(Luận văn) nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp glycoprotein (gp5) của vius gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (prrsv)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP GLYCOPROTEIN (GP5) lu an CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ va n HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN (PRRSV) p ie gh tn to Mã số: 60 42 02 01 d oa nl w Chuyên ngành: Công nghệ sinh học ll u nf va an lu oi m LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC z at nh z m co l gm @ an Lu Thái Nguyên, 2015 n va ac th Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn cơng trình nghiên cứu tơi dƣới hƣớng dẫn PGS.TS Lê Văn Sơn số liệu, kết nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Tác giả luận văn lu an va n Hà Đăng Chiến p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si ii LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Văn Sơn tận tình bảo hƣớng dẫn tơi suốt q trình triển khai, nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Thầy, Cô giáo – Các nhà khoa học trực tiếp giảng dạy truyền đạt kinh nghiệm, kiến thức khoa học quý báu Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy cô, đồng nghiệp bạn bè tận lu tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành luận văn Tôi an n va trân trọng biết ơn giúp đỡ tn to Tôi xin chân thành cảm ơn cán nghiên cứu thuộc Phịng Cơng gh nghệ DNA ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học p ie Công nghệ Việt Nam giúp đỡ q trình thực luận văn Tơi w xin cám ơn Phịng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen cung cấp oa nl kinh phí, thiết bị nhƣ cho phép tơi sử dụng kết nghiên cứu d thuộc đề tài NV07-PTNTDD2015 an lu va Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô cán sở đào tạo u nf thuộc Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên giúp đỡ tạo ll điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập nhƣ trình oi m z at nh thực đề tài Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình bạn bè ln động viên, giúp z đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu m co l gm @ Tác giả luận văn an Lu n va Hà Đăng Chiến ac th Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu bp Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt Cặp bazơ nitơ Base Pairs Cộng CS lu an n va Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxynucleoside Triphosphate E.coli Escherichia coli EtBr Ethidium Bromide EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid GP5 Glycoprotein IPTG Isopropylthio-β-Galactoside kb Kilobase kDa Kilodalton tn to DNA Môi trƣờng dinh dƣỡng nuôi cấy vi khuẩn Luria Bertani p ie gh LB 2-(N-morpholino)Etansulfonic acid MES Mật độ quang PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus RNA Ribonucleic Acid RNase Ribonuclease SDS Sodium Dodecyl Sulphate TAE Tris-Acetate-EDTA TBS Tris-Buffered Saline TTBS Tween Tris-Buffered Saline d oa nl w Optical Density OD va an lu Hội chứng rối loại hô hấp sinh sản lợn ll u nf Virus gây hội chứng rối loại hô hấp sinh sản lợn oi m z at nh z l gm @ 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-BetaD-Galacto-Pyranoside an Lu X-gal m co Vòng/ phút v/p n va ac th Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iii MỤC LỤC iv DANH MỤC HÌNH vi lu an MỞ ĐẦU va n Lý chọn đề tài tn to p ie gh Mục tiêu nghiên cứu: nl w Nội dung nghiên cứu: d oa Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU lu va an 1.1 Tổng