(Luận văn) nghiên cứu đặc tính sinh học và sinh học phân tử của chủng virus cường độc kty prrs 06 gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM HỒNG THỊ THẢO lu an n va NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ SINH HỌC tn to PHÂN TỬ CỦA CHỦNG VIRUS CƯỜNG ĐỘC p ie gh KTY-PRRS-06 GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN d oa nl w HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN an lu nf 60 64 01 01 oi lm ul Mã số : Thú y va Ngành : Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS Nguyễn Hữu Nam z at nh z m co l gm @ an Lu NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 n va ac th si LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan, giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 10 tháng 11 năm 2016 Tác giả luận văn lu an n va p ie gh tn to Hoàng Thị Thảo d oa nl w oi lm ul nf va an lu z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th i si LỜI CẢM ƠN Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy, Cơ giáo - người tận tình dạy dỗ, hướng dẫn giúp đỡ suốt trình tơi học tập Học viện Nơng nghiệp Việt Nam thời gian thực luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Hữu Nam, người hướng dẫn khoa học, giúp đỡ nhiệt tình có trách nhiệm tơi q trình thực đề tài hoàn thành luận văn lu an Lời cảm ơn xin gửi tới Bộ môn Bệnh lý - Khoa Thú y - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam, anh, chị, em phịng Thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú y - Khoa Thú y nơi thực đề tài tạo điều kiện để tơi hồn thành đề tài tốt n va đỡ tơi q trình hồn thành luận văn gh tn to Cuối xin cảm ơn tới gia đình, bạn bè đồng nghiệp động viên, giúp p ie Hà Nội, ngày 10 tháng 11 năm 2016 d oa nl w Tác giả luận văn an lu oi lm ul nf va Hoàng Thị Thảo z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th ii si MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng viii Danh mục hình ix lu Trích yếu luận văn x an Thesis Abstract xi va n Phần Mở đầu Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục đích nghiên cứu gh tn to 1.1 p ie Phần Tổng quan tài liệu Tình hình nghiên cứu Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn 2.1.1 Tình hình dịch PRRS giới nl w 2.1 Tình hình dịch PRRS Việt Nam 2.1.3 Những nghiên cứu dịch PRRS nước 2.1.4 Những nghiên cứu dịch PRRS Việt Nam 2.2 Virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (PRRSV) 2.2.1 Hình thái, cấu tạo virus PRRS 2.2.2 Phân loại virus PRRS 10 2.2.3 Khả gây bệnh virus PRRS 11 2.2.4 Sức đề kháng virus PRRS 11 2.2.5 Đặc tính ni cấy virus PRRS 12 2.3 Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản 12 2.3.1 Đặc điểm chung 12 2.3.2 Động vật cảm nhiễm 13 2.3.3 Chất chứa mầm bệnh 13 2.3.4 Cơ chế sinh bệnh phương thức truyền lây 13 2.3.5 Triệu chứng lâm sàng lợn mắc PRRS 15 d oa 2.1.2 oi lm ul nf va an lu z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th iii si 2.3.6 Bệnh tích lợn mắc PRRS 17 2.3.7 Các phương pháp chẩn đoán PRRS 18 2.3.8 Biện pháp phòng trị bệnh 19 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 21 lu an va 3.1 Đối tượng, địa điểm thời gian nghiên cứu 21 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 21 3.1.3 Địa điểm nghiên cứu 22 3.1.4 Thời gian nghiên cứu 22 3.2 Nội dung nghiên cứu 22 3.2.1 Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng virus KTY-PRRS-06 qua n 40 đời cấy chuyển môi trường tế bào Marc-145 22 Nghiên cứu số đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTYPRRS-06 