(Luận văn) nghiên cứu đặc tính sinh học và phân tử của chủng virus nhược độc kty prrs 04 gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HÀ VĂN THỊNH lu an NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ SINH HỌC va n PHÂN TỬ CỦA CHỦNG VIRUS NHƯỢC ĐỘC KTY - to gh tn PRRS - 04 GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP p ie VÀ SINH SẢN Ở LỢN d oa nl w an lu Thú y Mã số: 60 64 01 01 ul nf va Chuyên ngành: oi lm Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Lan z at nh z m co l gm @ an Lu n va NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 ac th si LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu Các kết quả, số liệu nêu luận văn hoàn toàn trung thực chưa bảo vệ học vị khác Tơi cam đoan thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2016 lu Tác giả luận văn an n va tn to p ie gh Hà Văn Thịnh d oa nl w oi lm ul nf va an lu z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th i si LỜI CẢM ƠN Quá trình học tập rèn luyện mái trường Học viện Nông nghiệp Việt Nam giúp tơi hịa thiện nhân cách trình độ chuyên môn Tôi nhận quan tâm, dạy dỗ tận tình Thầy, Cơ giáo đặc biệt Thầy, Cô giáo công tác Khoa Thú y lu Nhân dịp hồn thành khóa luận tốt nghiệp Cao học chuyên ngành Thạc sỹ thú y cho phép tơi bày tỏ lịng biết ơn chân thành, sâu sắc đến Thầy, Cô giáo – người tận tình dạy dỗ, hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình tơi học tập Trường Học viện Nông nghiệp Việt Nam suốt q trình tơi thực khóa luận an n va p ie gh tn to Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Cô PGS TS Nguyễn Thị Lan, Bộ môn Bệnh lý, Khoa Thú y – Học viện Nơng nghiệp Hà Nội, tận tình hướng dẫn tơi suốt thời gian thực khóa luận Đồng thời xin bày tỏ biết ơn đến Thầy, Cô môn Bệnh lý – Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, anh chị phịng Thí nghiệm trọng điểm CNSH – khoa Thú Y (B213 – B214) nơi thực đề tài, tạo điều kiện để tơi hồn thành đề tài tốt w nl Cuối tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè d oa người động viên, tạo điều kiện tốt giúp đỡ tơi suốt q trình học tập hồn thành khóa luận lu an Trân trọng cảm ơn! nf va Hà Nội, ngày tháng năm 2016 oi lm ul Tác giả luận văn z at nh z Hà Văn Thịnh m co l gm @ an Lu n va ac th ii si MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục từ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii lu Trích yếu luận văn ix an Thesis abstract x va Phần Mở đầu n Tính cấp thiết đề tài: 1.2 Mục tiêu đề tài gh tn to 1.1 ie Phần Tổng quan tài liệu Tình hình nghiên cứu hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn p 2.1 Tình hình dịch PRRS Việt Nam oa nl 2.1.2 Tình hình dịch PRRS giới w 2.1.1 Những nghiên cứu dịch PRRS nước 2.1.4 Những nghiên cứu dịch PRRS Việt Nam 2.2 Virus gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (PRRSV) 2.2.1 Hình thái, cấu tạo 2.2.2 Phân loại virus PRRS 11 2.2.3 Khả gây bệnh virus PRRS 11 2.2.4 Sức đề kháng virus PRRS 11 2.2.5 Đặc tính ni cấy virus PRRS 12 2.3 Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản 13 2.3.1 Đặc điểm chung 13 2.3.2 Động vật cảm nhiễm 13 2.3.3 Chất chứa mầm bệnh 13 2.3.4 Cơ chế sinh bệnh phương thức truyền lây 14 2.3.5 Triệu chứng lâm sàng lợn mắc PRRS 16 2.3.6 Bệnh tích lợn mắc PRRS 17 d 2.1.3 oi lm ul nf va an lu z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th iii si 2.3.7 Các phương pháp chẩn đoán PRRS 18 2.3.8 Biện pháp phòng trị bệnh 20 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 22 lu an 3.1 Đối tượng, địa điểm