quan PRRS u nf 1.1.1 Khái niệm PRRS ll 1.1.2 Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn m oi 1.1.3 Virus gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (PRRSV) z at nh 1.2 Protein tái tổ hợp 11 z @ gm 1.2.1 Giới thiệu 11 l 1.2.2 Glycoprotein (GP5) 12 m co 1.2.3 Sản xuất protein tái tổ hợp dựa ORF5 13 an Lu 1.2.4 Vector biểu pET 32a(+) chủng biểu BL21 14 n va Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 ac th Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si v 2.1 Vật liệu 16 2.1.1 Nguyên liệu 16 2.1.2 Hóa chất mơi trƣờng 18 2.1.3 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 19 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Tạo dòng gen gp5 19 2.2.2 Tạo vector tái tổ hợp mang gen gp5 21 2.2.3 Phƣơng pháp biểu tinh protein GP5 25 lu an n va Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 gh tn to 3.1 Tạo dịng vector mang gen mã hóa protein GP5 29 p ie 3.2 Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen mã hóa protein GP5 32 oa nl w 3.3 Biểu tinh protein GP5 E.coli 34 d KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41 an lu u nf va Kết luận 41 ll Đề nghị 41 oi m z at nh TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 z m co l gm @ an Lu n va ac th Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hệ gen virus PRRS 10 Hình 2.1 Sơ đồ vector tách dòng pBT 16 Hình 2.2 Cấu trúc vector biểu pET 32a(+) 17 Hình 3.1 Kết qủa điện di sản phẩm colony - PCR khuẩn lạc mang gen GP5 30 Hình 3.2 Kết cắt kiểm tra tinh pBT-GP5 31 lu Hình 3.3 Kết cắt kiểm tra plasmid pET 32a(+) enzyme cắt giới hạn an n va SacI HindIII 32 tn to Hình 3.4 Kết cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp enzyme cắt giới hạn p ie gh SacI HindIII 34 w Hình 3.5 Kết điện di SDS-PAGE dịch nuôi vi khuẩn mang vector tái d oa nl tổ hợp ……… 35 an lu Hình 3.6 Kết phân tích Western blot với kháng thể anti-His-tag (pha u nf va loãng 1:1000 lần) 36 ll Hình 3.7 Khảo sát nồng độ Imidazol để tinh sản phẩm 38 oi m z at nh Hình 3.8 Kết điện di kiểm tra GP5 tinh sắc ký lực Ni-NTA 39 z m co l gm @ an Lu n va ac th Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Tên thiết bị thí nghiệm 19 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 20 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 20 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng cắt pBT mang gen GP5 22 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng cắt pET 32a(+) 22 lu Bảng 2.6 Thành phần phản ứng ghép nối gen 24 an va n Bảng 2.7 Thành phần gel điện di protein (SDS-PAGE) 26 p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (PRRS - Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome), Việt Nam gọi bệnh “lợn tai xanh” (Blue Ear), đƣợc xem bệnh truyền nhiễm nguy hiểm lợn đƣợc ghi nhận giới đƣợc ghi nhận lần Bắc Mỹ năm 1987, lợn mắc bệnh thƣờng bị xung huyết tai, lúc đầu đỏ sẫm sau tím xanh Đặc trƣng bệnh, với lợn cái, PRRS gây hậu nghiêm trọng nhƣ sảy thai, đẻ non, lợn sinh yếu ớt, chết non, tình trạng bệnh lu âm ỉ gây rối loạn sinh sản nhƣ động dục kéo dài, chậm động dục trở lại Đối an va với lợn đực giống, PRRS làm giảm số lƣợng tinh dịch, chất lƣợng tinh dịch n kém, ảnh hƣởng đến tỷ lệ thụ thai chất lƣợng đàn [9] “Lợn tai xanh” gh tn to bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm, virus PRRS (PRRSV), thuộc họ ie Arteriviridae, Nidovirales gây Bệnh lây lan nhanh làm chết nhiều p lợn nhiễm bệnh [1] nl w Hiện nay, PRRS trở