qua 40 đời cấy chuyển môi trường tế bào Marc-145 22 3.3 Phương pháp nghiên cứu 22 3.3.1 Nuôi cấy virus KTY-PRRS-06 môi trường tế bào Marc-145 22 oa 3.3.3 Phương pháp xác định hiệu giá virus TCID50 24 nl 3.3.2 w p ie gh tn to 3.2.2 Xác định đường cong sinh trưởng virus PRRS qua đời cấy d an lu chuyển 24 Phương pháp tách chiết RNA tổng số hệ gen virus PRRS 24 3.3.5 Phương pháp RT- PCR 25 3.3.6 Phương pháp giải trình tự Gen 27 3.3.7 Phương pháp đọc kết 28 oi lm ul nf va 3.3.4 z at nh Phần Kết thảo luận 29 Kết nghiên cứu chủng virus prrs nghiên cứu 29 4.1.1 Kết lựa chọn mẫu PRRS cho nghiên cứu 29 4.1.2 Kết kiểm tra khả tạp nhiễm với loại virus khác 32 4.2 Kết nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng virus KTY- z 4.1 l gm @ PRRS-06 33 m co Kết xác định khả gây bệnh tích tế bào qua đời cấy chuyển 33 4.2.2 Kết xác định hiệu giá chủng virus KTY-PRRS-06 36 an Lu 4.2.1 n va ac th iv si 4.3 Kết nghiên cứu số đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTY-PRRS-06 39 4.3.1 Kết tách chiết RNA tổng số chủng virus KTY-PRRS-06 40 4.3.2 Kết giải trình tự đoạn ORF5 chủng virus KTY-PRRS-06 41 4.3.3 Kết nghiên cứu so sánh trình tự nucleotide qua đời cấy chuyển 43 4.3.4 Kết nghiên cứu so sánh trình tự axit amin virus KTY-PRRS-06 qua đời cấy chuyển 47 4.3.5 Kết xây dựng sinh học phân tử 50 Phần Kết luận kiến nghị 52 lu an va 5.1 Kết luận 52 5.2 Kiến nghị 52 n Tài liệu tham khảo 53 p ie gh tn to d oa nl w oi lm ul nf va an lu z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th v si DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT lu an n va Chữ viết đầy đủ BED Blue Ear disease BLAST Basic Local Alignment Search Tool Bp Base pair CNSH Công nghệ sinh học CPE Cyto Pathogenic Effect DMEM Dulbecco,s Modified Eagle’s Medium DMSO Dimethylsulfoxide DNA Deoxynucleotide Acid dNTP Deoxynucleotide triphotphat EAV Equine Arteritis virus p ie gh tn to Từ viết tắt w Ethylenediaminetetraacetic Acide oa nl EDTA Enzyme Linked Immunosortbent Assay d ELISA Fetal Bovine Serum va Fetal Calf Serum ul nf FCS an lu FBS Glycoprotein IFA Indirect Immunofluoresence Assay kDa Kilodalton LDHV Lactate Dehydlogenase – elevating virus Log Logarit (cơ số 10) MEGA5 Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 5.10 MOI Multiplicity Of Infection mRNA Acid Ribonucleic thông tin oi lm GP z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th vi si lu an n va Mistery Swine Disease OIE Tổ chức thú y giới ORF Open Reading Frame (khung đọc mở) PAM Pulmnary Alveolar Macrophage PBS Phosphate Buffer Saline PCR Polymerase Chain Reaction PEARS Porcine Endemic Abortion and Respiratory Syndrome PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus RNA Ribonucleic Acid RT- PCR Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction SHFV Simian Hemorrhaghic Fever Virus TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 p ie gh tn to MSD oa nl w Virus Neutralization Test d VNT oi lm ul nf va an lu z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th vii si DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Protein cấu trúc PRRSV 10 Bảng 2.2 Sức đề kháng virus với điều kiện ngoại cảnh 11 Bảng 3.1 Thành phần thể tích cho phản ứng RT- PCR 25 Bảng 3.2 Các cặp mồi cho phản ứng RT- PCR 26 Bảng 3.3 Chu kỳ nhiệt độ cho phản ứng RT- PCR 26 Bảng 4.1 Mẫu lợn nghi mắc PRRS thu thập 29 Bảng 4.2 Kết chẩn đoán RT- PCR lợn nghi mắc PRRS 31 lu an Bảng 4.3 Hồ sơ giống virus PRRS lựa chọn nghiên