Khảo sát biểu hiện protein tái tổ hợp g CSF trên e coli và nghiên cứu quy trình tinh sạch protein tái tổ hợp g CSF

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỔ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC -o0o - LUẬN VĂN THẠC SĨ KHẢO SÁT BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP G-CSF TRÊN E.COLI VÀ NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP G-CSF GVHD: PGSTS Nguyễn Thúy Hƣơng HV: Đặng Thị Tuyết Ân (11310602) TP Hồ Chí Minh, tháng 8/2012 CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HỒN THÀNH TẠI CÔNG TY TNHH CNSH DƢỢC NANOGEN Cán hƣớng dẫn khoa học: PGS TS NGUYỄN THÖY HƢƠNG (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị, chữ ký) Cán chấm nhận xét 1:…………………………………………………………… (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị, chữ ký) Cán chấm nhận xét 2:…………………………………………………………… (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị, chữ ký) Luận văn thạc sĩ đƣợc bảo vệ trƣờng Đại Học Bách Khoa, ĐHQG Tp Hồ Chí Minh ngày 16 tháng 12 năm 2012 Thành phần hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ PGS TS NGUYỄN ĐỨC LƢỢNG TS PHAN NGỌC HÕA …………………………………… …………………………………… ………………………………… Xác nhận chủ tịch hội đồng đánh giá luận văn trƣởng khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn đƣợc sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƢỞNG KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập – Tự – Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: ĐẶNG THỊ TUYẾT ÂN…………………….MSHV: 11310602 Ngày, tháng, năm sinh: 24/03/1986………………………… Nơi sinh: Quảng Nam Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC……………………Mã số: 604280 I TÊN ĐỀ TÀI: KHẢO SÁT BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP G-CSF TRÊN E.COLI VÀ NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP G-CSF II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:  Tạo dòng gen hg-csf vào vecto pET-26b(+)  Dựng đƣờng cong sinh trƣởng chủng biểu BL21DE3 mang vecto tái tổ hợp pET26b(+)-hg scf  Khảo sát biểu protein hG-CSF  Tinh protein tái tổ hợp G-CSF III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 04/ 11/2011 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 02/07/2012 V CÁN BỘ HƢỚNG DẪN: PGS.TS NGUYỄN THUÝ HƢƠNG Tp Hồ Chí Minh, ngày … tháng…… năm …… CÁN BỘ HƢỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) CHỦ NHIỆM BỘ MÔN (Họ tên chữ ký) LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Thúy Hƣơng, TS Đỗ Minh Sĩ, cô thầy định hƣớng, tận tình dẫn, giúp đỡ, kiểm tra tiến độ làm việc, động viên nhiều suốt trình thực viết luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tổng giám đốc công ty TNHH CNSH Dƣợc Nanogen – anh Hồ Nhân – anh tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành tốt luận văn Tôi xin cám ơn chị Nguyễn Thị Thùy Trang, anh Nguyễn Trƣơng Trọng Nghĩa, chị Lê Thị Thanh Nga, chị Hoàng Thị Linh Sa, bạn Nguyễn Mai Khôi anh chị em thuộc phận R&D, MP công ty TNHH CNSH Dƣợc Nanogen lời cám ơn chân thành Xin cám ơn ngƣời tạo điều kiện, theo sát giúp đỡ để tơi hồn thành phần nhỏ luận văn Tôi xin cám ơn thầy cô trƣờng Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh giúp đỡ năm qua, đặc biệt thầy cô môn Công Nghệ Sinh Học truyền đạt kiến thức nhƣ kinh nghiệm quý báu, tạo điều kiện thuận lợi trình theo học để