thành dịch nhiều nƣớc giới, d oa gây tổn thất nặng nề cho kinh tế PRRS lần đƣợc phát an lu Hoa Kỳ vào năm 1987, châu Âu Đức năm 1990, Hà Lan năm 1991 va châu Á vào đầu năm 1990 [36] Tại Việt Nam, PRRSV đƣợc phát u nf đàn lợn nhập từ Mỹ năm 1997 phản ứng huyết học Gần ll đây, từ tháng năm 2007 đến nay, liên tiếp xảy đợt dịch bệnh nhiều m oi địa phƣơng nƣớc, gây thiệt hại hàng trăm tỷ đồng cho ngành chăn z at nh nuôi phải tiêu huỷ lợn bệnh nhằm ngăn chặn nguồn virus lây nhiễm [7] z Virus PRRS có tính thích ứng cao đại thực bào phổi @ gm Hệ gen PRRSV phân tử RNA sợi đơn dƣơng, có cấu trúc tƣơng tự cấu l trúc Coronavirus, gồm khung đọc mở gối lên mã hóa cho m co protein virus gồm: GP1, GP2, GP3, GP4, GP5, M N Trong số đó, protein GP5 (glycoprotein 5) đƣợc mã hoá ORF5, protein đƣợc an Lu va n Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si glycosyl hoá, gắn với màng bọc ngồi PRRSV, có tính kháng nguyên mạnh chịu trách nhiệm gây bệnh virus Protein GP5 đích chủ yếu kháng thể trung hoà, tham gia vào chế “lẩn tránh” đáp ứng miễn dịch thể vật chủ PRRSV, ngăn cản tƣợng trình diện kháng nguyên virus đại thực bào với tế bào có thẩm quyền miễn dịch đáp ứng miễn dịch dịch thể qua trung gian tế bào (CMI-cell mediated immunity) Ngồi ra, GP5 cịn tham gia tƣợng “chết theo chƣơng trình” (apoptosis) tế bào thể bị nhiễm PRRSV Sự biến đổi GP5 nguyên nhân lu làm gia tăng khả lây nhiễm gây bệnh PRRSV, làm cho bệnh an dịch PRRS ngày phức tạp, làm giảm hiệu phòng bệnh va n vaccine phòng bệnh lƣu hành to gh tn Chính vậy, nghiên cứu protein tái tổ hợp GP5 PRRSV thực ie cần thiết, giúp cho chẩn đoán xác định bệnh sản xuất vaccine tái tổ hợp p hệ nhằm khống chế, giảm bớt thiệt hại virus PRRSV gây nl w Từ sở lý luận khoa học nghiên cứu nhà khoa d oa học nƣớc tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu an lu biểu tinh protein tái tổ hợp glycoprotein (GP5) vius gây Mục tiêu nghiên cứu ll u nf va hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (PRRSV)” oi m Thiết kế đƣợc vector biểu protein tái tổ hợp GP5 Biểu Respiratory Syndrome virus z at nh tinh đƣợc protein tái tổ hợp GP5 Porcine Reproductive and z gm @ Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu tạo dòng vector mang gen gp5: Dựa thông tin l phân lập kiểm tra nhân gen PCR m co trình tự nucleotide gen gp5 công bố, thiết kế cặp mồi phù hợp để an Lu va n Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si 32 đoạn gen Kích thƣớc đoạn gen khoảng 650bp, đoạn gen mã hóa gp5 Tuy nhiên, để thu đƣợc đoạn gen cần tiến hành tinh từ gel agarose (Hình 3.2 B) Trên hình 3.2 B kết sau tiến hành tinh gp5 từ gel agarose kít hãng “Thermo scientific’’ Kết cho thấy băng 650 bp trùng khớp với kích thƣớc gp5 có độ tinh cao, đảm bảo cho thí nghiệm 3.2 Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen mã hóa protein GP5 lu Mở vòng vector pET 32a(+) an n va Vector biểu pET 32a(+) đƣợc xử lý enzyme cắt giới tn to hạn SacI HindIII tạo đầu dính bổ sung với gen gp5 Hỗn hợp đƣợc ủ gh 37oC sau tiến hành điện di kiểm tra gel agarose 1% Kết p ie hình 3.3 d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ Hình 3.3 Kết cắt kiểm tra plasmid pET 32a(+) enzyme cắt giới an Lu hạn SacI HindIII va n Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si 33 Giếng 1, pET 32a(+) gốc, Giếng pET 32a(+) sau cắt enzyme giới hạn SacI HindIII Ở hình 3.3 giếng có hai băng sáng plasmid có cấu trúc dạng xoắn siêu xoắn, giếng thứ có băng