cứu 32 va Bảng 4.4 Kết xác định có mặt virus PRRS, CSF, FMD, FED, TGE 32 n Bảng 4.5 Kết xác định khả gây bệnh tích tế bào chủng virus KTYBảng 4.6 Hiệu giá chủng virus KTY-PRRS-06 thời điểm thu hoạch 37 ie gh tn to PRRS-06 qua đời cấy chuyển 33 p Bảng 4.7 Hiệu giá chủng virus KTY-PRRS-06 qua đời cấy chuyển 38 w Bảng 4.8 Sai khác vị trí nucleotide đời chủng KTY-PRRS-06 46 oa nl Bảng 4.9 So sánh tương đồng nucleotide virus KTY-PRRS-06 qua đời cấy chuyển 46 d an lu Bảng 4.10 Sai khác vị trí axit amin đời chủng KTY-PRRS-06 49 Bảng 4.11 So sánh tương đồng axit amin virus KTY-PRRS-06 va oi lm ul nf đời cấy chuyển 49 z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th viii si DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Bản đồ lịch sử xuất PRRS giới Hình 2.2 Cấu trúc hạt PRRS virus Hình 2.3 Cấu trúc hệ gen virus PRRS Hình 2.4 Virus PRRS xâm nhập phá hủy tế bào đại thực bào 14 Hình 4.1 Tế bào Marc-145 chưa gây nhiễm virus 35 Hình 4.2 Bệnh tích tế bào sau 36 gây nhiễm 35 Hình 4.3 Bệnh tích tế bào sau 48 gây nhiễm 35 lu an Hình 4.4 Bệnh tích tế bào sau 60 gây nhiễm 35 va Hình 4.5 Bệnh tích tế bào sau 72 gây nhiễm 35 n Hình 4.6 Đường cong sinh trưởng virus KTY-PRRS-06 37 Hình 4.8 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết RNA tổng số 40 gh tn to Hình 4.7 Log10 hiệu giá chủng virus KTY-PRRS-06 39 p ie Hình 4.9 Kết phản ứng RT- PCR với mồi ORF5 41 chủng KTY-PRRS-06 đời cấy chuyển thứ 10 43 nl w Hình 4.10 Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide đoạn gen ORF5 oa Hình 4.11 So sánh trình tự nucleotide chủng KTY-PRRS-06 qua đời d cấy chuyển 45 lu an Hình 4.12 So sánh trình tự axit amin chủng KTY-PRRS-06 qua đời nf va cấy chuyển 48 oi lm ul Hình 4.13 Cây sinh học phân tử chủng virus KTY-PRRS-06 51 z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th ix si Sản phẩm điện di cho vạch DNA tương ứng với 683bp theo thiết kế mồi Kết tạo DNA chủng KTY-PRRS-06 qua đời cấy chuyển thành công Như khẳng định xác có mặt virus PRRS mẫu nuôi cấy chuyển đời môi trường tế bào Marc -145 Kết giải trình tự gen đời cấy chuyển Sau tiến hành kỹ thuật RT- PCR thu sản phẩm tiến hành tinh sản phẩm phản ứng RT- PCR Kit để loại bỏ hết thành phần dư thừa sau phản ứng Sản phẩm sau tinh DNA virus cloning với loại mồi đơn (mồi xuôi mồi ngược) để nhân nhanh lu số lượng theo chiều đoạn gene an va Tinh sản phẩm phản ứng PCR giải trình tự Kit cung cấp n nhà sản xuất, sau tiến hành giải trình tự gene Quá trình giải trình tự phịng Thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú Y - Khoa Thú Y Kết biểu gh tn to thực nhờ vào máy giải trình tự Beckman coulter CEQ 8000 Mỹ p ie thị chương trình Geneetyx trình bày minh họa hình 4.10 Qua hình 4.10 cho thấy chất lượng giải trình tự tương đối tốt, đỉnh màu nl w giản đồ thể loại nucleotide, loại nucleotide khác tiếp oa nhận thuốc nhuộm huỳnh quang khác đọc tia laser cho hiển thị d màu tương ứng Adenine cho màu đỏ, Thymine cho màu xanh, Guanine lu an cho màu xanh cây, Cytosine cho màu đen Sau giải trình tự, chuỗi va nucleotide thu xử lý phần mềm phân tích máy tính Sau oi lm PRRS-06 có độ dài 603bp ul nf phân tích chúng tơi thu tồn đoạn gen ORF5 chủng virus KTYNhư việc tách chiết RNA tổng số, trình thực RT- PCR giải z at nh trình tự thực thành cơng Trình tự nucleotide đoạn gen ORF5 chủng qua đời nghiên cứu định z m co l gm @ an Lu n va ac th 42 si lu an n va p ie gh tn to d oa nl w oi lm ul nf va an lu z at nh z @ l gm Hình 4.10 Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide đoạn gen ORF5 chủng KTY-PRRS-06 đời cấy chuyển thứ 10 m co 4.3.3 Kết nghiên cứu so sánh trình tự nucleotide qua đời cấy chuyển an Lu Để nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTY-PRRS06 Chúng tơi tiến hành giải trình tự đoạn gen ORF5 chủng virus nghiên cứu đời cấy chuyển thứ 10, 20, 30, 40 để xác định tương đồng n va ac th 43 si nucleotide đời cấy chuyển, qua thấy cụ thể mức độ biến đổi thành phần, trật tự nucleotide biến đổi cấu trúc gen chủng virus KTY-PRRS-06 qua đời cấy chuyển Chuỗi gen mà chúng tơi tiến hành giải trình tự thành cơng có kích thước 603bp dùng làm chuỗi truy cập chương trình BLAST ngân hàng gen quốc tế nhằm tìm kiếm chuỗi đích đăng ký ngân hàng gen dựa vào mức độ tương ứng nucleotide Kết so sánh trình tự nucleotide chủng qua đời nghiên cứu xử lý phần mềm Genetyx thể hình 4.11 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w oi lm ul nf va an lu z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 44 si lu an n va p ie gh tn to d oa nl w oi lm ul nf va an lu z at nh Hình 4.11 So sánh trình tự nucleotide chủng KTY-PRRS-06 đời cấy chuyển z Qua hình 4.11 thấy thành phần nucleotide đời cấy chuyển chủng virus khơng có thay đổi có thay đổi khơng gm @ m co l đáng kể khác từ đến nucleotide, cụ thể sau: - Đời P0 đời P10 có trình tự nucleotide giống - Đời P20, P30 đời P40 có trình tự nucleotide giống Sự sai khác đời P0, P10 so với đời P20, đời P30 đời P40 an Lu tổng hợp bảng 4.8 n va ac th 45 si Bảng 4.8 Sai khác vị trí nucleotide đời chủng KTY-PRRS-06 Vị trí sai khác P0 P10 P20 P30 P40 97 A A G G G 135 A A G G G 168 A A G G G 177 A A T T T 280 C C G G G 287 G G T T T 351 A A G G G 405 T T C C C 490 G G A A A 10 519 C C G G G 11 587 A A T T T lu STT an n va p ie gh tn to Qua bảng 4.8 cho thấy, sai khác vị trí nucleotide 603 nucleotide theo thứ tự trình tự thu nhận chủng virus KTY-PRRS-06 đời P0 P10 so với đời P20, P30 P40 11 vị trí sau: 97 (A ↔ G); 135 (A ↔ G); 168 (A ↔ G); 177 (A ↔ T); 280 (C ↔ G); 287 (G ↔ T); 351 (A nl w oa ↔ G); 405 (T ↔ C); 490 (G ↔ A); 519 (C ↔ G); 587 (A ↔ T) d Từ kết giải trình tự đoạn gen ORF5 chủng PRRS nghiên cứu lu va an đời cấy chuyển tiến hành thu thập xử lý chương trình MEGA5 để so sánh mức độ tương đồng nucleotide đời cấy chuyển Kết ul nf thể bảng 4.9 oi lm Bảng 4.9 So sánh tương đồng nucleotide virus KTY-PRRS-06 P0 - ORF5 z at nh đời cấy chuyển P10 - ORF5 P20 - ORF5 P30 - ORF5 P40 - ORF5 z 100,00 P10 - ORF5 100,00 100,00 P20 - ORF5 98,15 98,15 100,00 P30 - ORF5 98,15 98,15 100,00 P40 - ORF5 98,15 98,15 100,00 m co l gm @ P0 - ORF5 100,00 an Lu 100,00 100,00 n va ac th 46 si Qua bảng 4.9 cho thấy: - Mức độ tương đồng nucleotide đoạn gen ORF5 đời P0 P10 100%; đời P20, P30 P40 100% - Độ tương đồng nucleotide đoạn gen ORF5 đời P0 P10 so với đời P20, P30 P40 98,15% Như vậy, sau cấy chuyển qua 40 đời chủng virus KTY-PRRS06 tương đồng nucleotide đạt tỷ lệ cao 4.3.4 Kết nghiên cứu so sánh trình tự axit amin virus KTY-PRRS- lu 06 qua đời cấy chuyển an va Những sai khác trình tự nucleotide ba mã hóa dẫn đến n sai khác thành phần axit amin (cứ nucleotide mã hóa cho axit thay đổi nucleotide mà khơng dẫn đến thay đổi axit amin số axit gh tn to amin - nucleotide gọi mã hóa) nhiên có p ie amin nhiều ba nucleotide mã hóa Chính vậy, đơi sai khác nucleotide lại không dẫn đến sai khác axit amin nên không làm nl w thay đổi cấu trúc protein mã hóa gen d oa Tuy nhiên, có sai khác nucleotide