thời gian nghiên cứu 22 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22 3.1.2 Nguyên liệu nghiên cứu 22 3.1.3 Địa điểm nghiên cứu 23 3.1.4 Thời gian nghiên cứu 23 3.2 Nội dung nghiên cứu 23 3.2.1 Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng virus KTY - PRRS - 04 va qua 40 đời cấy chuyển môi trường tế bào Marc -145 23 n 3.2.2 Nghiên cứu số đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTY - 3.3 Phương pháp nghiên cứu 23 3.3.1 Nuôi cấy virus KTY - PRRS - 04 môi trường tế bào Marc - 145 23 3.3.2 Phương pháp xác định hiệu giá virus TCID50 25 3.3.3 Xác định đường cong sinh trưởng virus PRRS qua đời cấy chuyển 25 p ie gh tn to PRRS - 04 qua 40 đời cấy chuyển môi trường tế bào Marc -145 23 nl w Phương pháp tách chiết RNA tổng số hệ gen virus PRRS 25 d oa 3.3.4 Phương pháp giải trình tự Gen 28 3.3.6 Phương pháp đọc kết 30 va an lu 3.3.5 Phần Kết thảo luận 31 nf Kết nghiên cứu chủng virus PRRS nghiên cứu 31 4.1.1 Kết lựa chọn mẫu PRRS cho nghiên cứu 31 4.1.2 Kiểm tra khả tạp nhiễm với loại virus khác 34 4.2 Kết nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng virus kty - oi lm ul 4.1 z at nh PRRS - 04 34 z Kết xác định khả gây bệnh tích tế bào qua đời cấy @ 4.2.1 gm chuyển 34 Kết xác định hiệu giá virus qua đời cấy chuyển 38 4.3 Kết nghiên cứu số đặc tính sinh học phân tử chủng virus m co l 4.2.2 4.3.1 an Lu KTY - PRRS - 04 41 Kết tách chiết RNA tổng số chủng virus KTY – PRRS - 04 41 n va ac th iv si 4.3.2 Kết giải trình tự đoạn ORF5 chủng virus KTY - PRRS - 04 42 4.3.3 Kết nghiên cứu so sánh trình tự nucleotide qua đời cấy chuyển 45 4.3.4 Kết nghiên cứu so sánh trình tự axit amin virus KTY - PRRS - 04 qua đời cấy chuyển 48 4.3.5 Kết xây dựng sinh học phân tử 51 Phần Kết luận kiến nghị 53 5.1 Kết luận 53 5.2 Kiến nghị 53 Tài liệu tham khảo 55 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w oi lm ul nf va an lu z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th v si DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT lu an n va p ie gh tn to Aa : acid amin BED : Blue Ear disease CNSH : Công nghệ sinh học CPE : Cyto Pathogenic Effect Cs : Cộng DMEM : Dulbecco,s Modified Eagle Medium ELISA : Enzyme Immunosortbent Linking Assay EVA : Equine virus FCS : Fetal Calf Serum IFA : Indirect Immunofluoresence Assay : Kilodalton nl w kDa : Lactate Dehydlogenase – elevating virus MK : Monkey kidney cell d oa LDHV : Mistery Swine Disease OIE va an lu MSD ORF : Open reading frame (khung đọc mở) PAM : Pulmnary alveolar macrophage PEARS : Porcine Endemic abortion and Respiratory syndrome PRRS : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus oi lm ul nf : Tổ chức thú y giới z at nh z : Ribonucleic acid : Simian hemorrhaghic fever virus : Lần m co l L1 gm SHFV @ RNA an Lu n va ac th vi si DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Protein cấu trúc PRRSV 10 Bảng 2.2 Sức đề kháng virus với điều kiện ngoại cảnh 12 Bảng 3.1 Thành phần thể tích cho phản ứng RT-PCR 27 Bảng 3.2 Các cặp mồi cho phản ứng RT-PCR 27 Bảng 3.3 Chu kỳ nhiệt độ cho phản ứng RT-PCR 27 Bảng 4.1 Mẫu lợn nghi mắc PRRS thu thập 31 lu Bảng 4.2 Kết chẩn đoán RT-PCR lợn nghi mắc PRRS 33 an Bảng 4.3 Hồ sơ giống virus PRRS lựa chọn nghiên cứu 34 va Bảng 4.4 Kết xác định có mặt virus PRRS, CSF, FMD, PED n Bảng 4.5 Kết xác định khả gây bệnh tích tế bào chủng virus KTY gh tn to TGE 34 ie - PRRS - 04 qua đời 35 p Bảng 4.6 Hiệu giá chủng virus KTY – PRRS – 04 thời điểm thu w hoạch 38 oa nl Bảng 4.7 Hiệu giá chủng virus