Nghiên ứu quá trình phân hủy sinh họ ao su thiên nhiên protein bằng tập hợp vi sinh vật

Cao su thiên nhiên .... Cao su thiên nhiên loi protein DPNR .... Ming DPNR tan trong dung d ch Chloroform .... mucilaginosa, Pseudomonas sp.

B môn:  Công ngh Sinh h c 

Vin: Công ngh Sinh h c &  Công ngh Th c phm 

HÀ NI, /2020 06

B môn:  Công ngh Sinh h c 

Vin: Công nghSinh hc & Công ngh Th c phm 

Ch ký c a GVHD 

HÀ NI, 06 20 /20

L I C N

 hoàn thành nhi m v   c giao c tài, ngoài n l c h c h i c a     

b n thân còn có s   ng d n t n tình c a th y cô và s        ng viên ca

h c và Công ngh  thc ph m  ch  b o tôi trong th i gian làm vi c t  i phòng thí nghi m 

Bên c  m và bng l c cho tôi c bi t là các anh ch và các b n làm vi c cùng tôi t i Phòng thí nghi m Trung tâm khoa h c và     công ngh    r t nhi u trong su t quá trình h c t p, nghiên tôi     

GVHD: PGS TS Nguy iii

M C L C   L I L I C II DANH M C B NG  V DANH MC HÌNH VI DANH M C T VI  T TT VII M  U 1

NG QUAN 3

1.1 Cao su thiên nhiên 3

1.1.1 Ngu n g c và s phát tri n c a cao su thiên nhiên 3  

1.1.2 Thành phc tính 3

1.2 Cao su thiên nhiên loi protein (DPNR) 4

1.2.1 Gii thiu v DPNR 4

  lo i protein 5

1.2.3 Phân loc tính c a cao su thiên nhiên lo i protein 6 

1.2.4 ng d ng c a cao su thiên nhiên lo i protein (DPNR) 9   

1.3 Hi n tr ng x lý ph    thi cao su thiên nhiên 10

1.3.1 Tình hình x lý ph  thi cao su thiên nhiên 10

 lý ph th i cao su 11 

1.4 Phân h y cao su thiên nhiên b ng vi sinh v t 13  

ng phân h y cao su thiên nhiên 13

1.4.2 Phân h y cao su thiên nhiên b ng các ch ng vi sinh v t 15   

1.5 Tình hình nghiên cc 16

1.5.1 Các nghiên cc 16

1.5.2 Các nghiên cc 18

 y sinh h c DPNR b ng vi   sinh vt 19

  gi m kh  ng mi ng cao su 19  

m Schiff 20

1.6.3 Phân tích quang ph h ng ngo  i  FTIR 20

nh t p h p vi sinh v t 22  

GVHD: PGS TS Nguy iv

 V T LI  23

2.1 Vt liu nghiên c u 23

2.1.1 Ngu n phân l p 23 

2.1.2 Ngu n vi sinh v t có sn 23

t th KNPH cao su c a vi sinh v t 23  

ng 24

2.1.5 Hóa ch t 25

2.1.6 Thi t b 25 

u 26

 nghiên c u 26

u 28

2.3 N i dung nghiên c u 32 

2.3.1 Làm giàu t p h p vi sinh v t 32  

2.3.2 Phân l p vi sinh v t có kh y (KNPH) cao su 33

 y DPNR c a t ng ch ng vi sinh v t và h n      h p các ch ng trong m  t tp h p 33

T QU VÀ TH O LU N 35  

3.1 Kh y DPNR ca tp h p vi sinh v t làm giàu 35 

  gi m kh  ng DPNR c a t p h p vi sinh v t làm giàu 35     

3.1.2 S  i cu trúc phân t DPNR t   ng làm giàu 36

  bi ng t p h p vi sinh v  ng làm giàu 40

3.2.1 S bi ng t p h p vi sinh v  ng làm giàu 40

3.2.2 M i quan h  gi a t p h p vi sinh v t c a các l n chuy n c     ng và hi u qu gi m kh   ng mi ng DPNR 46

3.3 Phân l p vi sinh v t có kh y DPNR t m t Sapa 50

3.4 Kh n y DPNR b ng t p h p các ch ng l    a chn 54

K T LUN VÀ KI N NGH 56

TÀI LIU THAM KH O 57

PH  L C 65

GVHD: PGS TS Nguy v DANH MC B NG B ng 1.1 Thành ph n c  a latex cao su thiên nhiên 3