dẫn đến sai khác lu mã hóa hệ sai khác axit amin thay đổi tính an chất protein tạo axit amin nguyên nhân phát sinh nf va biến dị di truyền thay đổi tính gây bệnh virus oi lm ul Để nghiên cứu toàn diện đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTY-PRRS-06 sau xác định trình tự nucleotide cần xác định tiếp z at nh thành phần axit amin đoạn gen để có kết xác biến đổi mức độ phân tử chủng virus KTY-PRRS-06 qua đời cấy chuyển z Từ trình tự nucleotide đoạn gen thu được, tiến hành xác định trình gm @ tự axit amin đoạn gen ORF5 dựa mã vi khuẩn bậc thấp (Bacterial code) có ngân hàng gen so sánh trình tự axit amin chủng virus KTY- m co l PRRS-06 qua đời cấy chuyển Kết so sánh trình bày hình 4.12 an Lu n va ac th 47 si lu an n va p ie gh tn to d oa nl w oi lm ul nf va an lu z at nh Hình 4.12 So sánh trình tự axit amin chủng KTY-PRRS-06 đời cấy chuyển z Qua hình 3.12 chúng tơi thấy trình tự axit amin đoạn gen ORF5 chủng virus KTY-PRRS-06 đời nghiên cứu có kích thước 200 axit amin @ m co l gm Cũng giống với trình tự nucleotide, trình tự axit amin đoạn gen ORF5 chủng virus KTY-PRRS-06 đời P0 đời P10 giống nhau; đời P20, P30 P40 giống an Lu Sự sai khác diễn đời P0, P10 so với đời P20, P30, P40 thể bảng 4.10 n va ac th 48 si Bảng 4.10 Sai khác vị trí axit amin đời chủng KTY-PRRS-06 STT Vị trí sai khác P0 P10 P20 P30 P40 33 N N D D D 59 K K N N N 94 P P A A A 96 G G V V V 164 G G R R R 196 Q Q L L L lu an n va Từ kết so sánh cho thấy thành phần axit amin đời cấy chuyển chủng virus khơng có thay đổi có thay đổi khơng p ie gh tn to Qua bảng 4.10 chúng tơi thấy, sai khác trình tự axit amin chủng KTYPRRS-06 đời P0 P10 so với đời P20, P30 P40 vị trí gồm axit amin thứ 33 (N ↔ D); axit amin thứ 59 (K ↔ N); axit amin thứ 94 (P ↔ A); axit amin thứ 96 (G ↔ V); axit amin thứ 164 (G ↔ R); axit amin thứ 196 (Q ↔ L) đáng kể d oa nl w Kết giải trình tự đoạn gen ORF5 chủng virus KTY-PRRS-06 trình tự axit amin tương ứng xác định, thu thập sử dụng chương trình Genetyx để so sánh tỷ lệ đồng thành phần axit amin chủng v iru s KTY-PRRS-06 qua đời cấy chuyển Kết trình bày nf va an lu bảng 4.11 oi lm ul Bảng 4.11 So sánh tương đồng axit amin virus KTY-PRRS-06 đời cấy chuyển z at nh P0 - ORF5 P10 - ORF5 P20 - ORF5 P30 - ORF5 P40 - ORF5 100,00 P10 - ORF5 100,00 100,00 P20 - ORF5 96,88 96,88 100,00 P30 - ORF5 96,88 96,88 100,00 P40 - ORF5 96,88 96,88 100,00 z P0 - ORF5 m co l gm @ 100,00 an Lu 100,00 100,00 n va ac th 49 si Qua bảng 4.11 cho thấy sau cấy chuyển qua 40 đời chủng virus KTY-PRRS-06 tương đồng axit amin đạt tỷ lệ cao Cụ thể, mức tương đồng trình tự axit amin đoạn gen ORF5 đời P0 P10 100%; đời P20, P30 P40 100%; đời P0 P10 so với đời P20, đời P30, đời P40 96,88% Tóm lại, từ kết phân tích thành phần nucleotide, axit amin so sánh đời cấy chuyển chủng virus nghiên cứu chúng tơi nhận thấy trình tự nucleotide axit amin đời cấy chuyển khơng có sai khác có sai khác khơng đáng kể Điều chứng tỏ chủng virus KTY-PRRS-06 có lu an ổn định đặc tính di truyền đời cấy chuyển n va 4.3.5 Kết xây dựng sinh học phân tử chủng virus PRRS phân lập chủng tham chiếu, tiến hành xây gh tn to Qua việc so sánh mức độ tương đồng nucleotide axit amin ie dựng sinh học phân tử để xác định nguồn gốc phát sinh chủng virus p KTY-PRRS-06 Kết phân tích nguồn gốc phát sinh chủng PRRS nghiên nl w cứu trình bày hình 4.13 oa Từ kết so sánh thành phần nucleotide axit amin chủng virus d KTY-PRRS-06 Dựa chương trình ClustalW chúng tơi tiến