KTY - PRRS – 04 qua đời cấy chuyển 40 d Bảng 4.8 Sai khác vị trí nucleotide đời chủng PRRS nghiên cứu 47 an lu Bảng 4.9 So sánh tương đồng nucleotide virus KTY - PRRS – 04 va đời cấy chuyển 47 ul nf Bảng 4.10 Sai khác vị trí axit amin đời chủng KTY - PRRS - 04 50 oi lm Bảng 4.11 So sánh tương đồng axit amin virus PRRS – 04 đời cấy chuyển 50 z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th vii si DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Bản đồ lịch sử xuất PRRS giới Hình 2.2 Cấu trúc hạt PRRS virus Hình 2.3 Cấu trúc gen PRRS virus Hình 2.4: Bộ gen virus PRRS 10 Hình 2.5 Virus PRRS xâm nhập phá hủy tế bào đại thực bào 14 Hình 4.1 Tế bào Marc-145 chưa gây nhiễm virus 36 lu Hình 4.2 Bệnh tích tế bào sau 36 gây nhiễm 36 an Hình 4.3 Bệnh tích tế bào sau 48 gây nhiễm 37 va Hình 4.4 Bệnh tích tế bào sau 60 gây nhiễm 37 n Hình 4.6 Đường cong sinh trưởng virus KTY – PRRS - 04 39 gh tn to Hình 4.5 Bệnh tích tế bào sau 72 gây gây nhiễm 37 ie Hình 4.7 Log10 hiệu giá chủng virus KTY - PRRS – 04 qua đời cấy p chuyển 40 w Hình 4.8 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết RNA tổng số 42 oa nl Hình 4.9 Kết phản ứng RT-PCR với mồi ORF5 43 d Hình 4.10 Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide đoạn gen ORF5 an lu chủng KTY-PRRS-04 đời cấy chuyển thứ 10 44 va Hình 4.11 So sánh trình tự nucleotide chủng KYT-PRRS-04 đời cấy ul nf chuyển 46 oi lm Hình 4.12 So sánh trình tự axit amin chủng KTY-PRRS-04 đời cấy chuyển 49 z at nh Hình 4.13 Cây sinh học phân tử chủng virus KTY - PRRS - 52 z m co l gm @ an Lu n va ac th viii si TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Hà Văn Thịnh Tên luận văn: “Nghiên cứu đặc tính sinh học sinh học phân tử chủng virus nhược độc KTY - PRRS – 04 gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn” Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Tên sở đào tạo: Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu lu Đề tài nhằm mục đích đánh giá ổn định số đặc tính sinh học sinh an học phân tử chủng virus cường độc KTY - PRRS – 04 gây hội chứng rối loạn sinh n va sản hô hấp lợn, qua đời cấy chuyển môi trường tế bào Marc-145 Bằng phương pháp nghiên cứu: nuôi cấy virus KTY - PRRS - 04 môi trường tế bào Marc-145; xác định hiệu giá virus TCID50; xác định đường cong sinh ie gh tn to Phương pháp nghiên cứu p trưởng virus PRRS qua đời cấy truyền; tách chiết RNA tổng số hệ gen virus w PRRS; RT-PCR; phương pháp giải trình tự Gen oa nl Kết kết luận Đặc tính sinh học chủng virus KTY - PRRS - 04: d an lu Khả gây bệnh tích tế bào chủng virus nghiên cứu có tính ổn định cao qua đời cấy chuyển môi trường Marc-145 Chủng virus PRRS có hiệu giá cao ổn va nf định, có khả phát triển nhân lên tốt môi trường tế bào Marc-145 Hiệu giá oi lm ul virus thu cao thời điểm 72 sau gây nhiễm Đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTY - PRRS - 04: z at nh Xác định trình tự nucleotide đoạn gen ORF5 chủng virus sau đời cấy chuyển liên tục Đoạn gen ORF5 quy định kháng nguyên GP5 chủng virus KTY - PRRS - 04 có kích thước 603 bp mã hóa cho 200 axit amin protein kháng nguyên z @ GP5 Trình tự nucleotide axit amin đoạn gen ORF5 chủng nghiên cứu gm qua đời cấy chuyển môi trường tế bào Marc-145 tương đối ổn định, mức độ m co l tương đồng nucleotide từ 98,15% đến 100%; axit amin từ 96,88% đến 100% an Lu n va ac th ix si lu an va n to tn Hình 4.8 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết RNA tổng số ie gh (Theo thứ tự từ trái sang phải kết tách chiết RNA