B ng 1.2 Tính ch t ca cao su DNPR dng kh i 8 

B ng 1.3 ng d ng c a DPNR 9    

ng môi  ng khoáng W 24 

B ng 2.2 Thành ph n tham gia ph n ng PCR 30    

By cho ph n ng PCR 31  

B ng 3.1 T l các chi vi khu   ng ch a DPNR 42

B ng 3.2 Mô t các ch ng vi sinh v t phân l p t m      t Sapa 51

GVHD: PGS TS Nguy vi DANH MC HÌNH Hình 1.1 Công thc hóa h c phân t cao su 4 

ng phân cis - 1,4 c a cao su thiên nhiên 4 

Hình 1.3 Các hc - (b) sau khi mt protein 5

 quy trình ch bi n DPNR 6  

Hình 1.5 Các sn DPNR c a Công ty cao su Sumito mo 7

Hình 1.6 Cao su DPNR dng kh i và các s n ph m t DPNR d ng kh i 8    

Hình 1.7 ng phân gi i cao su nh vi sinh v t 15   

 n ng c a nhóm aldehyde v i thu c th Schiff 20    

Hình 2.1 Mt thu th p t nh núi Sapa, t nh Lào Cai, Vi t Nam 23     

 quy trình t o cao su thiên nhiên lo i protein 24  

Hình 2.3 Máy quang ph  h ng ngo i FTIR (Jasco-4600, Nh t Bn) 26  

 nghiên c u 27 

Hình 2.5 Ming DPNR tan trong dung d ch Chloroform 32 

Hình 3.1 Hi u su t gi m kh    ng mi ng DPNR sau m i l n chuy n canh     ng làm giàu (%) 35

Hình 3.2 Ph FTIR c a miu 37 

Hình 3.3 Ph FTIR c a mi ng DPNR c a m u ki m ch ng (KC) và m u trong        ng (E1, E3, E6 và E9) c a l n làm giàu th 1, 3, 6 và 9 38 

Hình 3.4 T l các ngành vi khu  ng ch a DPNR d a vào trình   t 16S rRNA 41 

Hình 3.5 Bi phân c m   m c phân lo i ngành 47 

Hình 3.6 Bi biplot bi u di n m  a hi u su t gi m kh   ng ming DPNR và thành ph n vi sinh v t    m ng c a các  l n chuy n m u 48   

Hình 3.7 Hình thái khu n l c chng 3D1 phân l p t m  t Sapa 52

Hình 3.8 Nhum Schiff chch DPNR 2 l p 53 

 Hi u su t gi m kh    ng mi ng DPNR c a các ch ng vi sinh v t     riêng l và các t p h p vi sinh v t k t h     p l i 54

DANH MC T VI T T T   

ANRPC Association of Natural Rubber Producing Countries 

Hip hc Sn xu t Cao su t nhiên  

CA Cluster Analysis Phân tích c m  

DPNR Deproteinized natural rubber  Cao su thiên nhiên lo i 

protein E-DPNR Deprotein Natural Rubber with Enzyme  Cao su thiên

nhiên lo i protein b ng enzyme  FDA Food anh Drug Administration C c qu c n l

ph m FTIR Fourier Transform InfraRed Quang ph h ng ngo   i

bii Fourier GPC Gel permeation chromatography S c ký th m th u    

gel HANR Hight Amoni Natural Rubber Cao su thiên nhiên 



PPS Protein Precipitation Solution Dung dch kt ta

protein

SEWS-M Salt/Ethanol Wash Solution DNase-free

U-DPNR Deprotein Natural Rubber with Ure

t là gây ô nhi m th c  p v i th i  gian phân h y cao su kéo dài nên c n di n tích l    y th i gian phân 

h y cao su v i nh ng gi i pháp an toàn thân thi n v      ng, các nghiên

c    c t p trung vào vi c s d ng vi sinh v      phân gii CSTN Các nghiên c u ch y  u là phân l p các vi sinh v t có kh    i cao su M t s nghiên c u v gen mã hóa t ng h p enzyme xúc tác cho các ph n       

ng phân gi i cao su và ti n hành t o l p t p h p vi sinh      

v trên các mng làm giàu t các ngu n  khác nhau, m t khác k t qu    i hi u su t phân gi i cao su th p v i th i gian      phân gi i kéo dài Trong nghiên c u này không ch kích ho t các t p h p vi sinh      

v t phân h y CSTN mà còn phân l p các vi sinh v t t m     t có v  a lý

c bing cn ngu n th i  

   nghiên c u quá trình phân h y sinh h        

N i dung c  tài, các v   c  c gi i quyt:

-   h y cao su thiên nhiên lo i protein c a t p h   p

vi sinh v t làm giàu 

-    bi ng t p h p vi sinh v      ng làm giàu

- Phân l p vi sinh v t có kh      y cao su thiên nhiên loi protein

-  y cao su thiên nhiên lo i protein b ng t p h   p các chng la chn

NG QUAN

1.1 Cao su thiên nhiên

1.1.1 Ngu n gc và s át tri c a cao su thiên nhiên ph  n 

Cao su thiên nhiên (CSTN) là v t li  c s n xu t t m cây cao su    

(Hevea brasiliensis) thuc h i kích (Euphorbiaceae)c phát hin và

s d ng t i Nam M    vào th k   ng t i Anh v à phát tri n m nh khu v c châu Âu Tuy nhiên CSTN ch      c s d ng ph bi   n

c các nhà khoa h c tìm ra [12] Sau 

c gieo tr ng kh p th gi i    c tr ng ch y  u

 các nt Nam, Philipin,  và Trung

Quc Theo th ng kê c a Hip hc S n xu t Cao su t nhiên (ANRPC),   

sng CSTN trên th  git 13,80 tri u t   ng d 

ki n s    u t [36] Cây cao su c trng

 Vi t Nam l n nay di n tích tr ng cây cao su Vi t    

t 969.700 ha v i g n 67% di   o n cho thu ho ch 

m cho s t 1.094.500 tVi  m t bình quân 1,6 1,7 t c k t 2007 [6]  