hành xác định an lu nguồn gốc phát sinh chủng PRRSV nghiên cứu để phân tích nguồn gốc nf va phát sinh chủng PRRS nghiên cứu oi lm ul Kết phân tích nguồn gốc phát sinh cho thấy: Chủng virus KTY-PRRS-06 nằm nhánh phát sinh với chủng virus 374KTY, 352KTY, HTP0, nằm nhánh phát sinh khác với chủng 171KTY z at nh thuộc nhánh chủng virus PRRS Trung Quốc (GU980186) Chủng virus nghiên cứu không nằm nhánh phát sinh chủng z @ virus Bắc Mỹ VR-2332 nhánh Châu Âu - Lelystad Điều phù hợp với gm kết nghiên cứu trước sai khác nucleotide axit amin m co l chủng virus với Các chủng virus PRRS Singapore, Thái Lan đưa vào phả an Lu hệ Tuy nhiên, chúng không nằm nguồn gốc phát sinh với chủng virus KTY-PRRS-06 n va ac th 50 si Như vậy, lập sơ đồ phả hệ phân tích nguồn gốc phát sinh nghiên cứu so sánh với số chủng khu vực giới dựa trình tự chuỗi gen ORF5 cho thấy Chủng virus KTY-PRRS-06 có nguồn gốc phát sinh với chủng PRRSV Trung Quốc, không nguồn gốc phát sinh với chủng VR-2332 EF488048China 171KTY 20 Vaccine GU980185 lu TRICHOTOMY an 52 GU980186 va 33 HTP1TY n 87 347KTY to 86 tn 24 352-KTY 26 gh KTY - PRRS - 06 ie p GU980179China GU980182China nl w 27 oa AF184212Sing d 100 an lu 100 DQ489311Eur va 70 96 nf oi lm ul 100 Lelystad 50 AF176463USA z at nh 39 AF046869USA 100 100 z AF176461USA @ 78 AF176348 VR-2332 46 m co l gm 73 AF066183 94 DQ056373Thailand an Lu ac th 51 n va Hình 4.13 Cây sinh học phân tử chủng virus KTY-PRRS-06 si PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Sau thời gian nghiên cứu Phịng thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú y, thu số kết luận đặc tính sinh học sinh học phân tử chủng virus KTY-PRRS-06 sau: Đặc tính sinh học chủng virus KTY-PRRS-06 sau 40 đời cấy chuyển: lu 1.1 Khả gây bệnh tích tế bào chủng virus nghiên cứu có tính ổn định cao qua đời cấy chuyển môi trường Marc-145 1.2 Chủng virus PRRS có hiệu giá cao ổn định, có khả phát triển nhân lên tốt môi trường tế bào Marc-145 Hiệu giá virus thu cao an n va gh tn to thời điểm 72 sau gây nhiễm Đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTY-PRRS-06 sau 40 đời cấy chuyển: p ie 2.1 Xác định trình tự nucleotide đoạn gen ORF5 chủng virus sau đời cấy chuyển liên tục Đoạn gen ORF5 quy định kháng nguyên GP5 chủng virus KTY-PRRS-06 có kích thước 603 bp mã hóa cho 200 axit amin protein kháng nguyên GP5 nl w d oa 2.2 Trình tự nucleotide axit amin đoạn gen ORF5 chủng nghiên cứu qua đời cấy chuyển môi trường tế bào Marc-145 ổn định, mức độ tương đồng nucleotide từ 98,15 % đến 100%; axit amin từ 96,88% oi lm ul nf 5.2 KIẾN NGHỊ va an lu đến 100% z at nh Để góp phần hồn thiện đề tài nghiên cứu chúng tơi có số kiến nghị sau: z Triển khai thực đề tài phạm vi rộng nghiên cứu với nhiều chủng PRRS nhằm thu kết toàn diện hơn, đánh giá chủng gây bệnh chủ yếu nước ta gm @ m co l Tiếp tục nghiên cứu để giải trình tự gen đoạn gen lại virus PRRS tiến tới giải trình tự tồn hệ gen virus phát biến chủng để chế tạo vacin có hiệu phòng bệnh cao an Lu n va ac th 52 si TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Cục Thú Y (2007) Báo cáo Hội thảo khoa học phịng chống hội chứng Rối loạn hơ hấp sinh sản lợn ngày 21 tháng năm 2008, Hà Nội Cục Thú Y (2008) Báo cáo Hội thảo khoa học phòng chống hội chứng Rối loạn hô hấp sinh sản lợn ngày 21 tháng năm 2008, Hà Nội Lê Văn Năm (2007) Kết khảo sát bước đầu biểu lâm sàng bệnh tích đại thể bệnh PRRS số địa phương thuộc đồng Bắc Bộ Việt Nam Hội lu an thảo Hội chứng rối