sau xử lý enzyme SacI HindIII plasmid chuyển thành dạng thẳng Nhƣ vậy, việc cắt vector pET 32a(+) thành công Tiến hành tinh để loại bỏ thành phần phụ phản ứng cắt mở vòng pET 32a(+) để thực thí nghiệm  Ghép nối plasmid pET 32a(+) với gen gp5 tạo vector tái tổ hợp lu an n va Để thu đƣợc vector tái tổ hợp pET 32a(+) mang gen mã hóa protein tn to GP5 tiến hành phản ứng nối vector pET 32a(+) mở vòng với DNA gp5 ie gh Hỗn hợp phản ứng nối đƣợc ủ tủ ổn nhiệt với nhiệt độ 22oC p thời gian Sau biến nạp vào chủng biểu E.coli BL21 để tạo oa nl w chủng biểu mang vector tái tổ hợp d Plasmid sau đƣợc biến nạp vào vi khuẩn E.coli đƣợc cấy trải an lu va mơi trƣờng LB đặc có bổ sung kháng sinh Carbecicilin (100 mg/ml) nuôi ll u nf 37oC 16 giờ, lựa chọn khuẩn lạc đơn môi trƣờng LB đặc chuyển oi m sang ni mơi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh Carbecicilin (100 hành phản ứng cắt kiểm tra z at nh mg/ml) nuôi 37oC 16 Tiến hành tách plasmid tái tổ hợp tiến z @ l gm  Cắt kiểm tra vector tái tổ hợp pET 32a(+)-gp5 enzyme cắt giới hạn m co Để kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET 32a(+) có mang gen gp5 hay an Lu không Chúng tiến hành cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET 32a(+) va n Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si 34 enzyme cắt giới hạn SacI HindIII kết đƣợc kiểm tra gel agarose 0.8% (Hình 3.4) lu an n va gh tn to Hình 3.4 Kết cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp ie p enzyme cắt giới hạn SacI HindIII nl w M: thang chuẩn 1kb hãng Thermo d oa Giếng 1: pET 32a(+)-gp5 đƣợc xử lý enzyme cắt giới hạn SacI HindIII lu an Từ Hình 3.4 (giếng 1) thấy sau xử lý enzyme cắt giới hạn u nf va SacI HindIII tạo đƣợc băng sáng kích thƣớc xấp xỉ 6kb chứng tỏ plasmid ll pET 32a(+) đƣợc cắt cắt giới hạn SacI HindIII chuyển thành mạch m oi thẳng Một băng có kích thƣớc xấp xỉ 0,65 kb kích thƣớc gp5 z at nh sau cắt enzyme giới hạn SacI HindIII Nhƣ vậy, việc tạo vector tái tổ hợp pET 32a(+) mang gen mã hóa cho protein GP5 thành công Chúng z gm @ tiến hành biểu protein GP5 tế bào E.coli chủng BL21 Biểu protein GP5 m co l 3.3 Biểu tinh protein GP5 E.coli an Lu Quy trình ni cấy biểu gen đƣợc tiến hành theo mô tả phần vật va n Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si 35 liệu, phƣơng pháp Theo lý thuyết GP5 đƣợc biểu số lƣợng lớn dƣới dạng protein dung hợp với Trx (gọi tắt TrxGP5) protein tạo thành có khối lƣợng phân tử khoảng 43 kDa Dịch nuôi chứa E.coli BL21 mang vector pET 32a(+)/gp5 đƣợc ni 16 sau tiếp tục ni biểu môi trƣờng LB lỏng 30oC có bổ sung chất cảm ứng IPTG nồng độ 0,5 mM Kết sau điện di SDS-PAGE (Hình 3.5) cho thấy phân đoạn 43 kDa phân đoạn không xuất mẫu đối chứng cảm ứng IPTG lu an n va p ie gh tn to d oa nl w lu va an Hình 3.5 Kết điện di SDS-PAGE dịch nuôi vi khuẩn u nf mang vector tái tổ hợp ll M: Thang chuẩn hãng Thermo m oi Giếng 1: E.coli BL21mang plasmid tái tổ hợp pET32/Trxgp5 z at nh Giếng DC: E.coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp pET 32a(+) (đối chứng) z Tế bào E coli BL21 mang vector pET 32a(+) không chứa gen ngoại @ gm lai nên protein tái tổ hợp (đối chứng âm) Trên điện di (Hình m co l 3.5) giếng (E coli BL21 mang pET32/Trxgp5) có vạch protein khối lƣợng khoảng 43 kDa đậm tƣơng ứng với kích thƣớc TrxGP5 mà an Lu đƣờng chạy đối chứng khơng có Trong giếng số E.coli BL21 va n Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si 36 mang plasmid tái