Lựa chọn, thiết kế, thử nghiệm và ứng dụng một số mồi nhằm khuếch đại các vùng trình tự tiềm năng để nhận diện các loài lan hài paphiopedilum việt nam

TRƯỞNG BẬX HỘC NGUYỄN TẪT THẰNH KHOA NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO VÃ CƠNG NGHỆ SĩNH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGj LỰA CHỌN, THIỀT KÊ^ thử nghiệm va ưng đụng mọt SổMĨÌ NHằM KHCH BẠI CAC VỪNG TRÌNH tự TIÊM NĂNG BÊ’NHẬN BIỆN GAC LOAI LAN HAI Paphiopedilum VIỆT NAM (Screenings designing, pilot evaluation and application of some primers potential i for molecular discrimination ũí Paphi&pedilum species in Vietnam) rhành viện SVTH í ĐẶNG VẪN KHẢI NGẲNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA í 2015 • 2017 GVHD ỉ ThS NGUYỄN THỊ NHẴ TM VÚ THỊ HUYỀN TRANG TP HỒ CHÍ MINH • NĂM 2017 LỤA CHỌN, THIẾT KÉ, THỬ NGHIỆM VÀ ỨNG DỤNG MỘT SỐ MỒI NHẰM KHUẾCH ĐẠI CẤC VỪNG TRÌNH Tự TIÈM NĂNG ĐẾ NHẬN DIỆN CÁC LỒI LAN HÀI Paphiopedỉlutn MỆT NAM (Screening, designing, pilot evaluation and application of some primers potential s for molecular discrimination of Paphiopedilum species in Vietnam) ĐẶNG VÁN KHẢI Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bàng Kỹ sư ngành Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hướng dần: ThS NGƯYẺN THỊ NHÀ ThS vừ THỊ HUYỀN TRANG TRƯỜNG ĐH NGUYỄN TẤT THÀNH TRUNG TÀM THÔNG TIN-THƯ VIỆN L\/00|Z(H / ii LỜI CẢM ƠN Đầu tiên xin cảm ơn đến Ba Mẹ lơi cảm ơn sáu sắc Cảm ơn gia đình ln bên tơi, ủng hộ cho niềm tin, chăm lo, động viên hỏ trợ mặt từ vật chất đến tinh thần để tơi hồn thành khóa luận Tơi xin cảm ơn ThS Vũ Thị Huyền Trang ■ ThS Nguyễn Thị Nhã người hướng dẫn tận tình dẫn, động viên tơi suốt q trình thực khóa luận, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý bâu q trình thực Cuối cùng, tơi xin cảm ơn thầy cô anh chị khoa Nông nghiệp Công nghệ Cao Công nghệ Sinh học hướng dẫn giúp đỡ lõi thời gian qua Đặng Văn Khải TÓM TẮT Đẻ tài “Lựa chọn, thiết ke, thử nghiệm đánh giá ứng dụng số mồi nhằm khuếch đại vùng trình tự tiém để nhận diện tan Hài Paphiopedilum Việt Nam (Screening, designing, pilot evaluation and application of some potential primers for molecular discrimination of Paphiopedilum species in Vietnam)” thực chi lan Hài paphiopediliurì) Chúng tiến hành chọn cặp mồi từ báo khoa học thực họ lan (orchidaceae) vùng trình tự matK, ACO, trnL Sau iựa chọn có vùng matK có mồi phù hợp, vùng ACO trnL khơng có mồi phù hợp r.ẻn lien hành thiết kế mồi cho vùng Thực phản ứng khuếch đại cho vìing trẽn vả tiến hành điện Chúng đạt kết sau: Hiệu chỉnh cặp mồi F56-mo: 5'-GGCAACAAAACTTCCTATA-3 ’ R1326-mo: 5’-TCTAGCACACGAAAGTCGA-3' từ mồi 56F Khevv ctv (2011) mồi 1326R (Xiang ctv, 2012) để khuếch đại vùng matK Khuếch đại thành cơng vùng trình tự mK bàng cặp mồi 56F-mo/1326r- mo, chiều dài khuếch đại đạt 1.200 bp, hiệu suất đạt 90% - Thiết kế cặp mồi F256: 5’- TCCCTGTTTCCAACATCTCC-3’ RI 190: 