1.1.2 Thành phc tính

M cao su nhiên nhiên là d c c a các h t cao su  

vng ph n khô t 28%-40%   (dng latex)c h t cao cao su r t

nh , c kho ng 0,05-3µm Trong 1 gam m cao su v    ng khô 40% có kho ng 5000 h t v   ng kính trung bình 0,26µm t t c các h     u

trng thái chuyng Browner [12] Các phân tích v latex cao su thiên nhiên





-          [1] H protein  mùi 

 DPNR 

   , và DPNRnên chúng chu ma sát, ch u nén t t so v CSTN d  i    c i chung [ ] Vì v y, x10  u th     s s d ng CSTN

1. i protein lo

V   n trong CSTN     CSTN  thái  do 

1.4  quy trình ch n DPN [10]  bi R

* Quy trình loại bỏ protein trong latex cao su thiên nhiên bằng ure

 1% ure (theo ulfat (SDS) 

     1% SDS (theo  vào  

 - -DPNR

* Quy trình loại bỏ protein trong latex cao su thiên nhiên bằng enzyme

04% enzym proteinHANR      

35oC S1% SDStâm  - -DPNR

Cao su sau khi  methanol và làm



1.2.3 Phân loc tính c a cao su thiên nhiên lo i protein  

 (latex),  là protein trong CSTN Các  cao su 

1.2.3.1 DPNR dạng latex

 

Hình 1.6 Cao su DPNR d ng kh i và các s   n phm t DPNR d ng kh  i [ ] 141.2.3.3 Đặc tính c a ủ DPNR

1.2.4 ng d ng c a cao su thiên nhiên i protein (DPNR)    lo

DPNR c ng d ng r ng rãi trong nhi  c bao g m: giao thông, công nghi p, tiêu dùng, v sinh và y t DPNR có kh      n ng cao trong các ph n ng bi n tính do protein b     loi nên các tác nhân bi n tính d  

gi m m c nh  y m ca chúng nên c i thi n   các tính ch t k  thu t   DPNR còn có nhi u ng d ng khác nhau Ngoài ra,    DPNR c dùng trong s n xu t  gang tay, bóng bay, mút th ch tán kem n n, n m, ng thông y t , ch t b t kín và       mim cao su nha khoa [42]

1.3 Hi n tr  ng x lý ph thi cao su thiên nhiên

1.3.1 Tình hình x  lý ph thi cao su thiên nhiên

ra u chi c l p ô tô   i khng kho ng 4,6 tri u t n   

   11%là 78% [21] Hin nay có chi c l p

ô tô m trong các h rác và các kho ch a trên kh  c M T i   Anh,

có kho ng 40 tri u chi c l p ph th i L      p xe ph th 

  m nhu c u di chuy n c a co    i khi n l p  

xe b v t b ngày càng nhi u     ng lp dt tr ng T i  California, l p xe ph  thi c thu gom và s d ng chúng trong vi c làm    ng

bê tông nh a cao su hóa [5] Công ngh nhi  c n

lý m 



 cao su                

 [7] 

, hi n nay có 637 nhà máy nhi t phân cao su phê th i    

  g 

 -R (Fuel Oils), than cac

v i áp su   t t Quá trình này bao

gn: khí hóa làm s ch khí     n Quá trình này

có hi u su t chuy  ng cao V i nhi t tr c a ph     thi cao su kho ng 

23238 kJ/kg, vic gia nhi t ho   t t o khí s   thi cao su thành mt

ngu n nhiên li u quan tr ng [13]    

h p ch h u cao phân t  t    (ch  y u là isoprene) thành các h p ch n

 p t c khoáng hóa và phân ph i l i qua các chu k nguyên t t o thành     khí metan (ng phân hy k khí) ho c t o thành   c và cacbon dioxide

(ng phân hy hi u khí) Vi sinh v t ti t ra các enzyme xúc tác cho s   phân c t c a các polyme   Phm vi và t  c a quá trình này ph thuc vào s 

ng, s  ng và loài vi sinh v t có m t và c u trúc hóa     

Các vùng   u ki      thoáng khí, pH khác nhau nên s phân b các vi sinh v   N i ta phân l p, tuy n  chn các vi sinh v t  có kh   phân gii CSTN M cao su 

