Đánh giá đa dạng di truyền và phân tích mối quan hệ phát sinh chủng loài của các loài lan hài (paphiopedilum) việt nam

TRƯỜN® ®ẬI MỘC NđOTỄĩỉ TẮT THÃNH S»OA NƠNG NQMỈỆR CƠM® mH O Vằ CM3 m A í BẤ NH giá »A DẠN6 »1 TRU YEN Vả j I PHẲN TÍCH MỐI QUAN HỆ PHAT sinh chủng loai j I CỦA CÁC LOÀI LAN HÀl iPapMopedtlum} VIỆT NAM I I (Genetic diversity and phylogeny of PaphỉopeđUum species I in Vietnam) i j I I SVTH > TRẰN THỊ THỮY TRẤN NGÀNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA I 20Ỉ5-20Ỉ7 GVHD I THS, VŨ THỊ HUYỀN TRANG s 31 Thành hụ- viện 713 !2 TP HƠ CHÍ MINH-NẲM 2017 i ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ PHẦN TÍCH MĨI QUAN HỆ PHÁT SINH CHỦNG LỒI CỦA CÁC LỒI LAN HÀI (Paphỉopedilrì) VIỆT NAM (GENETIC DIVERSITY AND PHYLOGENY OF PAPHIOPEDILUM SPECIES IN VIETNAM) TRẦN THỊ THÙY TRÂN Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu đề tài cấp Kỹ sư ngành Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: ThS Vũ Thị Huyền Trang TRƯỜNG ĐH NGUYỄN TẤT THÀNH TRUNG TÂM THỐNG TIN-THƯ VIỆN Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2017 LỜI CẢM ƠN Đê hoàn thành khóa luận tốt nghiệp ngồi nỗ lực thân ra, cịn có giúp đỡ ThS.Vũ Thị Huyền Trang nhiệt tình hướng dẫn em hồn thảnh tốt khóa thực tập Trong suốt q trình thực hiện, ln nhắc nhờ, sửa chữa sai sóĩ vã không ngừng động viên, tạo điều kiện cho em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tri ân sâu sắc cô cũa trường Đại học Nguyễn Tất Thành, đặc biệt thầy cô khoa Nông Nghiệp Công Nghệ Cao Và Công Nghệ Sinh Học tận tình giảng dạy truyền đạt cho em kiến thức kinh nghiệm quý báu, cảm ơn bạn lớp 15DSH.CLT1A nhiệt tình giúp đỡ suốt thời gian qua Em xin chân thành cảm ơn cô ThS Nguyễn Thị Nhã giúp đỡ em ưong suốt q trình làm đề tài phịng Sinh học phân tử thực vật, trường Đại học Nguyễn Tất Thành ii TÓM TẮT Đê tài “Đánh giá đa dạng di truyên phân tích mối quan hệ phát sinh chủng loài loài lan Hài (paphiopedỉlum) Việt Nam” thực từ tháng 1/2017 đến tháng 6/2017 Khoa Nông Nghiệp Công Nghệ Cao Và Công Nghệ Sinh Học, đề tài với mục tiêu đánh giá đa dạng di truyền đánh giá mối quan hệ nguồn gốc loài lan Hài nghiên cứu Đề tài có nội dung: Thu thập vả xử ĩý mẫu lan Hài, tách chiết DNA tổng số loài lan Hài Việt Nam nghiên cứu, khuếch đại vùng trình tự matK, ITS tất loài lan Hải Việt Nam nghiên cứu, giải hiệu chỉnh trình tự DNA vùng trình tự ITS maiK tât loài lan Hài Việt Nam nghiên cửu, xây dựng ma trận khoảng cách phát sinh loài cho loài lan Hài Việt Nam, đánh giá đa dạng di truyền loài lan Hài Việt Nam nghiên cứu, đánh giá mối quan hệ nguồn gốc loài lan Hài nghiên cứu Kểt đạt được: Thu thập, xử lý, tách chiết 46 mẫu lan Hài cùa 21 loài lan Hài Việt Nam nghiên cứu; Khuếch đại thành công vùng ITS vùng matK cho 21 lồi lan Hài Việt Nam nghiên cứu; Bộ trình tự DNA hai vùng trình tự ITS matK cho 21 loài lan Hài Việt Nam nghiên cứu; Mầu Paphiopedilum canhii thu được, định danh hình thái lại Paphiopedilum vietnamense Việt nam có đa dạng lồi lan Hài, có 21 lồi mà chúng tơi thu nghiên cứu Các lồi có đa dạng di truyền cao có quan hệ phát sinh thuộc chi lan Hài Paphiopedilum.vaox vùng trình tự có hướng tiến hóa khác nhau, đánh gía đa dạng di truyền dựa ưên vùng gene khác kết đánh giá đa dạng di truyền không giong nhau, điều chứng tỏ giới sinh vật đa dạng phong phú