5’-GAGGCGATTGACATCCTGTT-3 ’ để khuếch đại vùng ACO Khuếch đại trình tự ACO sổ mẫu lan Hài {Paphỉopedilum) Việt Nam cặp mồi F256/R1190, chiều dài khuếch đại 1.000 bp hiệu suất đạt 45% Thiết kế cặp mồi /77ĩL-F: 5’- GGTAGACGCTACGGACTTGATT-3’ z™L-R: 5’-CGGTATTGACATGTAAAATGGGACT-3'đẻ khuếch đại vùng trriL Khuếch đại vùng trình tự trnL 54 mẫu lan Hài (Paphiopedilum) Việt Nam cặp mồi tmL-F/tmL-R chiều dài khuếch đại đạt 500 bp, hiệu suất đạt 100% Cặp mồi maiK 56F-mo/1326R-mo ZrnL-F/irnL-R có hiệu suất khuếch đại cao đề xuất để nhận diện phàn tử loài lan Hài Paphìopedỉlum Việt Nam iii Mực LỤC LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT vii DANH SÁCH BẢNG viii DANH SÁCH HÌNH ẢNH ix MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Mục đích đề tài .2 Chương TỒNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung lan Hài 1.2 Nguồn gốc họ hàng lan Hài 1.2.1 Tên khoa học vị trí lan Hài hệ thống phân loại 1.2.2 Đặc điểm hình thái 1.2.3 Đặc điểm sinh thái 1.2.4 Phân bố lan Hài 1.3 Giá trị lan Hài 1.3.1 Giá trị kinh tể 1.3.2 Giá trị thẩm mỹ 1.3.3 Giá trị dược học 1.4 Các vùng trình tự sử dụng nghiên cửu 1.4.1 VùngACO 1.4.2 Gen matK (mứMrase K) 10 1.4.3 VùngửTĩL 11 1.5 Kỹ thuật PCR 11 1.5.1 Khái niệm 11 1.5.2 Lịch sử 11 1.5.3 Nguyên tắc hoạt động PCR 12 1.5.4 Thành phần phàn ứng PCR 14 1.6 Thiết kế mồi 17 1.6.1 Khái niệm 17 iv 1.6.2 Các loại mồi 18 1.6.3 Ý nghĩa lựa chọn mồi 18 1.6.4 Các tiêu chí thiết kế 18 1.6.5 Lưu ý thiết kế mồi 20 1.7 Kỳ thuật điện di 20 1.8 Tình hình nghiên cứu ngồi nước cãc vùng trình tự để sử dụng nhận diện chi lan Hài (Paphiopedilum) 20 1.8.1 Các nghiên cứu giới 20 1.8.2 Các nghiên cửu nước 22 Chương NỘI DƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨƯ 23 2.1 Nội dung nghiên cứu 23 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 24 2.3 Đối tượng nghiên cứu 24 2.4 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất 24 2.5 Phương pháp nghiên cứu 25 2.5.1 Phương pháp tìm kiếm liệutài liệu 25 2.5.2 Phương pháp tìm kiếm liệu trình tự 25 2.5.3 Lựa chọn mồi 26 2.5.4 Phương pháp thiết kế mồi 27 2.5.5 Khuếch đại vùng trình tự mồi chọn lọc thiết kế 30 2.5.6 Phương pháp điện di 32 Chương KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 43 3.1 Ket tìm kiếm tài liệu 43 3.1.1 Kết tìm tài liệu vùng Wơ/K 43 3.1.2 Kết tìm tài liệu vùng ACO .48 3.1.3 Kết tìm tài liệu vùng 49 3.2 Kết tìm kiếm liệu trình tự .49 3.2.1 Két tìm kiếm dừ liệu trình tự matK .49 3.2.2 Kết tìm kiểm dừ liệu ưình tự ACO .50 3.2.3 Kết tìm kiếm liệu ưình tự trnL 50 3.3 Kết quà lựa chọn mồi cho tùmg vùng trình tự 51 V 3.3.2 Kei quà lựa chọn mồi khuếch đại vùng /77Ớ/K 51 3.3.3 Kei lựa chọn mồi khuếch dại vùng ACO 53 Sử dụng cặp mồi báo đưa trmh tự Seaview mồi chạy không khớp mồi không sử dụng để nghiên cứu lốí 'an Hài (Paphiopedilum), nên tiến hành thiết kế mồi cho vùng ACO 53 3.3.4 Ket lựa chọn mồi khuếch đại vùng tmL 53 3.4 Kết thiết kế mồi 54 3.4.2 Kết thiết mồi khuếch đại vùng ACO 54 3.4.3 Kết thiết kế mồi khuếch đại vùng ỉr?