tổ hợp pET 32a(+) không mang gen GP5 nên khơng thấy xuất vạch vị trí có kích thƣớc 43 kDa Do đó, khẳng định protein tái tổ hợp TrxGP5 đƣợc tổng hợp tế bào E coli có kích thƣớc với kích thƣớc lý thuyết có hàm lƣợng lớn Để tiến hành tinh chế protein cần phải phá vỡ lƣợng lớn tế bào nhằm thu protein tổng số loại bỏ thành phần không cần thiết Kiểm tra biểu protein tái tổ hợp Western blot Để xác định protein, biểu tinh đƣợc GP5/His-tag, tiến hành kỹ thuật lai Western blot sử dụng kháng thể kháng trình tự His-tag với lu an nồng độ pha loãng 1:1000 lần Kết cho thấy dịch chiết tế bào va n thu đƣợc băng protein có kích thƣớc 43kDa (Hình 3.6) Chứng tỏ GP5 tn to đƣợc biểu thành công tế bào E.coli BL21 Kết ie gh việc sử dụng cột sắc ký lực Ni-NTA cho phép tinh đƣợc protein tái p tổ hợp GP5 d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z gm @ Hình 3.6 Kết phân tích Western blot với kháng thể anti-His-tag an Lu 1: phân đoạn thu mẫu m co M: thang chuẩn hãng Thermo l (pha lỗng 1:1000 lần) va n Số hố Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si 37 (-) đối chứng âm Khảo sát nồng độ Imidazol để tinh chế protein tái tổ hợp Cột tinh chế protein đƣợc thiết kế có giá thể gắn với ion kim loại Ni2+ nhờ phức hợp cua, ion có lực lớn với vòng Imidazol histidine Khi cho protein tổng số qua cột, protein có chứa amino acid histidine đƣợc giữ lại cột tƣơng tác Imidazol - Ni2+, cịn protein khơng chứa vòng Imidazol histidine khỏi cột Ái lực ion kim loại protein mạnh hay yếu phụ thuộc vào protein có nhiều lu Histidine khơng Histidine có nằm sát hay khơng Nếu protein an va có nhiều Histidine Histidine nằm gần liên kết chúng n với ion kim loại mạnh gh tn to Vector biểu pET 32a(+) đƣợc thiết kế cho sau dịch mã p ie protein tái tổ hợp có mang Histidine (Hexa histidine) nên chúng có lực w cao với ion Ni2+ Khi cho mẫu chứa protein tổng số qua cột oa nl protein khơng có chứa Histidine khỏi cột, lúc cột d protein có histidine liên kết với ion Ni2+ Nhƣng mức độ liên kết lu va an lại khác protein chứa nhiều amino acid Histidine liên kết với ll u nf ion kim loại mạnh ngƣợc lại oi m z at nh z m co l gm @ an Lu va n Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si 38 Hình 3.7 Khảo sát nồng độ Imidazol để tinh sản phẩm (+): đối chứng dƣơng M: thang chuẩn hãng Thermo Giếng 1: 20 mM Imidazol; giếng 2: 40 mM Imidazol; giếng 3: 60 mM Imidazol; giếng 4: 80 mM Imidazol; giếng 5: 100 mM Imidazol Từ số nghiên cứu thực nghiệm giới tiến hành khảo sát nồng độ Imidazol mức 20 nM đến 100 mM để đạt hiệu cao lu chi phí thấp an n va Khảo sát nồng độ Imidazol mức 20 mM đến 100 mM Có thể tn to thấy, nồng độ 100 mM Imidazol thu đƣợc băng sang đậm Chúng lựa ie gh chọn nồng độ 100 mM Imidazol thu đƣợc lƣợng protein tái tổ hợp p lớn, tốn hóa chất dễ dàng để loại muối thẩm tách oa nl w Tinh protein tái tổ hợp GP5 d Do protein nằm pha dịch tế bào nên sau siêu âm phá tế bào an lu va tiến hành ly tâm loại bỏ phần xác tế bào lắng xuống, thu lấy phần dịch cho trực u nf tiếp qua cột sắc ký lực Ni-NTA Do GP5 đƣợc biểu hệ thống ll vector hiểu pET 32a(+) nên protein đƣợc tạo đƣợc dung hợp với oi m z at nh trình tự gồm amino acid histidine Trình tự His-tag giúp protein tái tổ hợp kết bám vào cột sắc ký, protein khác bị loại bỏ băng dung z dịch rửa chứa Imidazol 100 mM Kết thu đƣợc điện di SDS-PAGE @ gm cho thấy protein GP5 tái tổ hợp đƣợc thu lại dạng tinh sạch, có kích thƣớc 43 m co l kDa tƣơng ứng với kích