Nhận diện hình thái và phân tử một số loài lan hài Paphiopedilum Việt Nam.pdf

II ịl Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TÁT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MƠI TRƯỜNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NHẬN DIỆN HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ MỘT SĨ LỒI LAN HÀI Paphiopedilum VIỆT NAM (Morphological and molecular authentication of some Paphiopedilum species in Vietnam) Sinh viên thực : BÙI THỊ MỶ HUYỀN Chun ngành TP.HCM, tháng năm 2018 í : Cơng nghệ sinh học Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẮT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MƠI TRƯỜNG cstĩlBO KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NHẬN DIỆN HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ MỘT SỐ LỒI LAN HÀI Paphiopedilum VIỆT NAM (Morphological and molecular authentication of some Paphiopedilum species in Vietnam) Sinh viên thực : BÙI THỊ MỸ HUYÈN Mãsốsinhviên : 1311524079 Lớp : 13DSH01 Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Giáo viên hướng dẫn : ThS vũ THỊ HUYỀN TRANG TP.HCM, tháng năm 2018 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Nguyền Tất Thành, quý thầy cô giảng dạy Khoa Công nghệ sinh học Môi trường tất thầy cô truyền đạt kiến thức quý báu, kỹ chuyên môn, cảm hứng nghiên cứu, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập làm khóa luận tốt nghiệp Đặc biệt, xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS Vũ Thị Huyền Trang Người sát cánh tôi, giúp định hướng đề tài, tận tụy hướng dần quan tâm giúp đỡ suốt thời gian làm đe tài Cuối xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến mẹ tôi, người ủng hộ chồ dựa vững cho Và vô biết ơn anh, chị, em bạn bè hết lịng giúp đờ, hồ trợ động viên tơi tơi gặp khó khăn q trình học tập sống đe tơi có thành tựu ngày hôm Bùi Thị Mỳ Huyền Khoa Công nghệ Sinh học Môi trường Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành 11 MỤC LỤC LỜỊCẢM.ƠN ịị MỤC LỤC iii TÓM TẮT V SUMMARY vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MUC CẤC HÌNH _ Ịx xi DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VÁN ĐỀ CHựỢNG ( TONG QỤẠN.TÀỊ.LIỆỤ Ị.1 Giới thieu chung lan Hài 1.2 Giới thiệu ye chiJan Hai Paphiopedilum 1.3 Ten khp.a hoc yaỊ.yị tricuaJan Hai he thongphan loai 1.3.1 Điều kiên sinh thái lan Hài 1.3Ị.2 Đặc diemhinh thái.chung.cualanhai L,3.3 Gia tri.cua Ian Hai 1,4 Tong, quan.ye ky thuat sinh hoc phan tfr 8 1.4.1 Tách chiết DNA 1.4.2 Phương pháp PCR 1.4.3 Điên di _ Ị ,4.4 Kythuật giải trình tư DNA 10 1.4.5 Giới thiêu vùng trình tư ITS (internal transcribed spacer) 10 1.5 Tình hình nghiện.cứu nựớc yậ quoc teyenhândien dựạ trên.hìnhthái, ỵậ trình tư DNA. 12 1.5.1 Các nghiên cửư thể giới 12 1.5.2 Các nghiên cứu nước 14 Nhận xet chung 15 C.H.ƯỢN.G 2,NÔỊ DUNG VÀ PHƯỢNG PHAP NGHIEN cứu 17 iii 2.1 Thời gian ya dia diem, nghiên cứu 2,2 Nôi dụng nghiên cứu 17 17 17 2,3Vật liệu nghiên cứu 2.4 Dung cụ thiet bi hoa chat 2.5 Phương pháp nghiên cửu 21 18 2.5.1 Phương phập nghiện cứu nhận dien hinh thai Ịá 2.1 2.5.2 Phương phập nghiên.cứu nhan dien phận tử .22 CHƯƠNG KÉT QUẢ VÀ THẢO LUÂN 28 3,1 Kẹt qụậ thu thập., xử lý.mầu,,tach chiet ya PCR 28 3, , Thu thập ya xử Ịý mâu 28 3.1 Ket tách DNA tống số 3,1 Ket qua khech.dai trinh tur.ITS3.1 30 Nhanxetket qua thu thập, xử lymau, tach chietyaPCR3.1 3,2 Ket qua nhan dien hinh thai ỵậ xây dựng khoá phân loai hình thái lan Hải Ket nhận diện hình thái _ 32 Khoa.phận Ịọại bang hình thái 3,3 49 Kẹt qụậ So s.anh.viec nhận dien lan hai viet nam dựa yao hinh thái ẹợ qụạn sinh dưỡng yiec nhận dien dua vao vung trinh tư phận tử ITS, 5.1 KẾT LUÂN VÀ ĐỀ NGHI 55 Kẹt Ịụận 55 Denghi 55 56 TÀI LIÊU THAM KHAO iv 32 TĨM TẢT Lan Hài, lồi lan q quan tâm nhà nghiên cứu Lan giới yêu Lan vẻ đẹp độc đáo, giá trị kinh tế cao số lồi chừa bệnh Đe tài: “Nhận diện hình thái phân tử số loài lan hài Paphiopediluni Việt Nam” thực từ tháng 02/2018 đến 08/2018 Khoa Công nghệ Sinh học Môi trường trường Đại học Nguyền Tất Thành với mục tiêu nhận diện số loài lan Hài Việt Nam dựa hình thái cùa xây dựng khóa phân loại dựa hình thái quan sinh dưỡng thân số loài lan Hài Việt Nam Đe tài có nội dung: Thu mầu, tách chiết DNA tong số, khuếch đại giải trình tự ITS để định danh phân tử mầu lan Hài