ỉL 56 3.5 Ket khuếch đại vùng trình tự cho lồi lan Hài (Paphiopedilurn) Việt Nam 59 3.5.1 Kết khuếch đại vùng trình tự mưrK 59 3.5.2 Kết khuếch đại vùng trình tự ACO .60 3.5.3 Kết khuếch đại vùng trình tự tmL 62 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 PHỤ LỤC .72 vi DANH SÁCH CHỮ VIÉT TẤT BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp Base pair cpDNA Chloroplast DNA DNA Deoxyribonucleic acid DNAse Deoxyribonuclease CỈNTP Deoxyribounucleotide triphosphate F Forward ITS Internal transcribed spacer mứ/K Afararase K mtDNA Mitochondrial DNA NCBI National Center for Biotechnology Infonnflrion PCR Polymerase Chain Reaction ORF Open Reading Frame R Reverse rDNA Ribosomal DNA RNA Ribonucleic acid RNAse Ribounuclease T1m Melting Temperature TBE Tris - Borate - Ethylenediaminetetraacetic acid Taq Thermus aquaticus u Unit uv Ultraviolet vii DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Danh mục dụng cụ sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 2.2: Danh mục hóa chất sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 2.3: Bảng thống kê mẫu sử dụng 31 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng khuếch đại (PCR 32 Bảng 3.1: Kết tìm tài ỉiệu có sử dụng mồi họ Lan (Orchidaceae) 43 Bảng 3.2: Tổng hợp mồi xuôi (F) mồi ngĩrọc R) cho vùng matK lan Hài 47 Bảng 3.3: Tổng hợp báo sử dụng vùng trình lự ACO 48 Bảng 3.4: Tổng hợp báo sử dụng vùng trình tự trnL 49 Bảng 3.5: Bảng mồi matK chỉnh sửa 52 Bảng 3.6 Ket cặp mồi đề xuất phần mềm Primer3Plus vùng ACO 55 Bảng 3.7: Bảng mồi thiết kế vùng ACO 55 Bảng 3.8: Kết quà cặp mồi đề xuất phần mềm Primer3Plus cùa vùng trnL 58 Bảng 3.9 Bảng mồi thiết kế vùng trnL 58 Bảng 3.10: Chu trình nhiệt phản ứng PCR vùng mat¥L 59 Bảng 3.11: Chu trình nhiệt phản ứng PCR vùng ACO 61 Bảng 3.12: Chu trình nhiệt phản ứng PCR vùng trnL 62 Bảng 3.13: Bảng tổng hợp số liệu kết PCR 64 viii DANH SACK HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình thái hoa Paphiopedilwn f Averyanov ctv, 2003) Hình 1.2 Cấu trúc vùng ACO Hình 1.3 Cấu tạo gen matK 10 Hình 1.4 Cấu trúc vùng trnL 11 Hình 1.5 Chu trình PCR dạng sơ đồ 14 Hình 2.1 Các trình tự sau tối ưu hóa sáp gior.g cột thảng hàng .26 Hình 2.2 Các tiêu chí thiết kế mồi 27 Hình 2.3 Vùng bảo tồn trình tự 28 Hình 2.4 Khung nhập liệu trình tự .28 Hình 2.5 Giao diện khai báo mục Genral Settings ưong Primer3Plus 29 Hình 2.6 Giao diện khai báo mục Advanced Settings ưong Primer3Plus 30 Hình 2.7 Các cặp mồi có độ tương thích cao 30 Hình 3.1 Dữ liệu trình tự gen maiK 50 Hình 3.2 Dữ liệu trình tự vùng ACO 50 Hình 3.3 Dữ liệu trình tự vùng trnL 51 Hình 3.4 Cấu trúc kẹp tóc (hairpin) 51 Hình 3.5 Hai phân tử mồi xi mồi ngược tự bắt cặp (dimer) 52 Hình 3.6 Khảo sát mồi mat'd 52 Hình 3.7 Kết lựa chọn mồi vùng ACO .53 Hình 3.8 Kết lựa chọn mồi cho vùng trriL 53 Hình 3.9 Các cặp mồi Primer3Plus đề xuất cho vùng ACO 54 Hình 3.10 Trình tự mồi xi F256 vị trí nucleotide 256 - 275 56 Hình 3.11 Trình tự mồi ngược RI 190 vị trí nucleotide 1202 - 1221 56 Hình 3.12 Các cặp mồi Primer3Plus đề xuất cho vùng trnL 57 Hình 3.13 Trình tự thiết kể mồi xi rrnL vị trí nucleotide 61 - 82 58 Hình 3.14 Trình tự thiết kế mồi ngược vùng trriL vị trí nucleotide 589 - 613 59 Hình 3.15 Kết điện di vùng trinh tự matd 54 mẫu lan Hài 60 Hình 3.16 Kết điện di vùng trinh tự ACO 54 mẫu lan Hài 61 Hình 3.17 Kết điện di vùng trinh tự trriL 54 mẫu lan Hài 63 ix 24 Paphiopedilum gigantifolium KP312011.1 JQ660887.1 25 Paphiopedilum glanduliferum JQ929373.1 JQ929374.1 KP312012.1 ' AY557205.1 ' JQ929375.1 26 Paphiopedilum glaucophyUzen KP312027.1 KP312029.1 27 Paphiopedilum godefroyae KP312008.1 JQ660900.I JQ929376.1 JQ929377.1 Paphiopedilum gratrixianum JQ929378.1 28 KP312042.1 KP312043.1 Paphiopedilum gratrixiamim var KP312091.1 cangyuanense 29 Paphiopedilum guangdongense KP312085.1 KP311998.1 30 Paphiopedilwn hangianum KP311999.1 KP312000.1 JQ929379.1 31 Paphiopedilum haynaldianum KP312023.1 KP312024.1 JQ660901.1 32 Paphiopedilum helenae KP312044.1 KP312045.1 JQ929380.1 33 Paphiopedilum hennisianum KP312066.1 63 34 Paphiopedilnm henryanum KP312046.1 KP312047.1 HQ998490.1 HQ998491.1 HỌ998492.1 35 Paphiopedilum hìrsutissữr.:ứr HQ998493.1 HQ998494.1 JN181449.1 KF361652.1 KP312048.1 36 Paphiopedilum hookerae KP312067.1 HQ998495.1 HQ998496.1 HQ998497.1 HQ998498.1 37 Paphiopedilum insigne HQ998499.1 JQ660898.1 JQ929381.1 KP312049.1 KP312050.I GUI 20220.1 Paphiopedilum javanicwn KP312068.1 38 GUI 20222.1 Paphiopedilumjavanicum var Virens JQ929382.1 JQ929383.1 39 Paphiopedilum kolopakingii 40 Paphiopedilum iawrenceanum 41 Paphiopedilum liemianum KP312013.1 JQ929384.1 KP312069.1 JQ929385.1 KP312029.1 64 JQ660890.1 JQ660891.1 JQ929386.1 JQ929387.1 42 Paphiopedilum lowii KC692134.1 KC692135.1 KC692136.1 KC692137.1 KP312025.1 JQ929388.1 43 Paphiopedilum malipoense KF361653.1 KP311996.1 GUI 20217 44 Paphiopedilum mastersianum JQ929389.1 KP312070.1 JQ929390.1 45 Paphiopedilum micranthum 46 Paphiopedilum mohrianum KP311997.1 GƯ120218.1 JQ660903.1 JQ929391.1 47 Paphiopedilum niveum KC692138.1 KC692139.1 KP312009.1 JQ660891.1 48 Paphiopedilum parishii JQ929392.1 KP312026.1 49 PaphiopeđiỈum parnatan um KP312071.1 JQ929393.1 50 Paphiopedilum philippinense KP312014.1 KP312015.1 65 51 Paphiopedilum platyphyllum KP312016.1 52 Paphiopedil um praeslans JQ660886.1 JN181451.1 Paphiopedilum primulinum 53 JQ929394.1 KP312030.1 Paphiopedilum primuỉini.