                

 

    cho quá trình  ra 

                DPNR  [15]

1.4 Phân h y cao su thiên nhiên b ng vi sinh v   t

ng phân h y cao su thiên nhiên

Vai trò c a vi sinh v t trong quá trình phân gi i là gi i phóng các enzyme    ngothy phân các chu i polyisoprene thành các phân t nh và các s   n

phc h p thu vào các t      s d ng là mt ngu

ng Các s n ph m cu i cùng c a quá trình này là CO    2, H2O và các s n ph m

ph chúng có th   c s d ng b i các loài vi sinh v t khác [55]     Hin nay hai

c bi t 

n là Lcp (Latex-clearing protein) và RoxA (Rubber oxygenase A) [50]

Lcp xúc tác cho ph n   u tiên c a quá trình phân gi i poly(cis-1,4- isoprene) to thành thành các aldehyde và xetone cn

ph m này ti p t  c oxy hóa ti p thành axit c    ng Các axit c a isoprenoid ti p t  c oxy hóa [76]c phát hiu tiên

 ch ng  Streptomyces sp K30 (Rose và cng s , 2005) [69] c tìm thy trong các vi sinh v t phân gi       m ch ng 

Streptomyces LCIC4, ch ng Actinoplanes OR16, №cardia farcinica E1,

№cardia nova SH22a, Gordonia westfalica Kb1 và Gordoniapolyisoprenivorans

VH2 [26]

u trách nhi m phân gi u tiên c a quá trình phân gi i cao su th        c tìm th u tiên t chng Xanthomonas sp 35Y ngo    c tìm th y  các ch ng thuc chi Myxobacteria [46]    n nay ch có enzyme RoxA  chng Xanthomonas c nghiên c u c th và chi ti t Enzyme RoxA    

ho  t dioxygenase, xúc tác cho ph n ng phân gi    t o ra các sn

ph m ch y u là tri-   ng nh t, 12-oxo-4,8-dimethyltrideca-4,8-diene-1-al (ODTD) Các s n ph  c t o bng nh t và l ODTD [16]

ng phân gi i cao su nh vi sinh v  c d  à các 1,4-isoprene) b oxy hóa và phân tách thành các axit c 

poly(cis-s n ph m này poly(cis-s    c v n chuy n vào trong t bào vi sinh v t và ti p t c con      

h 1.7 [50]:

Hình 1.7 ng phân gi i cao su nh vi sinh v [65]  t

1.4.2 Phân h y cao su thiên nhiên b ng các ch ng vi sinh v t    

Vi khu n, x khu n và n m m c u có kh        i cao su [27]

Các vi sinh v t phân gi i cao su có th c chia làm hai nhóm chính:

- Nhóm th nh t: các vi sinh v t t o ra các vùng sáng (vòng th y phân)     

ch có ch a cao su Các thành viên c ng là các loài vi khu khun hình là Actinoplanes, Micromonospora, Streptomyces Ch có m t s ít vi khu n gram âm thu c nhóm này là    

Xanthomonas 35Y, Rhizobacter gummiphilus NS21 50 ch ng vi sinh v t  phân h y cao su hình thành  c công b T t c các vi sinh v t này    

1.5 Tình hình nghiên cc

1.5.1 Các nghiên cc

Các nghiên c u v vi sinh v t phân h       t hi  

  d phân l p vi sinh v t có  

kh  y cao su [48]i ti n k   thut này b ng cách s d   ng th ch và mu i khoáng k t h p v i vi      chng CSTN lên l p th ch nh m phát hi n ra các vòng th y phân b i vi sinh v t       [40] Vi c th c hi n phân l p và nuôi c y các vi sinh v t phân h      

ng th ch 2 l p: l  i ch a mu i khoáng, l p trên ch a cao su ho c     

m là m t thành t u quan tr ng    

Tsucnh các ch ng thu c chi   Xanthomonas

t o ra acetonyl-diprenyl- acetaldehyde t quá trình phân gi i cao su [52] Jendrossek và cng s     d n ng khoáng có b sung mi ng  CSTN là ngu n cacbon duy nh  phân l p các vi sinh v t K t qu     p

c 1220 ch ng vi sinh v t khác nhau Sau khi sàng l  c 46 ch ng vi khu n phân h ng thuc chi Streptomyces, 5 ch ng thu c

chi Micromonospora, 3 ch ng thu c chi   Actinoplanes, 2 ch ng thu c chi  

№cardia, 1 ch ng thu c chi   Dactylosporangium, 1 ch ng thu c chi  

Actinomadura và 3 chnh [48]

