(Luận văn) nghiên cứu biểu hiện protein e2 của virus dịch tả lợn cổ điển (classical swine fever) bằng hệ thống baculovirus

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM XENGPHAVONE KHONMANY lu NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN E2 CỦA VI RÚT an n va DỊCH TẢ LỢN CỔ ĐIỂN (CLASSICAL SWINE FEVER) to p ie gh tn BẰNG HỆ THỐNG BACULOVIRUS d oa nl w an lu Chuyên ngành : va 8640101 u nf Mã số Thú y TS Bùi Thị Tố Nga ll Người hướng dẫn khoa học oi m z at nh TS Đặng Vũ Hoàng z m co l gm @ an Lu NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP -2019 n va ac th si LỜI CAM ĐOAN Luận văn sản phẩm khoa học thuộc đề tài “Nghiên cứu sản xuất vắc xin vô hoạt chứa tiểu phần E2 hệ thống Baculovirus phòng bệnh dịch tả lợn” thuộc chương trình Cơng nghệ sinh học nông nghiệp thủy sản Bộ Nông Nghiệp Phát triển nông thôn TS Trần Thị Thanh Hà làm chủ trì Là người tham gia trực tiếp nội dung thuộc đề tài trình bày luận văn này, xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa tác giả khác công bố luận văn, luận án chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng vào luận văn Đề tài có quyền sử dụng kết luận văn để phục vụ cho đề tài lu an Hà Nội, ngày tháng năm 2019 n va Tác giả luận văn gh tn to p ie Xengphavone Khonmany d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th i si LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, tơi nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy cô giáo, cán công nhan viên giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc TS Bùi Thị Tố Nga TS Đặng Vũ Hồng tận tình hướng dẫn, dành nhiều cơng sức, thời gian tạo điều kiện cho suốt trình học tập thực đề tài lu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa Thú y Học viện Nơng nghiệp Việt Nam, , Bộ mơn Hóa sinh - Miễn dịch, Viện Thú y quốc gia (Việt Nam), tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hoàn thành luận văn an n va Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán viên chức Bộ môn Hóa sinh Miễn dịch giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực đề tài p ie gh tn to Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2019 d oa nl w Tác giả luận văn an lu Xengphavone Khonmany ll u nf va oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th ii si MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng viii Danh mục hình ix Trích yếu luận văn x Thesis abstract xiii lu Phần Mở đầu n va 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa khoa học 1.5 Ý nghĩa thực tiễn tn to Tính cấp thiết đề tài gh an 1.1 p ie Phần Tổng quan tài liệu w Hiểu biết vi rút dịch tả lợn (DTL) 2.1.1 Lịch sử bệnh DTL giới 2.1.2 Lịch sử bệnh DTL Việt Nam 2.1.3 Cấu trúc vi rút DTL 2.1.4 Sức đề kháng vi rút DTL 2.2 Bệnh dịch tả lợn 2.2.1 Nguyên nhân gây bệnh DTL 2.2.2 Loài mắc 2.2.3 Phương thức truyền lây 2.2.4 Lứa tuổi mắc bệnh 2.2.5 Chất chứa độc lực vi rút 2.2.6 Triệu chứng 2.2.7 Bệnh tích 11 2.2.8 Phương pháp chẩn đoán bệnh DTL 12 2.2.9 Phòng chống bệnh DTL 17 d oa nl 2.1 ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th iii si 2.3 Vắc xin phòng dịch tả lợn 19 2.3.1 Vắc xin sản xuất nước lưu hành Viêt Nam 19 2.3.2 Vắc xin phép nhập lưu hành Viêt Nam 20 2.4 Ứng dụng hệ thống biểu baculovirus sản xuất protein tái tổ hợp vi rút 21 Phần Đối tượng, nội dung, nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 23 lu an n va Đối tượng nghiên cứu 23 3.2 Nội dung nghiên cứu 23 3.