loạn hô hấp - sinh sản bệnh liên cầu khuẩn lợn ngày va 11/10/2007 ĐH Nông Nghiệp Hà Nội n Nguyễn Bá Hiên Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2007) Một số hiểu biết virus gây hội gh tn to chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp- sinh sản bệnh liên cầu khuẩn lợn ngày 11/10/2007 ĐH Nông Nghiệp Hà Nội ie p Nguyễn Bá Hiên, Trần Xuân Hạnh, Phạm Quang Thái Hoàng Văn Năm (2011) w Công nghệ chế tạo sử dụng văc xin Thú y Việt Nam Nhà xuất Nông oa nl nghiệp, Hà Nội d Nguyễn Hữu Nam Nguyễn Thị Lan (2007) Hội chứng rối loạn sinh sản hô lu an hấp, Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản bệnh liên cầu gây lợn nf va tháng 10/2007 Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội oi lm ul Nguyễn Thị Hoa (2011) Nghiên cứu số đặc tính sinh học phân tử chủng virus gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (PRRS) phân lập vùng phụ cận Hà Nội Luận văn thạc sĩ nông nghiệp Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội z at nh Nguyễn Thị Lan (2011) Nghiên cứu số đặc tính sinh học phân tử chủng virus gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (PRRS) phân lập vùng phụ cận z gm @ Hà Nội Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội tr.79 l Nguyễn Thị Lan Lương Quốc Hưng (2012) Nghiên cứu số đặc tính sinh học m co virus gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (PRRS) phân lập đàn an Lu lợn ni số tỉnh phía Bắc Việt Nam Tạp chí Khoa học Phát triển Nơng thôn (2) tr 82 – 88 n va ac th 53 si 10 Lê Thị Toan, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Hữu Nam, Phạm Hồng Ngân Lê Văn Hùng (2016) Đặc tính sinh học chủng virus PRRS (KTY - PRRS - 05) phân lập Việt Nam qua đời cấy chuyển Tạp chí Nơng nghiệp Việt Nam 2016 tập 14 số tr 605 – 612 11 Nguyễn Thu Trang (2015) Khảo sát số đặc tính sinh học chủng vi rút nhược độc PRRS Hanvet1.VN Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp Học viện Nông nghiệp Việt Nam Tr 32 – 34 12 Nguyễn Văn Thanh (2007) Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (PRRS) Hội lu thảo Hội chứng rối loạn hô hấp - sinh sản bệnh liên cầu khuẩn lợn ngày an 11/10/2007 ĐH Nông Nghiệp Hà Nội n va 13 Phạm Ngọc Thạch Đàm Văn Phải (2007) Một số tiêu lâm sàng, tiêu máu to lợn mắc hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (bệnh tai xanh) số đàn lợn ie gh tn tỉnh Hải Dương Hưng Yên Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp - sinh sản bệnh liên cầu khuẩn lợn ngày 11/10/2007 ĐH Nông Nghiệp Hà Nội p 14 Tô Long Thành Nguyễn Văn Long (2008) Kết chẩn đoán nghiên cứu gây w hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn Việt Nam từ tháng 3/2007 đến oa nl 5/2008 Tạp chí KHKT Thú y 15 (5) Tr - 13 d 15 William T.Christianson and Han Soo Joo (2001) Hội chứng rối loạn hô hấp sinh lu an sản lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome – PRRS) Tạp chí ul Tiếng Anh: nf va KHKT Thú y tập VIII - số – 2001 Tr 74 - 86 oi lm 16 A A.Bưtner, B.Strandbygaard, K.J sứrencen, M.B Oleksiewicz and T Storgaard, (2000) Distinction between ìnfections with European and American/vaccin type z at nh PRRS virus after vaccination with a modified - live PRRS virus vaccin Vet.Ré (31) pp.72 - 72 z @ 17 Anette botner (1997) Diagnosis of PRRS, Veterinary Microbiology 55 pp.295 gm - 301 l 18 Benfield, D.A., Nelson, E., Collins, J.E., Harris, L., Goyal, S.M., Robison, D., m co Christianson, W.T., Morrison, R.B., Gorcyca, D., and Chladek, D (1992) an Lu Characterization of