Claudia Gallert (20phân lc ch ng  Streptomyces La7 có kh 

i cao su Sau 70 ngày nuôi c y v i gang tay cao su    gi m kh i 

t 30% [57] n hành phân l p t các h    c 42 vi khu n phân h y cao su, trong  

  ng thu c chi  Streptomyces, 5 chng thu c chi  Micromonospora, 3

chng thu c chi  Actinoplanes, 2 chng thu c chi  Gordona và 1 chng thu c chi 

№cardia T t c các ch  u là vi khu [68] Shunsuke Imai

và c ng s   c 3 ch ng vi sinh v t là   Streptomyces LCIC4,

Actinoplanes OR16 và Methylibium NS2 Ch ng  Methylibium NS2 là ch ng vi khu n phân h c phát hi n Các s n ph m t o ra    trong quá trình vi sinh v t phân h y cao su c a các ch ng này b    GPC ch ra các ch ng LCIC4 và OR16 chuy   i các poly( -1,4-cis isoprene) thành các oligo(cis-1,4-isoprene) Ch ng NS21 có ho t tính phân h y y   

hai chn hóa các poly( -1,4-isoprene) thành các s n phcis  m

có trng phân t th [47]

Nida Kanwal và c ng s    y l p cao

su b i ch ng   Bacillus   ng mu i khoáng l ng (MSM) S   phân h y l p cao su t   pH 7 và 35 °C [49] Watcharakul và c ng s (2016)  

 p t mc thc ch ng  R rhodochrous RPK1 Gen mã hóa cho enzyme Lcp  c a ch     nh, nhân b n và bi u hi n   

trong E coli Enzyme Lcp tinh s ch có ho  là 3.1U/mg 30°C, s n ph m c   a quá trình phân gi i poly( -1,4-isoprene) là h n h p các oligoisoprene v i các  cis   nhóm ch c ketone và aldehyde [53] Sharma V và c ng s    

ng chuy n hóa cao su t    i v i ch ng vi khu n gram âm   

Steroidobacter cummioxidans ng phân gic ghi nhn

ti các vi khut ít thông tin v s t n t   i ca các ch ng vi khu n gram âm Các ch ng vi khu n gram âm phân h y cao su     

c ghi nh u tiên thu c chi  Xanthomonas là chng 35Y Ch ng này s  

d ng enzyme oxyase phân c  gen 16S rRNA ch ra v trí phân lo i ranh gi i c a ch ng 35Y là m t loài m i thu c chi         

Steroidobacter [39]

Chairat Nawong và c ng s   c 10 ch ng vi khu n trong m  t t nh Songkhla, Thái Lan Khi ti n hành nuôi c y riêng r t ng    chng vi sinh v t và k t h p các ch ng này v i         ng l ng MSM ch a các mi ng cao su thiên nhiên t gang tay trong 30 ngày Ch ng F5 là    chng nuôi riêng r    gi m khng mi ng cao su cao nh t (9,36%) K t   

qu nh danh b ng k     thut gi i trình t gen 16S rRNA cho th y ch ng F5 l    à chng Rhodococcus pyridinivorans vi m t 99% Trong các

t p h p thì t p h p 5 ch    gim khng cao su cao nht 18,82c xem là có ch a c 10  chng vi sinh v t ch gi m kh   ng mi ng cao su ch gi m 18,38% [35]   

v y, khi s d ng t p h p vi sinh v t cho hi u qu phân h        ng riêng r

1.5.2 Các nghiên cc

Nghiên c u vi sinh v t phân h  y CSTN Vit Nam m i xu t hi n trong   

nh Nghiên cc th c hi n b Bùi Th   i  Trang và công s (2013) K t qu        c 4 ch ng x khu n thu c chi   

Streptomyces là NMD1, M4D1b, M4T1c và T37 có kh  y CSTN Hiu su t gi m kh  ng gang tay làm t CSTN sau 30 ngày 30  oC c a các chng NMD1, M4D1b, M4T1c và T37 lt là 4,28 ± 0,32%, 11 ± 0,5%, 2,05

± 0,76 và 2,43 ± 0,34 [76] %

 t Linh và c ng s (      p c 3 ch ng: H2DA1, H2D12 và NVL3 t  ng làm giàu v i ngu n cacbon duy nh t là CSTN   Phân tích các s n ph m b ng GPC cho th y ch có ch ng NVL3 th hi n kh         

  y cao su Ch ng NVL3 phân h y CSTN t o ra các s n ph m có     

khng phân t khong 50-100 kDa [65] Trình t gen 16S rRNA c a NVL3  

ng nh t v i №cardia farcinica DSM 43665T Các thí nghi m nhu m Schiff    ch ra r ng các s n ph m ph trong quá trình phân h y cao su c a NVL3 là      aldehyde Gen mã hóa cho enzyme Lcp c bi n n p và bi  u

hi n trong  E coli BL2 [50]

