Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TÁT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN ĐỊNH LOÀI CỦA MỘT SỐ VÙNG TRÌNH Tự PHÂN TỬ TỪ NHÂN VÀ TỪ LỤC LA[.]
Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TÁT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN ĐỊNH LỒI CỦA MỘT SỐ VÙNG TRÌNH Tự PHÂN TỬ TỪ NHÂN VÀ TỪ LỤC LAP TRÊN CÁC LOÀI LẤN HAI PAPHIOPEDIL UM VIỆT NAM Sinh viên thực • • : Phạm • Thị• Vân Anh Chuyên ngành TP.HCM, tháng năm 2018 * : Công nghệ sinh học Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỀN TÁT THÀNH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MƠI TRƯỜNG KHĨA LƯẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN ĐỊNH LOÀI CỦA MỘT SỐ VÙNG TRÌNH Tự PHÂN TỬ TỪ NHÂN VÀ TỪ LỤC LẠP TRÊN CÁC LOÀI LẤN HAI PAPHIOPEDIL UM VIỆT NAM Sinh viên thực : Phạm Thị Vân Anh Mã sô sinh viên :1411530036 Lớp : 14DSH01 Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Giáo viên hướng dần : Th.s Vũ Thị Huyền Trang Th.s Huỳnh Văn Hiếu TP.HCM, tháng năm 2018 LỜI CẢM ƠN Trong suốt quãng thời gian từ bắt đầu môi trường đại học đến nay, em nhận dạy bảo tận tâm quý thầy cô giáo, giúp đỡ nhiệt tình bạn bè ân cần chăm sóc, động viên từ cha mẹ Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến quý thầy cô, bạn cha mẹ Em xin cảm ơn cô Vũ Thị Huyền Trang thầy Huỳnh Văn Hiếu định hướng, hướng dần tận tâm tận tình giúp đỡ em để hồn thành khóa luận Em xin cảm ơn quý thầy cô khoa Công nghệ Sinh học Môi trường đà tận tình giúp đỡ, truyền đạt kiến thức quý giá cho em suốt năm theo học trường Em xin cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Nguyền Tất Thành tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình học tập trường Con xin gửi lời cảm ơn, lòng biết ơn chân thành tới bố mẹ, cám ơn bo mẹ gia đình tạo điều kiện, giúp đờ, động viên sát cánh bên hồn cảnh để ni dưỡng nên người Là chồ dựa vật chất tinh thần lớn mạnh để an tâm giúp có thêm sức mạnh nghị lực để nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Cuối cùng, em xin cảm ơn anh, chị, bạn ngồi lớp tận tình giúp đỡ em q trình học tập hồn thành khóa luận Phạm Thị Vân Anh Khoa Công nghệ sinh học Môi trường Trường Đại học Nguyễn Tất Thành ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN 11 MỤC LỤC iii TÓM TẮT vi DANH MỤC CÁC CHỪ VIẾT TẮT viii DANH MỤC CÁC BẢNG ix DANH MỤC CÁC HÌNH X ĐẬT VÁN ĐÈ CHƯƠNG TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tong quan phong lan 1.2 Giới thiệu lan Hài 1.2.1 Vị trí phân loại lan Hài (Paphiopediluni) 1.2.2 Đặc điếm hình thái lan Hài 1.2.3 Phân bố điều kiện sinh thái lan Hài 1.2.4 Giá trị lan Hài 1.2.4.1 Giá trị kinh tế 1.2.4.2 Tình hình mua bán nước 1.2.5 Kỳ thuật khuếch đại vùng trình tự phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 1.2.6 Xây dựng phát sinh loài 1.2.7 Tính đa hình trình tự 10 1.3 Một số vùng trình tự sử dụng nghiên cứu để đánh giá phân định lan Hài Paphỉopedilutn Việt Nam 11 1.3.1 Vùng gen ITS 11 1.3.2 Vùng gen matK 11 iii 1.3.3 Vùng gen trnL 12 1.4 Các nghiên cứu nước giới 12 1.4.2 Các nghiên cứu giới 12 1.4.3 Các nghiên cứu nước 14 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚƯ 16 2.1 Nội dung nghiên cứu 16 2.2 Thời gian địa diem nghiên cứu 16 2.3 Vật liệu nghiên cứu 16 2.4 Phương pháp nghiên cứu 16 2.4.1 Các thiết bị, dụng cụ, hóa chất sử dụng nghiên cứu 16 2.4.2 Thu mẫu, xử lý bảo quản mầu 18 2.4.3 Tách chiết DNA tổng số 18 2.4.4 Khuếch đại gen kỳ thuật PCR 20 2.4.5 Kiểm tra chất lượng sản phẩm DNA 22 2.4.5.1 Kỳ thuật điện di 22 2.4.5.2 Kỳ thuật đo quang phổ (OD) 23 2.4.6 Giải hiệu chỉnh trình tự 23 2.4.6.1 Giải trình tự 23 2.4.6.2 Sắp gióng cột hiệu chỉnh trình tự 23 2.4.7 Đánh giá đa dạng di truyền loài lan Hài Paphiopedilum Việt Nam nghiên cứu 24 2.4.7.1 Đánh giá phân định loài phát sinh loài 24 2.4.7.2 Đánh giá phân định loài phương pháp phân tích đa hình trình tự 24 2.4.8 Đánh giá khả phân định loài số vùng trình tự phân tử 24 CHƯƠNG KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 iv 3.1 Kết thu thập, xử lý mầu 26 3.2 Ket đánh giá hiệu tách chiết DNA giải trình tự 28 3.3.1 Dựa vào vùng ITS (Internal Transcriber Spacer) 36 3.3.2 Dựa vào vùng matK (maturese K) 51 3.3.3 Dựa vào vùng trnL 56 3.4 Đánh giá đa hình trình tự 61 3.5 Đánh giá khả phân định loài 62 KẾT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 V TÓM TẮT Đe tài “Đánh giá khả phân định lồi dựa số vùng trình tự phân tử từ nhân từ lục lạp loài lan hài Paphiopedìlum Việt Nam.” thực từ tháng 2/2018 đến tháng 8/2018 Khoa Công nghệ sinh học Môi trường, trường Đại học Nguyễn Tất Thành với mục tiêu đánh giá khả phân định loài từ số vùng trình tự phân tử từ nhân từ lục lạp loài lan Hài Paphiopediỉum Việt Nam Mục tiêu xác định, đánh giá khả phân định lồi ba vùng trình tự vùng /nơtK, ITS trnL Dựa vào kết thu mầu, khả tách chiết DNA, hiệu suất khuếch đại trình tự (PCR), xây dựng phát sinh lồi xét tính đa hình trình tự để đánh giá vùng trình tự tối ưu để nhận diện, phân định loài bảo tồn loài lan Hài Việt Nam Ket sau tháng nghiên cứu, xác định vùng trình tự tối ưu việc nhận diện phân định lồi vùng trình tự ITS Giải trình tự thành công 39 mẫu vùng ITS, 46 mẫu vùng matK, 43 mầu vùng trnL Dựa phát sinh loài tính đa hình phân định 12 lồi vùng ITS, 11 lồi vùng mK, lồi vùng trnL cho lan Hài Paphiopedỉlutn Việt Nam vi SUMMARY The topic "Evaluating the ability of species identification based on and regions from nuclear sequences chloroplasts of the Paphiopedilum species in Vietnam" was conducted from February, 2018 to August, Biotechnology and Enviroment Nguyen Tat Thanh University The subject aims to determine and evaluate the species resolution of the regions ITS ( nuclear sequences), matK and trwL (chloroplast regions) We recommend ITS as the potential region for identification of Paphiopedilum spacies in Vietnam with 12/18 sepaneated species Followy is (8/18) vii (11/18) and tmL DANH MỤC CÁC CHŨ VIẾT TẤT bp Base pair kb kilobyte DNA Deoxyribonucleic Acid PCR Polymerase Chain Reaction rRNA Ribosom ribonucleic acid mRNA ARN thông tin - messenger ribonucleic acid tRNA ARN ribosom - Transfer ribonucleic acid RNA ARN vận chuyen - ribonucleic acid ITS Internal Transcribed spacer /HữtK Maturase K Í/77L tRNA-leu IUCN Liên minh bảo ton thiên nhiên quốc tế - International Union for Conservation of Nature SNP Đa hình nucleotide đơn - Single Nucleotide Polymorphisms RELP Restriction Fragment Length Polymorphism dNTP deoxynucleotide triphosphate HAT-RAPD High annealing temperature-random amplified polymorphic DNA RAPD Random Amplified Polymorphic DNA Tris-HCl Tris hydroxylmethyl EDTA Ethylen Diamine Tetra acetic Acid SDS Sodium Sodecyl Sulphata viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thống kê lan Hài Việt Nam nơi phân bố Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu Bảng 2.3 Các hóa chất sử dụng nghiên cứu Bảng 2.4 Danh mục dụng cụ sử dụng nghiên cứu Bảng 2.5 Các thành phần có phản ứng khuếch đại gen Bảng 2.6 Các mồi sử dụng phản ứng khuếch đại vùng trình tự Bảng 2.7 Chu trình nhiệt khuếch đại vùng ITS Bảng 2.8 Chu trình nhiệt khuếch đại vùng Bảng 2.9 Chu trình nhiệt khuếch đại vùng r/7zL Bảng 3.1 Mầu lan Hài thu nghiên cứu Bảng 3.2 Đánh giá chi tiết hiệu suất PCR giải trình tự Bảng 3.3 Đánh giá đa hình trình tự Bảng 3.4 Đánh giá phân định loài ix ... mục tiêu đánh giá khả phân định loài từ số vùng trình tự phân tử từ nhân từ lục lạp loài lan Hài Paphiopediỉum Việt Nam Mục tiêu xác định, đánh giá khả phân định lồi ba vùng trình tự vùng /nơtK,... 2.4.7.1 Đánh giá phân định loài phát sinh loài 24 2.4.7.2 Đánh giá phân định loài phương pháp phân tích đa hình trình tự 24 2.4.8 Đánh giá khả phân định loài số vùng trình tự phân tử 24... 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 V TÓM TẮT Đe tài ? ?Đánh giá khả phân định lồi dựa số vùng trình tự phân tử từ nhân từ lục lạp loài lan hài Paphiopedìlum Việt Nam. ” thực từ tháng 2/2018 đến