thƣớc tính tốn lý thuyết (Hình 3.8) an Lu va n Số hố Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si 39 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu m oi Hình 3.8 Kết điện di kiểm tra GP5 tinh sắc ký lực Ni-NTA z at nh z M: Thang chuẩn hãng Thermo Giếng 1: GP5 tinh Imidazol 100 mM Giếng 2: đối chứng (+) Giếng 3: đối chứng (-) l gm @ m co Trên hình 3.8 cho thấy với nồng độ 100 mM Imidazol protein tái tổ hợp thu đƣợc với lƣợng lớn tinh Nhƣ thấy, để tinh chế an Lu protein TrXGP5 dùng Imidazol với nồng độ 100 mM Nhƣ việc va n Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si 40 tinh chế protein tái tổ hợp thành công đạt hiệu xuất cao, tinh đảm bảo cho ứng dụng sau protein tái tổ hợp GP5 nhƣ việc tạo kit chuẩn đoán nhanh dịch bệnh hay tạo sản phẩm có chất vaccine với chất lƣợng tƣơng đƣơng chất lƣợng quốc tế… lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu va n Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1) Đã đƣợc tách dòng thành cơng gen gp5vào vector pBT 2) Gen mã hóa cho protein GP5 đƣợc thiết kế thành công vào vector biểu pET 32a(+) 3) Protein tái tổ hợp GP5 đƣợc biểu tinh cột sắc ký lực Ni-NTA với kích thƣớc 43 kDa lu Đề nghị an n va Với kết thu đƣợc nhƣ trên, đƣa số định 1) Tiếp tục thử nghiệm protein tái tổ hợp làm làm nguyên liệu để sản xuất hợp chất nhƣ vaccine hệ p ie gh tn to hƣớng nghiên cứu nhƣ sau: nl w 2) Nghiên cứu sử dụng kháng nguyên GP5 để tạo kháng thể đặc hiệu d oa nhằm chuẩn đoán nhanh bệnh dịch PRRSV ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu va n Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Tiêu Quang An, Nguyễn Hữu Nam (2011), “ Xác định số vi khuẩn kế phát gây chết lợn vùng dịch lợn Tai xanh huyện Văn Lâm tỉnh Hƣng Yên năm 2010”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 18(3), tr 56 - 64 [2] Bùi Quang Anh, Hoàng Văn Năm, Văn Đăng Kỳ, Nguyễn Văn Long, Nguyễn Ngọc Tiến (2008), Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (Bệnh Tai xanh), Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr - 21 lu [3] Nguyễn Văn Cảm, Nguyễn Tùng, Nguyễn Đăng Thọ, Tống Hữu Hiến an n va (2011), “Điều tra lƣu hành Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (PRRS) 21 - 30 ie gh tn to đàn lợn số tỉnh Việt Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 18(1), tr p [4] Cục Thú y (2008), Báo cáo chẩn đoán nghiên cứu virus gây nl w Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn Việt Nam từ tháng 3/2007 oa đến 5/2008, Hội thảo khoa học phòng chống Hội chứng rối loạn hô d hấp sinh sản lợn, ngày 21 tháng năm 2008, Hà Nội an lu va [5] Nguyễn Tiến Dũng (2011), “Những vấn đề thời Hội chứng rối loạn ll u nf hô hấp sinh sản lợn”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 18(1), tr - 11 m oi [6] Đậu Ngọc Hào, Văng Đăng Kỳ, Nguyễn Văn Long, Tiêu Quang Ân z at nh (2008), “Một số đặc điểm dịch tễ hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn từ cuối tháng đến đầu tháng 7/2008 môt số tỉnh nƣớc”, z gm @ Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 15(5), tr 14-20 l [7] Nguyễn Bá Hiên, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Hữu Nam (2013), “Ngiên m co cứu chọn chủng virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (PRRS) thuật thú y, 20(1), tr -15 an Lu để sản xuất vaccine phòng bệnh Việt Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ va n Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si 43 [8] Lê Thanh Hòa, Lê Thị Kim