tơi có đƣợc nhƣ ngày hơm – chân thành cảm ơn! Xin cảm ơn bố mẹ, gia đình ngƣời thƣơng yêu chỗ dựa vững chắc, khuyến khích động viên tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập Cuối cùng, xin gửi đến anh chị, tất bạn bè thân thiết – ngƣời sát cánh tôi, giúp đỡ, động viên nhiều học tập lẫn sống – lời cảm ơn chân thành Tp Hồ Chí Minh tháng năm 2012 Đặng Thị Tuyết Ân TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ hG-CSF (yếu tố kích thích tăng trƣởng tế bào hạt), gồm 174 amino axit, hoocmon kích thích tủy xƣơng sản xuất bạch cầu hạt tế bào gốc, sau đƣa vào máu hG-CSF đƣợc định dùng cho bệnh nhân bị ung thƣ đƣợc điều trị phƣơng pháp hóa trị, bệnh nhân bị giảm bạch cầu trung tính mãn tính nghiêm trọng Trong nghiên cứu này, đoạn gen hg-csf đƣợc dịng hóa vào vector pET26b(+) để tạo thành vector pET26b(+) G-CSF đƣợc chuyển vào chủng biểu BL21(DE3) Dòng tế bào biểu vƣợt mức môi trƣờng LB bổ sung 0,4% glucose, 0,5Mm IPTG, lắc chế độ 250 vòng/phút nhiệt độ 370C thời gian Quá trình tinh protein G-CSF từ thể vùi tế bào E.Coli có độ tinh > 95% protein tổng số thu đƣợc > 1mg/ml pH 3,5 – 4,0 Trọng lƣợng phân tử protein G-CSF sau tinh nằm khoảng 18 – 20 KDa, khơng có lẫn DNA tế bào chủ, khơng có edotoxin có hoạt tính sinh học ABSTRACT hG-CSF (human Granulocyte Colony-Stimulating Factor), consisting of 174 amino acid, is a colony-stimulating factor hormone, to stimulate the bone marrow to produce granulocytes and stem cells G-CSF then stimulates the bone marrow to release them into the blood hG-CSF was approved to treat for cancer patients receiving myelosuppressive chemotherapy, patients with acute myeloid leukemia receiving induction or consolidation chemotherapy patients with severe chronic neutropenia In this study, gene endoing for hG-CSF was cloned to pET26b(+)GCSF expression vector and transformed to E.coli to create E.coli BL21(DE3) GCSF1 strain used to overexpress hG-CSF in LB medium with 0.4% glucose, 0.5mM IPTG, 250rpm, 370C, hours Extraction and purification of hG-CSF procedure archived the recombinant hG-CSF with purity of >95%, total protein concentration >1mg/ml, pH 3.5-4.5, molecular weight of 18-20 KDa, no host cell derived DNA and peptide residue contamination, endotoxin free and the biological activity of 101.13 MU/m MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ vi DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ PHỤ LỤC viii PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nhân tố kích thích dịng tế bào bạch cầu hạt G-CSF 1.1.1 Giới thiệu 1.1.2 Nguồn gốc 1.1.3 Vị trí hình thái 1.1.4 Cấu trúc 1.2 Chức sinh học 1.2.1 Cảm ứng tăng sinh 1.2.2 Kích hoạt biệt hóa 1.2.3 Các tác dụng khác tế bào bạch cầu hạt trung tính trƣởng thành 1.2.4 Tác dụng G-CSF bên hệ thống tế bào máu 1.3 Cơ chế hoạt động 1.4 Ứng dụng 12 1.4.1 Trong phản ứng viêm 13 1.4.2 Trong cấy ghép tế bào/mô/cơ quan 14 1.4.3 G-CSF cấy ghép tế bào mầm 15 1.4.4 Trong điều trị bệnh Neutropenia (bệnh giảm bạch cầu trung tính) 15 1.5 Bệnh giảm bạch cầu trung tính (Neutropenia), nguy bị bệnh giảm bạch cầu trung tính điều trị hóa trị bênh nhân ung thƣ cách điều trị 16 1.5.1 Bệnh giảm bạch cầu trung tính 16 i 1.5.2 Nguy bị bệnh giảm bạch cầu trung tính điều trị hóa trị bệnh nhân ung thƣ 18 1.5.3 Cách điều trị 19 1.6 Tình hình sản