tổng số chủng p KTY – PRRS – 04 đời P0, P10, P20, P30, P40) w Qua hình ảnh điện di cho thấy có lượng lớn RNA thu sau d oa nl tiến hành tách chiết, biểu vệt sáng thu chụp ảnh máy chụp ảnh gel RNA giữ Ethidiumbromide lại thạch tác dụng tia UV thuốc nhuộm này phát màu sáng Đồng thời RNA tách chiết có độ nguyên vẹn cao biểu thị vạch sáng, va an lu oi lm ul nf RNA tích điện âm nên điện trường chúng chạy cực dương Nếu phổ điện di RNA tách chiết hình cho nhiều dải băng (nhiều vạch sáng) chứng tỏ chiết tách chúng bị gãy đoạn nhiều Phổ điện di z at nh gọn chứng tỏ RNA chiết tách bị đứt gãy Như vậy, trình tách chiết RNA tổng số chủng virus KTY – PRRS – 04 qua đời cấy chuyển thành công, cung cấp nguyên liệu cho phản ứng RT-PCR z 4.3.2 Kết giải trình tự đoạn ORF5 chủng virus KTY - PRRS - 04 @ m co l gm * Kết phản ứng RT-PCR Sản phẩm RNA tổng số chủng virus KTY - PRRS – 04 thu tách chiết khuếch đại kỹ thuật RT-PCR với tham gia enzyme an Lu chép ngược (Reverse Transcriptase) sử dụng cặp mồi ORF5 (đã trình bày phần phương pháp nghiên cứu) có khả phát virus PRRS thuộc chủng Bắc Mỹ chủng Châu Âu (cặp mồi cho phép xác định đoạn gen virus n va ac th 42 si PRRS có kích thước 683bp) để tạo đoạn DNA hoàn chỉnh (cDNA) Sản phẩm cDNA sau khuếch đại máy PCR điện di chụp ảnh Kết phản ứng RT-PCR xác định PRRSV trình bày hình 4.9 lu an n va p ie gh tn to oa nl w Hình 4.9 Kết phản ứng RT-PCR với mồi ORF5 d [Virus KTY - PRRS - 04 phát phản ứng RT-PCR với độ dài gen 683bp, thang chẩn M 100bp, giếng từ 1-5 mẫu đời an lu oi lm ul nf va virus KTY - PRRS - 04 (lần lượt từ phải qua trái P0, P10, P20, P30, P40), giếng đối chứng âm, giếng đối chứng dương (virus PRRS)] Sản phẩm điện di cho vạch DNA tương ứng với 683bp theo thiết kế mồi Kết tạo DNA chủng KTY- PRRS- 04 qua đời cấy chuyển thành công z at nh Như chúng tơi khẳng định xác có mặt virus Kết giải trình tự gen đời cấy chuyển Sau tiến hành kỹ thuật RT-PCR thu sản phẩm tiến z m co l gm @ hành tinh sản phẩm phản ứng RT-PCR kít để loại bỏ hết thành phần dư thừa sau phản ứng Sản phẩm sau tinh DNA virus cloning với loại mồi đơn (mồi xuôi mồi ngược) để nhân nhanh số lượng theo chiều đoạn gene an Lu Tinh sản phẩm phản ứng PCR giải trình tự kit cung cấp nhà sản xuất, sau tiến hành giải trình tự gene Quá trình giải trình tự thực nhờ vào máy giải trình tự Beckman coulter CEQ 8000 Mỹ phòng n va ac th 43 si Thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú Y – Khoa Thú Y Kết biểu thị chương trình Geneetyx trình bày minh họa hình 3.9 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w oi lm ul nf va an lu z at nh z @ Hình 4.10 Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide đoạn gen l gm ORF5 chủng KTY-PRRS-04 đời cấy chuyển thứ 10 Qua hình 4.10 cho thấy chất lượng giải trình tự tương đối tốt, đỉnh m co màu giản đồ thể loại nucleotide, loại nucleotide khác an Lu tiếp nhận thuốc nhuộm huỳnh quang khác đọc tia laser cho hiển thị màu tương ứng Adenine cho màu đỏ, Thymine cho màu xanh, n va ac th 44 si Guanine cho màu xanh cây, Cytosine cho màu đen Sau giải trình tự, chuỗi nucleotide thu xử lý phần mềm phân tích máy tính Như việc tách chiết RNA tổng số, trình thực RT-PCR giải trình tự thực thành cơng Trình tự nucleotide đoạn gen ORF5 chủng qua đời nghiên cứu xác định 4.3.3 Kết nghiên cứu so sánh trình tự nucleotide qua đời cấy chuyển lu Để nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTY - PRRS 04 Chúng tiến hành giải trình tự đoạn gen ORF5 chủng virus nghiên cứu đời cấy chuyển thứ 