Giải trình tự bộ gen lục lạp của cây chuối cô đơn (ensete glaucum (roxb.) cheesman) bằng công nghệ oxford nanopore.pdf

NTTU-NCKH-04 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ NĂM 2021 - 2022 Tên đề tài: Giải trình tự gen lục lạp chuối cô đơn (Ensete glaucum (Roxb.) Cheesman) công nghệ Oxford Nanopore Mã đề tài: 2021.01.161 Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Hồng Danh Đơn vị cơng tác: Viện kĩ thuật công nghệ cao NTT Thời gian thực hiện: 11/2021 đến tháng 05/2022 TP Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 05 năm 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ NĂM 2021 - 2022 Tên đề tài: Giải trình tự gen lục lạp chuối cô đơn (Ensete glaucum (Roxb.) Cheesman) công nghệ Oxford Nanopore Mã đề tài: 2021.01.161 Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Hoàng Danh Đơn vị công tác: Viện kĩ thuật công nghệ cao NTT Thời gian thực hiện: 11/2021 đến tháng 05/2022 ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Chuối cô đơn (Ensete glaucum (Roxb.) Cheesman) 1.1 Đặc điểm phân bố chuối cô đơn 1.2 Các nghiên cứu dược tính chuối cô đơn 1.3 Các nghiên cứu trình tự gen chuối cô đơn Cơng nghệ giải trình tự Oxford Nanopore Tình hình nghiên cứu hệ gen thực vật 3.1 Giải trình tự gen phục vụ định danh phân tử 3.2 Giải trình tự hệ gen nhân 3.3 Giải trình tự hệ gen lục lạp CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 10 1.1 Mẫu thí nghiệm 10 1.2 Hóa chất 10 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 Tách chiết, tinh DNA tổng số, chuẩn bị thư viện giải trình tự 11 2.2 Phân tích đa dạng di truyền gen lục lạp chuối cô đơn 18 2.3 Xây dựng phát sinh lồi chuối đơn 18 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 KẾT QUẢ 20 1.1 Kết thu nhận DNA tổng số giải trình tự 20 1.2 Bản đồ hệ gen chuối cô đơn 21 iii 1.3 Phân tích đa dạng di truyền gen lục lạp chuối cô đơn 23 1.4 Xây dựng phát sinh lồi lồi chuối đơn 27 THẢO LUẬN 28 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 30 KẾT LUẬN 30 KIẾN NGHỊ 30 iv DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG Bảng Thơng tin trình tự hệ gen lục lạp loài họ Chuối Bảng Kết đo OD mẫu DNA máy đo Nanodrop 20 Bảng Các thông tin liệu thu nhận 21 Bảng Thông tin hệ gen lục lạp chuối cô đơn 22 Bảng Thành phần nhóm gen hệ gen lục lạp chuối cô đơn 23 Bảng Đặc điểm trình tự lặp hệ gen lục lạp loài chuối đơn 25 Hình Các đặc điểm chuối đơn hình dạng, hoa chuối, hạt phân bố chuối cô đơn giới Hình Nguyên lý giải trình tự hệ thống Oxford Nanopore Hình Bộ kit Ligation Sequencing Kit kit Flow Cell Priming Kit 10 Hình Quy trình tóm tắt từ thu thập mẫu, tách chiết, tinh DNA tổng số, chuẩn bị thư viện giải trình tự 11 Hình Sơ đồ bước xây dựng phát sinh loài 19 Hình Điện di DNA tổng số tinh DNA gel agarose 0,8% 20 Hình Bản đồ gen lục lạp hồn chỉnh lồi chuối đơn 22 Hình Sự đa dạng nucleotide 46 lồi chuối (chi Musa, Musella Ensete) 24 Hình Tỷ lệ, vị trí loại trình tự lặp đơn hệ gen lục lạp chuối đơn 25 Hình 10 Tỷ lệ, vị trí loại trình tự lặp dài hệ gen lục lạp chuối cô đơn 25 Hình 11 Cây phát sinh lồi loài họ Musaceae xây dựng từ 79 vùng