Xây dựng lý thuyết và thực nghiệm nhằm định danh một số loài nấm thuộc chi nấm ký sinh côn trùng bằng sinh học phân tử kết hợp sinh tin học nghiên cứu khoa học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA XÉT GIẢI THƯỞNG SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC X D NG L THU ẾT VÀ TH C NGHI M NH M Đ NH DANH M T SỐ LOÀI NẤM THU C CHI NẤM K SINH C N TR NG B NG SINH HỌC PH N T KẾT H P SINH – TIN HỌC Thuộc nhóm ngành khoa học: Vi sinh – Sinh học phân tử Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA XÉT GIẢI THƯỞNG SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC X D NG L THU ẾT VÀ TH C NGHI M NH M Đ NH DANH M T SỐ LOÀI NẤM THU C CHI NẤM K SINH C N TR NG B NG SINH HỌC PH N T KẾT H P SINH – TIN HỌC Thuộc nhóm ngành khoa học: Vi sinh – Sinh học phân tử Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Hải Ngọc Nam, Nữ: Nữ Tr Nam, Nữ: Nữ ng Thị ch Vân Hu nh Thảo Trân Nam, Nữ: Nữ Ph m Xuân Xinh Nam, Nữ: Nữ Trịnh Hoàng Luân Nam, Nữ: Nam Dân tộc: Kinh Lớp, khoa: Công Nghệ Sinh Học Năm thứ: /Số năm đào t o:4 Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Giảng viên h ớng dẫn: ThS Lao Đức Thuận Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2014 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin gửi lời cám n chân thành đến ng ời thầy, ng ời b n bên, truyền cho niềm đam mê nghiên cứu khoa học cho lời khun bổ ích để nhóm nghiên cứu vững b ớc h n đ ờng mà b ớc Chúng tơi xin gửi lời tri ân sâu sắc đến cô PGS TS Lê Huyền Ái Thúy ThS Lao Đức Thuận tận tình h ớng dẫn, giúp đỡ, truyền đ t kinh nghiệm kiến thức quý báu suốt thời gian phụ việc t i phịng thí nghiệm Sinh học phân tử để hoàn thành đề tài sinh viên nghiên cứu khoa học Cảm n b n nhóm đề tài tất b n phụ việc phịng thí nghiệm Sinh học phân tử nhiệt tình giúp đỡ, động viên chúng tơi lúc khó khăn thời gian thực đề tài Chúng xin gửi lời cám n đến bậc sinh thành có cơng sinh thành d ỡng dục, t o điều kiện tốt q trình chúng tơi thực đề tài ình D ng, ngày 07 tháng 04 năm 2014 Danh mục bảng biểu Bảng ảng m i sử dụng thực nghiệm 31 Bảng 2 Các thông số thiết lập cho chu k nhiệt phản ứng PCR để khuếch đ i v ng gen nrSSU, nrLSU, Rpb1, Tef1, Rpb2, Tub, Atp6 thực nghiệm nh sau: 33 Bảng Thông tin trình tự thơng số đánh giá c a m i nh m khuếch đ i v ng gen mục tiêu đ ợc trình bày d ới đây: 38 Bảng Kết kiểm tra DNA b ng mật độ quang phổ kế mẫu nấm tách chiết có bổ sung β-mercaptoethanol 49 Bảng 3 Kết tổng hợp thiết lập chu k nhiệt PCR khuếch đ i v ng gen nrSSU, nrLSU, Rpb1, Rpb2, Tef1, Tub, Atp6 c a mẫu nấm ký sinh côn tr ng 54 Bảng 4: Kết so sánh trình tự nrSSU, nrLSU, Rpb1, Tef1 hiệu ch nh với trình tự Gen ank 61 Bảng 5: NGU N G C CÁC TR NH T DN Đ CS D NG L M TH M CHI U TRONG Đ T I T N KHO H C, NG N H NG GI NG, M S C P TR N GEN TRUY NK 62 Bảng 3.6: Tổng hợp kết định danh mẫu nấm t liệu phân tử 77 Danh mục hình ảnh Hình 1: Cordyceps sinensis ngu n:http: medicinalmushroominfo.com Hình 2: Cấu trúc hóa học c a cordycepin Hình 3: Cấu trúc gen vị trí m i NS1 NS4 khuyếch đ i v ng gen nrSSU 13 Hình 4: S đ vị trí v ng domain thuộc trình tự LSU 14 Hình 5: Chức c a v ng CTD thuộc gen Rpb1 15 Hình 6: Cấu trúc c p m i khuyếch đ i gen Rpb2 15 Hình 7: cấu trúc c p m i khuyếch đ i gen Tef1 16 Hình 8: Cấu trúc gen m i khuyếch đ i gen Tub 17 Hình Kết kiểm tra m i b ng last Gen ank 40 Hình Kết giống cột c a m i xi NS1 trình tự gen nrSSU 40 Hình 3 Kết gióng cột c