10, 20, 30, 40 Để xác định tương đồng nucleotide đời cấy chuyển, qua thấy cụ thể mức độ biến an va đổi thành phần, trật tự nucleotide biến đổi cấu trúc gen chủng n virus KTY - PRRS - 04 qua đời cấy chuyển p ie gh tn to Chuỗi gen mà tiến hành giải trình tự thành cơng có kích thước 603bp dùng làm chuỗi truy cập chương trình BLAST ngân hàng gen quốc tế nhằm tìm kiếm chuỗi đích đăng ký ngân hàng gen dựa vào mức độ tương ứng nucleotide Kết so sánh trình tự nucleotide chủng qua đời nghiên cứu nl w d oa xử lý phần mềm Genetyx thể hình 4.11 oi lm ul nf va an lu z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 45 si lu an n va p ie gh tn to d oa nl w oi lm ul nf va an lu Hình 4.11 So sánh trình tự nucleotide chủng KYT-PRRS-04 z at nh đời cấy chuyển z Qua hình 4.11 chúng tơi thấy trình tự nucleotide đoạn gen ORF5 chủng PRRSV đời nghiên cứu có độ dài 603bp Kết so sánh cho thấy thành phần nucleotide đời cấy chuyển chủng virus khơng có gm @ m co l thay đổi có thay đổi khơng đáng kể khác từ đến nucleotide, cụ thể sau: Đời P0 P10 có trình tự nucleotide giống - Đời P20, P30 P40 có trình tự nucleotide giống an Lu - Sự sai khác diễn đời cấy chuyển thể bảng 4.8 n va ac th 46 si Bảng 4.8 Sai khác vị trí nucleotide đời chủng PRRS nghiên cứu Vị trí sai khác P0 P10 P20 P30 P40 97 A A G G G 135 A A G G G 168 A A G G G 177 A A T T T 280 C C G G G 287 G G T T T 351 A A G G G 405 T T C C C 490 G G A A A 10 519 C C G G G 11 587 A A T T T lu STT an n va p ie gh tn to Qua bảng 4.8 cho thấy, sai khác vị trí nucleotide 603 nucleotide theo thứ tự trình tự thu nhận chủng virus KTY - PRRS – 04 đời P0 P10 so với đời P20, P30 P40 11 vị trí sau 97 (A ↔ G); w nl 135 (A ↔ G); 168 (A ↔ G); 177 (A ↔ T); 280 (C ↔ G); 287 (G ↔ T); 351 (A d oa ↔ G); 405 (T ↔ C); 490 (G ↔ A); 519 (C ↔ G); 587 (A ↔ T) lu Từ kết giải trình tự đoạn gen ORF5 chủng PRRS nghiên cứu nf va an đời cấy chuyển tiến hành thu thập xử lý chương trình MEGA5 để so sánh mức độ tương đồng nucleotide đời cấy chuyển oi lm ul Kết thể bảng 4.9 Bảng 4.9 So sánh tương đồng nucleotide virus KTY - PRRS – 04 P0 - ORF5 z at nh đời cấy chuyển P10 - ORF5 P20 - ORF5 P30 - ORF5 P40 ORF5 z 100,00 P10 - ORF5 100,00 100,00 P20 - ORF5 98,15 98,15 100,00 P30 - ORF5 98,15 98,15 100,00 P40 - ORF5 98,15 98,15 100,00 m co l gm @ P0 - ORF5 an Lu 100,00 100,00 100,00 n va ac th 47 si Qua bảng 4.9 cho thấy: - Mức độ tương đồng nucleotide đoạn gen ORF5 đời P0 P10 100%; đời P20, P30 P40 100% - Độ tương đồng nucleotide đoạn gen ORF5 đời P0 P10 so với đời P20, P30 P40 98,15% Như vậy, sau cấy chuyển qua 40 đời chủng virus KTY - PRRS 04 tương đồng nucleotide đạt tỷ lệ cao 4.3.4 Kết nghiên cứu so sánh trình tự axit amin virus KTY - PRRS lu - 04 qua đời cấy chuyển an va Những sai khác trình tự nucleotide ba mã hóa dẫn đến n sai khác thành phần axit amin (cứ nucleotide mã hóa cho axit thay đổi nucleotide mà không dẫn đến thay đổi axit amin số axit gh tn to amin- nucleotide gọi mã hóa) nhiên có p ie amin nhiều ba nucleotide mã hóa Chính vậy, đơi sai khác nucleotide lại không dẫn đến sai khác axit amin nên không làm nl w thay đổi cấu trúc protein mã hóa gen d oa Tuy nhiên, có sai khác nucleotide dẫn đến sai khác an lu mã hóa hệ sai khác axit amin thay đổi tính chất protein tạo axit amin nguyên nhân phát sinh va ul nf biến dị di truyền thay đổi tính gây bệnh virus oi lm Để nghiên cứu tồn diện đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTY - PRRS – 04 sau xác định trình tự nucleotide cần xác định tiếp z at nh thành