trình tự mã hóa hệ gen lục lạp 28 v TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU STT Kết đạt Công việc thực Kết thu nhận DNA tổng số giải trình tự Mẫu tươi thu nhận tách chiết DNA tổng tinh Sau đó, mẫu DNA tổng số điện di gel agarose 1% Kết cho thấy, băng, DNA điện di cho vạch sáng đậm rõ nét, bị vệt dài thể nồng độ độ nguyên vẹn cao Tiếp theo, mẫu DNA đánh giá độ tinh thông qua máy đo Nanodrop (ThermoFisher Scientific) Mức độ nhiễm polysaccharide / chloroform thấp giá trị tỷ lệ A260/ A230 2.04, 2.18 mẫu (1) (2) Tương tự, việc loại bỏ protein hiệu với mẫu DNA cho giá trị A260/ A280 1.85 mẫu (1), 1.93 mẫu (2) Phương pháp tách chiết tinh DNA tổng số cho thấy hiệu cao thu nhận DNA, mẫu DNA có nồng độ cao (660 ng/ µl mẫu (1) 604 ng/ µl mẫu (2)) Tiếp theo, mẫu DNA đạt chuẩn nguyên liệu cho trình chuẩn bị thư viện DNA giải trình tự hệ thống Oxford Nanopore Thu nhận liệu giải trình tự Tổng số 277 260 trình tự thơ thu nhận, độ dài trình tự dao động từ 41 bp đến 27 789 bp Sau lọc trình tự thơ với trình tự tham chiếu, số lượng trình tự cịn lại 9729 trình tự, chiếm tỷ lệ 0.7% liệu thơ ban đầu Kích thước trình tự sau lọc dao động từ 310 bp đến 19 024 bp Các trình tự sử dụng để hồn thiện hệ gen lục lạp chuối đơn Trong số trình tự sau lọc, cịn 514 trình tự (kích thước từ 338 bp đến 19 024 bp) sử dụng để lắp ráp hoàn thiện gen lục lạp chuối đơn với độ bao phủ trung bình 91X vi Xây dựng Trình tự hệ gen lục lạp lồi chuối đơn hồn chỉnh đồ hệ nghiên cứu công bố trang web NCBI với mã số truy cập MZ856381 Hệ gen lục lạp lồi chuối đơn có kích thước gen 168 483 bp, mang cấu trúc bốn phần điển hình lục lạp, bao gồm: chuối đơn vùng LSC (88 233 bp) vùng SSC (11 138 bp), hai vùng phân tách hai vùng IR ( 34 636 bp) Trình tự hệ gen bao gồm 135 vùng trình tự mã hóa (87 gen mã hóa protein, 40 tRNA rRNA) Chi tiết thành phần nhóm gen hệ gen lục lạp mô tả chi tiết bảng Phân tích Dữ liệu hệ gen lục lạp tiếp tục phân tích để tìm kiếm đa dạng di thơng tin hữu ích đánh giá độ đa dạng vùng trình tự tiềm làm mã vạch DNA, phân tích vùng trình tự lặp lại truyền gen lục lạp (repeat) hệ gen lục lạp phục vụ đánh giá đa dạng di truyền định danh phân tử Bộ liệu gồm 46 trình tự hệ gen lục lạp 46 chuối lồi chuối từ chi Musa, Musella Ensete sử dụng để đánh đơn giá đa dạng nucleotide Kết cho thấy, số vùng gen có tỷ lệ biến động nucleotide cao matK- rps16, trnE – psbD, rbcL-accD, ycf2, ycf1, ndhH – ndhF Xây dựng phát sinh lồi lồi chuối đơn Dữ liệu hệ gen lục lạp thu nhận từ 15 loài họ chuối, đại diện cho chi Musa, Musella Ensete nhóm ngoại lồi họ Strelitziaceae – Thiên điểu (Ravenala madagascariensis – chuối rẻ quạt) Bộ liệu sử dụng để phân tích mối quan hệ tiến hóa lồi họ Chuối Dựa phát sinh loài, họ Musaceae (họ chuối) chi làm hai nhóm chính: nhóm bao gồm chi Musa nhóm bao gồm chi Musella Ensete Xét mối quan hệ tiến hóa, chi Ensete có quan hệ gần gũi với chi Musella chi Musa Trong chi Ensete, mẫu chuối cô đơn từ Việt Nam có mối quan vii hệ gần gũi với lồi chuối đơn từ Đài Loan (mã số LC610748) so với loài từ Ấn Độ (mã số MZ286962) STT Sản phẩm đạt Sản phẩm đăng