xuất hG-CSF giới nhu cầu Việt Nam 20 1.6.1 Tình hình sản xuất hG-CSF giới 20 1.6.2 Tình hình ung thƣ nhu cầu sản xuất hG-CSF tái tổ hợp Việt Nam 23 1.7 Tổng quan tạo dòng biểu protein ngoại lai E.Coli 24 1.7.1 Tổng quan tạo dòng 24 1.7.2 Biểu protein ngoại lai E.coli 25 1.7.2.1 Hệ thống vector biểu pET-26b(+) 25 1.7.2.2 Chủng biểu BL21(DE3) 28 1.8 Các nghiên cứu nƣớc hG-CSF 29 1.8.1 Các nghiên cứu nƣớc 29 1.8.2 Các nghiên cứu nƣớc 31 PHẦN 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 33 2.1 Nguyên vật liệu 33 2.1.1 Thiết bị, dụng cụ 33 2.1.2 Hóa chất 34 2.2 Phƣơng pháp 38 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu chung 38 2.2.2 Nội dung nghiên cứu 40 2.2.3 Các phƣơng pháp phân tích 48 PHẦN 3: KẾT QUẢ 60 3.1 Tạo dòng gen hg-csf vào vector pET-26b(+) 60 3.2 Dựng đƣờng cong sinh trƣởng chủng biểu BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pET26b(+)-hg csf 64 3.3 Khảo sát biểu protein hG-CSF 65 ii 3.3.1 Dựa vào đƣờng cong sinh trƣởng, khảo sát thời điểm biểu IPTG cho kết biểu cao (Thí nghiệm 1) 65 3.3.2 Khảo sát nồng độ IPTG cảm ứng (Thí nghiệm 2) 68 3.3.3 Khảo sát lƣợng glucose bổ sung q trình ni cấy 70 3.3.4 Khảo sát số vịng lắc nhiệt độ q trình cảm ứng 72 3.3.5 Khảo sát thời gian cảm ứng 74 3.3.6 Lên men thu nhận G-CSF quy mơ lít để tiến hành nghiên cứu q trình tinh 76 3.4 Tinh protein hG-CSF 76 3.4.1 Tách chiết G-CSF 76 3.4.2 Tinh G-CSF 80 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 84 TÀI LIỆU THAM KHẢO 85 PHỤ LỤC 89 iii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Quy định chữ viết tắt Kí hiệu/chữ viết tắt Thuật ngữ tiếng Anh Amp Ampiciline Ampr Ampicilline resistance APS Ammonium Persulfate bp base pair DNA Deoxyribonucleoic Acid Triphosphate E.coli Escherichia coli EDTA Ethylenendiamine Tetraacetic Acid IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactoside Kan Kanamycin Kanr Kanamycin resistance Kb kilobase kDA kiloDaltone MCS Multicloning site ORF Open Reading Frame PCR Polymerase Chain Reacton PT7 Promoter T7 RNA Ribonucleic Acid Rnase Ribonuclease iv Deoxyribonucleotide SDS Sodium Dodecyl Sulfate SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Electrophoresis N, N, N, N-Tetramethyl-Ethylenediamine TEMED Quy định mã hóa cho amino acid: Acid Glutamic Glu E Leucine Leu L Alanine Ala A Lysine Lys K Arginine Arg R Methionine Met M Asparagine Asn N Phenylalanine Phe F Aspartic acid Asp D Proline Pro P Cystein Cys C Serin Ser S Glutamine Gln Q Threonine Thr T Glycine Gly G Tryptophan Trp W Histidine His H Tyrosine Tyr Y Isoleucine Ile I Valine Val V v Gel Kết luận kiến nghị Luận văn thạc sĩ CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN: Đề tài “khảo sát biểu protein tái tổ hợp G-CSF E.coli nghiên cứu quy trình tinh protein tái tổ hợp G-CSF” dừng lại kết sau: - Tạo dòng vector pET26b(+) mang gen g-scf đƣợc chuyển vào dòng tế bào biểu E.coli BL21(DE)3 - Khảo sát biểu protein G-CSF dòng tế bào E.coli BL21(DE)3 nhận thấy điều kiện để thu nhận lƣợng protein G-CSF nhiều là: môi trƣờng LB bổ sung 0.4% glucose, bổ sung 0.5mM IPTG sau 2,5 lắc, điều kiện cảm ứng 370C, 250 rpm, thời gian - Sử dụng điều kiện khảo sát để lên men quy mơ lít lƣợng G-CSF thu đƣợc sau tách chiết có nồng độ 42,6 mg/l - Quá trình tinh gồm giai đoạn: tái gấp cuộn, cation lần 1, loại