Xuyến, Đoàn Thị Thanh Hƣơng, Trần Quang Vui, Phạm Cơng Hoạt, Nguyễn Bá Hiên (2009), “ Phân tích gen M mã hóa protein màng vỉus gây PRRS Việt Nam so sánh với chủng Trung Quốc, giới”, Tạp chí Khoa học phát triển, 7(3), tr 282 - 290 [9] Lê Văn Năm (2007), Kết khảo sát bước biểu lâm sàng bệnh tích đại thể bệnh PRRS số địa phương thuộc Đồng Bắc Việt Nam, Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản bệnh liên cầu gây lợn 10/2007, Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội, tr 64 - 77 lu [10] Phạm Ngọc Thạch (2007), Một số tiêu lâm sàng, tiêu máu lợn an mắc Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (bệnh Tai xanh) số n va đàn lợn tỉnh Hải Dương Hưng Yên, Hội thảo khoa học Hội 10/2007, Trƣờng Đại học Nông nghiệp, Hà Nội, tr 25 - 34 gh tn to chứng rối loạn hô hấp sinh sản bệnh liên cầu gây lợn p ie [11] Khuất Hữu Thanh (2006), Kĩ thuật gen - nguyên lý ứng dụng, NXB w KHKT, Hà Nội oa nl [12] Tô Long Thành (2007), “Hội chứng rối loạn sinh sản hơ hấp lợn”, d Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 14 (3), tr 81 - 88 lu an [13] Nguyễn Nhƣ Thanh (2007), Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản, Hội u nf va thảo PRRS bệnh liên cầu khuẩn gây lợn tháng 10/2007, Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội ll oi m [14] Cao Văn Thật, Trần Thị Dân, Trần Thị Bích Liên, Thái Quốc Hiếu, z at nh Nguyễn Văn Hân, Hồ Huỳnh Mai, Nguyễn Thị Mến (2012), “Mức độ nhiễm virus PRRS ảnh hƣởng nhiễm ghép PRRSV-Leptospira lên z suất sinh sản heo nái tỉnh Tiền Giang”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật gm @ thú y, 19(6), tr 17 - 23 l [15] Nguyễn Ngọc Tiến (2011), “Tình hình dịch lợn Tai xanh (PRRS) Việt an Lu 18(1), tr 12 - 20 m co Nam công tác phịng chống dịch”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, va n Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si 44 [16] Cục Thú y (2008), Báo cáo chẩn đoán nghiên cứu virus gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn Việt Nam từ tháng 3/2007 đến 5/2008, Hội thảo khoa học phòng chống hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn, ngày 21 tháng năm 2008, Hà Nội [17] William T.Christianson, Han Soo Joo (2001), “Hội chứng rối loạn sinh sản hơ hấp lợn”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, (2), tr 74 - 87 Tài liệu tiếng Anh [18] Albina E., Madec F., Cariolet R., Torrison J (1994), “Immune response and persistence of the porcine reproductive and respiratory syndrome lu an virus in infected pigs and farm units”, Vet Rec 134, pp 567 - 573 n va [19] Alasdair D I., Bruun R T (2000), Promoter, patent WO 0078975 (PRRS or blue-eares pig disease)”, Vet Rec 130, pp 87 - 89 gh tn to [20] Anonymous (1992), “Porcine reproductive and respiratory syndrome p ie [21] Ansari I H., Kwon B., Osorio F.A., Pattnaik A K (2006), “Influence of N-linked glycosylation of porcine reproductive and respirattory w oa nl syndrome virus GP5 on virus infectivity, antigenicity, and ability to d induce neutralizing antibodies”, J Virol 80, pp 3994 - 4004 lu va an [22] Cancel-Tirado S.M., Evans R.B and Toom K.J (2004), “Monoclonal associated with antibody-dependent ll epitopes u nf antibody analysis of porcine reproductive and respiratory sydrome virus enhancement and m oi neutralization of virus infection” Vet Immunol Immunopathol 102, pp z at nh 249 – 262 z [23] Carson S.D, Konigsberg W.H (1981), Phenyl-Sepharose chromatography of membrane