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu 23 3.4 Nguyên liệu nghiên cứu 23 3.4.1 Các loại tế bào 23 3.4.2 Môi trường cho nuôi cấy tế bào 23 3.4.3 Vật liệu, hóa chất, sinh phẩm dùng phản ứng RT-PCR 24 3.4.4 Hóa chất dùng điện di 24 3.4.5 Vật liệu dùng để tách dòng biểu protein tái tổ hợp hệ thống Baculovirus 24 3.4.6 Môi trường, sinh phẩm, máy móc, dụng cụ dùng phản ứng Western blot 24 3.4.7 Máy móc, thiết bị 24 p ie gh tn to 3.1 w Các vật liệu khác 25 3.5 Phương pháp nghiên cứu 25 3.5.1 Phương pháp nhân chủng vi rút DTL theo phương pháp thường quy d oa nl 3.4.8 an lu Kiểm tra đặc tính chủng gốc, xác định có mặt vi rút RT– u nf 3.5.2 va Viện Thú y 25 ll PCR, xác định TCID50 vi rút theo phương pháp thường quy m oi Viện Thú y 25 Thiết kế mồi đặc hiệu gen E2 nhân gen tinh DNA z at nh 3.5.3 phương pháp thường quy 26 Tạo dịng protein mã hóa E2 kít thương mại theo hướng dẫn z 3.5.4 @ gm nhà sản xuất 27 Giải trình tự gen phương pháp Sanger 30 3.5.6 Tạo bacmid chuyển nạp vào tế bào côn trùng SF21AE tạo Baculovirus m co l 3.5.5 tái tổ hợp theo quy trình dẫn nhà sản xuất (bac-to -bac Expression an Lu System), quy trình cơng nghệ Viện Thú y Nhật Bản 30 n va ac th iv si 3.5.7 Phương pháp PCR phát nhanh Baculovirus tái tổ hợp mang Protein E2 tế bào côn trùng (theo công bố Barbara Malitscheck et al., 1999) 31 3.5.8 Phương pháp IPMA sử dụng tế bào côn trùng phát protein E2 tái tổ hợp 32 3.5.9 Phương pháp Western Blot phát protein E2 tái tổ hợp 32 Phần Kết thảo luận 37 4.1 Kết nhân chủng vi rút dtl, kiểm tra đặc tính vi rút chung gốc 37 4.1.1 Kết nuôi cấy tế bào 37 4.1.2 Kết gây nhiễm vi rút DTL dòng tế bào PK15a 38 4.1.3 Kiểm tra đặc tính củng gốc, xác định có mặt vi rút DTL phản lu ứng RT-PCR phát đoạn gene noncoding E2 vi rút DTL phân lập an tế bào PK15a 39 va n 4.2 Thiết kế mồi đặc hiệu khuếch đại protein E2 vi rút dịch tả lợn tn to phương pháp rt-pcr 40 Tạo dịng protein mã hóa E2 vector tách dòng pfastbac, kiểm tra gh 4.3 ie trình tự khung protein biểu 41 p 4.3.1 Tạo dòng gen E2 vi rút dịch tả lợn véc tơ tách dòng pFastBac1/NT- nl w TOPO 41 Tạo Baculovirus tái tổ hợp sử dụng tế bào côn trùng 44 4.3.3 Kiểm tra khả biểu protein tái tổ hợp phương pháp d oa 4.3.2 lu an Immuno Peroxidase Monolayer Assay (IPMA) tế bào trùng Đánh giá hoạt tính sinh học protein E2 tái tổ hợp hệ thống u nf 4.4 va Western Blot 46 ll baculovirus 47 m Kết thực phương pháp Immuno - Peroxidase Monolayer Assay oi 4.4.1 z at nh (IPMA) mẫu huyết thực địa 47 Phần Kết luận kiến nghị 50 Kết luận 50 5.2 Kiến nghị 50 z 5.1 gm @ l Tài liệu tham khảo 51 m co Một số hình ảnh thực đề tài 58 an Lu n va ac th v si DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT an n va % Percentage µl Microliter ml Milliliter µg Microgram μM Micromole ºC Celsius AEC 3- Amino-9-Ethycarbazone ASEAN Association of Southeast Asian Nations ASF African swine fever BDV Border disease virus bp Base Pair BVDV Bovine viral diarrhoea virus cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid CPE Cytopathogenic Effect (Bệnh tích tế bào) ie gh tn to Nghĩa tiếng Việt p lu Chữ viết tắt d Classical swine fever virus an lu dATP Classical swine fever oa CSFV nl w CSF Deoxyadenosine triphosphate va Deoxycytidine triphosphate dGTP Deoxyguanosine triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucelside triphosphate DTH Dịch tả heo DTL Dịch tả lợn dTTP Deoxythymidine triphosphate E.coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine Tetracetic Acid ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay EU European Union ll u nf dCTP oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th vi si an n va IFN Interferon IPMA Immuno - Peroxidase Monolayer Assay IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside LB Luria Bertani MDCK Madin - Darby Canine Kidney DMEM Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium 5’NCR 5' noncoding region NS Nonstructural protein OIE Office Internationale des Epizooties ORF Open Reading Frame PBS Phosphate buffered saline