Việt Nam; Xây dựng khóa phân loại lồi lan Hài nghiên cứu hình thái Những kết đạt sau tháng nghiên cứu: Thu 73 mẫu lan Hài thuộc 20 loài lan Hài Paphiopedỉlum Việt Nam Tách chiết thu nhận thành công 100% DNA tong số 73 mầu lan Hài phương pháp sử dụng EB3 (Extraction Buffer SDS 3%) đe xây dựng phát sinh lồi với vùng trình tự ITS Bước đầu nhận diện thành cơng 16 lồi tong số 20 lồi nghiên cứu phương pháp nhận diện hình thái Xây dựng thành cơng khố phân loại lồi lan Hài nghiên cứu hình thái quan sinh dưỡng thân V SUMMARY Paphiopedilum is a rare orchid species are appreciated by orchid researchers and orchid lovers by unique beauty and high economic value "Morphological and molecular authentication of some Paphiopedilum species in Vietnam” was conducted from February 2018 to August 2018 in the Faculty of Biotechnology and Environment of Nguyen Tat Thanh University with the objective are morphological authentication a number of Vietnamese orchid species based on the morphology of the leaf and construction of the Paphiopedilum classification system based on leaf morphology Results obtained after months of study: We Collected 73 specimens from 20 Paphiopedilum species in Vietnam We successfully extracted 100% of DNA samples by using EB3 (Extraction Buffer SDS 3%) method to amplify and construct phylogenetic tree with ITS sequence We identified 16 species out of 20 species studied by morphological identification of leaf Successfully built a classification system based on leaf morphology VI DANH MỤC CÁC CHŨ VIẾT TẲT BLAST Basic Local Alignment Search Tool Bp Base pair CTAB Cetyl trimethylammoium bromide DNA Deoxyribonucleic acid DNAse Deoxyribonuclease ddNTP Deoxyribonucleic triphosphat dNTP Deoxyribounucleotide triphosphate p Phenol c Chlorofom Isoamyl alcohol EDTA Ethylenediamine tetraacetate IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry ITS Internal transcribed spacer matK Maturase K PCR Polymerase Chain Reaction rDNA Ribosomal deoxyribonucleic acid rpoB RNA polymerase - p RNA Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulfate SNP Single Nucleotide Polymorphism RADP Random Ampified Polymorphic DNA Tm Melting Temperature TBE Tris - Borate - EDTA Vil TE Tris - EDTA Taq Thermus aquaticus ưv Ultraviolet NCBI The National Centre for Biotechnology Information viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Paphiopedilum vietnamense Hình 1.2 Sơ đồ vùng rDNA - ITS (Nguồn: http://www.biomedcentral.com/) Hình 2.1 Các đặc điểm hình thái Hình 2.2 Bỏ tín hiệu khơng xác hai đầu trình tự Hình 2.3 Đoi chiều nguợc phần mem FinchTV Hình 2.4 Thay đổi nucleotide T chiều xi thành nucleotide A Hình 3.1 Ket điện di DNA tống số Hình 3.2 Ket điện di sản pham PCR Hình 3.3 Nhóm có đốm khảm Hình 3.4 Nhóm có mặt trơn (khơng có đốm khảm) Hình 3.5 Paphiopedilum hỉrsutissimum khơng có đốm tím gốc Hình 3.6 Paphiopedilum tranlỉenỉanum gốc có vệt tím mịn Hình 3.7 Paphiopedilum tranlienianum có bẹ bè to ra, không ôm lấy trục thân mà có xu hướng cong lật phía ngồi Hình 3.8 Paphiopedilum henryanum mép có viền trắng dày rõ nét Hình 3.9 Paphiopedilum helenae Hình 3.10 Hình so sánh mép gợn sóng ba lồi: Paphiopedilum hangianutn, Paphiopedỉlum emersonii Paphiopedỉỉum dỉanthum a) Paphiopedilum hangianum; b) Paphiopedilum emersonii’, c) Paphiopedilum dianthum Hình 3.11 Hình so sánh hướng mọc ba loài: Paphiopedilum hangianum, Paphiopedilum etnersonỉỉ Paphiopedilum dỉanthum a) Paphiopedilum hangỉanum; b) Paphiopedilum emersonỉi; c) Paphiopedilum dianthutn Hình 3.12 Hình so sánh cách mọc Paphiopedilum hangianum Paphiopedỉlum emersonii a) Paphiopedilum hangianum; b) Paphiopediỉum etnersoniỉ IX ... việc nhận diện lan hài việt nam dựa vào hình thái quan sinh dưỡng việc nhận diện dựa vào vùng trình tự phân tử ITS - Xây dựng khố phân loại hình thái dựa quan sinh dưỡng cho loài lan hài việt. .. tiêu nhận diện số loài lan Hài Việt Nam dựa hình thái cùa xây dựng khóa phân loại dựa hình thái quan sinh dưỡng thân số loài lan Hài Việt Nam Đe tài có nội dung: Thu mầu, tách chiết DNA tong số, ... nhu cầu nhận diện hình thái thân thực sè góp phần đáng kể vào việc nhận diện ngăn chặn việc bn bán trái phép lồi q Xuất phát từ lý chọn đề tài "Nhận diện hình thái phân tử số loài lan Hài Paphiopedilutti