iii MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vií DANH MỤC BẢNG viii DANH MỰC HÌNH ẢNH ix MỞ ĐẦU Chương TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan lan Hài (JPhaphiopedilum) 1.1.1 Tên khoa học vị trí lan Hài hệ thống phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái lan Hài 1.1.3 Phân bố điều kiện sinh thái lan Hài 1.1.4 Giá trị lan Hài 1.2 Đa dạng di truyền phân tích mối quan hệ phát sinh chủng loài loài 1.2.1 Đa dạng di truyền loài 1.2.2 ứng dụng việc đánh giá đa dạng di truyền loài 1.2.3 Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền lồi phân tích mối quan hệ phát sinh chủng loài loài 1.3 Mối quan hệ phát sinh chủng loài 1.3.1 Khái niệm .8 1.3.2 ứng dụng việc xây dựng phát sinh loài 1.4 Các vùng trình tự sử dụng nghiên cứu 1.4.1 Gene matK 1.4.2 Vùng ITS 1.5 Tổng quan kĩ thuật sinh học phân tử dùng ữong nghiên cứu 1.5.1 Giới thiệu phương pháp tách chiết DNA 1.5.2 Kỹ thuật Điện di 10 1.5.2.1 Khái niệm 10 1.5.2.2 Nguyên lý điện di 10 iv 1.5.3 Kỹ thuật đo quang phổ (OD) 11 1.5.4 Kỹ thuật PCR 11 1.5.4.1 Khái niệm 11 1.5.4.2 Nguyên tắc kĩ thuật PCR 12 1.5.5 Giới thiệu kĩ thuật giải trình tự 12 1.5.5.1 Phương pháp Maxam - Gilbert 13 1.5.5.2 Phương pháp Sanger (dideoxynucleotide) 14 1.6 Tình hình nghiên cứu nước 17 1.6.1 Tình hình nghiên cứu giới ỉ 1.6.2 Tình hình nghiên cứu nước 17 Chương VẬT LEỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu .19 2.1 Nội dung nghiên cứu 19 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cửu 19 2.3 Vật liệu nghiên cứu 19 2.4 Phương pháp nghiên cứu 20 2.4.1 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất 20 2.4.2 Thu mẫu, xử lý bảo quản mẫu 21 2.4.3 Tách chiết DNA tổng số 21 2.4.4 Khuếch đại vùng trình tự kĩ thuật PCR 22 2.4.5 Kĩ thuật kiểm tra chất lượng sản phẩm 24 2.4.5.1 Điện di 24 2.4.5.2 Đo quang phổ (OD) 25 2.4.6 Giải, hiệu chỉnh trình tự so sánh với sở liệu GenBank 25 2.4 6.1 Giải trình tự sản phẩm PCR 25 2.4 Ô.2 Hiệu chỉnh trình tự 26 2.4.7 Phương pháp phân tích tính đa hình trình tự DNA 29 2.4.8 Xây dựng phát sinh loài 30 2.4.9 Đánh giá đa dạng di truyền xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loài loài lan Hài (Paphiopediluni) Việt Nam 30 V Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Kết thu thập xử lý mẫu, tách DNA tổng số 31 3.2 Khuyến đại vùng trình tự kỹ thuật PCR 33 3.2.1 Khuếch đại vùng ITS 33 3.2.2 Khuếch đại gene maiK 34 3.3 Kết giải hiệu chỉnh trình tự 35 3.4 So sánh trình tự mẫu lan Hài nghiên cứu với trình tự lanHài sỡ liệu GenBank 38 3.4.1 So sánh trình tự vùng ITS 38 3.4.2 So sánh trình tự gene matK 38 3.5 Phân tích đa hình trình tự DNA vùng trình tựnghiên cứu 39 3.7 Phân tích mối quan hệ phát sinh chủng lồi đánh giá đadạng di truyền loài lan Hài (JPaphiopedilwri) Việt Nam 50 3.7.1 Phân tích quan hệ phát sinh chủng lồi dựa vào vùng trình tự ITS 50 3.7.1.1 Phân tích khoảng cách di truyền lồi lan Hài dựa vào trình tự ITS 50 3.7.1.2 Phân tích phát sinh chủng lồi dựa vào vùng trình tự ITS 53 3.7.2 Phân tích quan hệ phát sinh chủng lồi dựa vào vùng trình tự matK 54 3.7.2.1 Phân tích khoảng cách di truyền lồi lan Hài dựa vào vùng trình tự matK 54 3.7.2.2 Phân tích phát sinh chủng lồi dựa vào vùng trình tự matK 57 3.7.3 Phân tích quan hệ phát sinh chủng lồi sử dụng trình tự ghép matK - ITS 58 3.7.3.1 