Trong t nhiên các vi sinh v t s ng c ng sinh t o ra các qu n xã mà loài      này s h  tr  cùng phát tri n, t   c hi u qu s d ng    ngu n th   t s nghiên c u t p trung vào vi  u

ki n kích ho t các t p h p vi sinh v t phân gi i cao su trong các m      ng

 Công Th nh và c ng s (2013)    p h p vi sinh v t t các m u    

t, bùn và m th i cao su t Vi n nghiên c u cao su Vi t Nam        trong b hi u khí th tích 5 lít S gi m kh i l ng c a các         ming CSTN sau 30

t kho ng 79,40% T p h p vi sinh v t có kh      y cao

su và t o ra các s n ph m có kh   ng phân t kho ng 50-100 KDa K t qu    phân tích metagenome cho thy nhóm vi sinh vt chi trong t p h p này  thuc v chi №cardia [11]

Nguyng s  tin hành phân l p các ch ng vi  sinh v t phân h y DPNR t các l n chuy n m     c

9 ch ng vi sinh v t có ho t tính phân h y     DPNR cao, trong 3 ch ng 5A1,  

1A1, 1A2 cho hi u su t phân h y cao su cao nh   ng là 43,92 ± 2,30%, 36,3 ± 2,53% và 38,87 ± 2,19% trong 30 ngày  30oC Trình t gen 16S rRNA, 

c a 5A1 cho th y s ng nh t cao nh t v      i Gordonia soli CC-AB07 

u tiên ch ng minh kh   y DPNR c a Gordonia sp phân 

l p t canh t  ng làm giàu ch t th i c  a m t nhà máy ch bi n cao su    Vit Nam

y, s phân h y cao su c a vi sinh v    c r t nhi u nhà khoa 

hc quan tâm nghiên c u Các  chng vi sinh v phân ht y cao su c phân l p Các nghiên c u    ra các t p h p vi sinh v t cho   

hi u qu phân gi  ng riêng r Các nghiên c u v t p h p     các ch ng vi sinh v t ch   tin hành nhi u trên DPNR 

nghiên c u s làm giàu các t p h p vi sinh v t k t h p v i vi c sàng         

llo  i b b t nh ng vi sinh v t không có kh    y ho c hi u su  t phân h y cao su kém    l a chn nh ng vi sinh v t có KNPH cao su t  t

nht    t o t p h p vi sinh v t có hi u qu phân h y cao su cao     

 y sinh h c DPNR b ng vi   sinh vt

  gi m khng mi ng cao su 

M t trong nh n nh nh s phân gi i c  a

 nh khng mt phân gi i Nguyên t c c a   

    ng mic (W1) và sau (W2) khi nuôi c y vi sinh v c khi nuôi c y vi sinh v t, các mi  c cân

và ghi l i kh ng, sau m t th i gian nuôi c y các mi    c l y ra,

r a s ch lo i b vi sinh v t, s y và cân l        so sánh v i kh u [35]   gi m kh

Hiu su t gi m kh  ng = [(W1 - W2) / W1] × 100    

Hiu su t gi m kh  ng càng l n thì hi u su t phân gi i cao su c a vi     sinh vc li

Tsuchii và cng s (1996) nghiên c u   ng cc, di n tích 

b m t c a các mi ng gang tay cao su t i kh       y (KNPH) c a ch ng  

№cardia ch KNPH tuyra n tính v i di n tích b m t trên m    

ng [16] Thu c th Schiff cho phép nh tính aldehyde do khi    chúng t h p v i k  nhau t o ra m t s n ph   m có  tía Ph n  c th hi n    sau:

.8 Ph n ng ca nhóm aldehyde v i thu  c th Schiff [62]

Khi b sung aldehyde xu t hi n m t vòng quinoid trong s n ph m D      

i ta còn s d ng thu c nhu    nh n bi t s xu t hi n c a aldehyde      

và ketone nh    b t màu thu c nhu m Schiff c a    u

hi nh n bi t m t vi sinh v t có kh      y m cao su 

Yikmis và c ng s (2008)     nh n bi t chng

Streptomyces t bi n [45] Broker và c ng s   (2008)   d a vào k t qu nhu m Schiff ki m tra KNPH c a các ch ng       

Streptomyces lividans TK23 tái t h p Tuy nhiên không ph i ch ng nào có    KNPH t t khi nhu t màu thu c nhu m này vì ch  

h y poly ( -1,4-isoprene cis ) thành các sn ph m th [19]

1.6.3 Phân tích quang ph h ng ngo   i  FTIR

phân tích quang ph h ng ngo i (FTIR) ho   ng d a trên 

s h p th b c x h ng ngo i c a v t ch t c n nghiên c           

nha các liên k t hóa h c gi a các nguyên t Các    

nhóm ch c quy nh tính ch t c a h p ch t h    i v trí các nhóm ch c trong các phân t các d ch chuy    y ran t x nên ph c a phân t h    liên quan t i các nhóm ch c c a chúngc sóng h p thu ci cho t ng nhóm ch c t          d t n t i c a các nhóm ch  h p th c a nó M t khác, m i lo    ng trong phân t 

h p th m t t n s       nh, ph (InfraRed) IR c các loi

a các liên k t hay các nhóm ch c có trong phân t    :