-: -.zr JQ929395.1 purpurascens KP312072.1 54 Paphiopedilum purpuratiJ-: KP312073.1 55 Paphiopedỉlum qingyc?:g:.: KP312087.1 56 Paphiopedilum randsii JQ929396.1 57 Paph iopedilum rhizomatosum KP312051.1 JQ660888.1 58 Paphiopedilum rothschildỉanum JQ929397.1 KP312017.1 59 Paphiopedilum sanderỉamim 60 Paphiopedilum sangii 61 Paphiopedilum schoseri KP312018.il JQ929398.1 KP312074.1 GƯ120214.1 HQ998504.1 HQ998505.1 HQ998506.1 62 Paphiopedìlum spicerianum HQ998507.1 JQ929399.1 KP312052.1 Paphiopediltim spicerianum X p 63 HQ998509.1 venustum 64 Paphìopedìỉum stenoỉomum 65 Paphìopediỉum stonei KP312090.1 JQ660889.1 JQ929400.1 66 KP312019.1 66 Paphiopedilum sugiyamanum GU120215.1 KP312075.1 67 JQ929401.1 Paphiopedilum sukhakulii KP312076.1 68 Paphiopedilum supardii KP312020.1 JQ660897.1 Paphiopedilum superbiens KP312077.1 69 Paphiopedilum superb^ :: Jr JQ929402.1 curtisii KP312033.1 70 Paphiopedilum tigrinum KP312054.1 KP312055.1 GƯ120216.1 JQ929403.1 71 Paphiopedilum tonsum KP312078.1 KP312079.1 72 Paph iopedilum tranlienianurn KP312056.1 73 Paphiopedilum urbaniamim KP312080.1 HQ998510.1 HQ998511.1 HQ998512.1 74 Paphiopedilum venustum HQ998513.1 KP312081.1 KP312082.1 75 Paphiopedilum victoria-mariae KP312031.1 JQ660893.1 JQ929404.1 76 Paphiopedilum victoria-regina KP312032.1 KP312034.1 67 KP312053.1 77 Paphiopedilum vielnamense JQ182194.1 HQ998514.1 HQ998515.1 Paphiopedilum villosum 78 JQ660899.1 JQ660902.1 KP312057.1 Paphiopedilum villasWT v~r ữoxallii JQ929405.1 JQ929406.1 79 Paphiopedilum violasci KP312083.1 HQ998516.1 80 JN181450.1 Paphiopedilum wardii JQ929407.1 81 Paphiopedilum wenshanense 82 Paphiopedilum wilhelminae 83 Paphiopedilum X lushuiense KP312010.1 KP312021.1 JQ929408.1 KP312088.1 HQ998500.1 HQ998501.1 84 Paphiopedilum X pradhailii HQ998502.1 HQ998503.1 85 Paphiopedilum X venustoinsigne HQ998508.1 86 Paphiopedilum X wuliangshanicum KP312093.1 87 Paphiopedilum X yingjiangense KP312086.1 87 253 68 Phụ lục 2: Kết tìm kiếm trình tự vùng trnL ! STT Mã số accession Lồi number Paphiopedilum acmodonìum EFl 55996.1 Paphiopedỉlum adductum EFl 55997.1 Paphiopedilum anitum Paphiopedilum appỉeto":ĩr.ũm : EFl55999.1 Paphỉopedilum argus EFl 56000.1 Paphiopedilum armeniacwTi EFl 56001.1 Paphiopedỉlum barbatum EFl 56002.1 Paphiopedilum barbigerum EFl 56003.1 Papìỉiopedilum braemii EFl 56004.1 10 Paphiopedilum callosum EFl 56005.1 11 Paphiopedilum charlesworthii EFl 56006.1 12 Paphiopedilum ciliolare EFl 56007.1 13 Papìĩiopedỉlum concolor EF156008.1 14 Paphiopedilum curtisii EFl 56009.1 15 Paphiopedilum dayanum EFl 56010.1 16 Paphiopedilum delenatii EF156011.1 17 Paphiopedilum dianthum EFl 56012.1 18 Paphỉopedilum druryi EF156013.1 19 Paphiopedilum emersonii EF156014.1 20 Paphiopedilum esquirolei EF156015.1 21 Paphiopedilum exul EF156016.1 22 Paphiopedìỉum fairrieanum EFl 56017.1 23 Paphìopediìum íbvvliei GQ505314.1 24 Paphiopedilum gigantifolium EF156018.1 25 Paphìopedìỉum glanduliferum EF156019.1 26 Paphiopedilum glaucophyllum EFl 56020.1 27 Paphiopediỉum godefroyae EF156021.1 69 • EF155998.1 EF 156022.1 28 Paphiopedilum gratrixianum EF 156023.1 29 Paphiopedilum hangianum