PCR Polymerase Chain Reaction pH Potential of Hydrogen PK15 Porcine Kidney RNA Ribonucleic Acid RT Reverse Transcriptase RT-PCR Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction ie gh tn to Glycoprotein p lu GP nl w Swine Testicular Epitheloid lu 50% Tissue Culture Infectious Dose va an TCID50 d STE Spodoptera frugiperda oa SF21AE Hight FIVE VNT Virus Neutralization Test ll u nf TN5 oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th vii si DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR 27 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng cắt enzyme 29 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng Phương pháp PCR phát nhanh Baculovirus tái tổ hợp mang Protein E2 tế bào côn trùng 31 Bảng 3.4 Thành phần phản ứng Western Blot phát protein E2 tái tổ hợp 33 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th viii si DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Bản đồ tình trạng bệnh DTL nước thành viên tổ chức Thú y giới cập nhật lần cuối vào tháng năm 2018 Hình 2.2 Cấu trúc gen Flavivirus Hình 2.3 Sơ đồ nguyên lý phản ứng RT - PCR 17 Hình 4.1 Tế bào PK15a sau 24 nuôi cấy với độ phóng đại 20X 37 Hình 4.2 Tế bào PK15a gây nhiễm vi rút DTL với độ phóng đại 20X 38 Hình 4.3 Phổ điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR 39 Hình 4.4 Phổ điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR 40 lu Hình 4.5 Cấu trúc vector pFastBac/NT TOPO 41 an Hình 4.6 Sáu khuẩn lạc ngẫu nhiên lựa chọn để kiểm tra khả mang va véc tơ pFastBac_E2 tái tổ hợp 42 n tn to Hình 4.7 Phổ điện di sản phẩm PCR sử dụng mồi đặc hiệu gen E2 khuôn plasmid từ khuẩn lạc lựa chọn 42 gh p ie Hình 4.8 Trình tự gen khung đọc gen E2 vi rút dịch tả lợn chủng VN91 tách dòng 43 w Hình 4.9 Kết so sánh trình tự gen nhận diện lồi sử dụng cơng cụ Blast oa nl trình tự gen E2 vi rút Dịch tả lợn ngân hàng NCBI 44 d Hình 4.10 Sơ đồ chủng biểu gen Baculovirus tái tổ hợp với hệ thống biểuhiện an lu Bac-to-Bac Expression System hãng Invitrogen (Invitrogen, 2008) 44 va Hình 4.11 Sơ đồ bước tái tổ hợp protein E2 vi rút DTL hệ thống biểu u nf Baculovirus 45 ll Hình 4.12 Hình ảnh khuẩn lạc mơi trường chọn lọc chứa kháng sinh chất m oi thi Bluo-gal khuẩn lạc dòng chứa Bacmid z at nh tái tổ hợp 45 Hình 4.13 Phổ điện di sản phẩm PCR 46 z Hình 4.14 Hình ảnh tế bào côn trùng SF21AE nuôi 27oC 72 47 @ Hình 4.15 Kết IPMA sử dụng tế bào côn trùng Hight FIVE nhiễm Baculovirus gm tái tổ hợp mang gen E2 vi rút dịch tả lợn 48 l m co Hình 4.16 Kiểm tra biểu gen E2 Baculovirus tái tổ hợp phương pháp Western Blot sử dụng kháng thể đặc hiệu kháng vi rút dịch tả lợn an Lu Viện Thú y Nhật Bản cung cấp 49 n va ac th ix si Kết thể hình 4.14 lu an Hình 4.14 Hình ảnh tế bào trùng SF21AE ni 27oC 72 va n (A) không gây nhiễm; (B) sau gây nhiễm Bacmid gh tn to Kết hình 4.14 cho thấy xuất bệnh tích tế bào (CPE) sau 72 ni cấy mẫu gây nhiễm Bacmid tái tổ hợp Mẫu đối p ie chứng không gây nhiễm với Bacmid tái tổ hợp phát triển bình thường hồn tồn khơng thấy xuất CPE Kết cho thấy tái tổ hợp thành công w oa nl Baculovirus mang gen E2 vi rút Dịch tả lợn vào tế bào côn trùng d 4.4 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA PROTEIN E2 TÁI TỔ HỢP BẰNG HỆ THỐNG BACULOVIRUS an lu va 4.4.1 Kết thực phương pháp Immuno - Peroxidase Monolayer u nf Assay (IPMA) mẫu huyết thực địa ll Để đánh giá, kiểm tra hoạt tính sinh học protein E2 tái tổ hợp, m oi tiến hành đánh giá phương pháp IPMA sử dụng tế bào trùng dịng Hight FIVE (TN5) nhằm phát có mặt Baculovirus mang protein E2 tái tổ hợp Phương pháp IPMA sử dụng tế bào côn trùng thiết lập mô tả z at nh z nghiên cứu trước chúng tơi (Hồng Phong cs., 2016) @ phù hợp Kết IPMA trình bày hình 4.15 m co l gm Ưu