực oxy, Uvis…[41]

20

Andler và c ng s 016) ộ ự (2 đã biến nạp vector mang gen mã hóa Lcp pET23a::lcp1VH2 vào E coli C41 (DE3) Chủng đã biến nạp được nuôi hai ởmôi trường nuôi c y khác nhau là AIM (7,52 g/L ấ Na2HPO4 × 2H2O, 3 g/L

KH2PO4, 20 g/L tryptone, 5 g/L cao nấm men, 5 g/L NaCl, 0,5 g/L glucose, 2 g/L lactose, 7,56 g/L glycerol) có b ổ sung ampicillin và LB được c m ng IPTG ả ứkhi OD600 đạt 0,4 0,5 và h– ạ nhiệt độ t 30 ừ oC xu ng 20 ố oC Ly tâm thu t bào ế ở

7700 × g, 4 trong 15 phút T °C ế bào được phá b i b ở ộ French Press trong đệm 0,2 M Tris-HCl, pH 7, ly tâm 7700 × g và 4 trong 30 phút, thu phở °C ần d ch ịnổi được enzyme thô và b o quả ản ở °C 4 Vi c tinh s ch Lcpệ ạ 1VH2 được thực hiện

b ng cách mu i hóa k t t a b ng ammonium sulfate Nằ ố ế ủ ằ ồng độ (NH4)2SO4 khác nhau trong các ng phố ả ứn ng, mỗ ối ng chứa 5 dmL ch enzyme thô và 5 ml muối ị

ở các nồng độ khác nhau Các mẫu được trộn cho đến khi đạt được hỗn hợp đồng nhất và ly tâm 7700 x g 4 °C trong 30 phút thu k t t a Protein k t tở ế ủ ế ủa được hòa tan trong dung dịch đệm Tris-HCl 0,2 M pH 7 và gi 4 ữ ở °C Sau đó muối đã được lo i b b ng cách s dạ ỏ ằ ử ụng ống thẩm tích 5 ml (ZelluTrans / Mini Dialyzer

MD 300) chưa 200 uL mẫu Các mẫu đượ ủc trong 3 gi ờ và thay đổi b m ộ đệthẩm tích sau 1 gi Kờ ết qu ả thu được cho thấ ớy v i vector mang gen mã hóa Lcp pET23a::lcp1VH2 khi bi n nế ạp vào E coli nuôi trên môi trường AIM có tốc độphát tri n gể ấp 4 lần trên môi trường LB [43]

Andler và c ng s ộ ự (2019) đã biến nạp vector mang gen mã hóa Lcp pET23a::Hislcp1VH2 vào chủng E coli C41 Chủng sau khi bi n nế ạp được nuôi cấy trên môi trường AIM và thực hi n các khệ ảo sát điều kiện nuôi cấy như tốc độ

l c 100 ắ – 300 rpm, nhiệt độ nuôi c y t 10 30 °C nấ ừ – ồng độ glucose 0,25 g/1 Ly tâm thu t bào 7000 x g, 4 °C trong 20 phút T ế ở ế bào được phá b ng b French ằ ộPress 1000MPa đệm ammonium sulfate thu được d ch enzyme thô D ch enzyme ị ịthô được thêm vào dung d ch amoni sulfat 2M theo t l ị ỷ ệ 1:1 (v/v) đảo tr n nhẹ ộnhàng Ti p t c ly tâm l n thế ụ ầ ứ hai 7700 x ở g, 4 °C trong 40 phút, thu được d ch ịprotein hòa tan và gi 4 °C Kữ ở ết qu khảo sát cho thấ ởả y 30 °C các t ế bào đạt

đến pha cân b ng sau 13 gi v i tằ ờ ớ ốc độ tăng trưởng là 0,17 h-1, trong khi 10 ° C ở

để đạ t pha cân b ng phằ ải mất 90 gi và tờ ốc độ tăng trưởng c ụ thể là 0,037 h-1

D a vào k t qu SDS-ự ế ả PAGE và hàm lượng protein thu được nhóm nghiên c u ứxác định nhiệt độ nuôi c y tấ ối ưu là 25oC Khảo sát tốc độ ắ ở l c 100 rpm, 150

21

rpm, 200 rpm, 250 rpm, 300 rpm cho thấ ự tăng trưởy s ng c a t bào b ủ ế ị ảnh hưởng b i tở ốc độ ắ l c, mật độ sinh khối tăng chậm hơn tạ ốc độ ắi t l c thấp D a ựvào nồng độ protein thu được và tốc độ tăng trưởng c a t bào, nhóm nghiên c u ủ ế ứxác định được tốc độ ắ ối ưu là 200 rpm l c t [44]

1.3.2.2 Tình hình nghiên cứu Lcp tái tổ hợp trong nước

Ở Vi t Nam các nghiên c u v vi sinh v t tái t hệ ứ ề ậ ổ ợp sinh ra enzyme Lcp phân gi i cao su thiên nhiên còn r t hả ấ ạn chế, các nghiên c u chứ ỉ ậ t p trung mở ức phân lập, định danh vi sinh v t trong t nhiên có khậ ự ả năng phân giải cao su và nghiên c u các t p hứ ậ ợp vi sinh v t có khậ ả năng phân giải cao su Cho đến hiện

t i, nghiên c u cạ ứ ủa Đào Việt Linh và c ng s (2017) là nghiên cộ ự ứu đầu tiên v vi ềsinh v t tái t hậ ổ ợp mang đoạn gen mã hóa Lcp có khả năng phân giải cao su thiên nhiên Trong nghiên cứu này đã biến nạp thành công vector pET21a(+)::NVL3 vào chủng E coli BL21 Chủng sau khi bi n nế ạp được nuôi cấy trong môi trường

LB có kháng sinh và cảm ứng 1mM IPTG t i ODạ 600 0,6 trong 12 24 gi – ờ ở

24oC Thu sinh khối và siêu âm phá t ếbào, ly tâm thu đượ ịc d ch enzyme thô Dịch enzyme thô được tinh s ch b ng c t His Spin Trap Enzyme tinh sạ ằ ộ ạch được

cô đặc, đổi đệm PBS sang Tris-HCl b ng c t cutoff màng 30 kDa Nằ ộ ồng độprotein được xác định bằng phương pháp Bradford [27]

Như vậy, Lcp tái t hổ ợp đã được các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm nghiên c u Các nghiên c u t p trung ứ ứ ậ chủ ế ủ y u c a các nhà khoa học

đến t c, các khu vừ Đứ ở ực khác như vùng Đông Nam Á và Việt Nam là chưa nhiều Chính vì v y, trong nghiên c u này không chậ ứ ỉ nghiên c u khứ ả năng biểu hiện của Lcp t mừ ột s chủ Gram dươngố ng là N farcinica NBRC 15532 và Rhodococcus sp E2 vào v t chậ ủ E coli BL21 mà còn khảo sát các đặc tính của enzyme để đưa vào nghiên cứ ứu ng d ng trong các hụ ệ thống xử lý