Phân tích khoảng cách di truyền loài lan Hài matK - ITS 58 3.7.3.2 Phân tích phát sinh chủng lồi dựa vào vùng trình tự matK - ITS 60 3.7.4 So sánh nhận diện lan Hài Paphiopedilum vietnamense 62 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 PHỤ LỤC 68 vi DANH MỤC CHỮ VIÉT TẮT BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp Base pair DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribounucleotide triphosphate EB3 Extraction Buffer SDS 3% EDTA Ethylenediamine tetraacetate F Forward IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry ITS Internal transcribed spacer matK Maturase K PCR Polymerase Chain Reaction R Reverse RNA Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulfate Tm Melting Temperature TAE Tris - acetate - EDTA TE Tris - EDTA Taq Thermus aquaticus u Unit vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Thống kê sơ đa dạng lan Hài Việt Nam Bảng 2.1: Dụng cụ sử dụng nghiên cứu 25 Bảng 2.2: Hóa chất sử dụng nghiên cửu 25 Bảng 2.3: Thiết bị dùng nghiên cửu 26 Bảng 2.4: Các mồi sử dụng phản ứng khuếch đại vùng trình tự 28 Bảng 2.5: Cách thành phần có phản ứng khuếch đại gen 28 Bảng 2.6: Chu kì nhiệt khuếch đại vùng ITS 29 Bảng 2.7: Chu kì nhiệt khuếch đại gen maiK 29 Bảng 3.1: Mầu lan Hài sử dụng kết OD mẫu nghiên cứu 36 Bảng 3.2: Kết tách chiết DNA, PCR giải trình tự 41 Bảng 3.3: Thống kê điểm đa hình nucleotied vùng ITS lồi lan Hài 45 Bảng 3.4: Thống kê điểm đa hình nucleotied vùng matK loài lan Hài 52 Bảng 3.5: Bảng phân tích đa hình trình tự DNA vùng ITS, matK 54 Bảng 3.6: Khoảng cách di truyền lồi lan Hài dựa vào vùng trình tự ITS 56 Bảng 3.7: Khoảng cách di truyền lồi lan Hài dựa vào vùng trình tự matK 60 Bảng 3.8: Khoảng cách di truyền loài lan Hài dựa vào trình tự ITS - matK 64 viii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình thái hoa Paphiopedilu Hình 1.2 Sơ đồ tóm tắt phương pháp hóa học Maxam Gilbert 13 Hình 1.3 Hình ảnh mơ tả cấu trúc dNTP ddNTP Hình 1.4 Nguyên lý phương pháp dideoxynucleotid 15 Hình 1.5 Sơ đồ tóm tắt quy trình giải trình tự máy tự động 16 Hình 2.1 Trường hợp trình tự DNA sử dụng hiệu chỉnh hai mạch 31 Hình 2.2 Trường hợp trình tự DNA hiệu chỉnh mạch 32 Hình 2.3 Trường hợp trình tự DNA khơng thể hiệu chỉnh ưên hai mạch 33 Hình 3.1 Kết điện di sản phẩm khuếch đại vùng trình tự ITS 39 Hình 3.2 Ket điện di sản phẩm khuếch đại gene ttỉứíK 40 Hình 3.3 Trình tự DNA sử dụng hiệu chỉnh cà hai mạch 41 Hình 3.4 Biểu đồ thể tỷ lệ tách chiết, PCR giải trình tự thành cơng mẫu lan Hài 41 Hình 3.5 Sắp giống cột trình tự ITS lồi lan Hài nghiên cứu phần mềm SeaView 42 Hình 3.6 Sắp giống cột trình tự makK loài lan Hài nghiên cứu phần mềm SeaView 42 Hình 3.7 Kết BLAST mẫu Viet vùng ITS củamẫuHừl 43 Hình 3.8 Kết BLAST Arml vùng Wứ/K mẫu Arml 43 Hình 3.9 Cây phát sinh lồi xây dựng phương pháp neighbor - joining (NJ) loài lan Hài vùng gene ITS 59 Hình 3.10 Cây phát sinh loài xây dựng phương pháp neighbor - joining (NJ) loài lan Hài vùng gene matK 63 Hình 3.11 Cây phát sinh loài xây dựng phương pháp neighbor - joining (NJ) loài lan Hài vùng gene ITS - matK 66 Hình 3.12 Kết so sánh trình tự loài Paphiopedilum vietnamense 68 ix > Paphiopedìlum helenae_2 IGGAG^ATGA.GJHAS:iErGGTCACTCATGGGCA'rrrGGTATTGCAG7GACCGAGA7-|TGCCATCGAAG I'rTGJJGGJGGGGATGTAA-AGCCTAGCCCGGCGCAG'i'i'í'í(1f