muối, cation lần Quá trình tinh thu đƣợc tổng thể tích mẫu G-CSF 200ml với nồng độ protein tổng số đo phƣơng pháp Bradford 350μg/ml KIẾN NGHỊ: Đề tài dừng lại giai đoạn sau tinh chế kiểm tra độ tinh Để phát triển đề tài, tiếp tục cách kiểm tra hoạt lực G-CSF dòng tế bào NSF60 thử nghiệm động vật hữu nhủ nhƣ chuột, thỏ Quá trình thử nghiệm thuốc sau tinh chế động vật hữu nhủ hƣớng phát triển tốt cần thiết 84 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1) Hill CP, Osslund TD, Eisenberg D (1993) The structure of granulocytecolony-stimulating factor and its relationship to other growth factors Proc Natl Acad Sci USA Vol 90, No 11, pp: 5167-71 2) Rodney Pearlman Y John Wang (1996), Formulation, Characterization and Stability of protein drug, Vol 7, pp: 303-328 3) Dominy BN, Minoux H, Brooks CL 3rd (2004) An electrostatic basic for the stability of thermophilic proteins, Proteins 57: 128 – 141 4) Carulli G (1997) Effects of recombinant human granulocyte colonystimulating factor administration on phenotype and functions, Haematologia 82: 606 – 616 5) Avalos B R (1996), Molecular Analysis of the Granulocyte Colony – Stimulating Factor Receptor, Blood , Vol 88 (3), pp: 761 – 777 6) Garland JM, Quesenberry PJ, Hilton DJ (1997), Colony-stimulating factors: molecular and cellular biology New York: M Dekker 7) Rodney Pearlman Y John Wang (1996), Formulation, Characterization and Stability of protein drug, Vol 7, pp: 303-328 8) Bishop B, Koay DC, Sartorellis AC, Regan L (2001), Reengineering Granulocyte Colony-stimulating factor for enhanced stability, J Biol Chem 276: 33465 – 33470 9) Bishop B, Koay DC, Sartorellis AC, Regan L (2001), Reengineering Granulocyte Colony-stimulating factor for enhanced stability, J Biol Chem 276: 33465 – 33470 10) Jaramillo A, Wernisch L, Hery S, Wodak SJ (2001), Automatic procedures for protein design, Comb Chem High Throughput Screen 4: 643 – 659 - 85 - 11) Belinda R Avalos (1996), Molecular Analysis of the Granulocyte Colony – Stimulating Factor Receptor, Blood , Vol 88, No.3, pp: 761 – 777 12) Tamada T, Honjo E, Maeda Y, Okamoto T, Ishibashi M, Tokunaga M, Kuroki R (2006) Homodimeric cross-over structure of the human granulocyte colonystimulating factor (G-CSF) receptor signaling complex Proc Natl Acad Sci USA Vol 103, No 9: 3135-40 13) Hubel K, Engert A (2003), Clinical applications of granulocyte colonystimulating factor: an update and summary, Ann Hematol 82: 207 – 213 14) Schwartzberg LS (2006) Neutropenia: etiology and pathogenesis Clin Cornerstone Suppl 5: S5-11 15) Kim SK, Demetri GD (1996) Chemotherapy and neutropenia Hematol Oncol Clin North Am 10(2): 377-95 16) Lyman GH (2006), Risks and consequences of chemotherapy-induced neutropenia Clin Cornerstone Suppl 5: S12-8 17) Fernández-Varón E, Villamayor L (2006), Granulocyte and granulocyte macrophage colony – stimulating factors as therapy in human and veterinary medicine, The Veterinary Journal 18) Các thuốc kích thích tạo máu http://www.cimsi.org.vn/CIMSI.aspx?action=Content&MenuChildID=257&ty pe=3 19) Koehl P, Levitt M (1999), De novo protein design I In search of stability and specificity, J Mol Biol 293: 1161 – 1181 20) Pavlou A K, Reichert J M (2004), Recombinant protein therapeutics – success rates, market trends and values