phần axit amin đoạn gen để có kết xác biến đổi mức độ phân tử chủng virus KTY - PRRS – 04 qua đời cấy chuyển z Từ trình tự nucleotide đoạn gen thu được, tiến hành xác định trình @ gm tự axit amin đoạn gen ORF5 dựa mã vi khuẩn bậc thấp (bacterial l code) có ngân hàng gen so sánh trình tự axit amin chủng virus KTY m co - PRRS - 04 qua đời cấy chuyển Kết so sánh trình bày hình 4.12 an Lu n va ac th 48 si lu an n va p ie gh tn to d oa nl w oi lm ul nf va an lu Hình 4.12 So sánh trình tự axit amin chủng KTY-PRRS-04 z at nh đời cấy chuyển z Qua hình 4.12 chúng tơi thấy trình tự axit amin đoạn gen ORF5 chủng virus KTY - PRRS – 04 đời nghiên cứu có kích thước 200 axit amin @ m co l gm Cũng giống với trình tự nucleotide, trình tự axit amin đoạn gen ORF5 chủng virus KTY - PRRS – 04 đời P0 P10 giống nhau; đời P20, P30 P40 giống Sự sai khác diễn đời P0, P10 so với đời P20, P30, P40 thể an Lu bảng 4.10 n va ac th 49 si Bảng 4.10 Sai khác vị trí axit amin đời chủng KTY - PRRS - 04 Vị trí sai khác P0 P10 P20 P30 P40 33 N N D D D 59 K K N N N 94 P P A A A 96 G G V V V 164 G G R R R 196 Q Q L L L lu STT an n va gh tn to Qua bảng 4.10 thấy, sai khác trình tự axit amin chủng KTY - PRRS – 04 đời đời P0 P10 so với đời P20, đời P30 đời P40 vị trí gồm axit amin thứ 33 (N ↔ D); axit amin thứ 59 (K ↔ N); axit amin thứ 94 (P ↔ A); axit amin thứ 96 (G ↔ V); axit amin thứ 164 (G ↔ R); axit amin p ie thứ 196 (Q ↔ L) Từ kết so sánh cho thấy thành phần axit amin đời cấy chuyển chủng virus khơng có thay đổi có thay đổi khơng w oa nl đáng kể d Kết giải trình tự đoạn gen ORF5 chủng virus KTY - PRRS - 04 trình tự axit amin tương ứng xác định, thu thập sử dụng chương trình genetyx để so sánh tỷ lệ đồng thành phần axit amin va an lu nf chủng v iru s KTY - PRRS - 04 qua đời cấy chuyển Kết trình bày oi lm ul bảng 4.11 Bảng 4.11 So sánh tương đồng axit amin virus KTY - PRRS – 04 z at nh đời cấy chuyển P0 - ORF5 P10 - ORF5 P20 - ORF5 P30 - ORF5 P40 - ORF5 z 100,00 P10 - ORF5 100,00 100,00 P20 - ORF5 96,88 96,88 100,00 P30 - ORF5 96,88 96,88 100,00 100,00 P40 - ORF5 96,88 96,88 100,00 100,00 m co l gm @ P0 - ORF5 an Lu 100,00 n va ac th 50 si Qua bảng 4.11 cho thấy sau cấy chuyển qua 40 đời chủng virus KTY - PRRS - 04 tương đồng axit amin đạt tỷ lệ cao Cụ thể, mức tương đồng trình tự axit amin đoạn gen ORF5 P0 P10 100%; đời P20, P30 P40 100%; đời P0 P10 so với đời P20, đời P30, đời P40 96,88% Tóm lại, từ kết phân tích thành phần nucleotide, axit amin so sánh đời cấy chuyển chủng virus nghiên cứu chúng tơi nhận thấy trình tự nucleotide axit amin đời cấy chuyển khơng có sai khác có sai khác khơng đáng kể Điều chứng tỏ chủng virus KTY - PRRS – 04 có lu ổn định đặc tính di truyền đời cấy chuyển an va 4.3.5 Kết xây dựng sinh học phân tử n Qua việc so sánh mức độ tương đồng nucleotide axit amin dựng sinh học phân tử để xác định nguồn gốc phát sinh chủng virus gh tn to chủng virus PRRS phân lập chủng tham chiếu, tiến hành xây p ie KTY - PRRS - 04 Kết phân tích nguồn gốc phát sinh chủng PRRS w nghiên cứu trình bày hình 4.13 nl Từ kết so sánh thành phần nucleotide axit amine d oa chủng virus K T Y - PRRS - 04 Dựa chương trình ClustalW lu tiến hành xác định nguồn gốc phát sinh chủng PRRSV nghiên cứu để va an phân tích nguồn gốc phát sinh chủng PRRS nghiên cứu nf Kết phân tích nguồn gốc phát sinh cho thấy: oi lm ul Chủng virus K T Y - PRRS - 04 nằm nhánh phát sinh với chủng virus 374KTY, 352KTY, HTP0, nằm nhánh phát sinh khác với chủng (GU980186) z at nh 171KTY