điểm dòng tế bào khả biểu protein cao gấp nhiều lần dòng tế bào khác SF21AE hay SF9 Mặt khác, tế bào TN5 nuôi cấy không cần bổ sung huyết thanh, sử dụng để đánh giá hoạt tính sinh học an Lu n va ac th 47 si lu an n va p ie gh tn to Hình 4.15 Kết IPMA sử dụng tế bào côn trùng Hight FIVE nhiễm Baculovirus tái tổ hợp mang gen E2 vi rút dịch tả lợn (A) huyết chuẩn âm: huyết lợn SPF (specific pathogen free pigs) âm tính với vi rút dịch nl w tả lợn; (B) Huyết chuẩn dương: huyết lợn gây tối miễn dịch với vi rút dịch tả lợn d oa Từ hình 4.15 cho thấy, giếng sử dụng huyết lợn âm tính với vi rút dịch tả lợn nhuộm tế bào không bị bắt màu, ngược lại giếng sử dụng huyết gây tối miễn dịch với vi rút dịch tả lợn tế bào bắt màu nâu đỏ nhuộm Từ thấy protein E2 vi rút dịch tả lợn tái tổ hợp phản ứng mạnh nhận diện kháng thể tự nhiên kháng vi rút dịch tả lợn huyết lợn, khẳng định protein E2 vi rút dịch tả ll u nf va an lu oi m z at nh lợn tái tổ hợp hệ thống baculorvirus mang hoạt tính sinh học tự nhiên z Trong trình biểu tinh khiết protein tái tổ hợp, điểm thiết yếu cần xác định protein biểu có phải xác protein mong muốn m co l gm @ hay khơng Để khẳng định điều đó, chúng tơi sử dụng kỹ thuật lai miễn dịch Western blot với kháng thể đặc hiệu kháng vi rút dịch tả lợn Viện Thú y Nhật Bản cung cấp Tế bào côn trùng ni cấy tạo bệnh tích tế bào Để khẳng định diện protein E2 tái tổ hợp, thu mẫu tế bào từ bắt đầu có bệnh tích ngày kiểm tra phương pháp lai an Lu n va ac th 48 si miễn dịch Western Blot Kết lai miễn dịch Western Blot thể qua hình 4.16 cho thấy, đường chạy protein số 2, 3, xuất băng màu đậm, rõ nét có kích thước khoảng 37kDa đậm giếng thứ tương đương với sau ngày gây nhiễm, kích thước protein E2 vi rút dịch tả lợn dung hợp với His-tag tính toán lý thuyết Vậy lần khẳng định protein E2 tái tổ hợp biểu hệ thống Baculovirus hồn tồn mang đặc tính sinh học tự nhiên lu an n va p ie gh tn to d oa nl w lu ll u nf va an Hình 4.16 Kiểm tra biểu gen E2 Baculovirus tái tổ hợp phương pháp Western Blot sử dụng kháng thể đặc hiệu kháng vi rút dịch tả lợn Viện Thú y Nhật Bản cung cấp oi m M: thang chuẩn (đơn vị kDa) z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 49 si PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu đây, với sở lý luận phân tích chúng tơi đưa kết luận sau: 1) Đã nhân thành công chủng vi rút DTL VN91 kiểm tra đặc tính vi rút chủng gốc 2) Đã thiết kế thành công cặp mồi đặc hiệu khuếch đại gen E2 vi rút DTL tinh DNA 3) Tạo dịng gen mã hóa E2 vector tách dịng pFastBac, kiểm tra trình lu tự khung gen biểu an 4) Tạo bacmid mang gen E2 vi rút DTL va n 5) Chúng chuyển nạp thành công bacmid vào tế bào côn trùng tn to SF21AE, tạo Baculovirus tái tổ hợp mang protein E2 p ie gh 6) Tái tổ hợp thành công protein E2 vi rút dịch tả lợn hệ thống biểu Baculovirus Protein E2 tái tổ hợp hệ thống biểu Baculovirus mang đầy đủ đặc tính sinh học tự nhiên (được nhận diện kháng thể kháng w oa nl vi rút DTL) d 5.2 KIẾN NGHỊ lu an Từ nghiên cứu đạt chúng tơi có đề xuất sau: u nf va 1) Tiếp tục nghiên cứu phát triển vắc xin tái tổ hợp protein E2 dùng phòng bệnh dịch tả lợn Việt Nam ll oi m 2) Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng kháng nguyên protein E2 tái tổ hợp dùng kháng nguyên tái tổ hợp (rELISA) z at nh chẩn đoán phát kháng thể kháng vi rút DTL ELISA sử dụng z m co l gm @ an Lu n va ac th 50 si TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt: Bùi, Q A (2001) "Nghiên cứu dịch tễ học bệnh dịch tả lợn (Classical swine fever) biện pháp phòng chống số tỉnh thuộc vùng Bắc Trung Bộ." Truy cập ngày 13/11/2018f web: http://luanan.nlv.gov.vn/luanan? a=d&d= TTbFfqyuOzqS2001&e= -vi-20 img-txIN -# Dân, T T., T T B Liên, N T C Tuyền H T T Lao (2000) "Biểu lâm sàng bệnh tích DTL lợn giết thịt lị mổ." Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y (5) tr 6-10 Dat, D T., N T Dung, N D Du, D V Tien, V K Bang va T T T Lien (1985) lu an "Ve tinh hinh dich te cua benh dich ta lon co dien o Viet Nam va van de phong va chong." Khoa Hoc va Ky Thuat Thu Y n Dat, D T and T T T Lien (1985) "Mot so net dac trung ve dich te hoc va benh to Dũng, N T (1999) "Dịch tả lợn cổ điển vấn đề thời sự." Tạp chí khoa học p Thuat Thu Y ie gh tn ly lam sang benh dich ta lon co dien o Viet Nam hien nay." Khoa Hoc va Ky Duyên, N T P., Đ V Khuyên and D Đ Quân (2000) "Thăm dò phát kháng oa nl w kỹ thuật Thú y 4(2) nguyên kháng thể dịch tả lợn phương pháp ELISA." Tạp chí khoa học kỹ d Hồng, Đ V., T Q Phong, T T Thanh Hà, N T Huyền, N T Lương, Đ T va an lu thuật Thú y 7(1) tr.6-10 u nf Kiều Anh, N T Duyên, N T Vinh and K Takehiro (2016) "Ứng dụng hệ thống ll biểu Baculovirus nhằm sản xuất protein ORF2 tái tổ hợp virus PCV2." m oi Khoa học kỹ thuật Thú y 28(2) tr 14 Lowings, P., G Ibata, J Needham and D Paton (1996) "Classical swine fever z at nh virus diversity and evolution." Journal of General Virology 77(6) tr 1311-1321 Lương, N (1997) Dịch tễ học Thú y phần chuyên khoa Học viện Nông nghiệp, z @ Navetco (2018) "Dịch tả heo tế bào nhược độc đông khô Truy cập19/11/2018 từ: l 10 gm Hà Nội NXB Nông nghiệp, Hà Nội m co http://www.navetco.com.vn/vi/sanpham/d%E1%BB%8Bch-t%E1%BA%A3-heot%E1%BA%BF-b%C3%A0o-nh%C6%B0%E1%BB%A3c- an Lu %C4%91%E1%BB%99c-%C4%91%C3%B4ng-kh%C3%B4 n va ac th 51 si 11 Nguyễn, T D., T H Hồ T L Ngô (2002) "Về miễn dịch mang trùng vi rút dịch tả lợn." Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y (2) tr 6-16 12 Nguyễn, T H C Đ T Trần (2005) "Xác định vai trò bệnh dịch tả heo hội chứng tiêu chảy kéo dài heo số trại chăn ni tập trung An Giang." Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y 12 (2) tr 40-45 13 Nuôi, B V (2018) "Thuốc thú y Bio – LHC chữa bệnh gì? Cho gì? Giá bán bao nhiêu? Truy cập ngày 19/11/2018, từ: https://benhvatnuoi.com/thuoc-thu-ybio-lhc-chua-benh-gi-cho-con-gi-gia-ban-bao-nhieu/ 14 Nuôi, B V (2018) "Thuốc thú y Dịch tả lợn đông khô chữa bệnh gì? Cho gì? Giá bán bao nhiêu? Truy cập ngày 19/11/2018, từ: ttps://benhvatnuoi.com/thuocthu-y-dich-ta-lon-dong-kho-chua-benh-gi-cho-con-gi-gia-ban-bao-nhieu/ lu an 15 Nuôi, B V (2018) "Thuốc thú y Hog Cholera Cell Culture Live chữa bệnh gì? va Cho gì? Giá bán bao nhiêu? Truy cập ngày 19/11/2018, từ: n https://benhvatnuoi.com/thuoc-thu-y-hog-cholera-cell-culture-live-chua-benh-gi- to tn cho-con-gi-gia-ban-bao-nhieu/ Nuôi, B V (2018) "Thuốc thú y Porcilis CSF live chữa bệnh gì? Cho gì? Giá ie gh 16 p bán bao nhiêu? Truy cập ngày 19/11/2018, từ: https://benhvatnuoi.com/thuocNuôi, B V (2018) "Thuốc thú y Porcilis Pesti chữa bệnh gì? Cho gì? Giá oa nl 17 w thu-y-porcilis-csf-live-chua-benh-gi-cho-con-gi-gia-ban-bao-nhieu/ bán bao nhiêu? Truy cập ngày 19/11/2018, từ: https://benhvatnuoi.com/thuoc- d Nuôi, B V (2018) "Thuốc thú y Vacxin dịch tả lợn chữa bệnh gì? Cho gì? va 18 an lu thu-y-porcilis-pesti-chua-benh-gi-cho-con-gi-gia-ban-bao-nhieu/ u nf Giá bán bao nhiêu? Truy cập ngày 19/11/2018, từ:https://benhvatnuoi.com/thuoc- ll thu-y-vacxin-dich-ta-lon-chua-benh-gi-cho-con-gi-gia-ban-bao-nhieu-2/ m Nuôi, B V (2018) "Thuốc thú y Vacxin dịch tả lợn chữa bệnh gì? Cho gì? oi 19 z at nh Giá bán bao nhiêu? Truy cập ngày 19/11/2018, từ: ttps://benhvatnuoi.com/thuocthu-y-vacxin-dich-ta-lon-chua-benh-gi-cho-con-gi-gia-ban-bao-nhieu/ Phạm, H S (2005) "Tình hình cảm nhiễm dịch tả lợn giết mổ ThừaThiên - z 20 @ Thanh Hà, T T., L Đ Việt, N T Huyền, N T Lương, Đ T Kiều Anh, Đ V l 21 gm Huế Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y 12(1) tr 6-11 m co Hoàng K Takehiro (2017) "Đánh giá ảnh hưởng tiềm interferon alpha đáp ứng miễn dịch lợn tiêm kháng nguyên GP5 tái tổ hợp an Lu virus tai xanh." Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y 24 (1) tr n va ac th 52 si 22 Trần Anh Đào, B (2009) "Một số đặc điểm bệnh lý lợn mắc bệnh dịch tả." Tạp chí Khoa học Phát triển 7(2): 165-170 23 TRUNG, P V T Y M (2018) "Hướng dẫn sử dụng vắc xin dịch tả lợn nhược độc-đông khô Truy cập ngày 19/11/2018, từ: http://phanvienthuy.com.vn/vi/product/vac-xin-dich-ta-lon-3/ 24 Vetvaco (2018) "Vắc-xin dịch tả lợn nhược độc đông khô Truy cập ngày 19/11/2018, từ: from https://vetvaco.com.vn/vac-xin-vetvaco/vacxin-dich-ta-lon-nhuoc-doc-dongkho.html II Tài liệu tiếng Anh: 25 AMAVET, C T C P K D T T Y (2018) "BIO-LHC VX DỊCH TẢ HEO." Retrieved 19/11/2018, 2018, from: http://www.amavet.com.vn/san-pham-cho-gia- lu an suc/vaccin/bio-lhc-vx-d-ch-t-heo.html va 26 Bai, B., X Lu, J Meng, Q Hu, P Mao, B Lu, Z Chen, Z Yuan and H Wang n (2008) "Vaccination of mice with recombinant Baculovirus expressing spike or to immune responses." Molecular immunology 45(4) pp 868-875 ie gh tn nucleocapsid protein of SARS-like coronavirus generates humoral and cellular Bhaskar, N., C Ravishankar, R Rajasekhar, K Sumod, T Sumithra, K John, M p 27 w Mini, R Ravindran, S Shaji and J Aishwarya (2015) "Molecular typing and oa nl phylogenetic analysis of classical swine fever virus isolates from Kerala, India." VirusDisease 26(4) pp 260-266 d Bian, T., Y Sun, M Hao, L Zhou, X Ge, X Guo, J Han and H Yang (2017) "A an lu 28 va recombinant type porcine reproductive and respiratory syndrome virus between u nf NADC30-like and a MLV-like: genetic characterization and pathogenicity for ll piglets." Infection, Genetics and Evolution 54 pp 279-286 m Blome, S., I Grotha, V Moennig and I Greiser-Wilke (2010) "Classical swine fever oi 29 z at nh virus in South-Eastern Europe—Retrospective analysis of the disease situation and molecular epidemiology." Veterinary microbiology 146(3-4) pp.276-284 Crauwels, A., M Nielen, A Elbers, J Stegeman and M Tielen (2003) z 30 @ gm "Neighbourhood infections of classical swine fever during the 1997–1998 Dahle, J and B Liess (1992) "A review on classical swine fever infections in m co 31 l epidemic in The Netherlands." Preventive veterinary medicine 61(4) pp.263-277 pigs: epizootiology, clinical disease and pathology." Comparative immunology, an Lu microbiology and infectious diseases 15(3) pp 203-211 n va ac th 53 si 32 Deng, M.-C., C.-C Huang, T.-S Huang, C.-Y Chang, Y.-J Lin, M.-S Chien and M.-H Jong (2005) "Phylogenetic analysis of classical swine fever virus isolated from Taiwan." Veterinary microbiology 106(3-4) pp 187-193 33 Desai, G., A Sharma, R Kataria, N Barman and A Tiwari (2010) "5'-UTRbased phylogenetic analysis of Classical swine fever virus isolates from India." Acta virologica 54(1) pp 79-82 34 DUNNE, H W (1975) "Hog cholera." Diseases of swine pp.189-255 35 E.P.S, E P S (2018) "HOG CHOLERA VAC." Retrieved 20/11/2018: from http://www.epsvn.com/san-pham/13/hog-cholera-vac.html 36 Floegel, G., A Wehrend, K Depner, J Fritzemeier, D Waberski and V Moennig lu (2000) "Detection of classical swine fever virus in semen of infected boars." an Veterinary microbiology 77(1-2) pp 109-116 n va Fuchs, F (1968) "Schweinepest." Handbuch der virusinfektionen bei Tieren 3: 38 Hanson, R (1957) "Origin of hog cholera." Journal of the American Veterinary gh tn to 37 Hanvet (2018) "Vắc xin Dịch tả lợn." Retrieved 19/11/2018, 2018, from p ie 39 Medical Association 131(5) pp 211 Hoffmann, B., M Beer, C Schelp, H Schirrmeier and K Depner (2005) nl w 40 http://hanvet.com.vn/vn/scripts/prodView.asp?idproduct=310&title=-page.html oa "Validation of a real-time RT-PCR assay for sensitive and specific detection of d classical swine fever." Journal of virological methods 130 (1-2) pp 36-44 lu Hu, J and C Zhang (2014) "Porcine reproductive and respiratory syndrome virus va an 41 u nf vaccines: current status and strategies to a universal vaccine." Transboundary and ll emerging diseases 61 (2) pp.109-120 Hulst, M., D Westra, G Wensvoort and R Moormann (1993) "Glycoprotein E1 oi m 42 z at nh of hog cholera virus expressed in insect cells protects swine from hog cholera." Journal of Virology 67 (9) pp 5435-5442 Koenen, F., G Van Caenegem, J Vermeersch, J Vandenheede and H Deluyker z 43 @ gm (1996) "Epidemiological characteristics of an outbreak of classical swine fever in Koroleva, N., P Spirin, A Timokhova, P Rubtzov, S Kochetkov, V Prasolov m co 44 l an area of high pig density." Veterinary Record 139 (15) pp.367-371 and S Beljelarskaya (2010) "Baculovirus vectors for efficient gene delivery and an Lu expression in mammalian cells." Molecular Biology 44 (3) pp 479-487 n va ac th 54 si 45 Leifer, I., H Everett, B Hoffmann, O Sosan, H Crooke, M Beer and S Blome (2010) "Escape of classical swine fever C-strain vaccine virus from detection by C-strain specific real-time RT-PCR caused by a point mutation in the primerbinding site." Journal of virological methods 166 (1-2) pp 98-100 46 Leifer, I., B Hoffmann, D Höper, T B Rasmussen, S Blome, G Strebelow, D Höreth-Böntgen, C Staubach and M Beer (2010) "Molecular epidemiology of current classical swine fever virus isolates of wild boar in Germany." Journal of General Virology 91(11) pp 2687-2697 47 Lin, S.-Y., Y.-C Chung and Y.-C Hu (2014) "Update on Baculovirus as an expression and/or delivery vehicle for vaccine antigens." Expert Review of Vaccines 13 (12) pp 1501-1521 lu an 48 Mesplède, A and E Albina (1997) "Le point sur la peste porcine classique: va épidémiologie et contrôle." POINT VETERINAIRE 28 pp 25-36 n 49 Meyers, G., T Rümenapf and H.-J Thiel (1989) "Molecular cloning and nucleotide to tn sequence of the genome of hog cholera virus." Virology 171(2): 555-567 Meyers, G., H.-J Thiel and T Rümenapf (1996) "Classical swine fever virus: ie gh 50 p recovery of infectious viruses from cDNA constructs and generation of w recombinant cytopathogenic defective interfering particles." Journal of virology 51 oa nl 70 (3) pp 1588-1595 Moennig, V (2000) "Introduction to classical swine fever: virus, disease and d Moennig, V., G Floegel-Niesmann and I Greiser-Wilke (2003) "Clinical signs va 52 an lu control policy." Veterinary microbiology 73 (2-3) pp 93-102 u nf and epidemiology of classical swine fever: a review of new knowledge." The ll Veterinary Journal 165 (1) pp 11-20 m Oleksiewicz, M B., T B Rasmussen, P Normann and Å Uttenthal (2003) oi 53 z at nh "Determination of the sequence of the complete open reading frame and the 5′ NTR of the Paderborn isolate of classical swine fever virus." Veterinary @ Park, C., T Kim, K Choi, J Jeong, I Kang, S J Park and C Chae (2017) "Two gm 54 z microbiology 92 (4) pp 311-325 l Commercial Type Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus m co (PRRSV)‐Modified Live Vaccines Reduce Seminal Shedding of Type PRRSV but not Type PRRSV in Infected Boars." Transboundary and emerging diseases an Lu 64 (1) pp.194-203 n va ac th 55 si 55 Paton, D and I Greiser-Wilke (2003) "Classical swine fever–an update." Research in veterinary science 75(3) pp.169-178 56 Paton, D., A McGoldrick, I Greiser-Wilke, S Parchariyanon, J.