ký Một báo đăng tạp chí quốc Một báo đăng tạp chí Khoa tế thuộc danh mục tạp chí Scopus học Cơng nghệ Trường Đại học Nguyễn Tất Thành Thời gian đăng ký: từ ngày 11/2021 đến ngày 05/2022 Thời gian nộp báo cáo: tháng 05/2022 viii MỞ ĐẦU Trước đây, giai đoạn khởi đầu kỷ nguyên hệ gen, thí nghiệm giải trình tự DNA cơng việc tốn nhiều thời gian, kinh phí khó tiếp cận rộng rãi Tuy nhiên, phát triển khoa học kỹ thuật tạo nhiều tảng giải trình tự DNA khác nhau, như: Sanger, Illumina, Ion Torrent, PacBio Nanopore với liệu có chất lượng cao, giá thành hợp lý dễ sử dụng tiếp cận dịch vụ Bên cạnh phát triển kỹ thuật giải trình tự, có nhiều phần mềm phân tích liệu giải trình tự hệ phát triển Trên giới Việt Nam, nghiên cứu sử dụng liệu gen nhằm định danh lồi thơng qua phân tích số vùng gen đặc trưng thực Việc phân tích khai thác sở liệu tồn hệ gen cung cấp nguồn thơng tin lớn, có giá trị độ tin cậy cao, hỗ trợ nghiên cứu phân tích gen, mối quan hệ tiến hóa, phát sinh lồi, q trình thích nghi xác định loài phục vụ nhu cầu giám sát thương mại bảo tồn nguồn gen Việt Nam quốc gia có đa dạng sinh học cao có nhiều lồi thảo dược tạo điều kiện cho nghiên cứu sinh hóa, cơng nghệ sinh học, nuôi cấy mô sinh học phân tử lồi có giá trị kinh tế cao Tuy nhiên, lĩnh vực hệ gen nghiên cứu Việt Nam chưa theo kịp xu hướng nghiên cứu giới Do đó, cần tiến hành nhiều nghiên cứu hệ gen để hiểu giá trị cốt lõi đa dạng sinh học Việt Nam góp phần vào cơng tác bảo tồn tương lai Đối với chuối cô đơn, nghiên cứu nước cho thấy tiềm lớn nhu cầu dược liệu Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu chuyên sâu hệ gen lục lạp chuối cô đơn công bố giới Cùng với đó, nhằm đáp ứng nhu cầu ngày tăng nghiên cứu xác định lồi, tiến hóa, bảo tồn, khai thác sử dụng bền vững loài thảo dược quý Việt Nam, góp phần xây dựng sở liệu gen loài chuối cô đơn định hướng ứng dụng giám định, xác định lồi chuối đơn lồi thuộc họ Chuối Việt Nam, đề tài: “Giải trình tự gen lục lạp chuối cô đơn (Ensete glaucum (Roxb.) Cheesman) công nghệ Oxford Nanopore” xây dựng thực Mục tiêu đề tài hồn thiện phân tích gen lục lạp chuối cô đơn phân bố Việt Nam Để hoàn thành mục tiêu này, ba nội dung cần phải thực sau: • Hồn chỉnh hệ gen lục lạp chuối đơn cơng nghệ Oxford Nanopore • Dựa liệu hệ gen lục lạp chuối cô đơn loài thân thuộc họ Chuối, tiến hành phân tích đa dạng nucleotide hệ gen lục lạp • Xây dựng phát sinh loài nhằm xác định mối quan hệ tiến hóa chuối đơn với lồi chuối liên quan dựa trình tự hệ gen lục lạp ... liệu gen lồi chuối đơn định hướng ứng dụng giám định, xác định lồi chuối đơn loài thuộc họ Chuối Việt Nam, đề tài: ? ?Giải trình tự gen lục lạp chuối cô đơn (Ensete glaucum (Roxb.) Cheesman) công nghệ. .. phần nhóm gen hệ gen lục lạp chuối cô đơn 23 Bảng Đặc điểm trình tự lặp hệ gen lục lạp lồi chuối đơn 25 Hình Các đặc điểm chuối đơn hình dạng, hoa chuối, hạt phân bố chuối cô đơn giới ... điểm công nghệ Oxford Nanopore việc giải trình tự hệ gen giải trình tự đoạn DNA dài, giúp xác định đoạn lặp đảo (IRA, IRB) gen lục lạp cách dễ dàng Cùng với đó, chi phí giải trình tự cơng nghệ Oxford