a m i ng ợc NS4 trình tự gen nrSSU 40 Hình Kết kiểm tra m i b ng last Gen ank 41 Hình Kết giống cột c a m i xuôi LR05 trình tự gen nrLSU 41 Hình Kết gióng cột c a m i ng ợc LR5 trình tự gen nrLSU 41 Hình Kết kiểm tra m i b ng last Gen ank 42 Hình Kết gióng cột c a m i xi 983F trình tự gen Tef1 42 Hình Kết gióng cột c a m i ng ợc 2218R trình tự gen Tef1 42 Hình 10.Kết kiểm tra m i b ng last Gen ank 43 Hình 11 Kết giống cột c a m i xuôi CRP trình tự gen Rpb1 43 Hình 12 Kết giống cột c a m i ng ợc RP 1Cr trình tự gen Rpb1 43 Hình 13 Kết kiểm tra m i b ng last Gen ank 44 Hình 14 Kết giống cột c a m i xi fRPB2-5F trình tự gen Rpb2 44 Hình 15 Kết giống cột c a m i ng ợc fRPB2-7cR trình tự gen Rpb2 45 Hình 16 Kết kiểm tra m i b ng last Gen ank 45 Hình 17 Kết giống cột c a m i xi T12 trình tự gen Tub 45 Hình 18 Kết gióng cột c a m i ng ợc T22 trình tự genTub 45 Hình 19 Kết kiểm tra m i b ng last Gen ank 46 Hình 20 Kết giống cột c a m i xi TP6-c1 trình tự genAtp6 46 Hình 21 Kết gióng cột c a m i ng ợc ATP6- c2 trình tự genAtp6 46 Hình 22 Kết điện di sản phẩm hai c p m i NS1 NS4, LR0R LR5 tách chiết theo ph ng pháp phenol: chloroform 48 Hình 23 Kết điện di sản phẩm hai c p m i NS1 NS4, LR0R LR5 tách chiết theo ph ng pháp phenol: chloroform bổ sung β-mercaptoethanol 48 Hình 24 Kết điện di sản phẩm hai c p m i NS1/NS4, LR0R/LR5 bổ sung βmercaptoethanol, tối u hóa nhiệt độ 50 Hình 25 Kết điện di c a sản phẩm PCR t c p m i 983F/2218R, Crpb1/Rpb1Cr 51 Hình 26 Kết điện di sản phẩm PCR hai m i 983F/2218R, Crpb1/Rpb1Cr nhiệt độ khác 51 Hình 27 Kết điện di sản phẩm PCR với hai c p m i fRpb2-5F/fRpb2-7cR T12/T22 52 Hình 28 Kết điện di sản phẩm PCR với c p m i ATP6-c1A/ATP6-c2A khuếch đ i v ng gen atp6 53 Hình 29 Kết điện di sản phẩm PCR c a hai mẫu DL0015, DL0075 với bốn c p m i nrSSU, nrLSU, Tef1, Rpb1đã tối u hóa quy trình 56 Hình 30 Hiệu ch nh tín hiệu nhiễu đầu m ch xuôi c a LSU 57 Hình 31 Vị trí sai lệch c a hai kết giải trình tự đầu m ch xi c a LSU 57 Hình 32 Hiệu ch nh v ng m ch LSU 58 Hình 33 Hiệu ch nh v ng 3, v ng m ch xuôi LSU 59 Hình 34 Hiệu ch nh v ng cuối mach xuôi LSU 59 Hình 35 Hiệu ch nh v ng cuối m ch xuôi c a LSU 59 Hình 36 Hình kết last trình tự LSU m ch xi hiệu ch nh 60 Hình 37 Kiểm tra mức độ t ng đ ng b ng công cụ Dot plot 60 Danh mục chữ viết tắt ATP : Adenosine triphosphate BLAST : Basic Local Alignment Search Tool bp : base-pair DNA : deoxyribonucleotide triphosphate ETS : external transcribed spacer IGS : intergenic spacer ITS : internal transcribed spacer LSU : large subunit ML : maximum likelihood MP : maximum parsimony NJ : neighbor-joining nu : nucleotide rDNA : ribosomal DNA RNA : ribosomal RNA rRNA : ribosomal RNA SSU : small subunit MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN N M K SINH C N TR NG 1.1 Đ c điểm chung thành phần loài 1.2 Tiềm ứng dụng NGHI N C U Đ NH D NH V PHÁT SINH LO I 2.1 Đ c điểm nhận d ng định danh 2.2 Định danh phân tử 10 2.3 Nhóm gen giữ nhà house-keeping gene định danh phân tử loài nấm 11 T NH H NH NGHI N C U TRONG N C 17 PH H PH N T 18 4.1 Phả hệ phân tử nghiên cứu phát sinh loài 18 4.2 Những b ớc c nghiên cứu phát sinh ch ng loài 18 K THU T PCR V GI I TR NH T T Đ NG 23 5.1 K thuật PCR 23 5.2 Giải trình tự tự động 24 CHƯƠNG 2: V T LI U – PHƯƠNG PHÁP 25 TH I GI N V Đ ĐI M NGHI N C U 26 V T LI U V PH NG PHÁP NGHI N C U 26 2.1 ộ mẫu nấm ký sinh côn tr ng 26 2.2 Dung cụ – thiết