C--H, C-O, C=O, C-N, O-H, N-H Chính vì th  i ta có th 

ng d ng máy quang ph h ng ngo   nh s xu t hi n c a các nhóm    

 n s phân h y c a DPNR có th là do s phân c t oxy hóa      

c ph n ánh r t t t trong vi c kh liên k      xu t di n c a aldehyde   

c th c hi n theo quy trình chu n; k t qu        t quang ph 

h ng ngo i bi   i (FTIR) trong các nghiên c   nh m nh m s   phân h y c a cao su thiên   i ta cho r ng s phân h y c a b khung     polyme c bu b i s phân c t oxy hóa c a các liên k     i polyme [37] S phân c t oxy hóa là s phân tách các liên k t C-      t o ra các liên k t C- t C-C b o -C và C-H b oxy hóa 

 ra vai trò c a s phân c t oxy hóa CSTN trong quá trình phân   

h y sinh h c Các nghiên c u      s phân h y sinh h c CSTN v i các 

vi sinh v ra r ng trong quá trình phân h y cao su, s phân c   t oxy hóa c a liên k cis-1,4-isopren S hi n di n c a aldehyde e)    

và ketone c thông báo Các axit cacboxyc hình thành sau khi tng phân h y c a n-ankan [21]

Nawong (2018   d phân gi gang tay cao su i

c a ch ng F5 [35]    d ng k thu  c

 phân gi i cao su thiên nhiên c a enzyme Lcp t ch ng VH2 [24] Vidya    (2017) s d  giá các s n ph n t o thành t quá trình phân gi    i cao su thiên nhiên c a x khu n [78]         d so sánh và  phân gi i cao su thiên nhiên c a các ch ng    A alternata, R mucilaginosa, Pseudomonas sp. [17]

nh t p h p vi sinh v t   

Hin nay, chúng ta có r t ít thông tin v    các vi sinh v t hi n di n   

t, ch y u là do chúng ta không th nuôi c y chúng trong phòng thí nghi m  - c r ng i 1%

ca tt c các loài vi khuc nuôi c y [3]  Trong nh khai thác hi u qu ngu n gen, DNA t ng s c     a      m ng

c tách chi t và gi i mã tr c ti p b ng h th ng gi i trình t th h m i d a             trên công ngh 

Jendrossek và cng s    d ng sàng l c thu 

c 46 ch ng vi khu n phân h       ng thu c chi 

Streptomyces, 5 ch ng thu c chi   Micromonospora, 3 ch ng thu c chi  

Actinoplanes, 2 ch ng thu c chi   №cardia, 1 ch ng thu c chi  

Dactylosporangium, 1 ch ng thu c chi   Actinomadura và 3 chnh [49]  Công Th nh và c ng s      d nghiên

c u h vi sinh v t trong b x      c th i cao su K t qu phân tích metagenome   cho thy nhóm vi sinh vt chi trong t p h p này thu c v chi     №cardia

[11] Watari và c ng s        i gi l i trong b UASB   (Upflow Anearobic Sludge Blanket) x  c th i cao su  b ng metagenome 

K t qu cho th y ngành vi khu n chi       là Bacteroidetes Firmicutes, ,

UASB [44]

Hình 2.1 M t thu th p t   nh núi Sapa, t nh Lào Cai, Vi t Nam  

2.1.2 Ngu n vi sinh v  t có sn

T p h p các ch ng vi sinh v t có s n trong ngân hàng vi sinh v t c      a Viện công ngh sinh h c & công ngh ệ ọ ệ thự c phẩm – Trường đạ ọ i h c Bách Khoa Hà

N iộ c phân l p t ngu n th   c tuy n ch n trong các nghiên  

c  c s d ng ph i h p v  i chng vi sinh v t phân l c t  m u

t Sapa cho hi u su t phân h  n ngu n th i cao  

  ti n hành nghiên c   y DPNR Ba ch ng vi sinh v t có s c s d ng bao g m: 5A1, 1A1, G9 Hình thái khu n l c c     a các chc mô t t i ph   l c 6

t th KNPH cao su c a vi sinh v t   

 Cao su thiên nhiên loi protein

Quy trình loc mô t hình 2.2:  

 quy trình t o cao su thiên nhiên lo i protein [10]  

 ng th ch W b sung 2% fructose: M  ng W + 2%fructose + 0,15% agar

 ng th ch W-DPNR 2 l p b sung 2% fructose   

- Lng W b sung 2% fructose + 0,15% agar 

- L   ng W b sung 0,15% DPNR 20% d ng l ng và 2   % fructose + 0,15% agar

2.1.5 Hóa ch t 

 Hóa cht dùng trong nuôi c y và phân l p  

Hóa ch t Trung Qu c: KH  2PO4, K2HPO4, NH4NO3, MgSO4.7H2O, NaCl, NaOH, CaCl2.2H2O, FeSO4.7H2O, Na2MoO4.2H2O, Na2WO4.2H2O, MnSO4.5H2O