proteins solubilized in Triton X-100 Anal Biochem 116, pp 398-401 l gm @ [24] Collins J E., Benfield D A., Christianson W T., Harris L., Hennings J m co C., Shaw D P., Goyal S M., McCullough S., Morrison R B., Joo S H., an Lu Gorcyca D., Chladek D (1992), “Isolation of swine infertility and va n Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si 45 respiratory syndrome virus (isolate ATCC VR- 2332) in North America and experimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs”, J Vet Diagn Invest 4, pp 117 - 126 [25] Zhang H., Yan Q., Song R., Feng T., Liu L., Zhou L., Lin T (2013), Construction and prokaryotic expression of the fusion gene PRRSV GP5 and Mycobacterium bovis Hsp70 Afri.J Biotech 12(30), pp: 475 – 4760 [26] Jiang W., Jiang P., Wang X., Li Y., Tang J., Wang X., Ma S (2006), “Recombinant adenovirus expressing GP5 and M fusion proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus induce both lu an humoral and cell-mediated immune responses in mice” Vet Immunol n va Immunopathol 113, pp 169 - 180 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 gh tn to [27] Jiang W., Jiang P., Wang X., Li Y., Wang X., Du Y (2007), “Influence p ie glycoprotein N-linked glycans on immune responses in mice” Virus Genes 35, pp 663 - 671 w d oa nl [28] Kegong Tian, Yu X (2007), Emergence of Fatal PRRSV Varants: Unparalleled Outbreaks of Atypical PRRS in China and Molecular Dissection of the Unique Hallmark, PloS ONE 2(6): e526 doi:10 1371/journal pone 0000526 va an lu ll u nf [29] Leman A D (1992), The decision to repopulate In Proceedings Am oi m Assoc Swine Pract pp - 12 z at nh [30] Lin P K T., Brown D.M (1992), “Synthesis of oligodeoxyribonucleotides containing degenrate bases and their use as primers in the Polymerase chain z reaction”, Nucleic Acids Res 19, pp 5149 - 5152 @ m co l gm [31] Lim A., Dimalanta E.T., Potamousis K.D., Apodaca J., Ananthara-man T.S., and Witkin E.M, “Differences in sensitivity to radiation in Escherichia coli” Proc Natl Acad Sci USA 32, pp 59 – 68 [32] Liu C., Liu C.J., Yuan X.G., Zhang C (2013), Purification and characterization of recombinant envelope protein GP5 of porcine an Lu va n Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si 46 reproductive and respiratorry syndrome virus from E.coili J Chromatogr A 23, pp 1304: 133-7 [33] Meulenberg J.J., Petersen den Besten A., de Kluyver E., van Nieuwstandt A., Wensvoort G and Moormann RJ (2004), Molecular characterization of Lelystand virus Vet Microbiol 55, pp 197 – 202 [34] Montpetit M L., Cassol S., Salas T., and O'Shaughnessy M V (1992), “OLIGOSCAN: A computer program to assist in the design of PCR primers homologous to multiple DNA sequences”, J Virol Methods 36, pp 119 - 128 lu [35] Sambrook J., Russell D W (2001), Molecular cloning a Laboratory an n va Manual, 3rd, ed Cold spring harbor laboratory press, cold springhabor NY in the Netherlands: the isolation of Lelystad virus”, The Veterinary gh tn to [36] Wensvoort G., Terpstra C., Pol J M A (1991), “Mystery swine disease p ie Quarterly 13, pp 121 - 130 w Internet oa nl [37] Nguyen Van D., Ken I., Phan Xuan T (2010), Nucleotide Porcine d reproductive and respiratory syndrome virus, GeneBank databases Acc lu 17/10/2010 ll u nf va an No HQ540655, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/311909479, ngày oi m z at nh z m co l gm @ an Lu va n Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th si