to 2010, Nature Biotechnology, Vol 22, No 12, pp: 1513 – 1519 - 86 - 21) Nomura H, Imazeki I, Oheda M, Kubota N, Tamura M, Ono M, Ueyama Y, Asano S (1986), Purification and characterization of human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) The EMBO Journal 5(5), 871 – 876 22) Novagen (2003), pET system manual, 10th edition, 23) Invitrogen, BL21 competent manual 24) Nguyễn Thị Phƣơng Hiếu, Liên Thúy Linh, Trần Linh Thƣớc (2009), Tạo dòng biểu Hg-CSF (Human granulocyte colony stimulating factor) dung hợp với ferritin chuỗi nặng ngƣời E.Coli, tạp chí phát triển Khoa Học Công Nghệ, tập 12, số 25) Trƣơng Lê Na (2008), Tạo dòng biểu protein ngƣời G-CSF hệ thống biểu Pachia pastoris, luận văn thạc sĩ 26) Ali Bahrami cộng (2007), Production of recombinant human granulocyte-colony stimulating factor by Pichia pastoris, Iranian journal of biotechnolory, Vol 5, No 27) Fallah M J, Akbari cộng (2003), Overexpression of Recombinant Human Granulocyte Colony-Stimulating Factor in E coli, Original article, Vol.28, No.3 28) http://www.fermentas.com/en/products/ 29) Avalos B R (1996), Molecular Analysis of the Granulocyte Colony – Stimulating Factor Receptor, Blood , Vol 88 (3), pp: 761 – 777 30) Jaramillo A, Wernisch L, Hery S, Wodak SJ (2001), Automatic procedures for protein design, Comb Chem High Throughput Screen 4: 643 – 659 31) Chiu TL, Goldstein RA (1998), Optimizing potentials for the inverse protein folding problem, Protein Eng 11: 749 – 752 32) Beasley JR, Hecht MH (1997), Protein design: the choice of de novo sequences, J Biol Chem 272: 2031 – 2034 - 87 - 33) Hubel K, Engert A (2003), Clinical applications of granulocyte colonystimulating factor: an update and summary, Ann Hematol 82: 207 – 21 34) F.W Studier, B.A Moffat (1986), Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes, J Mol Biol 189, 113-130 - 88 - PHỤ LỤC Phụ lục 1: Số liệu thô đƣờng cong sinh trƣởng Thời gian (giờ) OD600nm Thời gian (giờ) OD600nm 0.0 0.10 9.5 3.90 0.5 0.15 10.0 3.90 1.0 0.20 10.5 3.91 1.5 0.32 11.0 3.92 2.0 0.61 11.5 3.95 2.5 0.91 12.0 3.84 3.0 1.51 12.5 3.87 3.5 1.90 13.0 3.83 4.0 2.56 13.5 3.82 4.5 2.90 14.0 3.85 5.0 3.26 14.5 3.84 5.5 3.46 15.0 3.80 6.0 3.55 15.5 3.76 6.5 3.71 16.0 3.75 7.0 3.75 16.5 3.70 7.5 3.79 17.0 3.70 8.0 3.84 17.5 3.65 8.5 3.86 18.0 3.63 9.0 3.89 - 89 - Phụ lục 2: Kết so sánh giải trình tự gen sau dịng hóa vào vector pET26b(+) trình tự gen ban đầu - 90 - Phụ lục 3: Kết giải trình tự Sử dụng mồi T7-promotor (forward) - 91 - Sử dụng mồi T7-terminator (mồi reverse) - 92 - Phụ lục 4: Phổ đồ HPLC Phổ chạy đệm: - 93 - Phổ chạy chuẩn G-CSF - 94 - Phổ chạy mẫu G-CSF - 95 - - 96 - ... PROTEIN TÁI TỔ HỢP G- CSF TRÊN E. COLI VÀ NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP G- CSF II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:  Tạo dòng gen hg -csf vào vecto pET-26b(+)  Dựng đƣờng cong sinh trƣởng... triển công nghệ sản xuất G- CSF làm thuốc Trong giới hạn luận văn này, thực nghiên cứu ? ?Khảo sát biểu protein tái tổ hợp G- CSF người E Coli nghiên cứu quy trình tinh protein tái tổ hợp G- CSF? ?? với... trƣờng Việt Nam số quốc gia khác giới Feronsure (IFN) Pegnano (PegIFN) Hiện công ty nghiên cứu thành công số protein tái tổ hợp biểu dòng tế bào động vật tế bào E. coli G- CSF nghiên cứu nghiên cứu