EF 156024.1 30 Paphiopedilum h ayn al d i an um EF156025.1 31 Paphiopedilum helenae 32 Paphiopedilum henryar.um 33 Paphiopedilum hữs Uĩissimum Paphiopedilưm hookerae 34 : EF 156026.1 EF 156027.1 i EF 156029.1 EF156031.1 Paphiopedilum hockerae var EF 156030.1 volonteanum 35 36 Paphiopedilum intaniae EF 156032.1 Paphiopedilum javanicum EF 156035.1 Paphiopedilum javanicum var EF 156034.1 virens 37 Paphiopedilum kolopakingii EF156036.1 38 Paphiopedilum lawrenceanum EF 156037.1 39 Paphiopedilum liemianum EF156038.1 40 Paphiopedilum lowii EF 156039.1 EF 156040.1 Paphiopedilum malipoense JF796885.1 41 Paphiopedilum malipoense EF 156033.1 var jackii 42 Paphiopedilutn mastersianum EF156041.1 43 Paphiopedilum micranthum EF 156043.1 44 Paphiopedilum moquetteanum EF 156044.1 45 Paphiopedilum niveum EF 156045.1 46 Paphiopediỉum ooii EF 156046.1 47 Paphiopedìlum papuanum EF 156047.1 48 Pophìopedilum parishii EF 156048.1 49 Paphiopedilum philippinense EF 156049.1 70 EFl 56050.1 50 Paphiopedilum prirnulinum EF156051.1 51 Paphiopedilum purpuratum EFl 56052.1 52 Paphiopedilum randsii EF156053.1 53 Paph iopedilum ri chard • an - "i EFl 56054.1 54 Paphiopedilum robinsoni: EF156055.1 Paphiopedilum 55 EF156056.1 rothschildianum 56 Paphiopedilum sanderi EF156057.1 57 Paphiopedilum sangii EFl 56058.1 58 Paphiopedilum schoseri EFl 56059.1 59 Paphiopedilum spicerianum EFl 56060.1 60 Paphiopedilum stonei EF156061.1 61 Paphiopedilum sukhakulii EFl 56062.1 62 Paphiopedilum supardii GQ505312.1 63 Paphiopedilum superbiens EFl 56063.1 64 Paphiopedilum tigrinum EFl 56064.1 65 Paphiopedilum tonsum EFl 56065.1 66 Paphiopedilum tranlienianum EFl 56066.1 67 Paphiopedilum urbanianum EFl 56067.1 68 Paphiopedilum venustum 69 Paphiopedilum victoria-mariae EF156071.1 70 Paphiopedihmi victoria-regina EFl 56072.1 71 Paphiopedilum vietnamense EFl 56073.1 72 Paphiopedilum villosum EFl 56074.1 73 Paphiopedilwn viniferum EF156068.1 74 Paphiopedilurn violascens EFl 56075.1 75 Paphiopedilum wardii EFl 56076.1 76 Paphiopedilum wilhelminiae GQ505313.1 EFl 56069.1 EF 156070.1 71 77 Paphỉopeclilum herrmannii 77 EF 156028.1 84 72 Phụ lục 3: Kết tìm kiếm vùng trình tự ACO Mã số STT Loài accession number KP312517.1 Paphiopedilum acmodor.7-m KP312518.1 Paphiopedilum adducrum JQ182152.1 Paphiopedílum armeni^cuTi KP312432.1 Paphiopedilum barbarum KP312519.1 KP312520.1 Paphiopedilum barbigerum KP312484.1 JN181400.1 Paphiopedilum bellatulum JN181401.1 KP312440.1 KP312521.1 Paphiopedilum bullenianum KP312522.1 Paphiopedilum callosum Papỉiiopedilum callosum var KP312523.1 KP312524.1 sublaeve KP312485.1 Paphiopedilum charlesworthii KP312486.1 KP312487.1 10 Paphiopedilum ciliolare KP312525.1 KP312441.1 KP312442.1 KP312445.1 11 Paphìopedìlum concolor KP312446.1 KP312447.1 KP312448.1 KP312449.1 73 KP312450.1 12 Paphiopedilurn dayanum 13 Paphiopedilurn delenaúi KP312526.1 JQ182154.1 