thuộc nhánh chủng virus PRRS Trung Quốc z Chủng v i r u s nghiên cứu không nằm nhánh phát sinh gm @ chủng virus Bắc Mỹ VR-2332 nhánh Châu Âu -Lelystad Điều phù hợp với kết nghiên cứu trước sai khác nucleotide axit m co l amin chủng virus với Các chủng virus PRRS Singapore, Thái Lan đưa vào an Lu phả hệ Tuy nhiên, chúng không nằm nguồn gốc phát sinh với chủng virus KTY - PRRS - 04 n va ac th 51 si Như vậy, lập sơ đồ phả hệ phân tích nguồn gốc phát sinh nghiên cứu so sánh với số chủng khu vực giới dựa trình tự chuỗi gen ORF5 cho thấy Chủng v i r u s K TY - P R R S - có nguồn gốc phát sinh với chủng PRRSV Trung Quốc, không nguồn gốc phát sinh với chủng VR-2332 EF488048China 171 20 Vaccine GU980185 lu TRICHOTOMY an 52 GU980186 va 33 HTP1TY n 87 347KTY to 86 tn 24 352-KTY 26 gh KTY – PRRS - 04 ie p GU980179China GU980182China nl w oa 27 AF184212Sing d an lu 100 100 va DQ489311Eur 70 nf 96 oi lm ul 100 Lelystad 50 AF176463USA z at nh 39 AF046869USA 100 100 z AF176348 VR-2332 AF066183 m co 46 l gm 73 @ 78 AF176461USA 94 DQ056373Thailand an Lu Hình 4.13 Cây sinh học phân tử chủng virus KTY - PRRS - 04 n va ac th 52 si PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Sau thời gian nghiên cứu Phịng thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú y, thu số kết luận đặc tính sinh học sinh học phân tử chủng virus KTY – PRRS - 04 sau: Đặc tính sinh học chủng virus KTY – PRRS - 04 sau 40 đời cấy chuyển: 1.1 Khả gây bệnh tích tế bào chủng virus nghiên cứu có tính ổn định cao qua đời cấy chuyển môi trường Marc-145 lu an 1.2 Chủng virus PRRS có hiệu giá cao ổn định, có khả phát triển va nhân lên tốt môi trường tế bào Marc-145 Hiệu giá virus thu cao n thời điểm 72 sau gây nhiễm cấy chuyển: gh tn to Đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTY-PRRS-04 sau 40 đời p ie 2.1 Xác định trình tự nucleotide đoạn gen ORF5 chủng virus sau đời cấy chuyển liên tục Đoạn gen ORF5 quy định kháng nguyên GP5 nl w chủng virus KTY-PRRS-04 có kích thước 603 bp mã hóa cho 200 axit amin oa protein kháng nguyên GP5 d 2.2 Trình tự nucleotide axit amin đoạn gen ORF5 lu an chủng nghiên cứu qua đời cấy chuyển môi trường tế bào Marc-145 ổn oi lm 5.2 KIẾN NGHỊ ul 96,88 đến 100% nf va định, mức độ tương đồng nucleotide từ 98,15 đến 100%; axit amin từ z at nh Để góp phần hồn thiện đề tài nghiên cứu chúng tơi mong muốn: Triển khai thực đề tài phạm vi rộng nghiên cứu với z nhiều chủng PRRS nhằm thu kết toàn diện hơn, đánh giá gm @ chủng gây bệnh chủ yếu nước ta Tiếp tục nghiên cứu để giải trình tự gen đoạn gen cịn lại virus l PRRS tiến tới giải trình tự toàn hệ gen virus phát biến m co chủng để chế tạo vacxin có hiệu phịng bệnh cao an Lu Việc sản xuất vacxin phòng bệnh virus PRRS gây Việt Nam giới vấn đề cấp bách Kết nghiên cứu n va ac th 53 si gen ORF5 virus PRRS qua đời cấy chuyển môi trường tế bào Marc145 mà thu nhận sở liệu sinh học phân tử cho nghiên cứu vacxin phòng bệnh PRRS gây Chủng virus KTY - PRRS - 04 có nguồn gốc phát sinh với chủng PRRSV Trung Quốc, không nguồn gốc phát sinh với chủng VR-2332 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w oi lm ul nf va an lu z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 54 si TÀI LIỆU THAM KHẢO I TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn (2007), Hướng dẫn phịng chống hội chứngRối loạn hơ hấp sinh sản lợn (PRRS) Cục Thú Y (2007), Báo cáo Hội thảo khoa học phòng chống hội chứng Rối loạn hô hấp sinh sản lợn, ngày 21 tháng năm 2008, Hà