Hóa cht HIMEDIA, : Cao n m men, pepton 

 Hóa cht dùng trong sinh h c phân t  

Hóa ch t Sigma: Agarose,  PBS, EDTA, methane, Tween 20

Tris(hydroxymethyl)amino- Hóa ch t khác: Premix Ex taq Hot start (Takara), TAE 50X, thu c

th Schiff, Chloroform, dung d ch SEWS-  M

2.1.6 Thi t b

  n t AUW220 (SHIMADZU, Nh t B n)  

 Máy lc n nhi t (Bio Shaker BR 43FL, Nh  t Bn)

 Máy ly tâm (Tomy MX -305, Nh t B n)  

bc c y  s 50on khi và so sánh v i kh i  

ng ban u c a chúng [76] S gi m kh    ng c a mi ng cao   c tính theo công thc sau:

 C nh t bào b   t bôi trên ng n l n 2-3 l n 

  m b ng dung d ch Tím k t tinh (Crystal violet) trong 1 phút, r a    

c, th m khô 

 Nhum l i b ng dung d ch Iod trong 1 phút, r  c, th m khô      

 Nh  d ch t y màu, gi kho  n khi v a th y m t màu),   

S d ng k   thu nh t p h p vi sinh v t có trong   

 ng làm giàu d a vào gi i trình t gen th h m i (Next-Generation      Sequencing - NGS)i trình t s d ng trong nghiên c u này là    

nh trình t   o n ng n ng u nhiên (shotgun sequencing) c a vùng b o    

th V4 c a gen mã hóa 16S rRNA b ng h ng MiSeq (Illumina, Inc., San    thDiego, California, USA)

Dc thu vào ng falcon 15ml, ly tâm v i t   10000 rpm trong 10 phút, lo i d ch n i thu sinh kh i và b o qu n -20       oc g i 

  i h c Công ngh     ti n hành tách chi t axit  deoxyribonucleic (DNA), khu  n gen 16S rRNA b ng c p m  i Universal 515F-806R: Uni515F ( -GTG CCA GCM GCC GCG GTA A- 

m c U -GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT- ; và gi i trình t gen [20] C th  c thí nghi   c ti

 Tách chit DNA (s d ng FastDNA SPIN Kit for Soil c a  MP Biomedical, Santa Ana, CA, USA [75]: )

 Lo  i b t p ch t l n v i sinh kh i b ng cách r a v i dung d  m PBS         (Sodium Phosphate Buffer)

 Tách chit DNA b ng  ng d n c a nhà  

s n xu 

- Mng hóa b ng máy siêu âm Vibra-Cell (Sonics & Materials, Inc., USA) Phá t bào b ng cách votex m u v i các lo i h     c khác nhau (h t ceramic 1,4 mm, h t silica 0,1 mm, và h t th y tinh 4 mm) trong ng     

- R a gi i, thu h i DNA tinh s ch bám trên h t silica b ng dung d ch DES       (Deep Eutectic Solvents)

 Kim tra n  DNA sau tách chi t b ng máy quang ph Nanodrop   

2000 (Thermo Fisher Scientific, USA) b ng cách nh gi t 1 m     

c sóng 260/280 c k t qu ng/ và b o qu n m u -20 °C [38]       

 Ph n ng khui gen (Polymerase Chain Reaction - PCR)

 Pha loãng m u DNA t i n ng t 10ng/µl trên b     m TE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)

 Ph n ng PCR khuc th c hi n b ng m i    xuôi Uni515F ( -GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-    c

 -GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-   Premix Ex Taq Hot Start (Takara Bio, Otsu, Japan)

Thi gian 3 phút 45 giây 1 phút 1,5 phút 10 phút

Gi  s n ph m PCR 4°C  n khi ki m tra b    n di và tinh s ch 

 n di ki m tra k t qu PCR có khu   n gen quan tâm có

c kho ng 360bp b ng gel aragose (2%)   TAE (Tris-Acetic-EDTA)

 Tinh sch  s n ph m PCR b ng MinElute PCR purification kit (Qiagen,  Hilden, Germany) ng d n c a nhà s  n xu t 

 Gii trình t gen 

S n ph c pha loãng trong dung dm TE t i n 2.5 nM, ki m tra b ng máy do   DNA  b ng hu nh quang Qubit 3.0 (Thermo Fisher Scientific, USA)

Các mc x  ng dn c a nhà s n xu t MiSeq reagent kit  v.2, và ti n hành gi i trình t b ng h     thng MiSeq

 Phân tích d  li u

D u sau gi i trình t li   c phân tích b i ph n m m QIIME v.1.9.1   Sau khi lo i b các trình t o b ng ph n m m ChimeraSlayer, các trình t         c phân lo phân lo i loài (Operational Taxonomic Units -  OTUs)

vng [11] Các nhóm vi sinh vc phân lo i theo Greengenes database v.13_8