bị – hóa chất 26 2.3 Danh mục phần mềm sử dụng 28 TI N TR NH NGHI N C U 28 3.1 Thu thập mẫu 29 3.2 Tách chiết DN tổng số t hệ sợi nấm ký sinh côn tr ng 29 3.3 PCR 31 3.4 Xác định trình tự khuyếch đ i 34 3.5 Hiệu ch nh trình tự 34 3.6 So sánh với c sở liệu Genbank 35 3.7 Xây dựng c sở liệu DN 35 3.8 Dị tìm mơ hình tiến hóa 35 3.9 Xây dựng phát sinh loài 35 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LU N 37 K T QU ĐÁNH GIÁ M I 38 1.1 Đánh giá m i IDT 38 1.2 Kết kiểm tra m i b ng BLAST c a gen 40 X Y D NG QUY TR NH TH C NGHI M NH M KHU CH Đ I V NG GEN nrSSU, nrLSU, Rpb1, Tef1, RPb2, Tub, Atp6 CHO CÁC M U N M K SINH C N TR NG 47 K T QU HI U CH NH TR NH T 56 K T QU SO SÁNH V I C S D X Y D NG D LI U TR NH T LI U GEN NK 61 nrSSU, nrLSU, Rpb1, Rpb2, Tef1, Tub, Atp6 62 K T QU X Y D NG C Y PHÁT SINH LO I 66 CHƯƠNG KẾT LU N VÀ ĐỀ NGH 79 TÀI LI U THAM KHẢO 81 PHỤ LỤC 84 Đề tài SVNCKH cấp trường năm học 2013-2014 Cây phả h phân tử ược xây ng b ng phư ng pháp NJ gen Tef1 với li u 62 trình t 90 Đề tài SVNCKH cấp trường năm học 2013-2014 Cây phả h phân tử ược xây ng b ng phư ng pháp ML gen Tef1 với li u 62 trình t 91 Đề tài SVNCKH cấp trường năm học 2013-2014 Cây phả h phân tử ược xây ng b ng phư ng pháp MP gen Tef1 với li u 62 trình t 92 Đề tài SVNCKH cấp trường năm học 2013-2014 Cây phả h phân tử ược xây ng b ng phư ng pháp NJ gen Rpb1 với li u 62 trình t 93 Đề tài SVNCKH cấp trường năm học 2013-2014 Cây phả h phân tử ược xây ng b ng phư ng pháp ML gen Rpb1 với li u 62 trình t 94 Đề tài SVNCKH cấp trường năm học 2013-2014 Cây MP (Maximum Parsimony) a tr n vùng gen Rpb1 với c sở 62 trình t 95 Đề tài SVNCKH cấp trường năm học 2013-2014 Cây NJ (Neigh or Joining) a tr n vùng gen nrSSU với c sở 62 trình t m u nh danh 96 Đề tài SVNCKH cấp trường năm học 2013-2014 Cây ML (Maximum ike ihoo ) a tr n vùng gen nrSSU với c sở 62 trình t m u nh danh 97 Đề tài SVNCKH cấp trường năm học 2013-2014 Cây MP (Maximum Parsimony) a tr n vùng gen nrSSU với c sở 62 trình t m u nh danh 98 Đề tài SVNCKH cấp trường năm học 2013-2014 Cây NJ (Neigh or Joining) a tr n vùng gen Tef1 với c sở 62 trình t m u nh danh 99 Đề tài SVNCKH cấp trường năm học 2013-2014 Cây ML (Maximum ike ihoo ) a tr n vùng gen Tef1 với c sở 62 trình t m u nh danh 100 Đề tài SVNCKH cấp trường năm học 2013-2014 Cây MP (Maximum Parsimony) a tr n vùng gen Tef1 với c sở 62 trình t m u nh danh 101 Đề tài SVNCKH cấp trường năm học 2013-2014 Cây NJ (Neigh or Joining) a tr n vùng gen Rpb1 với c sở 62 trình t m u nh danh 102 Đề tài SVNCKH cấp trường năm học 2013-2014 Cây ML (Maximum Likelihood) d a tr n vùng gen Rpb1 với c sở 62 trình t m u nh danh 103 Đề tài SVNCKH cấp trường năm học 2013-2014 Cây MP (Maximum Parsimony) d a tr n vùng gen Rpb1 với c sở 62 trình t m u nh danh 104 ... M NH M Đ NH DANH M T SỐ LOÀI NẤM THU C CHI NẤM K SINH C N TR NG B NG SINH HỌC PH N T KẾT H P SINH – TIN HỌC Thuộc nhóm ngành khoa học: Vi sinh – Sinh học phân tử Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị... nhóm nấm Hiện nay, nghiên cứu định danh phân tử kết hợp với Tin – Sinh học xu h ớng mới, giúp giải vấn đề mà định danh hình thái ch a làm r Trong nghiên cứu h ớng tới xây dựng lý thuyết thực nghiệm. .. định danh Hiện nay, với phát triển m nh m c a sinh học phân tử, ph ng pháp định danh phân tử kết hợp với tin sinh học giúp h trợ xác định xác h n loài c a nấm ký sinh tr ng, có lồi thuộc chi Cordyceps