Nội Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2007), “Một số hiểu biết virus gây hội lu chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn”, Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp- an sinh sản bệnh liên cầu khuẩn lợn, ngày 11/10/2007, ĐH Nông Nghiệp Hà Nội va Nguyễn Hữu Nam, Nguyễn Thị Lan (2007), “Hội chứng rối loạn hô hấp sinh n tn to sản”, Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp - sinh sản bệnh liên cầu khuẩn lợn, ngày 11/10/2007, ĐH Nơng Nghiệp Hà Nội tích đại thể bệnh PRRS số địa phương thuộc đồng Bắc Bộ Việt ie Lê Văn Năm (2007), “Kết khảo sát bước đầu biểu lâm sàng bệnh p gh w Nam”, Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp - sinh sản bệnh liên cầu khuẩn Nguyễn Văn Thanh (2007), “Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (PRRS)”, Hội d oa nl lợn, ngày 11/10/2007, ĐH Nông Nghiệp Hà Nội an lu thảo Hội chứng rối loạn hô hấp - sinh sản bệnh liên cầu khuẩn lợn, ngày William T.Christianson Han Soo Joo (2001), Hội chứng rối loạn hô hấp ul nf va 11/10/2007, ĐH Nông Nghiệp Hà Nội oi lm sinh sản lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome – PRRS), Tạp chí KHKT Thú y, tập VIII - số – 2001, tr 74 - 86 Kết nghiên cứu chủng PRRSV cường độc Trung Quốc(Tian Kegong, Trung z at nh tâm kiểm soát dịch bệnh động vật Trung Quốc Bản dịch TS Nguyễn Hữu z Nam cộng sự) @ Done SH, Paton DJ, White ME (1996), “Porcine Reproductive and Respiratory l gm II TÀI LIỆU TIẾNG ANH diagnostic aspects Br Vet J 152, pp 153 – 174 Forsberg, R., Storgaard, T., Nielsen, H.S., Oleksiewicz, M.B., Cordioli, P., Sala, an Lu m co Syndrome – PRRS”: a revew, with emphasis on pathological, virological and G., Hein, J., Botner, A., 2002 The genetic diversity of European type PRRSV is n va ac th 55 si similar to that of the North American type but is geographically skewed within Europe Virology 299, 38–47 Kim, H.S., Kwang, J., Joo, H.S and Frey, M.L 1993 Enhanced replication of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in a homogeneous subpopulation of MA-104 cell line Arch Virol., 133:477-483 Gao, Z.Q., Guo, X., Yang, H.C., 2004 Genomic characterization of two Chinese isolates of porcine respiratory and reproductive syndrome virus Archives of Virology 149, 1341-1351 OIE, Porcinereproductive and respiratory syndrome (PRRS), chapter 2.6.5, lu an www.oie.int va Frederick A.Murphy, E.Paul J.Gibbs, Marian C.Horzinek, Michael J.Studdert, n “Veterinary virology (Third edition), chapter 34 Arteriviridae” virus RespPRRS MLV”, complete genome, May 15 gh tn to Nelsen CJ, GenBank, (1998), ‘‘Porcine reproductive and respiratory syndrome p ie 47 – 55 Key, K.F., Haqshenas, G., Guenette, D.K., Swenson, S.L., Toth, T.E., Meng, X.J., nl w Suazez P (2000), “Utrastructure pathogenesis of PRRS virus”, Vet Res 31, pp d oa 2001 Genetic variation and phylogenetic analyses of the ORF5 gene of acute lu porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates Veterinary 10 va an Microbiology 83, 249–263 Meng XJ, Paul PS, Halbur PG, Lum MA (1995), ‘‘ Phylogenetic analyses of the nf oi lm ul putative M (ORF 6) and N (ORF 7) genes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV): implication for the existence of two genotypes of 11 z at nh PRRSV in the U.S.A and Europe”, Arch Virol 140:745-755 Tian K, Yu, Zhao, (2007), “Emergence of fatal PRRS variants: unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique z m co l gm @ hallmark”, PLoS ONE (6), e526 doi: 10.137l/jouARNl Pone.0000526 an Lu n va ac th 56 si