KP312433.1 14 Papìĩiopedilum dianth -im JQ182153.1 KP312488.1 15 Paphiopedỉlum druryi KP312489.1 KP312490.1 16 Paphiopedilum exuỉ 17 Papìĩiopedilum giganti lồi ium KP312491.1 KP312455.1 KP312456.1 18 Papìỉiopedilum glanduliferum 19 Papỉìiopedilum glaucophyllum KP312457.1 KP312473.1 KP312474.1 KP312451.1 20 Paphiopedilum godefroyae KP312452.1 KP312492.1 Paphiopedilum gratrixianum KP312494.1 21 22 KP312493.1 Paphiopedilum gratrixianum var KP312554.1 cangyuanense KP312555.1 Paphiopedilum guangdongense KP312545.1 KP312437.1 23 Paphiopedilum hangianum KP31243 8.1 KP312439.1 KP312469.1 24 Paphiopedilum haynaldianum KP312470.1 KP312495.1 25 Paphìopedilum helenae KP312496.1 KP312497.1 74 KP312498.1 KP312499.1 26 Paphiopedilum hennanum KP312500.1 KP312501.1 Ị KP312502.1 27 Paphiopedilum hookerae 28 Paphiopedilum hirsutissimum KP312527.1 i JN181402.1 KP312503.1 KP312504.1 29 Paphiopedilum insigne KP312505.1 KP312506.1 30 Paphiopedilum javanicum KP312528.1 31 Paphiopedilum kolopakingii KP312458.1 32 Paphiopedilum lawrenceanum 33 Paphiopedilum liemianum KP312475.1 34 Paphiopedilum lowii KP312471.1 35 Paphiopedilum malipoense 36 Paphiopedilum mastersianum KP312531.1 37 Paphiopedilum micranthum KP312436.1 38 Paphiopedilum niveum KP312453.1 39 Paphiopedilum parishii KP312472.1 40 Paphiopedilwn pamatanum KP312532.1 KP312529.1 KP312530.1 KP312434.1 KP312435.1 KP312459.1 41 Paphiopedilum philippinense KP312460.1 KP312461.1 42 Paphiopedilum platyphyllum 43 Paphiopedilum primulinum KP312462.1 JN181405.1 KP312476.1 75 KP312477.1 44 Paphiopedilum purpuratum KP312533.1 KP312534.1 45 Paphỉopedilum q i ng} ongj i KP312548.1 KP312549.1 46 Paphiopedilum rhizo/nazosum 47 Paphiopedilum rothschilc i anum KP312507.1 KP312463.1 KP312464.1 48 Paphiopedilum sanded ar _n: KP312465.1 49 Paphiopedilum spicerianum KP312508.1 50 Paphiopedilum stenolomum KP312553.1 51 Paphiopedilum stone i KP312466.1 52 Paphiopedilum sugiyamanum KP312535.1 53 Paphiopedilum sukhakulii KP312536.1 KP312537.1 54 Paphiopedilum supardii KP312467.1 55 Paphiopedilum superbiens KP312538.1 KP312482.1 KP312511.1 56 Paphiopedilum tigrinum KP312512.1 KP312513.1 57 KP312539.1 Paphiopedilum tonsum KP312540.1 58 Paphiopedilum tranlienianum KP312514.1 59 Paphiopedihtm urbanianum KP312541.1 60 Paphiopedilum venustum KP312542.1 KP312543.1 KP312478.1 61 Paphiopedihan victoria-mariae KP312479.1 62 Paphiopedilwn victoria-regina 76 KP312480.1 KP312481.1 KP312483.1 KP312509.1 KP312510.1 63 Paphiopedilum vietnamense 64 Paphiopedilum villosum JQ182155.1 KP312515.1 KP312516.1 65 Paphiopedilum violascens 66 Paphiopedilum wardii KP312544.1 JN181403.1 JN181404.1 67 Paphiopedilum wenshanense KP312454.1 68 Paphiopedilum wilhelminae KP312468.1 69 Paphiopedilum X lushuiense 70 Paphiopeđilum X wuliangshanicum 71 Paphiopedilum X yingjiangense KP312550.1 KP312551.1 KP312556.1 KP312557.1 KP312546.1 KP312547.1 133 71 77