-Y Song, P Liou, T Stadejek, J Lowings, H Björklund and S Belak (2000) "Genetic typing of classical swine fever virus." Veterinary microbiology 73 (2-3) pp 137-157 57 Pearson, J (1992) "Hog cholera diagnostic techniques." Comparative immunology, microbiology and infectious diseases 15.(3) pp 213-219 58 Postel, A., S Schmeiser, J Bernau, A Meindl-Boehmer, G Pridotkas, Z Dirbakova, M Mojzis and P Becher (2012) "Improved strategy for phylogenetic analysis of classical swine fever virus based on full-length E2 encoding sequences." Veterinary research 43 (1) pp 50 lu an 59 Sabogal, Z Y., J D Mogollón, M A Rincón and A Clavijo (2006) va "Phylogenetic analysis of recent isolates of classical swine fever virus from n Colombia." Virus research 115 (1) pp 99-103 Sakoda, Y., S.-i Ozawa, S Damrongwatanapokin, M Sato, K Ishikawa and A gh Fukusho (1999) "Genetic heterogeneity of porcine and ruminant pestiviruses tn to 60 ie p mainly isolated in Japan." Veterinary microbiology 65(1): 75-86 Sarma, D K., N Mishra, S Vilcek, K Rajukumar, S P Behera, R K Nema, P w 61 oa nl Dubey and S C Dubey (2011) "Phylogenetic analysis of recent classical swine fever virus (CSFV) isolates from Assam, India." Comparative immunology, d Singh, V K and K K Rajak (2017) "Phylogenetic analysis of Classical swine va 62 an lu microbiology and infectious diseases 34 (1) pp 11-15 u nf fever virus from archival formalin fixed clinical tissues reveals vietnamese origin ll of the isolates." VirusDisease 28 (1) pp 121-125 m Snijder, E J., M Kikkert and Y Fang (2013) "Arterivirus molecular biology and oi 63 64 z at nh pathogenesis." Journal of General Virology 94(10) pp 2141-2163 Sun, S Q., S H Yin, H C Guo, Y Jin, Y J Shang and X T Liu (2013) z "Genetic typing of classical swine fever virus isolates from China." @ Terpstra, C (1991) "Hog cholera: an update of present knowledge." British 66 m co Veterinary Journal 147 (5) pp 397-406 l 65 gm Transboundary and emerging diseases 60 (4) pp 370-375 van Oers, M M and J M Vlak (2007) "Baculovirus genomics." Current drug an Lu targets (10) pp 1051-1068 n va ac th 56 si 67 Van Oirschot, J (1999) Hog cholera Encyclopedia of virology 68 Van Oirschot, J (2003) "Vaccinology of classical swine fever: from lab to field." Veterinary microbiology 96 (4) pp 367-384 69 Wentink, G and C Terpstra (1999) "Congress report on progress in pestivirus virology." Veterinary quarterly 21 (4) pp 163-165 70 Wikipidia (2018) "Classical swine fever." Retrieved 14/11/2018, 2018, from https://en.wikipedia.org/wiki/Classical_swine_fever 71 Zhou, J.-X., J.-D Xue, T Yu, J.-B Zhang, Y Liu, N Jiang, Y.-L Li and R.-L Hu (2010) "Immune responses in pigs induced by recombinant canine adenovirus expressing the glycoprotein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus." Veterinary research communications 34 (4) pp 371-380 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 57 si MỘT SỐ HÌNH ẢNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI lu an n va p ie gh tn to Hình Hình ảnh hóa chất cho ni cấy tế bào PK15a d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu Hình Hình ảnh bước thực ni cấy tế bào n va ac th 58 si lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ Hình Hình ảnh bước nghiền mẫu, phân lập gây nhiễm vi rút an Lu n va ac th 59 si Hình Vật liệu, hóa chất, sinh phẩm dùng phản ứng RT-PCR lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu Hình Các bước thực phản ứng RT-PCR n va ac th 60 si Hình Hình ảnh hóa chất dùng điện di lu an n va p ie gh tn to d oa nl w lu ll u nf va an Hình Các bước thực chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR oi m z at nh z m co l gm @ Hình Hình ảnh thực phương pháp Immuno - Peroxidase Monolayer an Lu Assay (IPMA) mẫu huyết thực địa n va ac th 61 si