swine infertility and respiratory syndrome (SIRS) virus (isolate ATCC VR-2332) Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 4.pp 127-133 n va ac th 54 si 19 Bush J.A., N.I berlin, W.N.Jensen, A.B bill, G.E Cart Wright and M.M Wintrobe (1995) Erythocyte life Span in Graving Swin as Determined by glycine J Exp.Med 20 Calvert Jay G, Slade David E, Shields Shelly L, Jolie Rika, Mannan Ramasamy M, Ankenbauer Robert G, Welch Siao-Kun W (2007) CD163 expression confers susceptibility to porcine reproductive and respiratory syndrome viruses Journal of virology 81 (14): 7371-9 doi:10.1128/JVI.00513-07 21 Collin JE, Benfield DA, Christianson ƯT, Harris L, Hennings JC, Shaw DP, Goyal SM, McCullough S, Morrison RB, Joo HS, Gorcyca D, Chladek D (1992) Isolation lu of swine infertility and respiratory syndrome virus (isolate ATCC VR - 2332) in an North America and experimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs J va n Vet Diagn Invest Pp 17- 126 tn to 22 Eichhorn G and J.W Frost (1997) Study on the Suitability of Sow Colostrum for (PRRS) Journal of Veterinary Medicine Series B – Infectious Diseases and p ie gh the Serological Diagnosis of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Veterinary Public Health nl w 23 Joo Han Soo (1997) Low pathogenicity PRRS live virus vacxinnes and methods of d oa preparation therepj an lu 24 Kamakawaa A, HTV and Yamada S (2006) Vet Microbiol 118: 47 – 56 25 Kegong Tian, Xiuling Yu and Tiezhu Zhao (2007) Emergence of Fatal PRRSV va ul nf Variants: Unparalleled Outbreaks of Atypical PRRS in China and Molecular oi lm Disection of the Unique Hall Mark 26 Kim, H.S., Kwang, J., Joo, H.S and Frey, M.L (1993) Enhanced replication of z at nh porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in a homogeneous subpopulation of MA-104 cell line Arch Virol 133 pp 477-483 z 27 Meulenberg, J.J.M., Hulst, M M., De Meijer, E J., Moonem, P L J M., Den @ gm besreten, A., De Kluyver, E P., Wensvoort, G., and Moormann and R J M (1993) l Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory m co syndrome (PEARS) is related to LDV and EAV Virology 192.pp 62-74 28 Lan N.T., Yamaguchi, R., Kai, K., Uchida, K., Kato, A and Tateyam, S (2005) an Lu The growth profiles of three types of canine distemper virus on Vero cells n va ac th 55 si expressing canine signaling lymphocyte activation molecule Journal of veterinary medical science 67(5) pp 491-495 29 Lunney Joan K (2007) Advances in swine biomedical model genomics International journal of biological sciences (3).pp 179-84 30 Nelsen, C.J., Murtaugh, M.P., Faaberg and K.S (1999) Porcine reproductive and respiratory syndrome virus comparison: divergent evolution on two continents J Virol 73 (1).pp 270-80 31 Paton DJ and Brown IH (1991) Blue ear disease of pigs Vet Ree 128 pp.617 32 Rossow KD (1998) Porcine reproductive and respiratory syndrome, J Vet Pathol lu an 35 pp.1-20 va 33 Segales.J, Piella J and Macro E (1998) Vet Rec 142 pp 483-486 n 34 Tian K, Yu, Zhao (2007) Emergence of fatal PRRS variants: unparalleled to tn outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique ie gh hallmark PLoS ONE (6), e526 doi: 10.137l/jouARNl Pone.0000526 p 35 Zimmerman JJ., Yoon, KJ., Willis RW And Swenson SL (1997) General overview w of PRRSV: A perspective from the United States Veterinary Microbiology 55.pp d oa nl 187- 196 oi lm ul nf va an lu z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 56 si